Análisis de la infectividad de un Begomovirus -...
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA Análisis de la infectividad de un Begomovirus bipartita (RhGMV-Sin) con un monopartita (TYLCV-Gve) y su interacción en infección mixta TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE PRESENTA Emmanuel Ortiz Espinoza GUASAVE, SINALOA; MÉXICO DICIEMBRE DEL 2013
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA
EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL
UNIDAD SINALOA
Análisis de la infectividad de un Begomovirus
bipartita (RhGMV-Sin) con un monopartita
(TYLCV-Gve) y su interacción en infección mixta
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN
RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA
Emmanuel Ortiz Espinoza
GUASAVE, SINALOA; MÉXICO DICIEMBRE DEL 2013
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AGRADECIMIENTO A PROYECTOS Y BECAS
El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de Biotecnología Agrícola del
Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR)
Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN) bajo la dirección del Dr. Jesús
Méndez Lozano. El presente trabajo fue apoyado económicamente a través del
proyecto SIP 20131613. El alumno Emmanuel Ortiz Espinoza fue apoyado con una
beca CONACYT con clave 418613, así mismo, por las becas otorgadas del IPN a
través de la Secretaría de Investigación y Posgrado (SIP).
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DEDICATORIA
Esta tesis la dedico a mi familia, que son el mejor ejemplo y el principal motor que me
impulsa cada día a ser mejor. Esta tesis va dedicada a ustedes:
A mi mama: Por darme la vida, por darme siempre lo mejor, por su amor incondicional.
. Mil palabras no bastarían para agradecer todo el apoyo y todo lo que han hecho por
mí. Gracias.
A mí papa: Que a pesar de no estar físicamente a mi lado, vive en mí y siempre me
acompaña en cada instante. Estoy seguro que se sentiría orgulloso de este logro, por
su memoria también dedico esta tesis.
.
A mi hermana: Por estar siempre a mi lado, por compartir momentos significativos
conmigo y por siempre estar dispuesta a escucharme y ayudarme en cualquier
momento. Por ser una persona que siempre me inspira a ser mejor y superar cada
obstáculo.
Espero hacerlos sentir orgullosas de mi es la mejor manera de demostrarles mi
agradecimiento y amor.
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AGRADECIMIENTOS
A Dios por darme la vida y guiarme siempre por el camino correcto.
A mi madre y mi hermana , quienes han estado conmigo en cada momento,
dado ánimos y muchísimas alegrías en mi vida, también por estar conmigo en
los momentos más difíciles, dándome ejemplos dignos de superación, entrega
y fortaleza, que nos han permitido salir adelante como familia a pesar de las
adversidades.
Al Dr. Jesús Méndez Lozano, por aceptarme como parte de su grupo de trabajo,
por compartirme toda su experiencia y parte de sus conocimientos, que me
ayudaron a crecer en mi vida profesional y personal. Pero sobre todo le
agradezco por su amistad, su confianza y por trasmitirme su pasión hacia el
apasionante mundo de la ciencia, así como guiarme en el camino correcto para
conseguir mis metas.
A la Dra. Norma Elena Leyva López y Dra. María Elena Santos Cervantes, por
aceptarme un tiempo en su laboratorio, por todos sus consejos para mejorar la
investigación y su apoyo en la revisión de este trabajo,
Al M.C. Juan Pablo Apún Molina y Dr. Miguel Ángel Apodaca Sánchez por
ayudarme, aconsejarme y apoyarme durante la realización de este proyecto.
A todos los profesores del CIIDIR-Sin que contribuyeron a mi formación
académica y profesional, gracias por compartir conmigo sus conocimientos y
preparación a lo largo de mi posgrado.
Agradezco a una persona muy especial, Lucina Romero Romero. Gracias por
todas sus enseñanzas, consejos, observaciones, paciencia, su confianza, pero
sobre todo por su amistad. Sin todo su apoyo no hubiera llegado hasta aquí.
viii
El éxito solo se logra cuando se encuentra rodeado de las personas correctas,
por eso agradezco a mis compañeros del laboratorio de Virología: Lucy, Erika,
Marco, Gustavo, Jesús, Marielos, Betty, Paulina, Rogelio, Karina, Josue Norma
Macías, Juan José, Hugo, Emanuel, Miriam, Clarisa, Jairo y Jarely. Les
agradezco por su apoyo en la realización de este trabajo, pero más que eso, les
agradezco por su amistad y por los buenos (y malos) momentos que vivimos
juntos, que al final son enseñanzas de vida y buenos recuerdos.
A mis compañeros y amigos de generación: Alda, Carmen, Mónica, Kike,
Andrés, Nataly, Jesús Quiroz, Daniel, Xiomara, Ulises y Enrique, asi como
amigos del laboratorio de Biologia molecular: Analilia, Nadia, Hector, Ernesto,
Zeiby, Paulina y Alicia. Igualmente a mis compañeros de acuacultura y medio
ambiente: Martin, Anayelli, Sarai, Violeta, Ricardo, Roberto, Nayelli, Rodo y
Alejandra, Viridiana y Lalo. Agradezco haber conocido a cada uno de ustedes y
haber iniciado este viaje junto, que ahora está por concluir, porque de cada uno
pude aprender algo nuevo y que con su compañía hicieron de cada día un
momento especial.
En general, a todo el personal del CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa, que de alguna
manera tuve la oportunidad de convivir con ellos y aportaron algo bueno durante
mi estancia en este centro
ix
ÍNDICE
GLOSARIO…………………………….………………………………………………………I
INDICE DE FIGURAS……………………………………………………………………….XI
INDICE DE CUADROS…………………………………….………………………………XII
RESUMEN………………..………………..………………..………………..…………….XIII
ABSTRACT………………………………………………………………………………...XIV
I. Introducción .......................................................................................................... 1
II. Antecedentes ........................................................................................................ 3
2.1 Horticultura en México .................................................................................... 3
2.1.1 Familia de las Solanáceas .......................................................................... 3
2.1.1.1 Importancia económica de las Solanaceas ............................................. 3
2.1.1.2 Producción nacional de las Solanáceas .................................................. 3
2.1.1.3 Factores que afectan al cultivo de las Solanáceas .................................. 4
2.2 Virus ............................................................................................................... 5
2.2.1 Generalidades ............................................................................................. 5
2.2.2 Virus Fitopatógenos .................................................................................... 5
2.2.3 Mecanismos de transmisión de los virus fitopatogenos .............................. 5
2.2.3.1 Transmisión mecánica ............................................................................. 5
2.2.3.2 Transmisión por órganos vegetativos ...................................................... 6
2.2.3.3 Transmisión por semilla y polen .............................................................. 6
2.2.3.4 Transmisión por vectores ........................................................................ 6
2.3 Enfermedades virales en plantas ................................................................... 7
2.4 Geminivirus .................................................................................................... 7
2.4.1 Familia Geminiviridae.................................................................................. 8
2.4.2 El género Begomovirus ............................................................................... 8
2.5 Organización genómica del género Begomovirus .......................................... 9
2.6 Ciclo viral ...................................................................................................... 11
2.6.1 Transmisión por el insecto vector ............................................................. 11
2.6.2 Replicación en células iniciales ................................................................. 12
2.6.3 Movimiento de los virus en la planta ......................................................... 12
2.6.4 Infección de Begomovirus en la planta ..................................................... 13
2.6.5 Enfermedades causadas por Begomovirus en el mundo .......................... 13
x
2.7 Infecciones mixtas en Begomovirus ............................................................. 14
2.8 Efectos de las infecciones mixtas ................................................................ 14
2.8.1 Recombinación de los Begomovirus ......................................................... 15
2.8.2 Efectos de las infecciones mixtas y su papel en la variabilidad genética y la
evolución de Begomovirus ..................................................................................... 15
2.9 Infecciones mixtas en el noroeste de México ............................................... 17
2.10 El Virus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate (TYLCV) .............. 17
2.10.1 Síntomas de TYLCV en tomate ................................................................ 17
2.10.2 Genoma de TYLCV ................................................................................... 17
2.10.3 Hospedantes alternos de TYLCV .............................................................. 18
2.11 Virus del mosaico dorado de la Rhynchosia Sinaloa (RhGMV-Sin) ............. 18
2.11.1 Síntomas de RhGMV-sin .......................................................................... 18
2.11.2 Hospedantes alternos de RhGMV-Sin ...................................................... 18
III. Justificación .................................................................................................. 19
IV. Hipótesis ...................................................................................................... 20
V. Objetivos ......................................................................................................... 20
5.1 Objetivo General .......................................................................................... 20
5.2 Objetivos específicos ................................................................................... 20
VI. Materiales y métodos ................................................................................... 21
6.1 Material vegetal ............................................................................................ 21
6.1.1 Obtención de plantas de Nicotiana benthamiana ...................................... 21
6.2 Obtención de DNA de RhGMV-Sin .............................................................. 21
6.2.1 Extracción de DNA total de plantas de Rhynchosia mínima ..................... 21
6.2.2 Detección molecular de Begomovirus mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR)................................................................................................... 22
6.2.3 Identificación preliminar de los Begomovirus por el patrón de restricción
RFLP……………….………………………………………………………………………24
6.2.4 Electroforesis en gel para la visualización de DNA ................................... 24
6.2.5 Obtención de material infectivo de RhGMV-Sin ........................................ 25
6.2.5.1 Amplificación por círculo rodante (RCA) ................................................ 25
6.2.5.2 Análisis de la presencia de RhGMV-Sin amplificado por RCA usando
enzimas de restricción ........................................................................................... 25
6.2.6 Obtención de material infectivo de TYLCV ............................................... 26
6.2.6.1 Liberación del fragmento de TYLCV con enzimas de restricción........... 26
xi
6.2.7 Inoculación por biobalística mediante un sistema de alta presión ............ 27
6.2.7.1 Preparación de partículas ...................................................................... 27
6.2.7.2 Impregnación de DNA a las partículas de oro ....................................... 27
6.2.7.3 Inoculación de las plantas ..................................................................... 28
6.2.8 Inoculación por biobalística mediante un sistema de baja presión ........... 28
6.2.8.1 Impregnación del DNA con las partículas de oro ................................... 29
6.2.8.2 Preparación de cartuchos ...................................................................... 29
6.2.8.3 Inoculación de las plantas ..................................................................... 30
6.2.9 Ensayo de infectividad de RhGMV-Sin en plantas de N. benthamiana .... 31
6.2.10 Ensayo de infectividad de RhGMV-Sin en tomate, tomatillo y chile .......... 31
6.2.11 Ensayo de infectividad de TYLCV-Gve en plantas de N. benthamiana .... 32
6.2.12 Ensayo de infectividad de TYLCV-Gve y su interacción con RhGMV-Sin en
N. benthamiana ...................................................................................................... 32
6.2.13 Identificación de Begomovirus por PCR/RFLP en plantas inoculadas por
biobalística ............................................................................................................. 33
VII. Resultados ................................................................................................... 34
7.1 Infectividad del Virus del mosaico dorado de la Rhynchosia (RhGMV-Sin) en
N. benthamiana ...................................................................................................... 34
7.2 Capacidad infectiva de RhGMV-Sin en plantas de la familia de la
Solanáceae………………………………………………………………………………..38
9
7.2.1 Infectividad de RhGMV-Sin en Tomate ........................................................ 40
7.2.2 Infectividad de RhGMV-Sin en tomatillo ....................................................... 41
7.2.3 Infectividad de RhGMV-Sin en chile ............................................................. 41
7.2.4 Infectividad de RhGMV-Sin en Nicotiana benthamiana y especies de la familia
de las Solanáceas .................................................................................................. 43
7.3 Infectividad de TYLCV-Gve en N. benthamiana ........................................... 45
7.4 Análisis de la interacción de TYLCV-Gve y RhGMV-Sin en infección mixta en
N. benthamiana. ..................................................................................................... 47
VIII. Discusión de resultados ............................................................................... 55
IX. Conclusiones ................................................................................................ 62
X. Perspectivas .................................................................................................. 635
XI. Bibliografía…………………………………………………………………………...646
GLOSARIO
Amarillamiento. Es la destrucción de la clorofila de los tejidos verdes. Normalmente
aparece previa, simultánea o después de la marchitez y muchas veces rodean tejidos
necróticos.
Ampicilina. Antibiótico derivado de la penicilina que interfiere con la síntesis de la
pared celular, impidiendo el crecimiento bacteriano. El gen asociado con la resistencia
a la ampicilina es muy usado en ingeniería genética como marcador de selección.
Amplificación. Aumento del número de copias de un gen o de una secuencia de DNA.
Bacteriófago. Son virus compuestos por un DNA de doble hebra relativamente largo,
cubierto por proteínas. Infectan las bacterias al inyectar su DNA y dejando fuera de la
bacteria sus proteínas. Aprovecha el aparato metabólico de la bacteria para la
replicación de su DNA.
Cápside. Cubierta proteica de un virus.
Ciclo agrícola. Recibe los nombres de las estaciones en que se realizan las siembra
de un cultivo (otoño-invierno y primavera verano).
Clonación. Involucra la modificación del genoma de una(s) célula(s) por incorporación
de un gen de interés. Las etapas comprenden la obtención del gen de interés, unión a
vector de clonación, introducción a célula(s) huésped y selección de células huésped
recombinantes.
Clonación in vitro. Emplea componentes celulares aislados para realizar la clonación
II
Clonación in vivo. Es aquella que se realiza en organismos vivos (casi siempre
microorganismos) para la reproducción del DNA.
Clonación molecular. Inserción de un segmento de DNA ajeno, de una determinada
longitud, dentro de un vector que se replica en un huésped específico.
Clona. Grupo de células o de organismos de idéntica constitución genética entre sí y
con el antepasado común del que proceden por división binaria o por reproducción
asexual.
Cromatina. Molécula lineal continúa de DNA bicatenario y proteínas.
Cromosomas homólogos. Cromosomas parcialmente similares por derivar de un
cromosoma ancestral común del que luego se distanciaron en el curso de la evolución.
Desnaturalización de ácidos nucleicos. Se refiere a la conversión de secuencias de
DNA doble hebra o RNA doble hebra a secuencias de hebra simple. Generalmente
ocurre por calentamiento.
Desoxiribonucleótido. Monómero del DNA formado por la unión covalente de una
base (A, T, G, C) + azúcar (2' deoxiribosa) + fosfato.
Didesoxinucleótido. Nucleótido modificado que en posición 3' ha perdido el grupo
OH. Se simboliza como ddNTP.
DNA (ácido desoxirribonucleico). Polímeros compuestos de cuatro unidades
moleculares diferentes, denominadas desoxirribonucleótidos (abreviados A, G, C y T)
III
que contienen el azúcar desoxirribosa. Los genes son parte de las moléculas de DNA
y su codificación viene está por la secuencia de los desoxirribonucleótidos.
DNA bicatenario. DNA compuesto de una doble cadena.
DNA Ligasa. Enzima que une extremos de las cadenas de DNA, mediante la
formación de enlaces fosfodiéster entre ellos.
DNA Polimerasa. Enzima que agrega nucleótidos a una cadena de DNA en sentido
de 5´ - 3´, durante su replicación.
Electroforesis. Método de separación de moléculas consistente en someter la mezcla
a un campo eléctrico de manera que las moléculas migrarán de acuerdo a su tamaño
y su carga eléctrica. Se puede utilizar para separar o purificar proteínas o fragmentos
de RNA o DNA.
Enfermedad. La enfermedad es cuando una o varias de las funciones de las células
y tejidos del hospedante son alteradas por patógenos o por determinadas condiciones
del ambiente en que se desarrollan. Esta alteración resulta de la irritación continua por
un agente patógeno o factor ambiental y que lleva al desarrollo de síntomas llega a
producir síntomas y es continua.
Enfermedad infecciosa. Enfermedad que es causada por un patógeno y que se
desplaza desde una planta enferma hasta una sana.
Enfermedad no infecciosa. Enfermedad que es producida por un factor ambiental,
no por un patógeno.
IV
Enzimas de restricción. Son endonucléasas de origen bacteriano, que constituyen
en estos organismos un mecanismo de defensa contra los DNA extraños. Las enzimas
de restricción se nombran de acuerdo con el microorganismo de donde provienen. La
primera letra, en mayúsculas, es la inicial de la especie; las dos letras siguientes, en
minúsculas, el género, seguida por un número romano de acuerdo con el orden de su
descubrimiento.
Gen. Fragmento de DNA en el que se contiene el código necesario para la síntesis de
una determinada proteína.
Genoma. Toda la información genética contenida en una célula, incluyendo a los
genes y a otras secuencias de DNA.
Hibridar. Producir un híbrido por complementariedad de bases entre un fragmento de
ácido nucleico de la muestra y un fragmento de ácido nucleico marcado, conocido
como «sonda»
Homólogo. Sustantivo jergal para designar cualquier molécula o segmento de ácido
nucleico (un gen, por ejemplo) cuya secuencia es idéntica a la de otro de referencia.
Horquilla de replicación. Durante la replicación, región del DNA en la cual las
cadenas progenitoras se separan y la DNA polimerasa copia los modelos originales.
Hortaliza. Las hortalizas son un conjunto de plantas cultivadas, generalmente, en huerta o regadíos, que se consumen como alimento, ya sea de forma cruda o cocida.
Infección. Establecimiento de un parásito dentro de una planta hospedante.
Injerto. Método de propagación de frutales sanos libre, o bien, de propagar y virus.
Consiste en que se unen dos tejidos cortados de diferentes plantas.
V
Inoculación. Arribo o transferencia de un patógeno sobre su hospedante.
Inoculación mecánica. Inoculación de un virus en una planta por medio de la
transferencia de savia de una planta infectada por un virus a una planta sana.
Inóculo. Patógeno o partes de él que causan infección; partes de los patógenos que
entran en contacto con el hospedante.
Inóculo primario. Patógeno o esporas de éste que sobreviven al verano o invierno y
que causan la infección primaria.
Inóculo secundario. Inóculo que se produce por las infecciones que ocurren durante
una misma estación de crecimiento.
Intercelular. Entre las células.
Intracelular. Que se localiza dentro de las células.
Invasión. Diseminación de un patógeno en su hospedante.
In Vitro. Significa que ocurre fuera del organismo vivo, en una ambiente artificial.
In Vivo. Significa que ocurre en el organismo vivo.
Kilobase (Kb). Unidad de longitud de ácidos nucleicos correspondiente a 1000
nucleótidos. Se abrevia como kb para ácidos nucleicos de hebra simple hebra.
VI
Mapa de restricción. Conjunto de puntos de corte que un DNA desde el de un
plásmido hasta un cromosoma entero tiene para un conjunto de endonucleasas de
restricción.
Marcador molecular. Cualquier segmento de DNA cuya secuencia nucleotídica varía
(es polimórfica) en distintos organismos y que por eso mismo puede servir para
reconocerlos.
Marchitez. Pérdida de la turgencia de los tejidos. Es causada por cualquier patógeno
o condición ambiental que impida la normal absorción y/o translocación de agua a las
raíces.
Monocultivo. Siembra frecuente o continuada de la misma especie en el mismo
predio.
Nucleótidos. Unidades o eslabones moleculares elementales, que enlazados uno a
continuación de otro, constituyen los ácidos nucleicos. Químicamente están formados
por un azúcar, un grupo fosfato y una base nitrogenada.
Oligonucleótidos. Mezcla necesaria para amplificar una región genómica específica,
cuya secuencia nucleotídica se ha deducido a partir de la secuencia de aminoácidos
conocida de la proteína, pues un mismo aminoácido puede estar codificado por más
de un triplete o codón. Está compuesto de un número idéntico de nucleótidos que tiene
una secuencia nucleotídica básica en común con el resto de los componentes de la
misma, pero difiere en ciertas posiciones.
Oligonucleótido degenerado. Suele referirse a una mezcla de cebadores de
composición básica similar, pero cuya secuencia nucleotídica varía en ciertas
posiciones (oligonucleótido degenerado).
VII
Organismo. Entidad biológica capaz de reproducirse o de transferir material genético,
incluyéndose dentro de este concepto a las entidades microbiológicas, sean o no
celulares. Todo organismo está formado por células, que pueden agruparse o no, en
órganos y éstos a su vez en sistemas, cada uno de los cuales realizan funciones
específicas.
Origen de replicación. Sitio específico del DNA en el cual se inicia su replicación.
Pares de bases (pb). Pares de bases (nucleótidos) complementarias en una molécula
de DNA o RNA.
PCR (del inglés “Polymerase Chain Reaction”). Reacción en cadena de la
Polimerasa. Sistema de amplificación genética que permite obtener millones de copias
de un determinado fragmento de DNA o RNA del que simplemente se conozcan dos
secuencias que lo flanqueen.
Polimerasa. Sistema de amplificación genética que permite obtener millones de
copias de un determinado fragmento de DNA o RNA del que simplemente se conozcan
dos secuencias que lo flanqueen.
Polimerasa (de DNA o RNA). Enzimas encargadas de sintetizar DNA o RNA a partir
de una cadena simple de DNA o RNA que actúa como molde.
Potenciador. Dominio de DNA en la región reguladora de un gen que aumenta la
transcripción independientemente de su orientación o posición.
Plásmido. Molécula de DNA cerrada, circular, que se multiplica de forma autónoma
en la célula y puede pasar de unas células a otras. Es bastante común en las bacterias.
VIII
Replicación de DNA. Síntesis de dos nuevas dobles hélices de DNA, a partir de una
doble hélice. Cada hebra de la doble hélice original actúa de molde para la síntesis de
una hebra complementaria.
RFLP (Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción). Este
procedimiento consiste en extraer el DNA y fragmentarlo mediante el uso de enzimas
de restricción. Como resultado se obtiene un grupo numeroso de fragmentos de DNA
de diferente longitud que pueden ser separados por electroforesis en un agarosa.
Resistencia. Capacidad que tiene un organismo para superar, totalmente o hasta
cierto grado, el efecto de un patógeno u otro factor perjudicial.
Resistente. Que tiene las cualidades para impedir el desarrollo de un determinado
patógeno. Que no es infectado o si lo es, en grado mínimo.
RNA (ácido ribonucleico). Polímero compuesto de cuatro unidades moleculares
diferentes denominadas ribonucleótidos (abreviados A, G, C y U), que contienen el
azúcar ribosa.
Secuenciación. Proceso que consiste en determinar el orden de los desoxinucleótidos
en la molécula del DNA. El DNA que se va a secuenciar (DNA molde) puede estar
introducido en un vector, o bien puede proceder de una amplificación por el método de
la PCR, y debe estar desnaturalizado.
Secuencia. Forma en que se encadenan los nucleótidos a lo largo de las cadenas de
DNA o RNA (o los aminoácidos en las cadenas proteínicas).
Taq polimerasa. Enzima obtenida del microorganismo Thermus aquaticus. Es la DNA-
polimerasa más utilizada en la PCR.
IX
Sinergismo. Parasitismo concurrente que sufre un hospedante por dos patógenos, en
el que los síntomas u otros efectos producidos son más notables que en el caso del
conjunto de síntomas que causa cada patógeno por separado.
Síntoma. Reacciones o alteraciones internas y externas que sufre una planta como
resultado de su enfermedad.
Susceptibilidad. Incapacidad de una planta para resistir el efecto de un patógeno u
otro factor perjudicial.
Susceptible. Cualquier planta que es atacada por un determinado patógeno; una
planta hospedante. Que carece de la capacidad inherente de resistir a las
enfermedades o al ataque de un cierto patógeno; no inmune.
Termociclador. Instrumento que permite ejecutar en forma automatizada la técnica
de PCR. Al aplicar ciclos térmicos secuenciales ocurre la desnaturalización, hibridación
y síntesis de DNA.
Tolerancia. Capacidad que tiene una planta para soportar los efectos de una
enfermedad sin que muera, sufra daños serios o se pierda la cosecha. Es también la
cantidad de residuos tóxicos tolerables en los órganos comestibles de la planta.
Toxina. Compuesto que producen los microorganismos y que es tóxico para las
plantas y los animales
Traducción. Proceso celular en el cual la molécula del RNAm dirige la síntesis de las
proteínas durante el ciclo celular.
X
Transcripción. Proceso celular en el cual la información del DNA es copiado en una
molécula de RNAm.
Vector. Molécula de DNA que puede replicarse autónomamente dentro de una célula
hospedera, de la cual puede aislarse de forma pura para su análisis.
Virulencia. Grado de patogenicidad de un patógeno determinado.
Virulento. Capaz de causar una enfermedad severa; notablemente patogénico.
Virus. Organismos no celulares que están formados por ácidos nucleicos (DNA o
RNA) y una proteína (cápside) que protege al virus. Sólo pueden reproducirse dentro
de una célula huésped (procarionte, eucarionte vegetal, eucarionte animal).
Virus circulantes. Virus que los vectores adquieren a través de sus partes bucales,
que se acumulan internamente en ellos, pasan a través de sus tejidos y se introducen
nuevamente en las plantas mediante las partes bucales de los vectores.
Virus latente. Virus que no induce la aparición de síntomas en su hospedante.
Virus propagativo. Virus que se multiplica en su insecto vector.
Vórtex. Aparato que sirve para agitar vigorosamente mediante vibración a distintas
soluciones y/o objetos en un laboratorio.
XI
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Organización genómica de Begomovirus monopartitas y bipartitas,
constituido por un DNA-A y DNA-B……………………………………………………….11
Figura 2. Obtención de DNA infectivo de monómero de TYLCV-Gve………......…..27
Figura 3. Técnica de biobalística con un sistema de alta presión PDS1000………..29
Figura 4. Técnica de biobalística con sistema de baja presión…………………........32
Figura 5. Obtención de material infectivo de RhGMV-Sin…….……….…....……..….36
Figura 6. Ensayo de infectividad de RhGMV-Sin en Nicotiana benthamiana ……....37
Figura 7. Escala de severidad desarrollado con base a la caracterización de los
síntomas observados en Nicotiana benthamiana después de la inoculación del virus
RhGMV-Sin…………………………………………………………………………….…….38
Figura 8. Caracterización de síntomas después de la inoculación del virus RhGMV-
Sin en plantas de Nicotiana benthamiana……………………………..…....................39
Figura 9. Ensayo de infectividad de RhGMV-Sin en tomate híbrido o cultivar
Sun6200…………………………………………………...…………………….…………..40
Figura 10. Ensayo de infectividad de RhGMV-Sin en tomatillo variedad
maya.......................................................................................................................….41
Figura 11. Ensayo de infectividad de RhGMV-Sin en tomatillo híbrido o cultivar
Querétaro…………………………………..……………………………………………..….43
XII
Figura 12. Ensayo de infectividad de RhGMV-Sin en Chile híbrido o cultivar Joe
Parker..........................................................................................................................44
Figura 13. Ensayo de infectividad de TYLCV-Gve en Nicotiana
benthamiana…………………………………………………………………………….…..47
Figura 14. Análisis de la interacción de TYLCV-Gve y RhGMV-Sin en infección mixta
con Nicotiana benthamiana……………………….………..………....……………...…..49
Figura 15: Segundo ensayo de interacción de TYLCV-Gve (monómero) y RhGMV-Sin
(obtención por RCA de N. benthamiana inoculada) en infección mixta con N.
benthamiana………………………………………………………………………………..…51
Figura 16. Desarrollo de síntomas y análisis molecular por PCR/RFLP de plantas de
Nicotiana benthamiana inoculadas con RhGMV-Sin y TYLCV-Gve a los 28
dpi……………………………………………………..……………………………….…..…52
Figura 17. Desarrollo de sintomatología en plantas de Nicotiana benthamiana
inoculadas con RhGMV-Sin y TYLCV-Gve en infección simple y en infección
mixta………………………………………………………………………………………….54
XIII
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Clasificación taxonómica de la familia Geminiviridae……………………...9
Cuadro 2.- Secuencia de oligonucleótidos utilizados para la detección molecular de
begomovirus monopartitas y bipartitas………………………………………………...…24
Cuadro 3.- Escala de severidad de RhGMV-Sin en Nicotiana
benthamiana………………………………………………………………………………...38
Cuadro 4.- Infectividad de RhGMV-Sin en Nicotiana benthamiana y miembros de la
familia de las Solanáceas…………………………………………………...……………..45
Cuadro 5.- Análisis de la interacción de TYLCV-Gve y RhGMV-Sin en infección
simple y en infección mixta en Nicotiana benthamiana…………………..............…...55
XIV
RESUMEN
La horticultura es seriamente afectada por agentes patógenos como los
begomovirus. En el 2005, se reportó al Virus del enrollamiento de la hoja amarilla del
tomate aislado de Guasave (TYLCV-Gve), un begomovirus monopartita que causó
pérdidas en la agricultura en el estado de Sinaloa, México hasta de un 100%. En años
recientes se ha detectado infecciones mixtas entre TYLCV-Gve con begomovirus
bipartitas nativos con efectos negativos en el cultivo del tomate. El objetivo de este
trabajo fue analizar la interacción entre TYLCV-Gve y el Virus del mosaico dorado de
Rhynchosia, aislado Sinaloa (RhGMV-Sin), un begomovirus bipartita aislado de una
maleza ampliamente distribuida en el Estado. La infectividad de RhGMV-Sin se analizó
en Nicotiana benthamiana y en Solanáceas, como tomate, tomatillo y chile. El DNA
infectivo se obtuvo usando la técnica de la amplificación por círculo rodante (RCA),
para después inocular el DNA viral en las plantas mediante la técnica de biobalística.
En las plantas inoculadas se observó el desarrollo de síntomas. Las hojas inoculadas
y hojas emergentes fueron cortadas para estraer su DNA y después analizarlas para
la presencia de una infecciòn por begomovirus mediante PCR y RFLP. Los resultados
indican que RhGMV-Sin puede infectar N. benthamiana, desarrollando mosaicos y
ampollamientos severos a los 28 días después de la inoculación (dpi). Este virus no
infectó plantas de chile y tomate pero si tomatillo, detectando al virus en hojas
inoculadas. La clona monomérica de TYLCV-Gve obtenida a partir de RCA fue
infectiva en plantas de N. benthamiana. Para analizar el efecto de la infección mixta
entre TYLCV-Gve y RhGMV-Sin, éstos se amplificaron por RCA a partir de una planta
de tomate infectada por ambos virus; como una segunda estrategia, el DNA infectivo
de ambos virus se inocularon por separado en una misma planta de N. benthamiana.
La interacción de TYLCV-Gve y RhGMV-Sin mostró un sinergismo en plantas de N.
benthamiana, alcanzando una alta severidad a los 4 dpi, causando un enanismo y
limitando el crecimiento de la planta.
XV
ABSTRACT
Horticulture in Mexico is seriously affected by pathogens such as begomoviruses.
Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV-Gve) was reported in 2005, a monopartite
begomovirus who caused unprecedented damage in Sinaloa state, Mexico up to 100%.
In recent year, it has been found in mixed infection with native begomovirus causing
severe damage in tomato crop. The aim of this study was to analyze the interaction
between Tomato yellow leaf curl virus-Guasave (TYLCV-Gve) and Rhynchosia golden
mosaic virus-Sinaloa, a bipartite begomovirus isolated from a widely distributed weed
in the state. Infectivity of RhGMV-Sin was analyzed in Nicotiana benthamiana and
Solanáceas crops, such as tomato, green tomato and pepper. Infective DNA was
amplified by rolling circle amplification (RCA) and followed of viral DNA inoculation by
biolistic procedure. Inoculated plants were observed every day for symptom
development. Begomovirus infection was analyze by DNA extraction, PCR and RFLP
from inoculated and emerging leaves. RhGMV-Sin is able to cause an infection in
Nicotiana benthamiana, develop severe blistering mosaic at 28 days post inoculated
(dpi). RhMGV-Sin did not induce an infection in pepper and tomato, but it can in green
tomato, amplifying virus in inoculated leaf. A monomeric clone of Tomato Yellow Leaf
Curl Virus (TYLCV-Gve) get by RCA was infectious in Nicotiana benthamiana plants,
develop yellowing, leaf curl and wrinkling in inoculated plants. Effect of mixed infection
between TYLCV-Gve and RhGMV-Sin was analyzed, both viruses was amplified
together by RCA from tomato infect plant, and as a second strategy, DNA infective from
both virus were inoculated in an individual Nicotiana benthamiana plants. TYLCV-Gve
and RhGMV-Sin interaction showed synergism in Nicotiana benthamiana plants in
mixed infection, reaching a high severity at 4 dpi, causing dwarfism and limiting the
growth of the plant.
1
I. INTRODUCCIÓN
En México la horticultura es una de las actividades agrícolas de mayor
importancia, tanto en el plano social como en el económico, por la captación de divisas
y la generación de empleos. El Estado de Sinaloa es uno de los principales productores
de tomate y chile con una producción de $3,070,433.17 y $ 2,971,847.14
respectivamente (SAGARPA, 2012). Una de las mayores limitantes de la producción
de este cultivo son las enfermedades virales, que se han incrementado en la última
década ocasionando reducciones de rendimiento de hasta 100%; los geminivirus son
probablemente los patógenos virales más importantes de las últimas décadas
(Martínez et al., 2006).
Los geminivirus son fitopatógenos que infectan a una amplia variedad de
plantas cultivadas y provocan anualmente grandes pérdidas económicas en las
regiones tropicales y subtropicales del mundo. En México, las primeras evidencias
sobre la posible presencia de geminivirus provienen de estudios en los estados de
Sinaloa y Sonora, con cultivos como el tomate, chile y frijol. Dentro de los geminivirus,
el género Begomovirus transmitido por mosca blanca se encuentra ampliamente
distribuidos en México, afectando diversos cultivos hortícolas. Ejemplos notables son
el Virus del chino del tomate (CdTV) (Brown y Nelson, 1988), el Virus del mosaico
dorado del chile (PepGMV) y el Virus huasteco de la vena amarilla del chile (PHYVV)
(Garzón-Tiznado et al., 1993; Torres-Pacheco et al., 1993; Torres- Pacheco et al.,
1996). Así mismo, se documentó que las malezas desempeñan un rol importante como
fuente de inóculo primario en la propagación y difusión de los virus que afectan a
plantas cultivadas. Recientemente, se han caracterizado begomovirus aislados de
plantas silvestres, como lo son el Virus del mosaico dorado de la Rhynchosia, aislado
Sinaloa (RhGMV-Sin) y el Virus del mosaico de la Sida Sinaloa (SiMSV) (Perea-Araujo,
2006; Méndez-Lozano et al., 2006).
2
La introducción del Virus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate,
aislado Guasave (TYLCV-Gve) en el agrosistema de Sinaloa en el 2005, favoreció las
interacciones entre begomovirus monopartitas y bipartitas en cultivos de importancia
agrícola y se desconocen los efectos que esta interacción tendría en la naturaleza, el
cual podría ser un mecanismo de evolución de estos begomovirus, originando nuevas
enfermedades (Orduño-Vega, 2010). Durante años, las investigaciones en Sinaloa se
han enfocado en caracterizar Begomovirus presentes en el estado, tanto en plantas
cultivables como en malezas. En el año 2010, se encontró a TYLCV-Gve en
coinfección con otros Begomovirus bipartitas, tanto en cultivos agrícolas como en
planta silvestres (Romero-Romero y Méndez-Lozano 2010, datos no publicados). Es
poco el conocimiento generado en cuanto al papel de estos virus y de su interacción
en infecciones mixtas en la emergencia de enfermedades más severas.
En este trabajo se implementó una estrategia basada en el uso de la
amplificación por círculo rodante (RCA) para determinar la infectividad de dos
begomovirus caracterizados en el estado, como lo son TYLCV-Gve y RhMGV-Sin en
plantas de Nicotiana benthamiana como planta modelo y en plantas de interés
comercial como tomate, tomatillo y chile, así como determinar su interacción en
infección mixta en plantas de Nicotiana benthamiana.
3
II. ANTECEDENTES
2.1 Horticultura en México
En México la horticultura es una de las actividades agrícolas de mayor
importancia, tanto en el plano social como en el económico, por la captación de divisas
y la generación de empleos. Las principales hortalizas cultivadas en el país son: el
tomate rojo o jitomate, el chile, la papa y el tomatillo o tomate verde, las cuales
representan junto con las frutas el 10% de la superficie cosechada en el país
(SAGARPA, 2009). Las hortalizas mexicanas son de las pocas actividades que
mantienen una balanza comercial positiva dentro del sector rural (FAO, 2012).
2.1.1 Familia de las Solanáceas
Las familia de las Solanáceas están distribuidas en todo el mundo, incluyendo 96
géneros y alrededor de 2300 especies, en su mayoría cultivos de importancia agrícola
como la papa (Solanum tuberosum), la berenjena (Solanum melongena), importante
por su valor nutricional, el tomate (Solanunum lycopersicum) y el chile (Capsicum
annuum), además de plantas ornamentales (Aguilar-Meléndez et al., 2009).
2.1.1.1 Importancia económica de las Solanáceas
México ocupa el tercer lugar mundial, después de China y España, como
exportador de hortalizas, con una ganancia de 10.4 miles de millones de dólares en
productos agroalimentarios, donde dos terceras partes corresponden a hortalizas.
Cabe mencionar que veinte productos mexicanos de exportación se encuentran entre
los principales productos en el mundo. El cultivo del tomate destaca por su importancia
al ser el primer lugar en exportación en México (SAGARPA, 2012).
2.1.1.2 Producción nacional de las Solanáceas
El chile verde, tomate y papa se encuentran entre los 10 cultivos agrícolas con
mayor valor de producción en el ciclo agrícola 2012, obteniendo ganancias de 37, 109,
837.33 miles de pesos, por otro lado, cultivos como el tomatillo, pepino, y sandia
también se encuentran entre los principales cultivos con mayor producción en ámbito
nacional. El tomate destaca por su importancia en la producción en los Estados de
4
Sinaloa (23.35%), Baja California (11.22%), Jalisco (8.76%), Baja California Sur (5.48
%), Zacatecas (5.09 %), México (4.27%) y Oaxaca (4.10%). El resto de los estados
productores con menos del 4.0%, según datos de producción nacional de tomate del
2012 (SAGARPA, 2012).
2.1.1.3 Factores que afectan al cultivo de las Solanáceas
En sentido amplio, la enfermedad es cualquier anormalidad fisiológica o
perturbaciones en el crecimiento de una planta. La enfermedad puede ser causada por
agentes vivos (bióticos), incluyendo hongos y bacterias, o por factores abióticos
(ambientales), tales como la deficiencia de nutrientes, la sequía, la falta de oxígeno, la
temperatura excesiva, la radiación ultravioleta, o la contaminación (Freeman y Beattie,
2008).
Las plantas de las Solanáceas están expuestas a diversas plagas y
enfermedades que afectan de manera drástica la producción y calidad del fruto. Dentro
de las principales plagas se encuentran la araña roja (Tetranychus urticae), la mosca
blanca (Bemisia tabaci), pulgón (Aphis gossypii), trips (Frankliniella occidentales),
minador de la hoja (Liriomyza trifolii), orugas (Spodoptera exigua) (Agrios, 2005).
Igualmente en hábitats naturales las plantas están rodeados de una amplia variedad
de agentes patógenos. La familia de las Solanáceas están expuestas a un gran
número de bacterias como Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis,
Pseudomonas syringae p.v. tomato y Xanthomonas campestris p.v. vesicatoria (Xcv),
agentes causales de enfermedades como el cancro bacteriano, peca bacteriana y
mancha bacteriana, respectivamente (Espinoza, 2008). Otros patógenos que también
afectan algunas solanáceas son los fitoplasmas (Santos-Cervantes et al. 2008),
algunos nemátodos, como Pratylechus spp., Globodera spp y Meoloidogyne spp
(Franco, 2010) y los virus trasmitidos por mosca blanca (Álvarez-Ruiz et al. 2007;
Gámez-Jiménez et al., 2009; Ochoa, 2010).
5
2.2 Virus
2.2.1 Generalidades
En la antigüedad, la palabra “virus" era asociado a un principio infeccioso, o
una sustancia venenosa producida en el cuerpo como resultado de una enfermedad,
capaz de ser introducido en un humano o animal por inoculación y que tenía la
capacidad de desarrollar la misma enfermedad en ellos. Estudios realizados por Louis
Pasteur y Robert Koch, definió a los virus como entidades infecciosas que afectan
células vivas (Van y Dijkstra, 2006), los cuales se comportan como microorganismos,
pero requieren de células vivas para reproducirse, tienen funciones genéticas, y se
comportan como moléculas químicas, que consisten en ácido nucleico y una proteína
de la cápside, que forma una capa protectora alrededor del ácido nucleico. En los virus
que afectan plantas, el 80 % constituyen RNA de cadena sencilla, el 5% virus de RNA
de doble cadena y el resto son virus de DNA de cadena sencilla y doble (Agrios, 2005).
2.2.2 Virus Fitopatógenos
El conocimiento real sobre la diversidad de virus, y de la interacción en
infecciones mixtas entre ellos es limitada (Wren et al., 2006). En la actualidad, existen
más de 2000 especies de virus reconocidos en el mundo por el Comité Internacional
de Taxonomía de Virus (ICTV, por sus siglas en inglés) (ICTV, 2013).
2.2.3 Mecanismos de transmisión de los virus fitopatogenos
2.2.3.1 Transmisión mecánica
Algunos virus fitopatógenos tienen la capacidad de transmitirse
mecánicamente, principalmente por contacto o inoculación mecánica por abrasión
(Hull, 2002). En el campo, estos virus pueden trasmitirse a través de instrumentos
contaminados, manos, ropa, por contacto directo entre planta y planta, como
consecuencia de una manipulación rutinaria durante el cultivo (Hull, 2002).
6
2.2.3.2 Transmisión por órg anos vegetativos
Este tipo de transmisión ocurre cuando se utilizan tubérculos, esquejes, bulbos
o rizomas y brotes de plantas madre infectadas, así como con injertos con material
infectado. Esto representa una práctica hortícola importante para la propagación
vegetativa; pero, también es un método efectivo de transferencia de virus (Arce et al.,
1997).
2.2.3.3 Transmisión por semilla y polen
La transmisión por semilla constituye uno de los factores más importantes en
el desarrollo epidemiológico de algunos virus. Las semillas infectadas dan origen a
plántulas que representan una fuente de inóculo inicial temprana, que además se
encuentra uniformemente distribuido (Johansen et al., 1994). La gran mayoría de los
virus que se transmiten por semilla persisten en el embrión; el porcentaje de
transmisión depende de la raza del virus, el hospedante, las condiciones ambientales,
entre otros factores; su "longevidad" depende del hospedante, inóculo, condiciones de
almacenamiento y el período de almacenaje. Los virus asociados con las semillas son
acarreados de dos formas: como una infección o como una infestación. La infección
implica que el virus es llevado internamente, inmerso en los tejidos de la semilla y
cuando el virus es llevado superficialmente, se le conoce como infestación o
contaminación. La transmisión por semilla o polen se conoce como transmisión vertical
de virus y es importante para la supervivencia invernal de los virus (Hull, 2002).
2.2.3.4 Transmisión por vectores
La mayoría de los virus vegetales son transmitidos de planta a planta por agentes
vectores: insectos (pulgones, mosquitas blancas, trips), nemátodos, ácaros y hongos.
Estos agentes vectores son capaces de provocar heridas que hacen posible la
diseminación horizontal de los virus fitopatógenos. Los patógenos como virus,
fitoplasmas, bacterias vasculares fastidiosas y protozoarios, son llevados directamente
en las células de las plantas por sus vectores. Penetran en las plantas a través de
heridas producidas por ciertos vectores, aunque algunos virus y viroides entran
también a las plantas a través de heridas producidas por herramientas y otros factores.
7
Los insectos diseminan a los patógenos a distancias variables dependiendo del tipo
de insecto, la asociación que se establece entre éste y el patógeno, así como las
condiciones climatológicas predominantes, en particular el viento (Agrios, 2005).
2.3 Enfermedades virales en plantas
En un sistema agrícola los patógenos son los causantes de grandes pérdidas
en el rendimiento de los cultivos. Debemos recordar que un agente patógeno no tiene
un papel ecológico en particular y que algunos de ellos pueden variar en sus efectos
en las plantas. Por ejemplo, en el caso de virus, estos pueden ser comunes en plantas
asintomáticas, e incluso tener un efecto positivo en las plantas ornamentales
(Alexander, 2010). Actualmente existe un aumento en la aparición de nuevas
enfermedades debido a la influencia de diversos factores, donde las actividades
humanas, el cambio climático así como la evolución y una mayor severidad de las
epifitas virales, permiten la aparición de virus emergentes en regiones donde antes no
causaban daños a la agricultura (Jones, 2009). Un patógeno emergente se define
como el agente causal de una enfermedad infecciosa cuya incidencia es creciente
después de su aparición en una nueva población de hospedantes (Woolhouse et al.,
2005).
2.4 Geminivirus
Los geminivirus son virus fitopatógenos de DNA, que se están diversificando
y extendiendo rápidamente, considerados como una amenaza emergente en todo el
mundo (Varma et al., 2011). Este grupo de virus han sido identificados como
patógenos en plantas desde la antigüedad; sin embargo, las prácticas agrícolas
modernas han promovido la expansión y diversificación de las enfermedades
asociadas a estos patógenos (Saunder et al., 2003). Reciben su nombre debido a su
morfología donde parecen dos poliedros regulares idénticos unidos por uno de sus
lados; esta característica los distingue de todos los demás virus conocidos (Zhang et
al., 2001).
8
2.4.1 Familia Geminiviridae
La familia Geminiviridae es un grupo altamente diversificado de virus de
plantas, que incluye a 229 especies distribuidas alrededor del mundo de acuerdo al
Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV). Estos virus se establecieron como
familia desde 1978, pero fue hasta principios de 1990 cuando la diversificación y la
aparición de una gran cantidad de nuevas especies de estos virus en distintos sistemas
de cultivo alrededor del mundo tuvo su auge, directamente asociado a la capacidad
adaptativa de su insecto vector Bemisia tabaci (Brown, 2007). Está constituida por 7
géneros, que son los Becurtovirus (2 especies), Begomovirus (192 especies),
Curtovirus (3 especies), Eragrovirus (1 especie), Mastrevirus (29 especies),
topocovirus (1 especie) y Turncurtovirus (1 especie)
(http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp). La clasificación taxonómica de los
geminivirus está representado en el Cuadro 1, tomando como criterios principales la
organización genómica, plantas hospedantes y el insecto vector, además de un virus
tipo para establecer la nomenclatura de los géneros (Fauquet et al., 2003; Fauquet y
Stanley, 2005).
2.4.2 El género Begomovirus
Son pequeños virus de plantas con partículas gemelas, que son viriones
quiasi-isometricos encapsidados de genomas circulares de DNA de cadena sencilla
(DNAcs) característico de los begomovirus, su virus tipo es el Bean golden yellow
mosaic virus (BGYMV) y son transmitidos por mosca blanca (Bemisia tabaci) a plantas
dicotiledóneas (Brown et al., 2012). Consisten en virus con genoma monopartita o
bipartita que globalmente son clasificados en como begomovirus del nuevo mundo y
del viejo mundo (Briddon et al., 2010).
9
Cuadro 1: Clasificación taxonómica de la familia Geminiviridae
Fuente: ICTV, 2013; Hull, 2002
2.5 Organización genómica del género Begomovirus
Hay dos tipos de begomovirus reportados en el mundo: aquellos que tienen un genoma
monopartita, es decir, un DNA genómico circular de 2.7 Kb aproximadamente y los
begomovirus bipartitas, con dos genomas de DNA, de aproximadamente 2.6 Kb cada
uno, que se conocen como DNA-A y DNA-B (Figura 1) (Rojas et al., 2005; Fauquet et
al., 2008; Briddon et al., 2010).
El primer componente (DNA-A) está presente en todos los Begomovirus, y El
DNA A codifica las proteínas necesarias para la replicación del DNA viral, su
transcripción, además de regular la expresión de los genes de la planta (Gutiérrez,
2000). Contiene 5 genes que codifican para diversas funciones (Figura 1A): La
proteína viral de replicación (Rep) tiene una fuerte competencia con la secuencia
Género Genoma Planta hospedera Insecto Vector
Becurtovirus Monopartita Dicotiledóneas
Chicharritas
Curtovirus
Eragrovirus Monocotiledóneas Desconocido
Mastrevirus Monocotiledóneas y
dicotiledóneas
Trepadores de hojas Topocovirus Dicotiledóneas
Turncurtovirus Desconocido
Begomovirus Monopartita
Bipartitas
Dicotiledóneas Mosca blanca
(Bemisia tabaci)
10
repetida (GGTAG), que se encuentra en la región 3´ del DNA del hospedero. Tras la
unión con el origen de la replicación, la secuencia conservada de nucleótidos
(TAATATT-AC), libera 3 moléculas OH, que inician la replicación del círculo rodante
de la maquinaria de replicación del hospedante (Fontes et al., 1994); en este
componente se localizan también los genes que codifican la proteína de la cápside
(CP), la cual es indispensable para la transmisión del virus a través del insecto vector,
ya que es la proteína que encapsida al DNA.
La CP es determinante en la acumulación del DNA viral dentro de los tejidos
infectados, al ser la proteína viral más abundante, además de intervenir en la
regulación de la función de la replicación (Rep) (Singh et al., 2005); En Begomovirus
el marco de lectura del gen TrAP codifica para una proteína que transactiva la
expresión del gen de la proteína de la cápside y de la proteína de movimiento (MP),
además de tener la función de supresor de silenciamiento en TrAP para el caso de
begomovirus bipartitas y C2 para monopartitas (Bisaro, 2006); La proteína Ren es
codificada por el gen AC3, el cual es un factor de amplificación de la replicación viral y
está asociado en la acumulación de DNA viral, es por esto que se dice que Ren
potencia la replicación del DNA viral (Hanley et al., 1999; Ascencio-Ibáñez et al., 1999;
Rojas et al., 2005).
El segundo componente (DNA-B) contiene dos genes involucrados en el
movimiento de virus a través de la planta (Figura 1B). El marco de lectura abierto del
gen MP o BC1 codifica para una proteína involucrada en el movimiento célula a célula,
llamada proteína de movimiento (MP), localizada entre la pared celular y la membrana
plasmática por su afinidad con el DNA de cadena doble y sencilla. La MP puede alterar
el límite de exclusión de los plasmodesmos y en algunos virus, como el Squash leaf
curl virus (SqLCV), está involucrada en el desarrollo de síntomas (Lazarowitz, 1992).
El gen BV1 o NSP codifica para la proteína de transporte nuclear, la cual tiene afinidad
al DNA viral de cadena doble y sencilla, empaquetándolo y transportándolo del núcleo
al citoplasma y viceversa. Por otro lado el gen BC1 o MP codifica para la proteína de
movimiento (MP), la cual tiene afinidad con los plasmodesmos (Sanderfoot y
11
Lazarowitz, 1996; Link y Fuchs, 2005). El origen de la replicación de los Begomovirus
se encuentra en la región intergénica (IR), por un motivo situado en el sitio de unión
de la replicación y por una estructura tallo asa, que corresponde a la zona donde inicia
la escisión del DNA para iniciar la replicación por circulo rodante (Florentino et al.,
2008).
2.6 Ciclo viral
El ciclo infectivo del virus hace referencia a las diversas etapas que transcurren
desde que las partículas virales se internan en una célula susceptible, hasta que se
producen más partículas que infecten otras células (Vega-Arreguín y Rivera-
Bustamante, 2001).
2.6.1 Transmisión por el insecto vector
Los Begomovirus son transmitidos por Bemisia tabaci biotipo A y B, el cual es
un insecto trasmisor de más de 100 virus en plantas que se trasmiten de manera
circulativa persistente. El virus se adquiere cuando la mosca se alimenta de tejidos
infectados, en un periodo aproximado de 48 horas; una vez que las partículas entran
en el intestino, son transportados a la hemolinfa y después alcanzan la glándula salival.
Una vez que el virus invadió las glándulas salivares, si el insecto se alimenta de nuevo,
Ilustración 1
Figura 1. Organización genómica de Begomovirus monopartitas (A) y bipartitas (B),
constituido por un DNA-A y DNA-B. CP) Proteína de la cápside; Rep) Proteína asociada a
la replicación; TrAP) Proteína activadora de la transcripción; REn), Proteína potenciadora de
la replicación; MP) Proteína de movimiento y NSP) Proteína transportadora nuclear; RI)
Región intergénica.
B
DNA-A -A
DNA-B TYLCV
A
12
el virus se inocula en plantas sanas (Hunter et al 1998; Brown y Czosnek, 2002; Brown,
2007; Czosnek y Ghanim, 2011). Los Begomovirus pueden perturbar el ciclo celular y
el metabolismo primario de la mosca blanca, alterando su longevidad y fecundidad,
debido a la invasión de los ovarios y de los tejidos de grasa corporal. Así mismo, la
invasión de Begomovirus suprime la respuesta inmune de la mosca blanca (Luan et
al., 2011).
2.6.2 Replicación en células iniciales
Después de la inoculación del virus en la planta por el insecto vector, se inicia
el ciclo infectivo con la introducción del DNA viral al núcleo de la célula huésped, es
empaquetado dentro del nucleosoma, donde utiliza la maquinaria de la célula huésped
para sintetizar un DNA de doble cadena o forma replicativa (FR). La unión de Rep con
la secuencia conservada de nucleótidos (TAATATT/AC) es el punto de inicio de la
replicación por círculo rodante, donde las FR promueven la síntesis de un DNA de
cadena sencilla, que inicia el proceso de transcripción y amplificación de genomas
virales (Yadava et al, 2010). En una ronda de replicación el DNA de cadena simple,
puede ser convertido en un DNA de doble cadena o FR, para servir a una nueva ronda
de replicación o ser encapsidado como una partícula germinada (Jeske, 2007).
2.6.3 Movimiento de los virus en la planta
El primer paso para el movimiento de los Begomovirus en la planta se conoce
como movimiento célula-célula, en el cual la célula inicial donde se replicó el virus debe
trasladarse hacia células vecinas a través de los plasmodesmos, (Lucas, 2005). Para
realizar este procedimiento, necesitan de células con núcleo para replicarse, por lo
tanto requieren trasladarse a células acompañantes, y células del parénquima del
floema, las cuales están conectadas entre sí por los plasmodesmos (Lough y Lucas,
2006). Las proteínas de movimiento de los Begomovirus actúan aumentando el límite
de exclusión de los plasmodesmos y de esta manera pueden trasladarse de una
manera más eficiente de una célula a otra (Carrington, 1996; Sanderfoot y Lazarowitz,
1996). Una vez que los virus se encuentran en el floema, se pueden mover a través
de los elementos cribosos. Después de cruzar la pared celular, sigue un proceso de
13
interacción entre los componentes virales con el sistema de endomembranas y la red
del citoesqueleto, moviéndose a través de la célula, ya que la propagación de los
viriones necesitan entrar a las células con núcleo del floema para su replicación (Wege,
2007). Los Begomovirus se encuentran restringidos al floema, aunque también
invaden el mesófilo y la epidermis, o bien, pueden extenderse en tallos, raíces, flores
y frutos, pero no en semillas (Sudarshana et al., 1998).
2.6.4 Infección de Begomovirus en la planta
El resultado final de la movilización y de la amplificación de un DNA genómico
viral es la producción de síntomas asociados a la infección y una enfermedad causada
por Begomovirus. Sin embargo, muchas infecciones virales progresan de manera
eficiente y sin desarrollo de los síntomas (Yadava et al., 2010). El desarrollo de la
enfermedad es influenciada por la inducción de mecanismos de defensa de la planta,
la supresión para contrarrestar las estrategias virales, así como la interacción entre el
patógeno y la planta (Pallas y García, 2011).
En teoría, los virus pueden infectar todas las especies de plantas cultivadas y
silvestres. Sin embargo, los rangos de hospedantes de cada virus son variables,
pudiendo ser reducidos o amplios. La respuesta vegetal a una infección puede ser
desde asintomática hasta enfermedad severa y muerte de la planta, o en algunos
casos, en el lugar de infección se desarrollan lesiones localizadas (pequeños puntos
cloróticos y necróticos). En la mayoría de los casos, los virus se dispersan a través de
toda la planta causando una infección sistémica (Gergerich et al., 2004)
2.6.5 Enfermedades causadas por Begomovirus en el mundo
Los Begomovirus bipartitas tienen gran impacto en el mundo, afectando
cultivos como la yuca, algodón, granos, leguminosas y vegetales. Es un grupo de virus
que causan pérdidas económicas importantes, afectando directamente la producción,
sobre todo en regiones tropicales y subtropicales, donde existen altas poblaciones de
mosca blanca debido a falta de estrategias de control y de prevención de estas
enfermedades (Zinga et al., 2013). Los principales factores que contribuyen a la
14
aparición y propagación de nuevas enfermedades por geminivirus son la evolución de
variantes de los virus existentes, la aparición de la mosca blanca biotipo 'B' y el
aumento de la población de vectores (Varma y Balathi, 2003). Los Begomovirus
afectan gravemente la producción de alimentos alrededor del mundo, sobre todo en
países en desarrollo. Por ejemplo, en África, se calculan pérdidas de 2.7 millones de
toneladas en la producción anual de yuca, causadas por un complejo de begomovirus
que afectan este cultivo (Ilardi, 2012). La enfermedad del mosaico de la yuca tiene un
gran impacto en África y en islas del océano indico, causando severos daños (Patil y
Fauquet, 2009; Monde et al., 2010; Rwegasira y Rey, 2012; De Bruyn et al., 2012;
Sumil et al., 2012). Otra enfermedad asociada a Begomovirus monopartitas es la
enfermedad del amarillamiento de la hoja amarilla del tomate (TYLCD) que
actualmente es una de las enfermedades virales más devastadoras en tomate en el
mundo, causando daños hasta en un 100% de la producción (Morriones y Navas,
2000). En la actualidad, hay 10 especies aceptadas por el ICTV asociadas a esta
enfermedad, la cual tiene un amplio rango de hospedantes, que incluyen al tomate
(Solanum lycopersicum L.), frijol (Phaseolus vulgaris), chile (Capsicum annuum L.),
tomatillo (Physalis ixocarpa B.) Nicotiana tabacum, Nicotiana benthamiana, plantas
ornamentales y malezas (Díaz-Pendon et al., 2010; Gámez-Jiménez et al., 2010).
2.7 Infecciones mixtas en Begomovirus
Las infecciones mixtas entre dos o más virus fitopatógenos son comunes en
la naturaleza, y frecuentemente crean consecuencias biológicas y epidemiológicas
impredecibles (Syller, 2012). Las infecciones mixtas del género Begomovirus
transmitidos por mosca blanca son comunes en la naturaleza, encontrándose en
cultivos de importancia agrícola y plantas silvestres, sobre todo en regiones tropicales
y subtropicales (Torres, 1999; Sanz et al., 2000) y la interacción entre los patógenos
coinfectantes puede inducir diversos fenómenos potenciadores o atenuadores de la
virulencia (Carrington, 1995; Accotto et al., 2003; Jovel et al., 2004).
2.8 Efectos de las infecciones mixtas
En las plantas, el tipo de interacción entre dos o más virus coinoculados
pueden inducir diferentes efectos, como un sinergismo viral, donde uno de los virus
15
aumenta la infección de otro virus (Latham y Wilson, 2008; Rentería et al., 2011), o en
caso contrario, un antagonismo, donde el ciclo infectivo de un virus puede afectar el
ciclo infectivo del otro, disminuyendo la severidad de sus síntomas. Ambos procesos
pueden afectar significativamente la epidemiologia de las enfermedades que ocurren
en la naturaleza (Gómez et al., 2009).
2.8.1 Recombinación de los Begomovirus
Un evento que puede originarse como consecuencia de una infección mixta es
la recombinación genética, que es un mecanismo de evolución de los virus que les
permite adaptarse a nuevos hospedantes y así ampliar su rango. Estos eventos
pueden originar infecciones sinérgicas, adquisición de la capacidad de transmitirse
mecánicamente y un aumento en el movimiento a corta y larga distancia dentro de las
plantas (Latham y Wilson, 2007). Particularmente en el género Begomovirus, aquellos
individuos que comparten iterones idénticos pueden formar pseudo-recombinantes
viables entre el DNA-A y el DNA-B de dos Begomovirus distintos, o bien, formar
pseudo-recombinantes con mezclas tripartitas, donde pueden encontrarse a un
Begomovirus con sus dos genomas junto con el DNA-B de otro Begomovirus (Hou y
Gilbertson, 1996, Méndez-Lozano et al., 2003).
2.8.2 Efectos de las infecciones mixtas y su papel en la variabilidad genética y
la evolución de Begomovirus
En inoculaciones artificiales, los estudios de infecciones mixtas entre
Begomovirus son amplios. Un ejemplo son los estudios realizados por Alves y
colaboradores (2009), donde se estudió dos begomovirus que infectan al tomate en
Brasil, que son el Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) y Tomato yellow spot virus
(ToYSV), que fueron inoculados en plantas de tomate y Nicotiana benthamiana en
diferentes períodos de tiempo. Estudiando la replicación de ambos virus en infección
mixta, se encontró que el sinergismo no está asociado a la replicación viral. Inoculando
ambos virus simultáneamente, se encontró que ToRMV interfiere negativamente con
ToYSV durante las etapas iniciales de la infección, pero ToYSV facilita la infección
sistémica de ToRMV en las etapas más avanzadas de la infección. En N. benthamiana,
16
se encontró a ToYSV invadiendo el mesófilo y a ToRMV restringido al floema, en
cambio, en infección mixta con ToYSV, se detectó ToRMV invadiendo el floema. De
acuerdo a la evidencia de este trabajo, se concluyó que ToYSV está mejor adaptado
que ToRMV, y esta adaptación fue más evidente en N. benthamiana que en tomate.
La patogenicidad es otro de los factores que varían entre los Begomovirus
cuando se encuentran en infección mixta. En Begomovirus monopartitas del viejo
mundo, su virulencia se asocia a su interacción con partículas subvirales de beta o alfa
satélites (Dry et al., 1997). Sin embargo, en estudios realizados con Begomovirus
infectando rábano en la India, se encontró que el DNA-B puede sustituir a estas
partículas, durante el proceso de infección (Singh, 2012). De forma contradictoria,
Begomovirus asociados con beta-satélites al cultivo de tomate en Nueva Delhi,
inoculados en plantas de N. benthamiana, encontraron que el DNA-B de Begomovirus
interfiere negativamente con las partículas subvirales (Jyothsna et al., 2013).
La interacción entre el Virus huasteco del amarillamiento de la vena del chile
(PHYVV) y el Virus del mosaico dorado del chile (PepGMV) muestran como algunas
interacciones son dependientes del hospedante. Bajo condiciones controladas se
presenta un antagonismo en plantas de chile Capsicum annum (Rentería et al., 2011),
mientras que en N. benthamiana y N. tabacum ocurre un sinergismo cuando ambos
virus se inoculan al mismo tiempo. Por otro lado, se demostró que en mezclas
tripartitas, PHYVV DNA-A + DNA-B es capaz de trans-complementar en movimiento el
DNA-A de PepGMV, induciendo síntomas a los 30 dpi, pero PepGMV A no es capaz
de trans-complementar al PHYVV B (Méndez-Lozano et al, 2003). Este fenómeno se
conoce como trans-complementacion asimétrica y es un caso exitoso donde
infecciones mixtas pueden ocasionar síntomas más severos en su hospedante natural.
Otro caso es el Tomato yellow spot virus, un Begomovirus que infecta a tomate y que
en su secuencia tiene una alta homología con virus que infectan al género Sida spp,
sin embargo, no es capaz de formar pseudorecombinantes viables (Andrade et al.,
2006).
17
2.9 Infecciones mixtas en el noroeste de México
Una gran diversidad de Begomovirus has sido caracterizados en México en
los últimos años (Morales et al., 2006; García et al., 2010). En el estado de Sinaloa
hay una alta incidencia de infecciones mixtas, debido a que es una zona donde la
agricultura es una de las actividades predominantes, además, las condiciones
ambientales favorecen la presencia de Bemisia tabaci. En el 2005, con la llegada de
TYLCV al estado, las infecciones mixtas aumentaron considerablemente. En estudios
de variabilidad genética en los estados de Coahuila, Baja California, Durango y Nayarit
se encontró infecciones mixtas entre TYLCV y Begomovirus nativos previamente
descritos (Gámez-Jiménez, 2007, Orduño-Vega, 2010).
2.10 El Virus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate (TYLCV)
El virus TYLCV, tiene su centro de origen en Israel y a la fecha con una amplia
distribución mundial (Reza et al., 2013). Este Begomovirus monopartita se reportó en
el estado de Sinaloa en el ciclo agrícola otoño-invierno 2005-2006 causando daños y
pérdidas sin precedentes de hasta un 100% (Gámez-Jiménez, 2007).
2.10.1 Síntomas de TYLCV en tomate
Los síntomas que induce en plantas de tomate van desde enanismos, clorosis,
aborto floral, clorosis intervenal, acucharamiento de las hojas hasta la maduración
prematura de fruto (Gámez-Jiménez, 2007). El efecto negativo sobre la fruta
comúnmente ocurre en las primeras etapas del crecimiento, afectando el rendimiento
de la planta infectada (Orduño-Vega, 2010).
2.10.2 Genoma de TYLCV
Su genoma está compuesto de una molécula de DNA circular de cadena
sencilla que semeja al DNA-A de los Begomovirus bipartitas (Rochester et al., 1994).
A diferencia de los Begomovirus bipartitas, está documentado que la CP en TYLCV es
esencial para su infectividad, ésta proteína se une y envuelve al genoma localizado en
el núcleo de las células infectadas y se ha encontrado que tiene la capacidad de
exportar tanto ssDNA como DNA de cadena doble (sdDNA) (Gronenborn, 2007).
18
2.10.3 Hospedantes alternos de TYLCV
Se determinó, además que este virus tiene como a hospedantes alternos a los
cultivos de frijol, chile, papa, Jatropha, tomatillo y malezas como el estafiate, trebolillo,
correhuela, girasol, bledo y choal (Gámez-Jiménez, 2007; Orduño-Vega, 2009). Este
virus se encuentra ampliamente distribuido en el estado, tiene un amplio rango de
hospedantes y se encuentra en infección mixta con otros Begomovirus bipartitas, como
lo son el Tomato chino La Paz virus (ToChLPV) y CdTV (Orduño-Vega, 2009). También
se a detectado a TYLCV en coinfección con otros virus como Virus del chino del tomate
de la Paz en Baja California, afectando el cultivo de (Gámez-Jiménez 2007; Orduño
vega, 2009; Cárdenas et al., 2009).
2.11 Virus del mosaico dorado de la Rhynchosia Sinaloa (RhGMV-Sin)
El hospedante natural de este virus es la maleza Rhynchosia mínima. Se
describió por primera vez en Honduras en 1999 (Potter et al., 2000). En México, fue
reportado por primera vez en Chiapas, infectando tabaco y posteriormente fue
reportado infectando soya en el norte de Sinaloa (Ascencio-Ibañez et al., 2002;
Méndez-Lozano et al., 2006).
2.11.1 Síntomas de RhGMV-Sin
En las plantas de Rhynchosia mínima en campo se observan síntomas como
moteados, mosaicos intensos, amarillamientos intenso, así como la deformación de
las hojas, mientras que en cultivos de soya infectados por este virus, se observan
arrugamientos de las hojas, mosaicos moderados, y amarillamientos intenso (Perea-
Araujo, 2006).
2.11.2 Hospedantes alternos de RhGMV-Sin
El rango de hospedantes de RhMGV-Sin en cultivos de importancia agrícola
incluye a la papa (Gámez-Jiménez 2007), girasol, frijolillo y soya (Ruelas Ayala, 2007).
En cuanto al Begomovirus caracterizado en Sinaloa RhMSV, solo se encontró en
Rhynchosia mínima y en soya (Ruelas-Ayala, 2007).
19
III. JUSTIFICACIÓN
El impacto de los virus en la agricultura de Sinaloa históricamente es uno de
los problemas más importantes. Durante más de dos décadas se han detectado y
caracterizado diversos virus del género Begomovirus en cultivos agrícolas, y
recientemente en plantas silvestres. Entre los Begomovirus caracterizados en el
estado, se encuentra el virus RhGMV-Sin, cuyo hospedante natural es Rhynchosia
mínima, una maleza distribuida ampliamente en las regiones agrícolas del estado; sin
embargo, se desconoce si puede afectar otros cultivos de importancia agrícola. En el
2005, la introducción del virus TYLCV ocasionó pérdidas en la horticultura hasta de un
100%. Debido a su importancia, este virus fue caracterizado molecularmente en el
2007. Las medidas para su control se basa en el uso de variedades resistentes y el
control de la mosca blanca; sin embargo, estas medidas no han controlado el problema
por completo, siendo la alta incidencia de infecciones mixtas una posible causa de este
problema. En el 2011, se detectó en el cultivo de tomate en infección mixta a un
Begomovirus monopartita (TYLCV-Gve) y un bipartita (RhGMV-Sin) de forma natural.
Los efectos de este tipo de interacción son desconocidos, pues son pocos los trabajos
reportados hasta el momento, y en un futuro puede dar origen a nuevas enfermedades.
Esta interacción es un modelo de estudio interesante, ya que permitiría comprender el
impacto de un Begomovirus introducido que interacciona con un Begomovirus nativo
aislado de una maleza predominante. Analizar este tipo de interacción en el laboratorio
permitiría comprender sus efectos en la naturaleza y brindaría herramientas para
entender el papel de las infecciones mixtas como un mecanismo de evolución de
Begomovirus, además de ser un primer paso para la búsqueda de estrategias para su
control.
20
IV. HIPÓTESIS
La infectividad de un Begomovirus bipartita (RhGMV-Sin) y un monopartita
(TYLCV-Gve) induce una interacción sinérgica en infección mixta.
V. OBJETIVOS
5.1 . Objetivo General
Analizar la infectividad de un Begomovirus bipartita (RhGMV-Sin) y un
monopartita (TYLCV-Gve) y su interacción en infección mixta.
5.2 . Objetivos específicos
Determinar la infectividad del Virus del mosaico dorado de la Rhynchosia
Sinaloa (RhGMV-Sin) en Nicotiana benthamiana y en plantas de la familia de
las Solanáceas como tomate, tomatillo y chile.
Determinar la infectividad del Virus del enrollamiento de la hoja amarilla del
tomate (TYLCV-Gve) y su interacción en infección mixta con un Begomovirus
bipartita (RhGMV-Sin) en plantas de Nicotiana benthamiana.
21
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Material vegetal
6.1.1 Obtención de plantas de Nicotiana benthamiana
Se germinaron semillas de N. benthamiana bajo condiciones in vitro. Con este
fin las semillas se desinfectaron superficialmente con un lavado con etanol al 70% por
1 minuto; se lavó cinco veces con agua destilada estéril; luego inalmente se
sumergieron con hipoclorito de sodio al 30% por 15 minutos con agitación constante;
posteriormente se lavaron con agua destilada estéril; se dejaron secar en papel
estérilado, una vez secas, se colocaron en cajas magentas individuales, con 50 ml de
medio MS solido (Murashige y Skoog, 1962). Las cajas magentas con las semillas se
mantuvieron en una cámara bioclimática a 24°C con un fotoperiodo de 16 h luz y 8 h
oscuridad. Otro método de germinación consistió en geminar las semillas en una caja
Petri, con papel secante estéril, y con humedad constante. Después de su
germinación, las plántulas se transfirieron a vasos de poli estireno de ¼ de kg
conteniendo sustrato peat moss húmedo. Se mantuvieron en condiciones controladas
a temperatura de 25°C y con un fotoperiodo de 16 horas luz, 8 horas oscuridad. Todas
las semillas fueron proporcionadas por el Laboratorio de Virología y el Laboratorio de
servicio al productor del CIIDIR IPN Unidad Sinaloa.
6.2 Obtención de DNA de RhGMV-Sin
Se colectaron plantas de Rhynchosia mínima en un campo perteneciente al
municipio de Guasave, con sintomatología asociada a virosis, las cuales se analizaron
para la presencia de Begomovirus mediante técnicas moleculares, con el fin de obtener
una fuente de inóculo inicial del virus RhGMV-Sin.
6.2.1 Extracción de DNA total de plantas de Rhynchosia mínima
Se realizó una extracción de DNA total de las plantas, utilizando el método del
CTAB 3%. Se molieron 0.3 gramos (gr) de tejido fresco, o bien 0.02gr de tejido
liofilizado con ayuda del Buffer CTAB (bromuro de cetil-trimetil-amonio) al 3% (CTAB:
22
3%, NaCl 1.4 molar (M), EDTA 20 milimolar (mM), Tris-HCL 100mM, pH 8,
mercaptoetanol 0.2%). Luego se agregó 200 microlitros (μl) de buffer precalentado a
60°C a cada muestra, después el tejido y el buffer se molieron con ayuda del equipo
“Tissue Lyser” con esferas metálicas de 5 milimetros (mm) para una correcta ruptura
del tejido; posteriormente se adicionó 600μl más de buffer y se incubó la mezcla a
60°C por 30 minutos con agitación constante cada 5 minutos para una mejor
homogenización. Consecutivamente, se agregó 600 μl de cloroformo:alcohol
isoamílico (24:1) a cada una de las muestras; se homogenizó por inversión del tubo.
Se centrifugó a 13,000 revoluciones por minuto (rpm) por 10 minutos para formar 2
fases: la fase superior (fase acuosa que contenía el DNA) se transfirió a un tubo nuevo
previamente marcado, cuidando de no tomar la fase inferior ya que aquí se encuentran
los restos de la fase orgánica. Enseguida se precipitó el DNA, adicionando isopropanól
al 100% a -20°C (un volumen igual al tomado de la fase superior recuperada), se agitó
por inversión y se centrifugó a 13,000 rpm durante ocho minutos, posteriormente se
decantó el sobrenadante. La pastilla se lavó con 1 mililitro (ml) de etanol al 70%
(previamente almacenado a -20°C) y se centrifugó a 13,000rpm por tres minutos y se
decantó el sobrenadante, conservando la pastilla en el tubo. Se dejó secando
perfectamente la pastilla y se resuspendió en 30μL de agua estéril bidestilada.
Finalmente las muestras se almacenaron a -20°C para su posterior análisis.
6.2.2 Detección molecular de Begomovirus mediante la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR)
Para detectar molecularmente a los Begomovirus, se realizó la PCR con
oligonucleótidos degenerados, que contenían variantes de nucleótidos en ciertas
posiciones del genoma. Estos oligonucleótidos están diseñados sobre una región
conservada en el DNA-A de Begomovirus caracterizados en el nuevo y el viejo mundo.
Este diseño de oligonucleótidos permitió diferenciar entre Begomovirus monopartitas
y bipartitas, de acuerdo al fragmento amplificado. El par de oligonucleótidos Rep-
DGRSAR (XbaI) /PC70-BamH1 amplificaron la región amino-terminal de la Rep hasta
el amino-terminal de la CP. La amplificación con dichos oligonucleótidos generó un
fragmento de 915 y 1,100 pares de bases (pb) para Begomovirus biparitas y
23
monopartitas, respectivamente (Mauricio-Castillo et al., 2010). Para aumentar la
sensibilidad en la detección se utilizó el PCR anidado con los oligonucleótidos Mot y
CP, los cuales amplifican un fragmento interno de aproximadamente 650pb y 750pb
en Begomovirus bipartitas y monopartitas respectivamente (Ascencio-Ibañez et al.,
1999).
El volumen final de la mezcla, en ambos casos, fue de 25 μl, en el cual se
adicionó 1µl de DNA total, buffer de reacción 10X, MgCl2 50 mM, dNTPs 10 mM, 10
picomol por microlitro (pmol/μL) de cada oligonucleótido y 0.5 unidades de enzima
Taq DNA polimerasa (Invitrogen, USA). Las condiciones de amplificación que se
utilizaron fueron: una desnaturalización inicial a 94°C por 2 minutos y 35 ciclos
conformados por 95°C por 1 minuto a 55°C, 72°C por 2 minutos, con una extensión
final de 72°C por 4 minutos. Los productos amplificados se analizaron por movilidad
electroforética en un gel de agarosa al 1%.
Cuadro 2: Secuencia de oligonucleótidos utilizados para la detección molecular de
Begomovirus del nuevo y del viejo mundo por PCR.
Técnica Nombre
oligonucleótido
Fragmento
esperado
Secuencia
PCR
Simple
DGRSAR 915-1100 pb GAGTCTAGATGCTGACCTCCTCTAGCWGATC
TGCCGTC
CP70-Bam HI 915-1100 pb CACGGATCCGATTGRACCTTACANGGNCCTTC
ACAACC
PCR
Anidado
Mot 650-750 pb GAGTCTAGAGGATANGTRAGGAAATARTTTGG
C
Cp 650-750 pb CGCGAATTCGACTGGACCTTACATTGGNCCTC
AC
Ascencio-Ibañez et al., 1999; Mauricio-Castillo, et al., 2007
24
6.2.3 Identificación preliminar de los Begomovirus por el patrón de restricción
RFLP
Para identificar preliminarmente los Begomovirus amplificados por
comparación de fragmentos obtenidos (RFLP), se realizó una digestión enzimática con
las enzimas MspI y/o HhaI en un volumen total de 10 µl, el cual consistió en una mezcla
del producto de PCR, buffer de reacción 10 X y 0.2 unidades de enzima. La reacción
se incubó por dos horas a 37°C. Para determinar la identidad del Begomovirus se corrió
un gel de agarosa al 1%, y se comparó con un mapa virtual generado por Ruelas-Ayala
en el 2007.
6.2.4 Electroforesis en gel para la visualización de DNA
Para la visualización del DNA y para verificar su calidad, se prepararon geles
de agarosa: al 0.8% para DNA total, 1% para productos de PCR y de 1.5% para RFLP.
Se disolvió la agarosa en 100 ml de TAE 1X (Tris–acetato 40mM pH 8.0, EDTA 1mM),
aplicando calor mediante un horno de microondas, esta mezcla se vertió en la base de
la cámara de electroforesis con un peine para formar los pozos y se dejó enfriar, se
agregó bromuro de etidio (10 mg/ml) para marcaje del DNA. Una vez gelificada la
agarosa, se depositó en la cámara de electroforesis conteniendo buffer TAE 1X. En
cada pozo se cargaron 2 μl de DNA en el gel con 2 μl de colorante naranja G (Glicerol
30%, EDTA 25mM pH 8.0, colorante naranja G 0.025%) y 6 μl de agua destilada estéril;
se colocó la mezcla en cada pozo con la ayuda de una micro pipeta. Para iniciar el
proceso de electroforesis, se utilizó una fuente de poder a 80 Volts (V) durante 30
minutos para el caso del DNA y 80 V durante 50 minutos como mínimo para los
productos de PCR y digestiones. Se visualizó y documentó el gel en el sistema Gel-
Doc (BioRad) y la imagen se manejó con el software Quality-One (BioRad, E.U.A.).
25
6.2.5 Obtención de material infectivo de RhGMV-Sin
6.2.5.1 Amplificación por círculo rodante (RCA)
El DNA genómico circular de RhGMV-Sin se amplificó por RCA usando el
TempliPhi Amplification kit. A un volumen de 4 µl del DNA total extraído de la planta se
agregaron 5 µl de buffer, esta mezcla se calentó a 95°C por 3 minutos para
desnaturalizar al DNA. Se aplicó un choque térmico en hielo, después se combinó con
una nueva mezcla, que contenía 5 µl de buffer de reacción más 2 µl de la mezcla de
la enzima que contiene la Phi29 DNA polimerasa y hexámeros aleatorios en 50% de
glicerol. La mezcla de la reacción se incubó por 20 horas a 30°C. Para desactivar la
enzima se calentó la mezcla a 65°C por 10 minutos. Los productos de RCA se
observaron en un gel de agarosa al 0.8% y posteriormente se almacenaron por no más
de tres días a 4°C.
6.2.5.2 Análisis de la presencia de RhGMV-Sin amplificado por RCA usando
enzimas de restricción
Con el fin de confirmar la amplificación de RhGMV-Sin, se realizó un análisis
de la secuencia reportada en el Gen Bank (Clave de Acceso DQ347950) tendiente a
determinar las enzimas con sitio de corte único en el DNA-A y en el DNA-B. Para
seleccionar las enzimas, se usó el software Seq Builder del paquete DNASTAR. Las
enzimas seleccionadas para el DNA-A fueron XbaI y XhoI, mientras que en el DNA-B,
se usaron las enzimas PstI y BamHI. En un tubo se mezclaron 1 µl del buffer IX de
cada enzima, 1 µl de la enzima (10 Unidades por microlitro (U/µl), y 2-4 µl de DNA
obtenido por RCA, por último se llevó a un volumen final de 10 µl con agua bidestilada
estéril. La reacción se incubó a 37°C por 2 horas y se visualizó por electroforesis en
gel de agarosa al 0.8 %, teñido con bromuro de etidio y el marcador de peso molecular
1 Kb Plus Lader como marcador de peso molecular (Invitrogen, USA). El producto
esperado de la digestión fue una banda de 2.6 a 2.8 kb, que corresponde al genoma
del DNA-A o en su caso, el DNA-B.
26
6.2.6 Obtención de material infectivo de TYLCV
6.2.6.1 Liberación del fragmento de TYLCV con enzimas de restricción
A partir del DNA monómero del TYLCV proporcionado por el Laboratorio de
Virología (Figura 2A) se llevó a cabo la liberación del fragmento del DNA de TYLCV-
Gve del vector pNEB193 mediante una digestión con la enzima XbaI (invitrogen, USA),
obteniéndose un fragmento de 2781 pb para TYLCV-Gve y de 2713 pb para el vector
(Figura 2B2). Realizando esta digestión es la manera previamente reportada para
obtener un DNA infectivo. Siguiendo las instrucciones del proveedor, se agregó para
una reacción de digestión 10 unidades de enzima XbaI, 1 µl del buffer, y una
concentración de 1 µg de DNA plasmídico (Figura 2B-1), para un volumen total de 10
µl de reacción. Se incubó por 2 horas a 37 °C, y el producto digerido se corrió en un
gel de agarosa al 0.8%. El DNA plasmídico digerido se usó en los ensayos de
infectividad.
Figura 2: Obtención de DNA infectivo de monómero de TYLCV-Gve: A: Genoma de
TYLCV-Gve, (amarillo) clonado en el vector pNEB193 (línea verde); B: DNA plasmídico de la
clona (1), digestión con la enzima XbaI para la liberación del fragmento de TYLCV-Gve (2),
marcador de peso molecular 1 Kp plus Later (3).
Ilustración 2
A
B
pTYLCV-Gve 5494 pb
1 2 3
27
6.2.7 Inoculación por biobalística mediante un sistema de alta presión
El método de la Biobalística es ampliamente usado en estudios de infectividad
de begomovirus en un amplio número de hospedantes. Esta técnica consiste en usar
microproyectiles impulsados por gas helio, que son directamente introducidos en
plantas intactas, el procedimiento se realiza en una cámara de vacío (Santos et al.,
2008).
6.2.7.1 Preparación de partículas
Para una preparación de 5 disparos se pesaron 30 mg de partículas de oro, se
lavaron con 1ml de etanol al 70% y homogenizó con un vórtex de 3-5 minutos, se
permitió que las partículas se empaparan con etanol por quince minutos, se centrifugó
por cinco segundos para obtener una pastilla. Posteriormente se decantó el
sobrenadante y las partículas se resuspendieron en 1 ml de agua estéril. Esta mezcla
se agitó vigorosamente por 1 minuto y se dejó reposar por un minuto más a
temperatura ambiente. Se centrifugó por 30 segundos y se decantó, este lavado se
repitió tres veces con agua destilada estéril. Para preservar la mezcla se adicionó
500µl de glicerol al 50% estéril. Estas partículas se almacenaron por dos semanas en
un ambiente seco, a 4°C.
6.2.7.2 Impregnación de DNA a las partículas de oro
Se mezclaron 50 µl de partículas por cada seis disparos en tubos estériles de
1.5 ml, se adicionaron 50 µl de CaCl2 [2.5M] y 20 µl de espermidina [0.1M]. Se llevó a
un vórtex y se agito de 2 a 3 minutos y reposó la mezcla por un minuto adicional. Se
centrifugó el tubo por 20 segundos a 8000 rpm, después se decantó el líquido con
ayuda de una pipeta. Se resuspendió en 140µl de etanol al 100%, y posteriormente se
centrifugó a 10 000 rpm por 5 minutos. Se desechó el sobrenadante con una
micropipeta y las partículas se resuspendieron con 60 µl de etanol absoluto.
28
6.2.7.3 Inoculación de las plantas
Las plantas de N. benthamiana se bombardearon usando una pistola PDS-
1000 con plantas que crecieron bajo condiciones in vitro en cajas magentas con medio
MS, usando una presión de helio de 900 psis. En cada experimento, se usó 5
repeticiones por virus inoculado, y 3 plantas inoculadas únicamente con agua, como
un control de inoculación, que se denominaron como Mock. Una vez que se inoculó
cada planta, se traspasaron a sustrato Peat-Most más vermiculita, y se mantuvieron
en una cámara de crecimiento aclimatadas con una temperatura de 26-28°C;
fotoperiodo luz/oscuridad (16:8).
Figura 3. – Técnica de biobalística con un sistema de alta presión PDS-1000. A) Pistola
PDS-1000. B) Preparación de microcarriers. C) Planta de Nicotiana benthamiana cultivada en
magenta con medio MS. D) Inoculación en la pistola de biobalística dentro de la pistola de alta
presión. E, Aplicación de vacío y presión de helio en una cámara de flujo laminar.
6.2.8 Inoculación por biobalística mediante un sistema de baja presión
La técnica de bombardeo de partículas se ha utilizado para infectar plantas
con virus de DNA y RNA. La pistola manual “Helios Gene Gun” (BIORAD) es un
sistema de inoculación basada en el recubrimiento del DNA sobre partículas de oro
recubiertas de DNA, una precipitación en el interior de la pared de un tubo de plástico
y una aceleración de particulas por el helio presurizado. Algunas de sus ventajas es
que los cartuchos pueden almacenarse durante varios meses y los procedimientos de
bombardeo son más rápidos en comparación con el instrumento PDS-1000/He. Por
otra parte, no tiene limitaciones como el tamaño de la planta, el uso de vacío, y las
B
D A C E
29
desventajas que conlleva el cultivo in vitro. Los procedimientos se llevaron a cabo de
acuerdo a lo reportado por el fabricante del equipo (Woods y Zito, 2008).
6.2.8.1 Impregnación del DNA con las partículas de oro
Se prepararon aproximadamente 45 cartuchos por cada virus. En un tubo
Eppendorf se adicionó la cantidad de 25 mg de oro, 50 µl de espermidina al 0.05 M y
la cantidad necesaria de DNA para completar un volumen con una concentración de
50 µg/µl de DNA viral. Con ayuda de un vórtex con velocidad moderada, se adicionó
CaCl2 (igual a la cantidad adicionada de espermidina y DNA), y se precipitó las
partículas de oro, se dejó reposar la mezcla durante 10 minutos, después se centrifugó
a baja velocidad, el sobrenadante se eliminó y el pellet de oro se lavó 3 veces con
etanol al 100% (grado HPLC). Una vez que se desechó el sobrenadante, se
resuspendió con una solución de 0.1 mg/ml de polivinilpirolidona (PVP) con etanol
como solvente, el cual sirvió como adhesivo durante el recubrimiento de DNA en los
microcarriers. Para lavar y resuspender las partículas de oro y el DNA se realizaron
lavados de 200 µl de la solución de PVP, se homogenizó con ayuda de un sonicador,
y se transfirió a un tubo de 15 ml. Los lavados se repitieron hasta completar un volumen
total de 3 ml.
6.2.8.2 Preparación de cartuchos
Todo el procedimiento se realizó en la “Tubing Prep Station”, la cual se utiliza
para recubrir la pared interna del tubo de plástico con partículas de oro recubiertas de
DNA para crear los cartuchos de DNA viral que será inoculado en plantas de N.
benthamiana con la pistola de baja presión Helios Gene Gun. Para la preparación de
cartuchos se cortó 75 centímetros (cm) de un tubo de plástico, se conectó a un tanque
de nitrógeno, el cual se aplica durante 15 minutos a una velocidad de 0.4 litros por
minuto (LPM) para eliminar la humedad remanente. Se adicionó la suspensión de
DNA/microcarriers resuspendidas en etanol, se homogenizó con ayuda de un vórtex.
Con una jeringa de 10cc se llenó la manguera, evitando la formación de burbujas, y se
dejó reposar durante 5 minutos. Con ayuda de una bomba peristáltica a una velocidad
de 5.5 a 6.0 mililitros por minuto (ml/min) se removió el etanol remanente. Se rotó el
30
tubo inmediatamente en un ángulo de 90°; se dejó reposar de 2-5 segundos; se rotó
nuevamente a 90°, se dejó reposar y finalmente se encendió el interruptor para un giro
constante por 5 minutos. Pasado ese tiempo se permitió que el oro se adhiriera a la
manguera por 30 segundos, después se eliminó la humedad permitiendo un flujo de
nitrógeno de 0.4 LPM durante 5 minutos. Después se apagó la “Tubing Prep Station”,
se cerró la válvula de nitrógeno y se retiró el tubo recubierto con los microcarriers de
oro. Se examinó la manguera para comprobar que la distribución fuera uniforme a
través del tubo y que estuviera por completó seco. Con ayuda de un cortador de
cartuchos se obtuvieron pequeños trozos, se almacenaron en un vial de plástico
perfectamente sellado y libre de humedad, para lo cual se cubrió la tapa con parafilm
y se agregó un desecador. Posteriormente se almacenaron a 4°C en un lugar seco
hasta el tiempo en que se realizó el disparo.
6.2.8.3 Inoculación de las plantas
Se seleccionaron plantas de N. benthamiana en etapa de tercera a sexta hoja
verdadera. Las plantas se mantuvieron en oscuridad una noche antes de ser
inoculadas; después se inoculó una hoja apical con 200 psis de presión, con un disparo
cada una (Figura 4A y 4B); se roció con abundante agua y se tapó con una bolsa de
plástico (Figura 4C), para mantener una humedad relativa alta.
Las plantas inoculadas se dejaron en oscuridad una noche, y al siguiente día
se retiró la bolsa y se mantuvieron a temperatura controlada. Las hojas inoculadas se
observaron diariamente para monitorear la aparición de síntomas (Figura 4D).
31
Figura 4: Técnica de biobalística con pistola de baja presión Helios gene gun system. A)
Inoculación con la pistola Helios Gene gun; B) Inoculación de una planta de chile. C) Planta
de tomate cubierta con bolsa de plástico, después de inoculación; D) Hoja de chile después
de la inoculación por biobalística.
6.2.9 Ensayo de infectividad de RhGMV-Sin en plantas de N. benthamiana
Se inocularon con el aislado de RhGMV-Sin plantas de N. benthamiana entre
su tercera o cuarta hoja verdadera manteniéndolas bajo condiciones controladas, entre
26 y 28 °C. Se realizó una observación diaria para monitorear la aparición y el
desarrollo de síntomas. Para confirmar la presencia de RhGMV-Sin en las plantas
inoculadas se realizó un análisis molecular por PCR anidado como se describió
anteriormente.
6.2.10 Ensayo de infectividad de RhGMV-Sin en tomate, tomatillo y chile
En el caso del tomate, se estudió la capacidad infectiva de RhGMV-Sin en los
híbridos maya y SUN 6200, que son susceptibles a enfermedades ocasionadas por
Begomovirus, la variedad de chile pimiento Joe Parker y tomatillo variedad Querétaro.
Estas plantas se inocularon con la pistola de baja presión, con los cartuchos utilizados
para el primer ensayo de infectividad en N. benthamiana. Se germinaron semillas en
sustrato peat most, y se inocularon plantas que estuvieran entre su tercera y su cuarta
hoja verdadera. Por cada planta se inocularon 5 repeticiones con RhGMV-Sin y un
Ilustración 3
A B C
D
32
control Mock (agua). Se usó en cada experimento 200 psis de presión de helio. Se
repitió el protocolo de inoculación descrito anteriormente y los análisis fueron similares
a los que se realizaron en N. benthamiana.
6.2.11 Ensayo de infectividad de TYLCV-Gve en plantas de N. benthamiana
Se inoculó con el aislado de TYLCV-Gve a ocho plantas de N. benthamiana
entre su tercera o cuarta hoja verdadera manteniéndolas bajo condiciones controladas,
entre 26 y 28 °C. Se realizó una observación diaria para monitorear la aparición y el
desarrollo de síntomas. Para confirmar la presencia de TYLCV-Gve en las plantas
inoculadas se realizó un análisis molecular por PCR anidado como se describió
anteriormente.
6.2.12 Ensayo de infectividad de TYLCV-Gve y su interacción con RhGMV-Sin en
N. benthamiana
Se analizó la interacción de TYLCV-Gve y RhGMV-Sin para conocer sus
efectos en infección mixta en N. benthamiana. Se colectó una planta de tomate
infectada con ambos virus en la cruz de Elota, Sinaloa, en el año 2011. A partir de esta
planta se obtuvo el DNA viral a utilizar en el bioensayo. En este ensayo se inocularon
cinco plantas de N. benthamiana entre su tercera y cuarta hoja verdadera, cultivadas
in vitro, usando un sistema de alta presión de biobalística. En este experimento
también se inocularon 5 plantas con RhMGV-Sin y 3 con TYLCV-Gve, para comparar
los efectos de estos virus en infección simple y en infección mixta. Después de la
inoculación, las plantas a los 4 dpi se trasplantaron a macetas con sustrato peat moss
y se mantuvieron bajo condiciones controladas entre 26 y 28 °C y un fotoperiodo
luz/oscuridad 16:8. Como segunda estrategia, se inoculó el DNA infectivo obtenido del
monómero TYLCV-Gve y el DNA obtenido a partir de un DNA total de una planta de
N. benthamiana inoculada con RhGMV-Sin, se agregó la cantidad suficiente de DNA
infectivo para completar un total de 1 µg de DNA inoculado por planta. El número de
plantas seleccionadas fue de 5 para cada virus en infección simple, 5 en infección
mixta y 3 controles.
33
6.2.13 Identificación de Begomovirus por PCR/RFLP en plantas inoculadas por
biobalística
Se colectaron hojas inoculadas a los 7 días después de la inoculación (dpi), y
hojas apicales a los 14 y 28 dpi. La infectividad de RhGMV-Sin se determinó con base
a las pruebas moleculares con PCR/RFLP. Una planta se consideró como positiva para
la infección por Begomovirus cuando en un PCR anidado se obtuvo una amplificación
de 588 pb, y en un RFLP el patrón obtenido fue de 3 bandas de 272, 215 y 101 pb
para la enzima HhaI, y de 385 y 203 pb con la enzima MspI. Si se amplificó un producto
a los 7 dpi, consideramos que el virus se replicó en las células iniciales y si es positiva
a los 14 y 28 dpi, el virus se movió a larga distancia a través de la planta.
34
VII. Resultados
7.1 Infectividad del Virus del mosaico dorado de la Rhynchosia (RhGMV-Sin) en
N. benthamiana
La planta silvestre Rhynchosia minima es hospedante natural de begomovirus
y es una maleza que crece en casi cualquier sitio destinado a la siembra de cultivos
agrícolas. En estudios anteriores realizados en laboratorio, se caracterizó
molecularmente al Virus del mosaico dorado de la Rhyncosia (RhGMV-Sin) aislado de
ésta planta silvestre (Ruelas-Ayala, 2007, Méndez-Lozano, et al., 2006). En el presente
trabajo se describe la infectividad de RhGMV-Sin en Nicotiana benthamiana como
planta modelo ampliamente utilizada para ensayos de infectividad de virus.
En el 2011, se colectó plantas de campo de Rhynchosia minima con síntomas
de mosaicos y amarillamientos severos en las hojas, previamente asociados a
RhGMV-Sin (Figura 5A). Para detectar a RhGMV-Sin en dichas plantas se realizó un
análisis molecular por PCR y RFLP (Figura 5B). Una vez confirmado la presencia de
RhGMV-Sin en el DNA total de la planta de Rhyncosia minima se utilizó para amplificar
el genoma viral (DNA-A y DNA-B) de RhGMV por la técnica de circulo rodante (RCA).
Para determinar si la molécula amplificada correspondía a RhGMV-Sin, se realizó una
digestión enzimática con la enzima XbaI, BamHI y/o PstI que presentan un sitio de
corte único en el DNA-A y DNA-B respectivamente en el genoma de RhGMV-Sin. El
análisis muestra una molécula lineal de 2.6 a 2.8 Kb como producto de la digestión con
cada enzima, confirmando que se amplificó el genoma de RhGMV-Sin (Figura 5C). Así
mismo, se observó un DNA concatémero (DNA con múltiples copias en tándem) de ~
12 Kb que corresponden a una DNA no digerido (Figura 5C).
35
Figura 5: Obtención de material infectivo de RhGMV-Sin. A) Planta de Rhynchosia mínima
(Rm); B) Detección de Begomovirus por PCR anidado en planta de Rm; C) Comprobación de
la amplificación de RhGMV-Sin mediante digestiones con enzimas de restricción.
El DNA viral obtenido por RCA se utilizó para realizar los ensayos de
infectividad en plantas de N. benthamiana. Se inocularon cinco plantas con sus
respectivos controles y se observó la evolución de la sintomatología diariamente. La
aparición de síntomas se observó en una planta con mosaicos ligeros a los cuatro días
posteriores a la inoculación (dpi). A los 7 dpi se observaron amarillamientos severos y
ampollamientos en hojas inoculadas y en hojas emergentes en tres de cinco plantas
inoculadas. A los 14 dpi, la severidad de los síntomas iniciales pasó de ser ligeros
ampollamientos a arrugamientos severos (Figura 6A); en hojas apicales, los síntomas
eran más severos que en el resto de la planta. A los 28 dpi los síntomas presentes
mostraban mayor severidad, no permitiendo el desarrollo adecuado de la planta; así
mismo, no se observó la producción de semillas. Para comprobar que los síntomas
que se presentaron en plantas de N. benthamiana eran inducidos por RhGMV-Sin, a
los 7 dpi se colectaron hojas inoculadas y se realizó una detección molecular por PCR
y análisis por RFLP. En el análisis por PCR en las plantas inoculadas con RhGMV-Sin
se observó el fragmento esperado de 950 pb en un PCR simple y de 588 pb para el
PCR anidado (Figura 6B). Se realizó un RFLP con las enzimas MspI y HhaI. El análisis
muestra los fragmentos esperados para RhGMV-Sin de 272, 215 y 101 pb para la
enzima HhaI y de 385 y 203 pb para la enzima MspI (Figura 6C).
A) Rhynchosia mínima (Rm)
588 pb
B))
(Rm) kb
RhGMV-Sin
Rm kb XbaI BamH1 XhoI PstI
2.8 Kb
C))
12 Kb
36
Figura 6: Ensayo de infectividad de RhGMV-Sin en N. benthamiana. A) Plantas de N.
benthamiana inoculadas con RhGMV-Sin. B) Detección por PCR de plantas de N.
benthamiana inoculadas a los 14 dpi. C: RFLP de plantas inoculadas con RhGMV-Sin. –C (1):
Control negativo de la reacción PCR; -C(2): Control de PCR anidado; C (+): Begomovirus
monopartita; Kb: Marcador de peso molecular; pb: pares de base; Rs: Plantas de N.
benthamiana inoculadas con RhGMV-Sin obtenido a partir de RCA.
Los resultados anteriores indican que las plantas están infectadas por el
mismo virus y de acuerdo a la comparación con los resultados obtenidos por Ruelas
Ayala en el 2007 se asocian al virus RhGMV-Sin (Figura 6B y 6C). De acuerdo a los
análisis moleculares confirmamos que el aislado obtenido de la planta de Rhynchosia
mínima en el municipio de Guasave en el año 2011 es infectivo y causa síntomas
severos en N. benthamiana. El ensayo de infectividad se repitió tres veces, alcanzando
un total de 20 plantas inoculadas, de las cuales, el 100% fueron positivas para la
presencia RhGMV-Sin, demostrando la infectividad de este virus en N. benthamiana.
Con base a los síntomas presentados se estableció la escala de severidad,
donde se asignó un valor numérico a cada planta inoculada (Cuadro 3). Es importante
resaltar que este cuadro sirvió de referencia para todos los ensayos realizados en la
presente investigación, incluidos los síntomas presentados con el virus TYLCV-Gve.
- C
750 pb
B))
-C(1)–C(2) kb C(+) Rs1 Rs2 Rs3 Rs4 Rs5
588 pb
C(+) Rs1 Rs2 Rs3 Rs4 Rs5 kb C(+) Rs1 Rs2 Rs3 Rs4 Rs5
Msp I Hha I
345 pb
272 pb 203 pb
215 pb
101 pb
C) )
A)
Rs1 Rs2 Rs3 Rs4 Rs 5
37
Cuadro 3: Escala de severidad de RhGMV-Sin en Nicotiana benthamiana.
Los síntomas observados en hojas inoculadas de N. benthamiana, iniciaba
como mosaicos ligeros, que conforme progresaba la enfermedad los mosaicos eran
más severos, con ampollamientos y rugósis en la planta (Figura 7).
Figura 7: Escala de severidad desarrollado con base a la caracterización de los síntomas
observados en Nicotiana benthamiana después de la inoculación del virus RhGMV-Sin.
Cabe destacar que en las plantas infectadas solo con RhGMV-Sin se observó
que a los 7 dpi los síntomas eran mosaicos moderados (Figura 8A), a los 14 dpi
aumento la severidad de la enfermedad (Figura 8B), pero no fue hasta los 28 dpi
(Figura 8C), cuando se observó enfermedad sistémica severa en toda la planta.
# Severidad Síntomas
0 Hoja Sana
1 + Ligeros mosaicos y/o ligeras deformaciones
2 ++ Mosaicos en la mayor parte de la hoja y ligera rugósis
3 +++ Mosaicos, rugósis severa y/o ligero acucharamientos
4 ++++ Mosaico y rugósis severos, poco desarrollo de la planta y
ligeros acucharamientos en toda la planta
5 +++++ Mosaicos severos, acucharamientos severos y enanismo.
0 1 2 3 4 5
38
Figura 8: Caracterización de síntomas después de la inoculación del virus RhGMV-Sin
en plantas de Nicotiana benthamiana. A: 7dpi; B: 14 dpi; C: 28 dpi; Control negativo (CN):
agua.
7.2 Capacidad infectiva de RhGMV-Sin en plantas de la familia de la Solanácea
Malezas como Rhynchosia mínima son reservorio, en particular de RhGMV-
Sin y se desconoce su capacidad de infectar cultivos de interés comercial y causar
graves daños a la agricultura regional. En este trabajó se analizó la capacidad de
RhGMV-Sin de infectar plantas de la familia de las Solanáceas como chile, tomate y
tomatillo
C (-) C (-) C (-)
CN
RS 1
RS 2
RS 3
-
++
++
++
+++
++
+++
A) B) C)
4
4 3
3 2
2
3 4 1
C (-) C (-) C (-)
39
7.2.1 Infectividad de RhGMV-Sin en Tomate
El tomate es una de las hortalizas más afectadas por begomovirus en el estado
de Sinaloa. Para estudiar la infectividad de RhGMV-Sin en este cultivo, se
seleccionaron los híbridos SUN 6200 (Figura 9) y maya (Figura 10), variedades
susceptibles al Begomovirus TYLCV. En plantas inoculadas del hibrido SUN 6200, no
se observaron síntomas virales asociados a una infección con RhMGV-Sin a los 7 y
28 dpi (Figura 9A y 9B), excepto algunos amarillamientos laterales en las hojas
apicales, pero solo en una planta. El análisis por PCR, de estas plantas no mostró
amplificación del fragmento esperado (Figura 9C).
Figura 9. Ensayo de infectividad de RhGMV-Sin en tomate híbrido o cultivar Sun6200. A) Plantas
inoculadas con RhGMV-Sin a los 7dpi; B) Plantas inoculadas con RhGMV-Sin a los 28 dpi. C) Detección
molecular por PCR de plantas infectadas; a) DNA de plantas inoculadas a los 7 dpi, analizado por PCR,
b) DNA de plantas inoculadas a los 28 dpi, analizado por PCR, C (-): Control negativo, C (+): Control
positivo de reacción de PCR de un DNA plasmídico de TYLCV, CN (H20): DNA total de planta de tomate
control, inoculada solo con agua, Kb: Marcador de peso molecular (1 kb plus lader). TS: Plantas de
tomate variedad SUN 6200 inoculadas con RhGMV-Sin, obténido a partir de RCA.
P1
P2
P3
C(-) C(+) kb CN TS1 TS2 TS3 TS4 TS5 a b a b a b a b a b a b
C)
588 pb
B)
CN TS 3
A)
TS 4 TS 1 TS 5 TS 2
40
En las plantas de variedad maya, a los 7 dpi, se observaron amarillamientos y
daño en la planta ocasionado por la inoculación a alta presión, o bien por el trasplante
de las plantas de cultivo in vitro a sustrato (Figura 10 A). Para los 28 dpi las plantas de
tomate variedad maya no expresaron síntomas como mosaicos o ampollamientos,
similares a los inducidos en N. benthamiana (Figura 10 B, P4). El análisis por PCR de
la plantas de tomate a los 7 y 28 dpi, no amplificó el fragmento esperado de 588 pb,
(Figura 10 C), indicando que RhGMV-Sin no causó una infección en este hibrido de
tomate.
Figura 10. Ensayo de infectividad de RhGMV-Sin en tomate híbrido o cultivar maya. A)
Plantas inoculadas con RhGMV-Sin a los 7dpi; B) Plantas inoculadas con RhGMV-Sin a los
28 dpi. C) Detección molecular por PCR de plantas infectadas; a) DNA de plantas inoculadas
a los 7 dpi, analizado por PCR, b) DNA de plantas inoculadas a los 28 dpi, analizado por PCR;
C (-): Control negativo; C (+): Control positivo de reacción de PCR de un DNA total de RhGMV-
Sin; CN (H20): DNA total de planta de tomate control, inoculada solo con agua, Kb: Marcador
de peso molecular (1kb plus lader). TM: Plantas de tomate variedad SUN 6200 inoculadas con
RhGMV-Sin, obtenido a partir de RCA.
588 pb
Mock TM1 TM 2 TM 3 TM 4
C(-) C(+) kb a b a b a b a b a b
TM 1 TMM+ 2
TM 3 TM 4
588 pb
A)
B)
C)
CN
41
7.2.2 Infectividad de RhGMV-Sin en tomatillo
El tomatillo es de gran importancia económica en el estado de Sinaloa. Es por
ello que se analizó la capacidad infectiva de RhGMV-Sin en esta planta (Gámez-
Jiménez, 2007). El ensayo indica que no se observaron síntomas virales en ninguna
de las plantas de tomatillo inoculadas con RhGMV-Sin (Figura 11 A y 11 B), sin
embargo, en algunas plantas se presentaron ligeras ampollamientos en hojas de
algunas plantas, asociado a un defecto genético de la semilla o a las condiciones de
humedad en invernadero (Figura 11 B, P3 y P5).
La detección molecular por PCR de RhGMV-Sin, muestra la amplificación del
fragmento esperado de 588 pb en dos plantas a los 7 dpi (Figura 11 C, P2 Y P5). Sin
embargo, en el análisis a los 14 dpi no se logró detectar por PCR la presencia de
RhGMV-Sin, lo cual sugiere que no pudo establecer una infección sistémica en las
plantas de tomatillo al no ser detectado en hojas nuevas hojas (Figura 11 D). Para
corroborar que el Begomomvirus amplificado los 7 dpi corresponde a RhGMV-Sin, se
realizó un RFLP, por digestión enzimática con la enzima MspI obteniendose un patrón
de restricción de 385 y 103 pb, idéntico al virus inoculado, confirmando la presencia
de RhGMV-Sin en las plantas de tomatillo (Figura 11 E). Los datos indican que fue
posible detectar a RhGMV-Sin en dos de cinco plantas inoculadas de tomatillo, por lo
tanto es posible que el virus infectó células iniciales, pero no mostró la capacidad de
moverse a larga distancia.
42
Figura 11: Ensayo de infectividad de RhGMV-Sin en tomatillo cultivar Querétaro. A y B,
plantas inoculadas con RhGMV-Sin, a los 7 y 28 dpi respectivamente. C y D, Detección
molecular de RhGMV-Sin a los 7 y 28 dpi respectivamente. E, RFLP de plantas infectadas con
RhGMV-Sin con la enzima Msp I. C(-);Control negativo; C (+): Control positivo de TYLCV; CN:
Control negativo, planta inoculada con agua, Kb: Marcador de peso molecular. TM: Plantas de
tomate variedad SUN 6200 inoculadas con RhGMV-Sin, obtenido a partir de RCA. TQ: Plantas
de tomatillo cultivar Queretaro inoculadas con RhGMV-Sin, obtenido a partir de RCA.
7.2.3 Infectividad de RhGMV-Sin en chile
El cultivo de chile es una hortaliza de gran importancia económica, por lo que fue
considerado para este estudio. Se inoculó chile híbrido Joe Parker con RhGMV-Sin
para demostrar si este virus tiene capacidad de infectar este cultivo. Se inocularon
cinco plantas del híbrido Joe Parker para determinar si RhGMV-Sin tiene capacidad
de infectar el cultivo de chile. No se observaron síntomas durante el desarrollo del
experimento a excepción del daño mecánico observado a los 7 dpi en el área de
CN TQ1 TQ2 TQ3 TQ4 TQ5
A)
B)
C(-1) C(-2) C(+) kb M TQ1TQ2TQ3TQ4TQ5
D) C)
588 pb 588 pb
C(-1) C(+) kb TQ1 TQ2 TQ3 TQ4 TQ5
C(+) kb TQ2 TQ5
E)
385 pb
203 pb
43
disparo (Figura 12 A y 12 B). El análisis molecular por PCR realizado a los 7 y 28 dpi
no muestra amplificaciones del fragmento esperado para Begomovirus. Este hecho,
indica que RhGMV-Sin no tiene la capacidad de infectar el cultivo de chile en estas
condiciones (Figura 12C y 12 D).
Figura 12: Ensayo de infectividad de RhGMV-Sin en Chile híbrido o cultivar Joe Parker.
Plantas inoculadas con RhGMV-Sin a los 7dpi; B) Plantas inoculadas con RhGMV-Sin a los
28 dpi. C) Detección molecular por PCR de las plantas inoculadas; a) DNA de plantas
inoculadas a los 7 dpi, analizado por PCR; b) DNA de plantas inoculadas a los 28 dpi, analizado
por PCR; C (-): Control negativo; C (+): Control positivo de reacción de PCR de un DNA total
de RhGMV-Sin; CN (H20): DNA total de planta de tomate control, inoculada solo con agua;
Kb: Marcador de peso molecular (1 kb plus lader); CJ: Plantas de chile hìbrido Joe Parker
inoculadas con RhGMV-Sin, obtenido a partir de RCA
CN CJ 1 CJ2 CJ3 CJ4 CJ5
A)
B)
C)
C(-1) C(-2) kb C(+) CN CJ 1 CJ2 CJ3 CJ 4 CJ5
a b a b a b a b a b a b
44
7.2.4 Infectividad de RhGMV-Sin en N. benthamiana y especies de la familia de
las Solanáceas
Los resultados descritos en este trabajo demuestran que RhGMV-Sin causa
síntomas como mosaicos, ampollamientos y rugósis severa en N. benthamiana,
infectando 12 de 15 plantas inoculadas; sin embargo, las 15 plantas fueron positivas
en el análisis por PCR, demostrando que este virus infectó todas las plantas
inoculadas. En el caso de las especies de la familia de las Solanáceas, RhGMV-Sin
no causo síntomas característicos en los cultivos de chile, tomatillo y tomate, tanto en
el híbrido Maya y el híbrido SUN 6200. En los análisis por PCR, las plantas de chile y
tomate inoculadas fueron negativas; sin embargo, en el caso de tomatillo dos de las
plantas fueron positivas, pero solo fue posible detectar al virus a los 7 dpi (Cuadro 4)
Cuadro 4: Infectividad de RhGMV-Sin en N. benthamiana y miembros de la familia de las
Solanáceas
Planta P. Síntomas /P.
inoculadas
P. Positivas/ P.
Inoculadas
Severidad
N. benthamiana 12/15 15/15 4
Tomate Maya 0/9 0/9 0
Tomate SUN 6200 0/5 0/5 0
Tomatillo 0/5 2/5 0
Chile 0/5 0/5 0
SS: Sin síntomas; ND: No detectado
45
7.3 Infectividad de TYLCV-Gve en N. benthamiana
El TYLCV es uno de los patógenos más agresivos en el mundo. En el 2005 se
reportó afectando el cultivo del tomate en Sinaloa. El genoma de TYLCV aislado
Guasave (TYLCV-Gve) fue clonado previo en el laboratorio. En este trabajo se inició
por determinar la infectividad de este virus. Por lo que se inocularon plantas de N.
benthamiana, con el aislado TYLCV-Gve (Figura 13).
El seguimiento de la infección mostró que los primeros síntomas se
presentaron a los 7 dpi, como ligeros ampollamientos en las hojas inoculadas y
apicales (Figura 13 A). Después de los 28 dpi, la severidad de los síntomas era
evidente en una de las plantas inoculadas, presentando un acucharramiento y
arrugamiento en la mayor parte del área foliar (Figura 13 B). Después de observar la
presencia de síntomas, se realizó un análisis por PCR en plantas a los 7 dpi,
encontrando que en todas las plantas inoculadas se obtuvo una amplificación de 750
pb que se asocia al fragmento esperado para un Begomovirus monopartita como
TYLCV (Figura 13 C). Así mismo, se realizó un análisis por RFLP para corroborar la
presencia de TYLCV digiriendo el fragmento de PCR con la enzima MspI, obteniendo
un patrón similar al esperado para TYLCV (Figura 13 D). Es relevante señalar que el
contar con una clona infectiva de TYLCV representa una herramienta para las
investigaciones futuras de este virus, que permitirá conocer y entender mejor el
proceso infectivo en el laboratorio. En la escala de severidad, anteriormente descrita
para las plantas infectadas con RGMV-Sin también se incluyó la sintomatología que
se encontró en TYLCV-Gve, por lo tanto esta escala fue usada en todos los
experimentos realizados en este trabajo.
46
Figura 13: Ensayo de infectividad de TYLCV-Gve en Nicotiana benthamiana. A) Plantas
inoculadas a los 7dpi; B) Plantas inoculadas a los 28 dpi. C) Detección molecular por PCR de
las plantas inoculadas; D) RFLP con la enzima MspI de plantas inoculadas con TYLCV-Gve,
positivas en un PCR anidado. C (-1): Control negativo del PCR anidado; C (-2): Control
negativo del PCR simple; C (+): Control positivo de reacción de PCR de un DNA total de
RhGMV-Sin; Kb: Marcador de peso molecular (1kb plus lader); Pb: pares de bases. TG:
Plantas de N. benthamiana inoculadas con DNA de un monómero de TYLCV-Gve.
TYLCV-Gve D)
KB TG1
CN TG1 TG2 TG3
C(-1) C(-2) C(+) kb TG1 TG2 TG3
750 pb
C)
A)
212 pb
458 pb
72 pb
B)
47
7.4 Análisis de la interacción de TYLCV-Gve y RhGMV-Sin en infección mixta en
N. benthamiana.
Estudios previos indican que las infecciones mixtas entre TYLCV y otros
Begomovirus bipartitas son comunes en los campos de cultivo de Sinaloa. Además un
modelo como el aquí reportado para estudiar interacciones entre un Begomovirus
monopartita (TYLCV-Gve) y otro bipartita (RhGMV-Sin) en infección mixta no ha sido
estudiado. En éste trabajo se presenta una herramienta alternativa para la inoculación
de virus. Ésta consiste en la inoculación de ambos virus a partir del producto de RCA
obtenido de un DNA genómico total de una planta coinfectada. De esta forma se
inocularon plantas de N. benthamiana con la mezcla de TYLCV-Gve y RhGMV-Sin
obtenida por RCA. El seguimiento de la infección indica la aparición de síntomas a
partir del 4-7 dpi e inició con mosaicos, ampollamientos y amarillamientos severos en
las hojas inoculadas (Figura 14 A).
La progresión de los síntomas fue agresiva y a los 28 dpi el efecto en el
crecimiento de la planta era evidente, induciendo un enanismo, poco o nulo desarrollo
de las hojas emergentes y no presentaron floración (Figura 14 B). Los resultados de
este ensayo indican que existe una interacción sinérgica entre TYLCV-Gve y RhGMV-
Sin, con base a los síntomas observados en infecciones simples de ambos virus
(Figura 14). Para una mejor comprensión del desarrollo de la enfermedad, se realizó
una detección por PCR y RFLP para analizar la infección mixta entre estos virus a los
7dpi y 28dpi. Es interesante observar que la amplificación en cada planta es diferencial,
a los 7 dpi se amplificó a TYLCV-Gve y RhGMV-Sin en 4 de las 5 plantas inoculadas
(Figura 14C), mientras que a los 28 dpi se amplificó en solo dos de las plantas para
ambos virus (Figura 14 C). Así mismo, en otra planta sólo se amplificó a RhGMV-Sin
a los 28 dpi, sugiriendo que este virus fue predominante durante la infección en esta
planta (Figura 14 C).
48
Figura 14: Análisis de la interacción de TYLCV-Gve y RhGMV-Sin en infección mixta con
Nicotiana benthamiana. A) Plantas inoculadas a los 7dpi; B) Plantas inoculadas a los 28 dpi.
C) Detección molecular por PCR simple de plantas de N. benthamiana inoculadas a los 7 dpi
y 28 dpi; D) Detección molecular por PCR anidado de plantas de N. benthamiana inoculadas
a los 7 dpi y 28 dpi. a) DNA de plantas inoculadas a los 7 dpi, analizado por PCR, b) DNA de
plantas inoculadas a los 28 dpi, analizado por PCR; C (-1): Control negativo del PCR anidado;
C (-2): Control negativo del PCR simple; C (+): Control positivo de reacción de PCR de un DNA
total de RhGMV-Sin; Kb: Marcador de peso molecular (1kb plus lader); Pb: pares de bases.
TR: Plantas de N. benthamiana inoculadas con TYLCV-Gve y RhGMV-Sin, obtenido a partir
de RCA.
CN TR1 TR 2 TR 3 TR 4 TR 5
A)
Ilustración 4
C(-1) C(-2) C(+) KB TR1 TR2 TR3 TR4 TR5
a b a b a b a b a b
D)
750 pb
588 pb
B)
1050 pb
TR 1 TR 2 TR 3 TR 4 TR 5
a b a b a b a b a b KB C (+)
950 pb
C)
49
En el ensayo anterior se demostró que hay una interacción sinérgica entre
TYLCV-Gve y RhGMV-Sin cuándo se amplifican por RCA a partir de un DNA total en
infección mixta. Con la finalidad de determinar si existe una diferencia cuando la fuente
de DNA viral infectivo se obtiene e inocula por separado se realizó un segundo ensayo.
Por un lado, se preparó el DNA infectivo de RhGMV-Sin amplificando por RCA de una
planta de N. benthamiana inoculada, mientras que para TYLCV se inoculó el
monómero de TYLCV-Gve clonado en el laboratorio. Las observaciones indican que
el efecto causado por la inoculación de estos virus por separado se comportó de forma
similar. De igual manera a los 7 dpi se presentaron síntomas severos, a los 14 dpi se
presentaron amarillamientos, mosaicos y puntos cloróticos en las hojas inoculadas, así
como un desarrollo anormal de las hojas apicales (Figura 15 A). Se observó que en 7
de 10 plantas inoculadas con esta mezcla, se presentaron síntomas similares. A los
28 dpi, el efecto sinérgico de los Begomovirus en infección mixta era evidente en
comparación con el control Mock (no DNA viral) (Figura 15 B). Se observó un enanismo
marcado en las plantas inoculadas, poco o nulo crecimiento de hojas apicales,
mosaicos, ampollamientos y acucharamientos severos en la planta.
De esta forma se confirmó que TYLCV-Gve y RhGMV-Sin tienen un efecto
sinérgico en N. benthamiana y la fuente de inoculación no marco diferencia. Para
corroborar la presencia de ambos virus en una misma planta, se analizó
molecularmente, obteniendo una amplificación tanto a los 7 como a los 28 dpi, donde
RhGMV-Sin es predominante en las plantas inoculadas (Figura 15 C).
50
Figura 15: Segundo ensayo de interacción de TYLCV-Gve (monómero) y RhGMV-Sin
(obtención por RCA de N. benthamiana inoculada) en infección mixta con N.
benthamiana. A) Plantas inoculadas a los 7dpi; B) Plantas inoculadas a los 28 dpi. C)
Detección molecular por PCR anidado de plantas de N. benthamiana inoculadas con RhGMV-
Sin y TYLCV-Gve a los 7 dpi (a) y 28 dpi (b); a) DNA de plantas inoculadas a los 7 dpi,
analizado por PCR; b) DNA de plantas inoculadas a los 28 dpi, analizado por PCR CN(H20):
DNA planta de N. benthamiana inoculada con agua; TR: Plantas de N. benthamiana inoculada
con DNA infectivo de monómero de TYLCV-Gve y una amplificación por RCA de RhGMV-Sin;
Kb: Marcador de peso molecular (1kb plus lader). Pb: pares de bases. TR: Plantas de N.
benthamiana inoculadas con TYLCV-Gve y RhGMV-Sin, obtenido a partir de RCA.
A)
B)
CN(H2O) TR 11 TR 12 TR 13 Kb a b a b a b a b
CN (H2O) TR 11 TR 12 TR 13
750 pb
588 pb
51
En general, la sintomatología observada en plantas con infección simple con
TYLCV-Gve o con RhGMV-Sin es menos severa que cuando son inoculados en
infección mixta como se observó a los 28 dpi. TYLCV-Gve presenta acucharramientos
severo y ligeros amarillamientos (Figura 16 B). Por su parte, las plantas inoculadas
con RhGMV-Sin mosaicos severos, acucharramientos, crecimiento anormal de las
hojas y ampollamientos severos (Figura 16 C).
En una infección mixta la sintomatología es más severa que las plantas en
infección simple, mostrando un enanismo marcado en las plantas (Figura 16 D),
comparado con el control Mock (Figura 16 A). Para confirmar que hay coinfección de
dos Begomovirus en una misma planta, se analizó por RFLP aquellas plantas donde
se amplificaron dos bandas de 750 y 588 pb en un PCR anidado. Esos productos se
cortaron con las enzimas MspI y HhaI, para analizar los fragmentos obtenidos, usando
como controles plantas infectadas únicamente con RhGMV-Sin y TYLCV-Gve,
respectivamente. Para la enzima MspI el patrón obtenido en las muestras con
infección mixta fueron cuatro bandas de 458, 388, 200 aproximadamente y 75 pb.
Comparando con las plantas con infección simple, En el control TYLCV-Gve se
obtuvieron fragmentos de 458, 203 y 75 pb, mientras que en el control que
corresponden a RhGMV-Sin se obtuvo un patrón de 385 y 203 pb. Con este análisis
se comprueba que en las plantas inoculadas con ambos virus existe un sinergismo, y
es posible detectar ambos virus a los 28 dpi.
Otro de los efectos observado en esta interacción fue la severidad de los
síntomas inducidos por los virus a través del tiempo, donde las plantas con infección
mixta desarrollaron la enfermedad más rápido que las plantas infectadas por los virus
en infección simple.
52
Figura 16. Desarrollo de síntomas y análisis molecular por PCR/RFLP de plantas de N.
benthamiana inoculadas con RhGMV-Sin y TYLCV-Gve a los 28 dpi. A) Mock; B) TYLCV-
Gve; C) RhGMV-sin; D) TYLCV-Gve y RhGMV-Sin en infección mixta; I) Desarrollo de
síntomas a los 28 dpi; II) RFLP con la enzima MspI de productos de PCR anidado de plantas
inoculadas.
++++
75 pb
385 pb
385 pb
203 pb
458 pb
212 pb
458 pb
203- 212 pb
A)
B)
D)
C)
I II
75 pb
53
En la figura 17, donde se asignó un valor a la severidad, agregando un valor
numérico a cada planta inoculada y se grafica la severidad de cada planta inoculada,
tanto en infección simple, como en infección mixta entre TYLCV-Gve y RhGMV-Sin.
Cabe destacar que las plantas que fueron infectadas solo con RhGMV-Sin a los 7 dpi
no presentaban una severidad alta, aumento a los 14 dpi, pero alcanzo un grado alto
a los 28 dpi, este dato es relevante, pues una vez que virus alcanza un grado de
severidad, la enfermedad se mantiene igual. En el caso de TYLCV-Gve, a los 7 y a los
14 dpi, la severidad es más baja, pero alcanza una severidad alta a los 28 dpi. En
infección mixta, observamos que todas las plantas manifestaron una severidad alta
desde los 7 dpi, mientras que a los 28 dpi, las plantas infectadas por los dos virus
sintomatología severa, que se manifiestó como nulo o poco desarrollo de la planta
debido al efecto sinérgico causado por la interacción entre TYLCV-Gve y RhGMV-Sin.
A pesar de tener un comportamiento diferente dependiendo de la manera en
que fueron inoculados TYLCV-Gve y RhGMV-Sin, todas las plantas presentaron una
sintomatología severa en comparación con una infección simple. Es importante
resaltar que las plantas donde se inoculó un producto de RCA que contiene ambos
virus presentaron síntomas de manera más temprana que aquellas plantas en que se
inoculó el producto de RCA de una planta de campo de RhGMV-sin y del DNA infectivo
de TYLCV-Gve.
Finalmente se puede señalar que los aislados obtenidos en estos ensayos son
infectivos en N. benthamiana tanto en infección simple como en infección mixta,
obteniendo porcentajes de infectividad en un 100% de las plantas inoculadas, así como
observando la presencia de síntomas desde los 4 dpi, excepto en plantas inoculadas
con TYLCV-Gve, que presentó síntomas a los 7 dpi (Cuadro 6).
0
2
4
Severidad
Infectividad de TYLCV-Gve en N. benthamiana
28 dpi
14 dpi
7 dpi
54
Figura 17. Desarrollo de sintomatología en plantas de N. benthamiana inoculadas con
RhGMV-Sin y TYLCV-Gve en infección simple y en infección mixta. Gráfica de barras de
la severidad de plantas de N. benthamiana inoculadas desarrollados durante 28 dpi A) TYLCV-
Gve. B) RhGMV-Sin; C) RhGMV-Sin y TYLCV-Gve. TR(1-5): Plantas de N. benthamiana
inoculadas con TYLCV-Gve y RhGMV-Sin obtenidos a partir de RCA de una planta infectada
en campo; TR(6-13): Plantas de N. benthamiana inoculadas con DNA infectivo de un
monómero de TYLCV-Gve y un producto amplificado por RCA de una planta inoculada con
RhGMV-Sin; TG(1-8): Plantas de N. benthamiana inoculadas con DNA infectivo de un
monómero de TYLCV-Gve; RS(1-15): Plantas de N. benthamiana inoculadas con RhGMV-Sin
amplificado a partir de una planta de Rhynchosia mínima infectada en campo.
Cuadro 5: Análisis de la interacción de TYLCV-Gve y RhGMV-Sin en infección
simple y en infección mixta en N. benthamiana
55
Virus Aparición
Síntomas
P. Síntomas / P.
inoculadas
P. Positivas / P.
inoculadas
Porcentaje de
infectividad
RhGMV-Sin 4 dpi 12/15 15/15 100 %
TYLCV-Gve 7 dpi 3/8 8/8 100%
TYLCV-Gve +
RhGMV-Sin
(mezcla)
4 dpi 5/5 5/5 100%
TYLCV-Gve y
RhGMV-Sin
(aislados)
4 dpi 7/7 7/7
100%
VIII. Discusión de resultados
Las infecciones mixtas entre dos o más virus fitopatógenos son comunes en
la naturaleza, y con consecuencias biológicas y epidemiológicas impredecibles (Syller,
2012). Por lo tanto, es importante la identificación del agente causal de virus, así como
entender aquellos factores que influencian en la epidemiologia de una enfermedad
(Jones, 2009). Los postulados de Koch son la base para el diagnóstico moderno de
patógenos de plantas, los cuales sugieren que un nuevo agente patógeno identificado
debe ser inoculado a una planta de prueba, y esta debe reproducir los síntomas de la
enfermedad. La mejor forma de evaluar las construcciones de los clones infecciosos
de Begomovirus es sometiéndolos a sus hospederos naturales mediante el método de
inoculación mecánica como la biobalística (Garzón-Tiznado et al., 1993; Méndez-
Lozano et al., 2003; Ariyo et al., 2006) o por agroinoculación (Czosnek et al., 1993).
Estas dos técnicas moleculares han sido ampliamente usadas para evaluar la infección
de Begomovirus (Oliveira et al., 2008), obteniendo mejores resultados mediante la
inoculación por biobalística. Sin embargo, en enfermedades causadas por
Begomovirus, la transmisión experimental es complicada, por ello un sistema de
inoculación eficiente consiste en el uso de la técnica de biobalística y la amplificación
por círculo rodante (RCA) (Guenoune et al., 2010). El uso de esta tecnología permite
obtener amplificaciones de DNA circulares pequeños y de cadena simple, sin tener en
consideración sus posibles variaciones secuenciales. Además, el RCA tiene una alta
56
fidelidad de copia y la cantidad de DNA molde empleada para la amplificación es
mínima (Johne et al., 2009).
En este trabajo, se aplicó un sistema de inoculación eficiente para el análisis
experimental de infectividad de Begomovirus, tanto en infección simple, como en
infección mixta, la amplificación del círculo rodante (RCA), inoculación de plantas de
N. benthamiana y un análisis de PCR-RFLP. Anteriormente, esta metodología se
aplicó con éxito en los Begomovirus Bean golden yellow mosaic virus (BGMV),
Cabbage leaf curl virus (CLCV), Squash leaf curl virus (SLCV), Tomato mottle virus
(TMV), y Watermelon chlorotic stunt virus (WCSV) demostrando su infectividad en sus
hospedantes naturales (Guenoune et al., 2010). Igualmente este sistema de
inoculación se empleó con éxito en la caracterización de Begomovirus en infección
mixta, logrando caracterizar al Sida maranta mosaic virus, lo cual no se había logrado
por otros métodos moleculares; también se determinó su infectividad en su hospedante
natural (Jeske et al., 2010).
Usando esta metodología, se demostró la infectividad del Virus del mosaico
dorado de la Rhynchosia Sinaloa (RhGMV-Sin) en N. benthamiana. Ruelas-Ayala en
el 2007 demostró la infectividad de este aislado inoculando un DNA total en plantas de
tabaco y soya por la técnica de biobalística. Sin embargo, en el presente trabajo los
síntomas aparecieron desde los 4 días después de la inoculación (4 dpi), a diferencia
de los obtenidos por Ruelas Ayala (2007), quien observó mosaicos severos con
arrugamiento en plantas de tabaco hasta los 21 dpi. En la presente investigación se
consiguió infectar plantas de N. benthamiana en un periodo corto de tiempo, lo cual
permitió conocer mejor los síntomas causados por este virus, mismos que fueron
similares a los observados en el campo (Pérez, 2006; Méndez-Lozano et al., 2006).
R. mínima es una maleza común en el Estado de Sinaloa y su desarrollo
vegetativo coincide con el desarrollo del cultivo de la soya durante el verano, por lo
que es muy probable que el RhGMVSin pudo haberse establecido en el cultivo de la
soya a través de esta maleza (Ruelas, 2007). Se han detectado diferentes
57
Begomovirus en América que afectan a Rhynchosia minima, como lo son Rhynchosia
golden mosaic virus (RhGMV) en Honduras (Potter et al 2000), en tabaco en Chiapas
(Ascencio et al., 2002) y una variante de este virus, denominado Rhynchosia Golden
Mosaic Sinaloa Virus (Méndez-Lozano et al., 2006). En la península de Yucatán ya fue
reportado un Begomovirus asociado a Rhynchosia minima con una recombinación en
el DNA-A, y al igual que en este trabajo, este virus fue altamente infectivo en plantas
de N. benthamiana, y en otros hospedantes de la familia de las Fabáceas, usando la
técnica del RCA para amplificar el virus (Hernández et al., 2010). En Pakistán también
se caracterizó recientemente a un Begomovirus de Rhynchosia mínima, el cual no fue
infectivo en N. benthamiana y se encontró que en el cultivo de soya, hay variedades
con resistencia a este virus (Muhammad et al., 2009). Este es un dato interesante, ya
que es un Begomovirus estrechamente relacionado con el aislado de Sinaloa (Ruelas-
Ayala, 2006), y a pesar de encontrarse en otro continente, presenta un rango de
hospedantes similar al RhGMV-Sin aislado en este trabajo, y se demuestra que la
infectividad de este virus en Soya tiene un efecto diferente de acuerdo a las variantes
de soya que se siembran en ese país.
Es interesante afirmar que en tres de las plantas de N. benthamiana
inoculadas con RhGMV-Sin no se presentaron síntomas, pero al momento de realizar
un análisis molecular, se demostró que el virus estaba presente. Ensayos realizados
de manera experimental, con los Begomovirus PepGMV y PHYVV, inoculados por
biobalística en plantas de chile, presentaron una remisión después de 15 dpi, es decir,
una disminución de la sintomatología asociada a Begomovirus. Este fenómeno puede
asociarse a los mecanismos de defensa de la planta, a la influencia de variables como
la etapa o el momento de la inoculación o bien, a que el número de células infectadas
fue bajo (Carrillo Trip et al., 2006).
Debido a la relevancia biológica de la infectividad de un Begomovirus como
RhGMV-Sin, presente en una maleza y que podría servir como fuente de inoculo para
cultivos de interés comercial, en este trabajo se analizó la capacidad infectiva de
RhGMV-Sin en cultivos de la familia de las Solanáceas, encontrando que este virus es
58
capaz de replicarse en células iniciales de tomatillo, detectándolo por PCR a los 7 dpi,
pero no fue capaz de infectar plantas de tomate y chile. Para determinar la infectividad
de tomatillo en el cultivo de tomatillo es necesario realizar más repeticiones de este
experimento, los cuales servirían para comprobar si es posible detectar al virus a los 7
dpi en más hojas inoculadas. El análisis por PCR solo determina la ausencia o
presencia de un begomovirus en la planta; sin embargo, para comprobar la infectividad
de RhGMV-Sin en el cultivo de tomatillo es necesario determinar si este Begomovirus
tiene la capacidad de infectar y replicarse en protoplastos (Hull, 2002), esta prueba
descartaría la posibilidad de obtener falsos positivos en el análisis por PCR, donde la
amplificación podría deberse a un DNA remante durante la inoculación del virus. Otra
técnica para analizar el movimiento de los virus en plantas es la hibridación “tissue
printing” que permite una visualización directa de la distribución del DNA viral en
diferentes órganos de la planta y permitiría determinar si RhGMV-Sin pudo replicarse
y moverse a través de la hoja inoculada, o bien, también se pueden usar técnicas de
hibridación Southern blot o PCR en tiempo real, para cuantificar la cantidad de DNA
viral a través del tiempo (Carillo-Trip, et al., 2006; Wege, 2007; García y Rivera-
Bustamante, 2010).
En tomatillo, ya se habían reportado a los virus PepGMV y PHYVV afectando
este cultivo en los estados de México, Puebla, Morelos y Sinaloa (Méndez-Lozano et
al., 2001) así como en San Luis Potosí (Mauricio-Castillo, 2007). Se encontró al virus
PHYVV en baja incidencia, tanto en infección simple y mixta con otros virus de RNA,
en los estados de estado de México, Morelos y Puebla (Torre-Almaraz et al., 2002). El
cultivo de tomatillo también esta reportado como hospedante de TYLCV en Sinaloa
(Gámez-Jiménez et al., 2009). Se demostró experimentalmente que RhGMV-Sin
puede infectar células iniciales de plantas de tomatillo, sin causar síntomas evidentes
en las plantas inoculadas.
Con este trabajo, se amplía el rango de hospedantes experimentales de
RhGMV-Sin en cultivos de importancia agrícola, que incluye a papa (Gámez-Jiménez
2007), el girasol, así como frijolillo y soya (Ruelas Ayala, 2007). En cuanto al
59
Begomovirus caracterizado en Sinaloa RhGMV, solo se encontró en Rhynchosia
mínima y en soya (Ruelas-Ayala, 2007). Algunos Begomovirus caracterizados en
malezas tienen la capacidad de infectar plantas de una familia diferente a la de su
hospedante natural, como el Euphorbia mosaic virus (EuMV), caracterizado en la
península de Yucatán, el cual puede infectar a plantas de las familias de las
Euphorbiaceae, Solanáceas y Fabáceas (Hernández et al., 2007). En Cuba,
encontraron dos nuevos Begomovirus de diferentes linajes asociados a malezas, y que
pueden servir como fuente de inoculo para la infección por otros virus (Fiallo et al.,
2010).
Otra aportación de este trabajo, es la obtención de una clona monomérica
infectiva del Virus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate (TYLCV), el cual es
un Begomovirus monopartita introducido en México, ampliamente distribuido en el
norte del país, tiene un amplio rango de hospedantes y se encuentra en infección mixta
con otros Begomovirus bipartitas, como lo son ToChLPV y CdTV y recientemente con
el Virus del chino del tomate de la Paz en Baja California, afectando el cultivo de chile
ancho (Gámez-Jiménez 2007; Orduño vega, 2009; Cárdenas et al., 2009). La
enfermedad del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate es causada por un
complejo de alrededor de 10 especies de Begomovirus aceptados por el ICTV y la
recombinación e interacción con otros Begomovirus favorece la diversidad genética,
que permite la aparición de especies más virulentas, relacionados con TYLCV (Díaz-
Plaza et al., 2010). Dada la importancia de este virus, múltiples trabajos se han
realizado para obtener clonas infectivas de este virus alrededor del mundo. La primera
vez que se logró infectar plantas con TYLCV por medio de biobalística, se usaron
vectores binarios, monómeros a los cuales se liberó el fragmento, y dímeros,
encontrando que la mejor estrategia, era el uso del vector binario (Lapitod et al., 2007).
Sin embargo, el empleo de la técnica del RCA, permitió obtener monómeros infectivos
de Begomovirus, incluyendo a TYLCV pero con un porcentaje bajo (Guenoune et al.,
2010). En otros trabajos se encontró que se puede obtener infectividad de TYLCV,
con clonas que solo contengan una región de 41 nucleótidos, altamente conservada
(Urbino et al., 2008).
60
Una vez que se demostró la infectividad de RhGMV-Sin y TYLCV-Gve en
Nicotiana benthamiana, se procedió a analizar la interacción de ambos virus en
infección mixta. Estudios previos indican que las infecciones mixtas entre TYLCV y
otros Begomovirus bipartitas son comunes en los campos de cultivo de Sinaloa.
Además un modelo como el aquí reportado para estudiar interacciones entre un
Begomovirus monopartita (TYLCV-Gve) y otro bipartita (RhGMV-Sin) en infección
mixta no ha sido estudiado. En éste trabajo, se presenta una herramienta alternativa
para la inoculación de virus, la cual consiste en inocular plantas de N. benthamiana
con el producto de RCA obtenido a partir del DNA genómico total de una planta
coinfectada con TYLCV-Gve y RhGMV-Sin, partiendo del conocimiento que esta
técnica amplifica las moléculas circulas presentes en un extracto. Los resultados
obtenidos de este bioensayo sugieren que ambos virus inducen una interacción
sinérgica, es decir, un aumento en la severidad de los síntomas. Para investigar la
interacción sinérgica, los virus se inocularon amplificando un DNA total de una planta
infectada por ambos virus, mediante RCA, y posteriormente fueron co-inoculados por
separado, RhGMV-Sin amplificado por igual por RCA, y un monómero de TYLCV-Gve,
que también es infectivo en Nicotiana benthamiana. Usando ambas estrategias, en
ambos casos se obtuvo una interacción sinérgica, lo cual nos demuestra que el método
de inoculación no interfiere en el efecto causado por ambos virus. Comúnmente, para
estudiar una infección mixta entre dos virus, se realiza en cuatro pasos, que son en la
expresión de síntomas, expresión de genes, replicación y movimiento (Méndez-
Lozano et al., 2003). En este trabajo se analizó la aparición de síntomas, analizando
la presencia y/o ausencia del virus mediante la técnica del PCR.
Los análisis moleculares realizados en los bioensayos en infección mixta de
TYLCV-Gve y RhGMV-Sin indican que en plantas donde se detectó molecularmente a
ambos virus, los síntomas son severos, confirmando el efecto sinérgico de la infección
mixta. Cabe señalar, que en algunas plantas se detectó inicialmente sólo a RhGMV-
Sin a los 7 dpi. Se podría especular que quizá este virus tiene una replicación más
eficiente que TYLCV-Sin, o bien, su proceso infectivo es más rápido. Así mismo, es
importante señalar que el desarrollo de la expresión de síntomas en las plantas
61
infectadas con RhGMV-Sin se observó más rápida comparada con aquellas infectadas
con TYLCV-Gve; sin embargo, la severidad de los síntomas causados por ambos virus
a los 45 dpi en N. benthamiana es similar.
De forma relevante en la aportación de este trabajo se considera el primer
reporte de una interacción de un Begomovirus monopartita con un bipartita en México
y el mundo. Cabe mencionar, que en África, ya hay reportes de una evolución del
Begomovirus African cassava mosaic virus, donde hay una recombinación entre
Begomovirus monopartitas y bipartitas en forma natural (Tiendrébéogo et al., 2012) lo
cual puede significar un nuevo paso hacia la evolución de este género. De manera
natural, TYLCV interacciona con otros virus que afectan el tomate, como el Virus del
mosaico del pepino (CMV), el Virus del mosaico del tomate (ToMV), perteneciente a
los Tobamovirus. Sin embargo, bajo condiciones controladas, una doble infección
depende del orden en que son inoculadas, pues ToMV suprime el efecto de TYLCV en
la planta (Mohamed, 2010). Diferentes efectos se observan en plantas que son
inoculadas con Begomovirus bipartitas, pudiendo desarrollar o un sinergismo, o bien
un antagonismo, y esto varía entre plantas que son inoculados en su hospedante y en
plantas modelo (Alves et al., 2009).
Este trabajo es un avance hacia la comprensión de la dinámica de las
enfermedades causadas por Begomovirus en el estado de Sinaloa, pues encontramos
que Begomovirus procedentes de malezas pueden infectar cultivos de importancia
agrícola, como lo son el tomate, tomatillo y chile. Además, pudimos caracterizar la
infectividad del RhGMV-Sin, el cual es un riesgo potencial para la agricultura
Sinaloense, pues tiene un amplio rango de hospedantes, es un Begomovirus muy
infectivo, y en interacción con TYLCV causa un sinergismo. Anteriormente se había
encontrado que este Begomovirus monopartita introducido desplazaba a los
Begomovirus bipartitas nativos, y las estrategias hacia su control se enfocaron en el
uso de variedades resistentes y el control del insecto vector. Sin embargo, en los años
recientes hubo un repunte de enfermedades virales, la cual puede deberse a la
interacción de estos Begomovirus en la naturaleza. El sinergismo que encontramos
62
entre estos dos Begomovirus en Nicotiana benthamiana puede favorecer la
emergencia de nuevas enfermedades, pues los estudios en este aspecto son pocos.
El sistema de inoculación usado en este trabajo debe emplearse para continuar
estudiando la interacción entre otros Begomovirus, pues de acuerdo a los estudios
realizados, la diversidad genética de este género es amplia. Ampliar los conocimientos
sobre esta patología permitirá establecer estrategias de control más eficientes en un
futuro cercano.
IX. Conclusiones
El Virus del mosaico dorado de la Rhynchosia (RhGMV-Sin) es capaz de causar
una infección en Nicotiana benthamiana, observando la aparición de síntomas
a los 4 dpi e induciendo una severidad alta a los 28 dpi.
63
El Virus del mosaico dorado de la Rhynchosia (RhGMV-Sin) no tiene la
capacidad de infectar el chile híbrido Joe Parker y los tomates híbridos maya y
Sun 6200 de
El Virus del mosaico dorado de la Rhynchosia (RhGMV-Sin) se detectó
molecularmente en hojas inoculadas de tomatillo cultivar Querétaro; sin
embargo, no logró establecer una infección sistémica.
El Virus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate (TYLCV-Gve) es capaz
de causar una infección en Nicotiana benthamiana, observando la aparición de
síntomas a los 7 dpi. Este hecho proporciona una herramienta potencial para el
estudio y comprensión de enfermedades ocasionadas por Begomovirus.
La interacción de TYLCV-Gve y RhGMV-Sin mostró un sinergismo en infección
mixta en plantas de Nicotiana benthamiana, alcanzando una severidad alta a
los 4 dpi, causando enanismo y limitando el crecimiento de la planta.
X. Perspectivas
En este trabajo encontramos que la interacción entre un Begomovirus
monopartita y un Begomovirus bipartita causan una interacción sinérgica en N.
benthamiana, lo cual abre paso a nuevas investigaciones, en un esfuerzo por entender
y predecir los efectos de las infecciones mixtas en el estado. Un paso importante sería
realizar análisis de interacción en los hospederos naturales de TYLCV-Gve y RhGMV-
Sin, así como en plantas de interés comercial, para conocer los efectos de la infección
64
mixta de ambos patógenos, así como también estudiar este tipo de interacción, pero
en su trasmisión con el insecto vector.
De la misma manera, un aspecto fundamental en el área de Virología de
plantas es el uso de clonas infectivas, pero esta estrategia era laboriosa y no se tenía
la garantía de resultados exitosos. En la presente investigación no solo se comprobó
que el RCA es una técnica eficaz para obtener clonas infectivas de manera rápida y
sencilla, como es el caso de TYLCV-Gve, sino que también se desarrolló un método
eficaz para analizar infecciones mixtas de Begomovirus que se encuentran en la
naturaleza, esto permitirá estudiar otras interacciones que se han encontrado en el
estado de manera natural, y conocer qué tipo de interacción representa un riesgo
potencial para cultivos agrícolas, e igualmente, el uso de esta técnica permitirá probar
en el laboratorio diferentes híbridos de semillas, para determinar cuáles pueden
presentar una resistencia a este tipo de virus, o bien, el desarrollo de estrategias para
el control de enfermedades virales.
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