| Page 1

Análisis de compuestos

farmacéuticos en sangre total

Julian de la Mata

Junio de 2012

| Page 2

Contenido

Preparación de muestras en la monitorización terapéutica

de fármacos y química forénsica.

Técnica mini-QuEChERS para el Clean-up de sangre.

La técnica de Puntos de Sangre Seca (Dried blood spots)

como una técnica de recolección de muestra.

Análisis rápidos de HPLC/UHPLC a presiones

convencionales con las columnas Poroshell 120

| Page 3

Dried Blood Spotting

QuEChERS

LC/MS/MS 1290Infinity/QQQ 6400

Extracto Poroshell 120

| Page 4

Análisis de Fármacos reductores del Colesterol (Estatinas) usando la Tecnología de Gotas en Matriz Seca (Dried Matrix Spots) y Columnas Poroshell 120

Nota de aplicación 5990-8305EN

http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5990--8305EN.pdf

| Page 5

Introducción

La tecnología Gota de Sangre Seca como método de muestreo

para el bioanálisis quantitativo de pequeñas moléculas.

Significativa reducción en los volúmenes de sangre necesarios,

lo que simplifica la recogida de muestras.

Reducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los

gastos de almacenamiento en condiciones ambientales

Estabilidad de los metabolitos en la tarjeta.

| Page 6

Los compuestos

Las Estatinas (inhibidores de la HMG-CoA reductasa) son un

grupo de fármacos usados para disminuir los niveles de

colesterol.

Se analizaron cuatro estatinas con las nuevas tarjetas de

Dried Matrix Spotting (DMS) no basadas en celulosa.

Excepto la atorvastatina, estos compuestos, que son ácidos

por naturaleza, son un reto á la hora de lograr unos límites de

detección bajos.

| Page 7

Propiedades de las Estatinas

Compuesto Estructura Log P pKa

Atorvastatina

6.36 6.36

Simvastatina

4.68 NA

Pravastatina

2.18 4.70

Lovastatina

4.26 NA

Naproxeno (IS)

3.18 4.15

| Page 8

Procedimiento DMS

Fortificación de sangre humana entera fresca con cada una de las cuatro estatinas para crear una curva de calibración.

Adición de la sangre fortificada en las tarjetas Agilent Bond Elut DMS (Part #: A400150).

Se prepararon 3 replicados de concentraciones de sangre a 20 ng/mL y 500 ng/mL.

Secado de las tarjetas.

Perforación de discos de 3 mm y se depositan en viales de 2 mL .

Disolución de cada gota en el solvente de desorción y vortex.

Evaporación hasta sequedad.

Reconstitución en 100 μL de fase móvil (70% 5 mM formiato amónico: 30% CH3CN) y agitación.

Las muestras se analizaron por LC–MS–MS.

| Page 9

Cromatograma LC–MS–MS de sangre fortificada

con 50 ng/mL de estatinas después del DMS.

| Page 10

Columna Poroshell 120 en la separación por HPLC

La columna Poroshell 120 ofrece velocidad y alta resolución

comparable a las columnas sub-2 μm de UHPLC.

La tecnologia de partículas superficialmente genera

separaciones de alta eficacia a menores presiones.

Se generaron presiones inferiores a 400 bares.

La Poroshell 120 EC-C8, proporciona excelentes formas de

pico para todos los analitos.

La atorvastatina puede ser facilmente detectada a 1 ng/mL

con una SNR de 797.

| Page 11

Recuperaciones de estatinas con tarjetas Bond

Elut DMS y tarjetas de celulosa (n = 3).

Los resultados indican que cuando se usan tarjetas de celulosa hay incremento

ionico, dando lugar a altas recuperaciones artificiales.

Estos datos corroboran que las tarjetas no celulosicas exhiben datos de desorción

de mejor calidad comparados con las tarjetas tradicionales de celulosa.

| Page 12

Conclusiones

Método simple y rápido para el análisis de un grupo de compuestos acídicos en muestras de sangre humana con DMS y LC–MS–MS.

El método ha demostrado ser exacto, preciso y robusto.

Buena linealidad para la pravastatina y atorvastatina usando una regresión lineal con coeficientes de correlación mejores de 0.998.

Estas tarjetas ofrecen mejores propiedades de desorción comparadas con las tarjetas competitivas basadas en celulosa.

La columna Poroshell 120 EC-C8 es una excelente elección para las aplicaciones bioanáliticas.

La tecnologia de Gota de Sangre Seca (Dried blood spots) es una técnica de recolección de muestra para el análisis de fármacos en estudios clínicos y preclínicos.

| Page 13

•Tecnología Innovadora , no-celulosa

•Proporciona un nuevo nivel de confianza en la recolección de muestras

•Mejora significativa en la sensibilidad analítica, reproducibilidad y fácil uso.

Análisis Dried Blood Spotting (DBS)

Desarrollado en colaboración con Compañías farmacéuticas y CROs, este

dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que

hay en el mercado

•Muestreo de Sangre, plasma o suero (líquido sinovial,lágrimas, bilis, LCR) para

análisis bioanalíticos en pruebas farmacéuticas clínicas y preclínicas en

empresasa farmacéuticas de bioanálisis (DMPK, ADME y MetID) (no para

Diagnóstico clínico)

| Page 14

La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa

Mejora la Señal del MS

•Formato libre de celulosa ha reducido el enlazado no específico y no contiene reactivos

químicos impregnados

Ventajas del Producto

Flujo de trabajo más fácil

• La extracción de la muestra de la tarjeta

requiere 5 veces menos fuerza que el

producto de celulosa

Proporciona excelente homogeneidad

de la mancha

• Extracciones reproducibles,

recuperaciones más altas,

independientemente del nivel de

hematocrito

| Page 15

Ventajas Clave de la Técnica DBS de Agilent

• Una vez seca, la muestra de sangre no supone peligro biológico alguno y se

puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeración costosos.

• Permite a los laboratorios centralizar los análisis de muestra periféricas

• Se requiere menos volumen de muestra (menor nº de sujetos en el ensayo,

menor nº de repeticiones y eliminación de sujetos satélite)

• Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto

• La recolección de sangre es más sencilla

| Page 16

La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos

Farmacéuticos y Toxinas en Sangre Total

Análisis de Compuestos Farmacéuticos en Sangre Total con

la columna Poroshell 120, Usando el método Modificado

Mini-QuEChERS para la preparación de muestra.

Nota de Aplicación5990-8789EN

http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5990-8789EN.pdf

| Page 17

Introducción

Determinación de compuestos farmacéuticos en análisis clínicos y

forénsicos ADME (DMPK).

La preparación de muestra va desde la simple precipitación de

proteinas (PPT) a la más compleja extracción en fase sólida (SPE).

Habitualmente la SPE, ha ocupado este vacío, pero simpre hay

espacio para técnicas de preparación de muestras que son rápidas y

baratas de implementar.

Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con

analisis LC–MS-MS para la determinación de fármacos en sangre

total

Se analizan nueve diferentes fármacos (lidocaina, tramadol,

amitriptilina, biperidina, oxazepam, lorazepam, clorpromazina,

diltiazem, y naloxona)

| Page 18

Compuestos farmacéuticos usados en el estudio

Compuesto Número CAS Log P (o/w) pKa Uso

terapéutico

Lidocaina 137-58-6 2.4 8.01 Anestésico local,

antiarrithmico

Tramadol 27203-92-5 2.5 9.41 Analgesico

Amitriptilina 50-48-6 4.92 9.4 Antidepresivo

Biperidena 514-65-8 4.0 10.8 Anticolinergico

Oxazepam 604-75-1 2.23 1.7, 11.3 Antianxiedad

Lorazepam 846-49-1 2.47 1.3, 11.5 Antidepresivo

Clorpromazina 50-53-3 5.18 9.3 Antipsycótico

Diltiazem 42399-41-7 3.63 7.7 Bloqueante de los

canales del calcio

Naloxona 465-65-6 1.45 7.9 Antagonista de los

receptores de opio

Nortriptilina (IS) 72-69-5 5.65 9.7

5 ug/mL de solución (9 compuestos) y estandar interno en metanol

| Page 19

La Técnica de QuEChERS aplicada a las muestras

de sangre

La sangre es el más complejo de los fluidos biológicos

La determinación de fármacos en sangre total es a menudo necesaria en los

análisis forénsicos dada la dificultad de obtener suero o plasma.

Los procedimientos convencionales para analizar fármacos en matrices

complejas como la sangre total son complicados

QuEChERS es una técnica de preparación de muestra que fue desarrollada

para la extracción de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales

en 2003

A pesar de que los fluidos biológicos pueden parecer muy diferentes a una

pieza de fruta, sin embargo siguen caminos paralelos.

| Page 20

Caminos paralelos en la preparación de muestra

Fluidos Biológicos

Matrices complejas

Rotura de la arquitectura celular

• Lisis, agitación, solvente orgánico,

hidrólisis

Analitos con un amplio rango de

polaridades.

Retirar analito o matriz

Análisis por LC/MS/MS, GC/MS o

GC/MS/MS

Frutas y Vegetales

Matrices complejas

Rotura de la arquitectura celular

• Trituración, agitación, solvente

orgánico, hidrólisis

Analitos con un amplio rango de

polaridades.

Retirar analito o matriz

Análisis por LC/MS/MS, GC/MS o

GC/MS/MS

| Page 21

Procedimiento Básico QuEChERS

15 g muestra homogeneizada, (fortificada)

Añadir 15 mL ACN (1% AA), vortex

Añadir Sales de Extracción AOAC, agitar

Centrifugar

Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC, vortex, centrifugar

Transferir al vial de Análisis

| Page 22

Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS

Ventajas

Extracción tipo líquido/líquido

Uso de ácido para interrumpir el ligado de proteinas

Exceso de sal para lisar los componentes celulares

Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitación protéica

Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz

Plossl, et.at., J Chrom A, 1135 (2006), 19-26

Desventajas

La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el método no

son “biológicamente adecuados”

| Page 23

Fármacos en sangre. Procedimiento mini-QuEChERS:

mini-Q

Procedimiento:

1. Añadir 2 homogeneizadores cerámicos

2. Añadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centrífuga con tapón de rosca

3. Añadir estandar interno, vortex

4. Añadir 2 mL de ACN acidificado ( 0.4% FA), vortex 30 seg

5. Añadir 500 mg de sales de extracción, agitar vigorsamente 1 minuto, centrifugar 5000 rpm, 1 min

6. Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga, vortex, centrifugar

7. Añadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC , vortex y analizar

| Page 24

Conclusiones del estudio

El ACN con 4% de FA como solvente de extracción muestra una lisis más completa de la muestra frente a otros solventes de extracción que mostraron una masa sólida.

Las sales tamponadas AOAC de acetato Sódico generan el extracto más límpio y para la d-SPE se usaron 50mg de PSA y 150mg de MgSO4

El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los métodos de extracción con sales EN y no tamponadas principalmente.

| Page 25

3 x10

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2

2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

2.6

2.7

2.8

2.9

3

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

3.6

3.7

3.8

3.9

4

4.1

4.2

4.3

4.4

4.5

4.6

4.7

4.8

4.9

5

5.1

+ESI MRM Frag=112.0V CID@19.0 (278.2000 -> 117.0000) HQC_6.d

1 1

Counts vs. Acquisition Time (min) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6

Nalo

xo

ne

Lid

oc

ain

e

Tra

mad

ol

Oxazep

am

Lo

razep

am

Bip

eri

de

n

Am

itri

pty

lin

e

Dil

tiazem

Ch

lorp

rom

azin

e

No

rtri

pty

lin

e (

IS)

Cromatograma LC/MS/MS de 10 ng/mL de sangre total fortificada después

de extracción mini-QuEChERS ; AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y

150mg MgSO4)

| Page 26

Recuperación y Reproducibilidad

Compuesto 50 ng/mL Spiked

Recuperación RSD

100 ng/mL Spiked

Recuperación RSD

Lidocaine 98.7 15.7 100 11.8

Tramadol 105 3.0 104 8.2

Amitriptyline 104 2.1 104 8.2

Biperidene 97 4.5 99 8.2

Oxazepam 77.0 9.2 78 8.6

Lorazepam 81.9 6.8 81.8 8.6

Chlorpromazine 110 10.3 105 6.3

Diltiazem 88.1 2.7 91.7 8.3

Naloxone 80.6 9.0 75.5 7.7

| Page 27

Conclusiónes y trabajo posterior

El método mini-QuEChERS para la extracción de compuestos farmacéuticos en

sangre total ofrece una alternativa a otras técnicas de preparación de muestras

La preparación de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple, facil y

barato, que requiere una mínima experiencia en preparación de muestras y

mínimo equipamiento

Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas,

en otras matrices biológicas, y en sangre postmortem.

El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de

extracción como de los sorbentes de d-SPE por el método mini-QuEChERS.

La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas

de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmacéuticos usados en este

estudio.

| Page 28

MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN

HPLC ESTÁNDAR CON COLUMNAS

POROSHELL

Page 28

| Page 29

Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC:

• 80-90% de eficacia de las sub 2um

• A presiones un ~40-50% más bajas

• Con un tamaño de partícula de 2.7um

• Con una frita de entrada de 2um

• Con el doble de resolución de una

columna de 3.5um

• Con un límite de presión de 600 bar

• La partícula tiene un núcleo sólido

(1.7um) y una cubierta exterior porosa

de 0.5um como zona de difusión

Las Columnas Poroshell 120 tienen:

Page 29

| Page 30

Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente!

Page 30

Flujo: 0.582 mL/min Acetonitrilo/Agua (60:40)

Volumen de Inyección: 4 µL

TCC: 26 oC

DAD: Sig=254,4nm Ref=360,100nm

Muestra: Muestra de test RRLC

(PN 5188-6529) inoculada con

50 µL 2 mg/mL Tiourea en

agua/acetonitrilo (65:35)

2.5 5 7.5 10

mAU

0

200

400

600

0.6

46

0

.82

6

1.1

48

1.5

18

2.0

16

2

.22

3

2.8

16

4.1

32

6.2

73

9.7

53

← N = 25053, Presión = 182 bar

Poroshell 120 EC-C18, 3.0 x 100 mm, 2.7 um

min 2.5 5 7.5 10 12.5

mAU

0

200

400

600

0.6

49

0

.86

5

1.2

75

1.7

56

2.4

18

2.7

05

3.4

94

5.2

81

8.2

18

13

.04

1

← N = 27295, Presión = 386 bar

Eclipse Plus C18, 3.0 x 100 mm, 1.8 um

>90% de la Eficacia de una 1.8um

| Page 31

¿En qué tipos de instrumentos puede usar

Columnas Poroshell 120? HPLC’s y UHPLC’s

Consideraciones en UHPLC

• Las columnas Poroshell 120 tienen un límite de presión de 600 bar

• Los UHPLC están ajustados para columnas de bajo volumen, por lo tanto las

Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC

Consideraciones en HPLC

• Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar

• Minimize los volumenes extra columna para las columnas 2.1 y 3.0mm ID –

siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (1.8um, 600 bar)

• Use en el detector velocidades adecuadas de adquisición para picos

estrechos , de alta eficacia.

Page 31

| Page 32

Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea

Muestras Complejas- Plasma

Diflusinal in Plasma

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

1 501 1001 1501 2001 2501

Injections

Pre

ssu

re

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Eff

icie

ncy (

N)

End Press

Plates

Columna: Poroshell 120 EC-C18, 3.0 x 50mm, 2.7um LC: Agilent 1200 RRLC (SL)

Muestra: Plasma Precipitado: 2 partes Plasma: 7 Partes 20/80 Agua-MeCN w/0.1 % Ácido Fórmico con 1 Parte de Diflusinal en

50/50 Agua-MeCN 10 ug/ml (Concentracion Final Diflusinal 1 ug/ml) Agitado y dejado reposar 10 minutos

No Centrifugado/ No Filtrado

Volumen de Inyección: 1ul

Solvente A: Agua w/0.1 % TFA

Solvente B: MeCN w/0.08 % TFA

Flujo 1 ml/min 1 ul inyección

Tiempo % B

0 20

0.5 90

0.6 90

1.1 20

2.5 20

Page 32

'Diflusinal' es un anti-inflamatorio no esteroidal análogo

a la aspirina. desarrollado por Merck Sharp & Dohme .

| Page 33

Comparación de 4.6 x 250 mm 5 um con Poroshell

120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7um

min 5 10 15 20 25 30

mAU

0

20

40

60

80

100

9.7

12

11.1

16

11.5

96

12.6

74

15.2

48

16.1

51

16.4

35

20.6

87

23.0

76

29.2

90

min 5 10 15 20 25 30

mAU

0

50

100

150

200

250

1.7

19

2.1

89

2.3

11

2.6

06

3.8

67

4.4

37 4.5

58

5.4

50

5.9

20

7.0

37

Análisis más rápido(columna más corta, flujo más alto)

Mayor sensibilidad(partícula más pequeña,pico más estrecho)

Más optimizado (un análisis más rápido permite ajustar mejor)

Ambos análisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)

No se requiere cambio en la preparación de muestra, frita de entrada

de 2 micras en ambas columnas.

325 bar

110 bar

Sulfadiazina,

Sulfatiazol

Sulfapiridina

Sulfamerazina,

Sulfametazina,

Sulfametazol,

Sulfametoxipiridazina,

Sulfacloropiridazina

Sulfametoxazol,

Sulfadimetoxina

Tiempo %B

0 8

33 33

34 33

Columna: Eclipse Plus C18

4.6 x 250mm, 5um

Flujo: 1 mL/min

Fase Móvil:

A: 0.1% Ácido Fórmico en Agua

B: 0.1% Ácido Fórmico en ACN

Tiempo %B

0 8

12 33

13.2 33

Columna: 4.6 x 100mm

Poroshell 120 EC-C18,

2.7um

Flujo: 1.85 mL/min

Page 33

| Page 34

Comparación de 4.6 x 250 mm 5 um con Poroshell

120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7um

min 5 10 15 20 25 30

mAU

0

20

40

60

80

100

9.7

12

11.1

16

11.5

96

12.6

74

15.2

48

16.1

51

16.4

35

20.6

87

23.0

76

29.2

90

110 bar

5

mAU

0

50

100

150

200

250

1.7

19

2.1

89

2.3

11

2.6

06

3.8

67

4.4

37 4.5

58

5.4

50

5.9

20

7.0

37

325 bar

min

Ver condiciones en diapositiva anterior

Page 34

Mejor Resolución ,

linea base!!

| Page 35

Sumario

• La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta

Resolución y Alta Velocidad, que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC

• Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja

presión .

• Puede usarse con muestras sucias, sin ver una elevación anormal de la

presión.

• Puede usarse en un método USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de

Método.

Page 35