ANALISIS DE MODOS ELEMENTALES EN LA PRODUCCIÓN DE BUTANOL A PARTIR DE ÁCIDOS

GRASOS VOLÁTILES MEDIANTE E. COLI MODIFICADA

JAIRO ALBERTO MOSQUERA DOMINGUEZ

PROYECTO DE GRADO

ASESORA:

JOHANA HUSSERL

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERIA

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA CIVIL Y AMBIENTAL

BOGOTA

2013

INTRODUCCIÓN Durante las últimas décadas debido a la creciente preocupación por el costo, reserva e impacto

ambiental de la extracción y uso de combustibles fósiles las fuentes de energía a partir de recursos

renovables han estado no sólo en los programas locales y globales de los gobiernos sino también

en la mira de la comunidad académica en busca del desarrollo sostenible.

Una de las alternativas energéticas con mayor investigación, normatividad y aplicación en el sector

transporte son los carburantes obtenidos a través de procesos biológicos, conocidos como

biocombustibles. Aunque el etanol es el biocombustible de mayor distribución comercial han

existido problemas debido a algunas de sus propiedades como la alta corrosión que produce, su

alta solubilidad en agua, su alta presión de vapor y la baja densidad energética que posee (todas

con relación a la gasolina). Esta situación ha impulsado el desarrollo de alcoholes carburantes de

cadena más larga que presenten mejoras en las propiedades descritas, como el n-butanol, ya que

permiten usar la infraestructura existente (Atsumi, y otros, 2008).

A pesar de la gran variedad de microorganismos que han desarrollado la capacidad de producir

naturalmente compuestos (actualmente usados como biocombustibles) a través de diferentes

rutas metabólicas, el proceso más eficiente y económico de obtención de alcoholes carburantes es

mediante la fermentación de un medio rico en glucosa y su posterior destilación (Trinh, 2012).

Aunque sea más económico el uso de azucares como materia prima estudios sugieren que cuando

la fuente de carbono son ácidos grasos se obtiene un mayor rendimiento en la producción de

biocombustibles debido a las reacciones metabólicas que deben ocurrir para la formación de

Acetyl CoA, principal precursor de estos (Dellomonaco, Rivera, Cambell, & Gonzalez, 2010).

La optimización de la producción de biocombustibles (conocida también como biorefinería) por

cualquier vía requiere el uso de herramientas y tecnología genética así como un profundo

conocimiento fisiológico del organismo para poder manipularlo efectivamente. Es por esta razón

que la bacteria E. Coli se ha convertido en la principal especie sobre la cual se llevan a cabo

experimentos y procesos de ingeniería genética (Clomburg & Gonzalez, 2010).

En base a lo explicado anteriormente este estudio intentará mediante un análisis de modos

elementales comprobar la existencia de una red metabólica que garantice la viabilidad energética

de crecimiento celular y producción anaeróbica de butanol usando como fuente de carbono los

ácidos grasos volátiles presentes en aguas residuales.

MARCO TEÓRICO

Antecedentes

La producción de bioalcoholes de cadenas de carbono más larga que el etanol se presenta de

manera natural en algunas especies del genero Clostridium (e.g. C. Beijirinckii, C. acetobutylicum).

Sin embargo debido a la falta de información genética se ha dificultado la creación de mejoras

para optimizar su producción. Por ello se han hecho múltiples experimentos de ingeniería

metabólica usando otras especies, como E. Coli, con el fin de crear una sepa capaz de lograr un

proceso industrial económicamente viable para la producción de butanol a partir de diferentes

materias primas. Teniendo en cuenta que la E. Coli dentro de sus rutas metabólicas originales no

posee ninguna en la que se produzca butanol, los experimentos realizados en ella se ven forzados

a insertar genes de Clostridium acetobutylicum (Clomburg & Gonzalez, 2010).

Algunos de los estudios en la producción de butanol de manera anaerobia han tomado como

fuente de carbono el azúcar aunque se han propuesto diferentes rutas metabólicas para su

conversión. Una de ellas consiste en la adición de los genes que permiten la transformación de

acetil-CoA a butanol y la eliminación de los genes que favorecen los caminos metabólicos

fermentativos que son competencia aumentando la generación de butanol (Trinh, 2012). Otro

estudio propone hacer reversible la beta oxidación de ácidos grasos para sintetizar butiril-CoA a

partir de acetil-CoA y agregar los genes necesarios para llevar el butiril-CoA a butanol; en esta

investigación la eliminación de rutas metabólicas competitivas lleva a una disminución en la

producción de butanol (Gulevich, y otros, 2012).

Los trabajos cuya generación anaerobia de butanol se realiza a partir de ácidos grasos por E. coli

también proponen diferentes rutas metabólicas. Dellomonaco et al. (2010) proponen un modelo

respiro-fermentativo siguiendo la beta-oxidación de ácidos grasos produciendo acetil-CoA para su

posterior conversión a butanol mediante enzimas de C. acetobutylicum ATCC 824 insertadas.

Durante el desarrollo de este proyecto se publicó una investigación en la cual mediante la adición

de ADN recombinado se transformaban ácidos grasos de cadena corta a bioalcoholes, sin embargo

la conversión era del acido al alcohol respectivo (i.e. ácido propionico a propanol) (Mattam &

Yazdani, 2013).

Metabolismo de la E. Coli MG1655

La Escherichia Coli es una bacteria anaerobia facultativa cuya fuente de carbono principal son los

azucares, degradados mediante un proceso metabólico conocido como glicólisis, sin embargo por

razones evolutivas ha desarrollado la capacidad de utilizar múltiples compuestos para sus

requerimientos biológicos permitiendo así su supervivencia en una amplia variedad de ambientes.

Algunos de estos compuestos son los ácidos grasos los cuales se dividen en tres clases: ácidos

grasos de cadena larga (>C12), de cadena mediana (C7-C11) y de cadena corta (C4-C6). (Clark &

Cronan, 1996)

El crecimiento de la E. Coli silvestre usando ácidos grasos como única fuente de carbono ocurre

solamente cuando estos son de cadena larga y luego de un periodo durante el cual se induce el

gen regulador fad encargado de los procesos de transporte, activación y degradación de los

ácidos. El crecimiento con ácidos de cadena mediana se produce cuando el gen fad ya ha sido

inducido o por mutaciones en el gen fadR. Los ácidos de cadena corta además de las enzimas

producidas por el sistema fad necesitan otras enzimas para permitir su aprovechamiento

producidas por los genes atoA, atoB y atoD reguladas por el gen atoC (Clark & Cronan, 1996). Se

descubrió que durante la oxidación anaeróbica de ácidos grasos los genes responsables son fadJ,

fadK y fadL que son equivalentes a los genes fadA, fadB, fadD responsables de la oxidación en

condiciones aerobias; el gen fadK es el encargado de la acilación de ácidos de cadena corta

(Campbell, Morgan-Kiss, & Cronan, 2003).

La ruta metabólica mediante la cual se degradan los ácidos grasos se conoce como β-oxidación y

en ella se degradan sustratos homólogos a través de productos intermedios homólogos. En cada

ciclo de la β-oxidación el acil-CoA pierde un fragmento de dos carbonos en forma de acetil-CoA y

produce una molécula de FADH y una de NADH. Las dos últimas se pueden utilizar en la

generación de ATP (Clark & Cronan, 1996). Cuando los ácidos tiene un número de carbonos par el

ciclo termina con el butiril-CoA convirtiéndose en dos moléculas de acetil-CoA, sin embargo

cuando el numero de carbonos es impar termina produciendo una molecula de acetyl-CoA y una

de propil-CoA.

El siguiente paso en la ruta metabólica es el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA por sus siglas en

inglés) el cual cumple dos funciones principalmente: la oxidación total del Acetyl-CoA y la

contribución a la biosíntesis de un amplio número de aminoácidos con los productos intermedios

formados durante el ciclo. Resulta de vital importancia en el crecimiento desde ácidos grasos la

existencia de la desviación del glioxilato ya que permite la circulación total de los carbonos

presentes en el Acetyl-CoA; de no existir esta desviación los carbonos se perderían gradualmente

en forma de CO2 (Cronan & Laporte, 1996). En condiciones anaerobias el TCA no se presenta de

manera completa debido a que el paso de 2-oxoglutarato a succinil-CoA está regulado por el

complejo multienzimático 2-oxoglutarato dehidrogenasa el cual contiene un radical libre generado

durante una reacción con oxígeno (Frank, Kay, Hirst, & Luisi, 2008).

La E. Coli silvestre cuenta en su metabolismo con los genes necesarios para realizar reacciones

anapleróticas mediante las cuales el malato y el oxaloacetato (intermediarios del TCA) son

convertidos a piruvato y a fosfoenolpiruvato (intermediarios de la glicolisis) respectivamente. La

importancia en la producción del fosfoenolpiruvato es iniciar un proceso metabólico conocido

como gluconeogénesis, el cual sigue la ruta inversa de la glicólisis. Durante la revisión de las bases

de datos de la red metabólica se descubrió que ciertos productos intermedios de estas rutas son

los únicos precursores en la biosíntesis de nucleótidos, estructuras de membranas celulares y

algunos aminoácidos.

En condiciones anaerobias cuando no se cuenta con la cantidad adecuada de un aceptor de

electrones se produce la fermentación creando productos a excretar a partir del acetil-CoA y el

piruvato. Los productos más comunes son los ácidos acético, láctico, fórmico, succínico y etanol

regulados por los genes ack, ldh, fhl, frd y adh respectivamente (Bock & Sawers, 1996).

Metatool 5.0 y el análisis de modos elementales

El estudio de bacterias en sistemas in vivo (en sus condiciones naturales) se ha desarrollado desde

hace más de 170 años y en sistemas aislados en cultivos puros (in vitro) por casi 100. Hace un par

de décadas se ha venido estableciendo una forma diferente de realizar predicciones metabólicas

mediante programas computacionales conocido como sistemas in silico los cuales se han visto

beneficiados por la amplia disponibilidad de información genética en bases de datos y por los

avances en informática que permiten introducir aspectos matemáticos y estadísticos al análisis

(Henaut & Danchin, 1996).

Metatool 5.0 es un programa computacional desarrollado por Pfeiffer con la colaboración de

Nuno, Schuster y Moldenhauer que permite entender la estructura de la red metabólica mediante

el cálculo de la cantidad de modos elementales a partir de ecuaciones estequiométricas y

reversibilidad de enzimas (Metatool, 2006).

El método que permite describir la red bioquímica en Metatool 5.0 es el análisis de flujo de modos

elementales. Este análisis se basa en la construcción de rutas de transformación, siguiendo el

análisis estequiométrico de redes de Clarke, para ir desde un sustrato hasta un producto por

medio de reacciones/etapas, donde cada paso es considerado un vector unitario lineal

independiente. Un modo elemental es un conjunto de enzimas que puede funcionar en estado

estacionario; si estas son las únicas enzimas activas y una de ellas es inhibida completamente

algún flujo del sistema en estado estacionario será detenido. Las principales ventajas de este

método son que mediante múltiplos del vector es posible simular cualquier combinación de flujo y

que no es necesario tener información cinética o interactiva entre reacciones para definir los

modos (Schuster, Fell, & Dandekar, 2000).

El método divide los metabolitos en internos y externos, siendo los internos aquellos cuya tasa de

producción es igual a la tasa de consumo y los externos son ajenos al proceso simulado y

provienen de fuentes y van hacia sumideros extracelulares (Schuster, Fell, & Dandekar, 2000).

La única información que se debe conocer acerca de las enzimas que regulan una reacción es su

reversibilidad ya que ésta indica la dirección del vector. Irreversibilidad significa que el flujo neto

siempre tendrá el mismo signo. Especificar la reversibilidad en lugar de crear dos reacciones para

un mismo proceso puede simplificar y reducir el tiempo de los cálculos computacionales (Schuster,

Fell, & Dandekar, 2000).

El programa Metatool 5.0 está disponible de manera gratuita para GNU octave y Matlab en Linux,

Windows y Mac Os. El archivo de entrada debe estar en formato .txt y un ejemplo del esquema

que debe seguir se presenta en la página web de Metatool (Metatool, 2006). El cálculo de modos

elementales se realiza siguiendo el algoritmo propuesto por Urbanczik y Wagner en el cual los

coeficientes estequiometricos, enteros o decimales, se convierten en una matriz que al ser

traspuesta y aumentada da origen a una matriz llamada tabla inicial (von Kamp & Schuster, 2006).

A partir de esta tabla se calculan secuencialmente otras matrices combinando linealmente pares

de filas haciendo que la matriz estequiométrica traspuesta se convierta en vectores nulos

asegurando las condiciones de estado estacionario para cada uno de los metabolitos internos

(Schuster, Dandekar, & Fell, Description of the algorithm for computing elementary flux modes).

ECOCYC

EcoCyc es una base de datos bioinformatica basada en literatura científica que describe el genoma

y el funcionamiento bioquímico de E.Coli K12 MG1655. Además de tener la secuencia genómica

completa tiene la posición de nucleótidos, función y una breve reseña de los productos de todos

los genes. Contiene también una amplia descripción de la red reguladora incluyendo operones,

promotores, factores de transcripción y atenuadores. La base provee de igual manera la

descripción de todas las rutas conocidas de transducción y metabólicas incluyendo las reacciones

de transporte celular, especificando los cofactores, inhibidores, activadores y subunidades de cada

enzima metabólica (Keseler, y otros, 2011).

La base de datos cuenta con un equipo encargado de actualizarla diariamente, a marzo de 2013 se

habían utilizado más de 25000 publicaciones para sustentar la información presentada (EcoCyc,

2013). La página web presenta una interfaz de fácil navegación, comprensión y acceso a la

literatura en la que se basa.

METODOLOGÍA El presente trabajo se dividió principalmente en dos secciones: la construcción de la red

metabólica y el análisis de modos elementales. Durante la construcción de la red central de la E.

Coli MG1655 se utilizó la base de datos bioinformáticos EcoCyc y posteriormente se agregaron y

eliminaron los genes que según la literatura permiten y mejoran la producción anaerobia de

Clostridium Acetobutylicum ATCC824 butanol a partir de ácidos grasos de cadena corta. Para la

segunda etapa se utilizó la herramienta Metatool 5.0 en Matlab determinando la cantidad de

modos elementales presentes en la ruta metabólica de interés.

Debido a la incapacidad de operar la red construida en la herramienta Metatool 5.0 por razones

no determinadas, se utilizó como modelo básico una red metabólica más simple presentada por

Trinh (2012) en el material complementario de su artículo. La red metabólica completa utilizada

durante las simulaciones se presenta en Anexo.

Los ácidos grasos volátiles que se tomaron como fuente de carbono en el modelo fueron decididos

a partir de las eficiencias teóricas y de sus comportamientos metabólicos. La simulación se realizó

utilizando los sustratos puros y combinaciones de éstos.

Como se mencionó anteriormente debido a la incapacidad de generación de butanol por parte de

la E. Coli silvestre es necesario agregar al genoma fragmentos de ADN provenientes de la

Clostridium Acetobutylicum ATCC824. Estos genes que codifican las enzimas necesarias para la

conversión de acetoacetil-CoA a butanol son: hbd, Beta-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase; crt,

crotonase; bcd, butyryl-CoA dehydrogenase; etfAB, electron transfer flavoprotein y adhE2, alcohol

dehydrogenase secundaria (Ver Anexo) (Dellomonaco, Rivera, Cambell, & Gonzalez, 2010).

Para optimizar la producción de butanol se decidió eliminar genes que conducen a rutas

metabólicas competitivas estos son: frd, fumarate reductase, impidiendo la producción de

succinato; ldh, D-lactate hidrogenase, para impedir la producción de lactato; adhE, alcohol

dehydrogenase, encargado de la producción de etanol; pta, phosphate acetyl transferase y poxB,

pyruvate oxidase, interrumpiendo las rutas del acetato (Ver Anexo) (Trinh, 2012).

En el modelo se supone que los ácidos grasos volátiles son la única fuente de carbono, por lo cual

si no existen más nutrientes en el medio no será necesaria la eliminación de ningún gen. Sin

embargo si en el medio se encuentra diferentes materias primas se deben inhibir los procesos de

transporte al interior de la célula de aquellos que tengan mayor “afinidad de consumo” que los

ácidos grasos (e.g. glucosa). En el caso de los azucares supondría la eliminación del operón

ManXYZ.

ANALISIS DE RESULTADOS A partir de la suposición de que todo el sustrato es destinado únicamente a la producción de n-

butanol se halló el rendimiento máximo para distintos ácidos grasos analizados. Siguiendo este

método se obtienen las eficiencias de conversión teóricas presentadas en la Tabla 1.

Tabla 1. Eficiencias másicas y molares teóricas

Ácido Graso Max RMolar

(nAc/nButOH) Max RMass

(gAc/gButOH)

Caproico 1.5 0.94

Pentanoico 0.5 0.35

Butírico 1 0.83

Propionico 0 0

Acético 0.5 0.61

Los ácidos grasos de cadena impar poseen un menor rendimiento debido a que durante la beta

oxidación se pierden dos carbonos de la cadena por ciclo, por lo cual el ácido propionico como

sustrato no entraría en el ciclo ni tendría la capacidad de producir acetil-CoA y resultaría como un

producto en la beta oxidación del ácido pentanoico.

Para determinar la existencia de una red metabólica que resultara energéticamente viable y

produjese tanto butanol como biomasa a partir de ácidos grasos volátiles se realizaron múltiples

simulaciones cambiando la composición del sustrato y los genes suprimidos usando la herramienta

Metatool 5.0. La vía metabólica por la cual se obtiene la mayor eficiencia, además de no generar

crecimiento, resulta energéticamente inviable debido a deficiencias de ATP y NADH incluso para el

ácido graso volátil de cadena más larga (6 carbonos).

Los sustratos elegidos para las pruebas fueron mezclas entre ácido caproico, ácido butírico y ácido

acético y cada uno como sustrato puro. Las cantidades de MEs obtenidos son presentadas en la

Tabla 2.

Tabla 2. Resultados usando ácidos grasos volátiles puros y combinaciones

Condiciones Genes suprimidos

Ácido Acético (AA) Ácido Butírico (AB) Ácido Cáprico (AC) AA+AB+AC AA+AB AA+AC AB+AC

MEs Butoh Biom MEs Butoh Biom MEs Butoh Biom MEs Butoh Biom MEs Butoh Biom MEs Butoh Biom MEs Butoh Biom

Anaerobio - 1 No No 4 No No 8 No No 72 No No 14 No No 19 No No 13 No No

Aerobio - 1212 Sí Sí Error2 - - Error2 - - Error2 - - Error2 - - Error2 - - Error2 - -

Aerobio frd, adhE 994 Sí Sí 2135 Sí Sí 3047 Sí Sí 26207 Sí Sí 8449 Sí Sí 10201 Sí Sí 6146 Sí Sí

Aerobio frd, ldh, adhE 929 Sí Sí 1884 Sí Sí Error1 - - Error 1 - - Error1 - - Error1 - - 5538 Sí Sí

Aerobio frd, ldh, pta, poxB 902 Sí Sí 1888 Sí Sí 2467 Sí Sí 14179 Sí Sí 7092 Sí Sí 5718 Sí Sí 3086 Sí Sí

Aerobio frd, pta, poxB, adhE 831 Sí Sí 1734 Sí Sí 2230 Sí Sí 12448 Sí Sí 6321 Sí Sí 5047 Sí Sí 2854 Sí Sí

Aerobio ldh, pta, poxB, adhE 7219 Sí Sí 41 No No 7317 Sí Sí 53632 Sí Sí 27197 Sí Sí 25694 Sí Sí 42 No No

Aerobio frd, ldh, pta, poxB, adhE 769 Sí Sí 38 No No 3 No No 15 No No 3 No No 7 No No 39 No No

MEs= Modos elementales; Butoh= Butanol; Biom= Biomasa.

En la Tabla 2 se reportan dos tipos de error emitidos por Metatool 5.0. El error1 genera el mensaje

“Integer resolution exceeded” mientras que en el error2 aparece “Cannot sort modes with more

than 52 rows\n”. Los casos en los que se presentó el error1 corresponden a la supresión de los

genes frd, ldh y adhE. El error2 sólo se dio cuando se encontraba la red metabólica completa bajo

condiciones aerobias. No se halló la manera de corregir los errores presentados.

Según los resultados obtenidos es posible evidenciar que, en sustratos puros, al aumentar el

número de carbonos en la cadena del sustrato suele aumentar la cantidad de MEs. En el caso de

las mezclas la cantidad de MEs aumenta cuando hay mayor número de sustancias.

No se puede establecer una relación de correspondencia entre el número de genes suprimidos y la

cantidad de MEs calculados ya que dicha relación depende de la ruta metabólica que se esté

inhibiendo y de la participación de sustancias no producidas en otras rutas. En este aspecto vale la

pena resaltar el aumento en la cantidad de MEs hallados cuando el gen frd no es suprimido, esto

se debe a que dicho gen participa y completa el TCA generando varios subproductos y moléculas

energéticas.

Durante la aplicación del modelo en el caso anaerobio los MEs obtenidos no involucraban una

transformación neta de los metabolitos externos de interés (i.e. butanol y biomasa). En

condiciones aerobias al eliminar todos los genes de subproductos competitivos se presentó el

menor número de MEs, algunos de ellos con producción de las sustancias de interés pero la gran

mayoría no representaban la transformación neta de metabolitos externos.

Si bien cuando se simuló la supresión parcial de rutas competitivas en condiciones aerobias se

identificó la generación de los productos deseados, se identificó también la conversión de los

ácidos grasos a una amplia cantidad de sustancias lo cual sugiere una baja eficiencia en la

producción de butanol. La eficiencia disminuye a medida que aumenta la cantidad de MEs

obtenidos ya que un mayor número de MEs suele producir un mayor número de subproductos.

Al realizar la simulación con ácido acético como única fuente de carbono, en condiciones aerobias

y suprimiendo todas las rutas metabólicas competitivas se identificó la menor cantidad de MEs

que incluían la producción de biomasa y butanol.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Según los resultados obtenidos no es posible producir butanol y biomasa a partir de ácidos grasos

de cadena corta en condiciones anaeróbicas mientras en presencia de oxigeno es posible su

obtención alcanzando la mayor eficiencia (menor número de modos elementales) cuando el ácido

acético es el único sustrato y se han suprimido los genes de las rutas metabólicas competitivas.

La necesidad de oxígeno para la producción de butanol en los modos elementales hallados sugiere

que en los cultivos se deben propiciar condiciones microaerofílicas con el fin de suplir las

necesidades energéticas de crecimiento y producción sin que se inhiban totalmente las rutas

fermentativas.

Si bien la red metabólica utilizada resulta ventajosa para el propósito de este estudio es

importante resaltar que fue creada con el objetivo de simular el consumo de glucosa como

sustrato y no de ácidos grasos lo cual puede generar limitaciones durante la ejecución del modelo.

Aunque se hallaron casos que al suprimir genes resultaban aptos para una producción más

eficiente de butanol a partir de AGV se recomienda profundizar en los detalles de la conversión

mediante el uso de una herramienta que involucre la cinética de las reacciones de las rutas

metabólicas al igual que la cuantificación de moléculas energéticas en los procesos que las

consumen/generan para proponer estrategias de bioingeniería que potencien o eviten dichos

procesos.

A diferencia de la aptitud de la glucosa para la producción de butanol demostrada por Trinh

(2012), el uso de los AGVs no resulta viable bajo condiciones anaerobias. Las principales

diferencias usando AGVs como sustrato son que durante la glucogénesis se consumen moléculas

de ATP y en la betaoxidación se producen moléculas de NADH.

Si bien la conversión de alcohol a partir de AGVs propuesta por Mattam & Yazdani (2013)

representa una ruta metabólica eficiente, en ella no se utiliza el ácido graso como fuente de

carbono. La ruta propuesta exige que para la producción de butanol ingrese únicamente ácido

butírico.

Comparando los resultados obtenidos en este proyecto con los presentados por Dellomonaco et

al. (2010) se evidencia que el uso de ácidos de cadena larga (>C12) resulta más atractivo que los

AGV en la producción de butanol, no obstante debido a su ausencia en las aguas residuales

domésticas no se pueden utilizar en los reactores dedicadas al aprovechamiento de éstas.

Es necesario seguir investigando cómo aprovechar el gran potencial y alta disponibilidad de los

AGV mediante su conversión no sólo a biocombustibles sino hacia otras formas de energía, por

ejemplo directamente a electricidad como se presenta en el estudio de Teng et al. (2010).

Bibliografía Atsumi, S., Cann, A., Connor, M., Shen, C., Smith, K., Brynildsen, M., y otros. (2008). Metabolic

engineering of Escherichia Coli for 1-butanol production . Metabolic Engineering, 305-311.

Bock, A., & Sawers, G. (1996). Fermentation. En F. Neidhardt, Escherichia Coli and Salmonella:

Cellular and Molecular Biology (págs. 262-282). Washington D.C.: ASM Press.

Campbell, J., Morgan-Kiss, R., & Cronan, J. (2003). A new Escherichia Coli metabolic competency:

growth on fatty acid by a novel anaerobic beta-oxidation pathway. Molecular

Microbiology, 47, 793-805.

Clark, D., & Cronan, J. (1996). Two-Carbon Compounds and Fatty Acids as Carbon Sources. En F.

Neidhardt, Escherichia Coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology (págs. 343-

357). Washington D.C.: ASM Press.

Clomburg, J., & Gonzalez, R. (2010). Biofuel production in Escherichia Coli: the role of metabolic

engineering and synthethic biology. Applied Microbiology and Biotechnology, 419-434.

Cronan, J., & Laporte, D. (1996). Tricarboxylic Acid Cycle and Glyoxylate bypass. En F. Neidhardt,

Escherichia Coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology (págs. 206-216).

Washington D.C.: ASM Press.

Dellomonaco, C., Rivera, C., Cambell, P., & Gonzalez, R. (2010). Engineered respiro-fermentative

metabolism for the production of biofuels and biochemicals from fatty acid-rich feedstock.

Applied and Environmental Microbiology, 5067-5078.

EcoCyc. (2013). EcoCyc project overview. Obtenido de Sitio web de EcoCyc:

http://ecocyc.org/EcoCycUserGuide.shtml#node_sec_2

Frank, R., Kay, C., Hirst, J., & Luisi, B. (2008). Off-pathway, oxygen-dependent thiamine radical in

the Krebs cycle. Journal of the AMerican Chemistry Society, 130, 1662-1668.

Gulevich, A., Skorokhodova, A., Morzhakova, A., Antonova, S., Sukhozhenko, A., Shakulov, R., y

otros. (2012). 1-Butanol Synthesis by Escherichia coli Cells Through ButyrylCoA Formation

by Heterologous Enzymes of Clostridia and Native Enzymes of Fatty Acid β-Oxidation.

Applied Biochemistry and Microbiology, 344-349.

Henaut, A., & Danchin, A. (1996). Analysis and Predictions from Escherichia coli Sequences, or E.

Coli In Silico. En F. Neidhardt, Escherichia Coli and Salmonella: Cellular and molecular

biology (págs. 2047-2066). Washington D.C.: ASM Press.

Keseler, I., Collado-Vides, J., Santos-Zavaleta, A., Peralta-Gil, M., Gama-Castro, S., Muñiz-Rascado,

L., y otros. (2011). EcoCyc: a comprehensive database of Escherichia coli biology. Nucleic

Acid Research, 39, D583-D590.

Mattam, A., & Yazdani, S. (2013). Engineering E. coli strain for conversion of short chain fatty acids

to alcohols. Biotechnology for Biofuels.

Metatool. (2006). Recuperado el 2 de Septiembre de 2013, de Sitio web de Metatool 5.0:

http://pinguin.biologie.uni-

jena.de/bioinformatik/networks/metatool/metatool5.0/metatool5.0.html

Schuster, S., Dandekar, T., & Fell, D. (s.f.). Description of the algorithm for computing elementary

flux modes. Obtenido de Sitio web de Metatool: http://pinguin.biologie.uni-

jena.de/bioinformatik/networks/metatool/algorithm.pdf

Schuster, S., Fell, D., & Dandekar, T. (2000). A general definition of metabolic pathways useful for

systematic organization and analysis of complex metabolic networks. Nature

Biotechnology.

Teng, S.-X., Tong, Z.-H., Li, W.-W., Wang, S.-G., Sheng, G.-P., Shi, X.-Y., y otros. (2010). Electricity

generation from mixed volatile fatty acids using microbial fuel cells. Applied Microbiology

& Biotechnology, 2365-2372.

Trinh, C. (2012). Elucidating and reprogramming Escherichia Coli metabolisms for obligate

anaerobic n-butanol and isobutanol production. Applied Microbiology and Biotechnology ,

1083-1094.

von Kamp, A., & Schuster, S. (2006). Metatool 5.0 : fast and flexible elementary modes analysis.

Bioinformatics, 1930-1931.

ANEXO Tabla 1. Red metabólica de E. Coli modificada para el cálculo de modos elementales

Reacción estequiométrica Genes

Activación de ácidos grasos

CAPAC + ATP + COA = CAPYLCOA + AMP fadK

BUTAC + COA + ATP = BUTYLCOA + AMP fadK

ACE + COA + ATP = ACOA + AMP fadK

Beta oxidación de ácidos grasos

CAPYLCOA + NADPH = NADP + TCAPYLCOA fadE

TCAPYLCOA = CAPHYACOA fadBJ; paaZ

CAPHYACOA + NAD = NADH + CAPOACOA fadBJ

CAPOACOA + COA = ACOA + BUTYLCOA fadAI

BUTYLCOA + NADPH = NADP + CROCOA fadE

CROCOA = HYBUTYLCOA fadBJ; paaZ

HYBUTYLCOA + NAD = NADH + AACOA fadBJ

AACOA + COA = 2 ACOA fadAI

Ciclo del ácido tricarboxílico (TCA)

ACOA + OAA = COA + CIT prpC; gltA

CIT <=> CACO acnAB

CACO <=> ICIT acnAB

ICIT + NADP = OG + NADPH + CO2 icd

OG + NAD + COA = NADH + SUCCCOA + CO2 lpdA; sucAB

SUCCCOA + ADP <=> ATP + COA + SUCC sucCD

SUCC + Q = FUM + QH2 sdhABCD

FUM <=> MAL fumABC

MAL + NAD <=> NADH + OAA mdh

FUM + QH2 = SUCC + Q frdABCD

Ruta anaplerótica

ICIT = SUCC + GLYO aceA

GLYO + ACOA = MAL + COA glcB; aceB

PEP + CO2 = OAA ppc

MAL + NAD = PYR + CO2 + NADH sfcA; maeB

OAA + ATP = PEP + ADP + CO2 pckA

Glucogénesis / Glicólisis

PEP + ADP = PYR + ATP pykAF

PYR + ATP = PEP + AMP pps

PYR + COA + NAD = ACOA + CO2 + NADH lpdA; aceEF

P2G <=> PEP eno

P3G <=> P2G pgmAI; ytjC

ADP + PPG <=> P3G + ATP pgk

GLYP + NAD <=> PPG + NADH gapA

DHAP <=> GLYP tpiA

FPP <=> GLYP + DHAP fbaAB

FPP = FP glpX; fbp

FP + ATP = ADP + FPP pfkAB

GP <=> FP pgi

Ruta de la pentosa fosfato

GP + NADP = NADPH + PGL zwf

PGL = GLUP pgl

GLUP + NADP = NADPH + CO2 + RIBUP gnd

RIBUP <=> XP rpe

RIBUP <=> RP rpiA; alsI

XP + RP <=> SHP + GLYP tktAB

SHP + GLYP <=> FP + EP talAB

EP + XP <=> FP + GLYP tktAB

Ruta de ácidos fermentativos

PYR + COA = ACOA + FOR pflB; tdcE

PYR + Q = ACE + CO2 + QH2 poxB

PYR + NADH = LAC + NAD ldhA

FOR = CO2 + HEX hycBCDEFG; fdhF

ACOA + NADH = ACA + NAD + COA adhE

ACA + NADH = ETOH + NAD adhEP

ACOA = ACP + COA pta

ACP + ADP = ACE + ATP ackAB

PYR = ACA + CO2 pdc

Ruta de Entner Doudoroff

GP = KDPG edd

KDPG = PYR + GLYP eda

Síntesis de butanol

2 ACOA = AACOA + COA atoB

AACOA + NADH = HYBUTYLCOA + NAD hbd

HYBUTYLCOA = CROCOA crt

CROCOA + NADH = BUTYLCOA + NAD bcd; etfAB

BUTYLCOA + NADH = BUTAL + NAD + COA adhE2

BUTAL + NADH = BUTOH + NAD adhE2

Síntesis de biomasa

49 GP + 17 FP + 860 RP + 1426 OG + 2355 OAA + 512 EP + 960 PEP + 3920 PYR + 1642 P3G + 31 GLYP + 1207 ACOA + 40680 ATP + 4079 NAD + 18320 NADPH + 12502 NH3 = BIOMASA + 1207 COA + 40680 ADP + 4079 NADH + 18320 NADP

Fosforilación oxidativa y energía de mantenimiento

NADH + 2 ADP + OEX = NAD + 2 ATP nuoAHJKLMNEFGBCI; atpABCDEFGHI

QH2 + ADP + OEX = Q + ATP cyoABCD; atpABCDEFGHI

NADH + Q <=> NAD + QH2 ndh

ATP = ADP + ATPM Ciclos fùtiles

NAD + NADPH <=> NADP + NADH pntAB

AMP + ATP = 2 ADP adk

Transporte en membrana

ETOH = ETOHEX ACE = ACEX NH3EX = NH3 LAC = LACEX SUCC = SUCCEX BUTOH = BUTOHEX CO2 = CO2EX FOR = FOREX ACEX = ACE BUTEX = BUTAC CAPACEX = CAPAC

Abreviaturas de los metabolitos. AACOA: Acetoacetil-CoA; ACA: Acetaldehido; ACE: Ácido acético;

ACOA: Acetil-COA; ACP: Acetilfosfato; AMP: Adenosín monofosfato; ADP: Adenosín difosfato; ATP:

Adenosín trifosfato; BUTAC: Ácido butírico; BUTAL: Butanal; BUTOH: Butanol; BUTYLCOA: Butanoil-

CoA; CACO: Cis-aconitato; CAPAC: Ácido caproico; CAPHYACOA: 3-hidroxihexanoil-CoA;

CAPOACOA: 3-oxohexanoil-CoA; CAPYLCOA:Caproil-CoA; CIT: Citrato; CO2: Dióxido de carbono;

COA: Coenzima A; CROCOA: Crotonil-CoA; DHAP: Dihidroxiacetona fosfato; EP: Eritrosa 4-fosfato;

ETOH: Etanol; FOR: Ácido Fórmico; FP: Fructosa 6-fosfato; FPP: Frutosa 1,6-bifosfato; FUM:

Fumarato; GLUP: Gluconato 6-fosfato; GLYO: Glioxilato; GP: Glucosa 6-fosfato; HYBUTYLCOA: 3-

hidroxibutiril-CoA; ICIT: Isocitrato; KDPG: 2-Keto-3-deoxi-6-fosfo-gluconato; LAC: Ácido láctico;

MAL: Malato; NAD: Nicotinamida adenina dinucleótido; NADH: Dihidronicotinamida adenina

dinucleótido; NADP: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato; NADPH: Dihidronicotinamida

adenina dinucleótido fosfato; NH3: Amoniaco; OAA: Oxaloacetato; OG:Oxoglutarato; P2G:

Glicerato-2-fosfato; P3G: Glicerato-3-fosfato; PEP: Fosfoenolpiruvato; PGL: Gluconolactona 6-

fosfato; PPG: 1,3 bifosfoglicerato; PYR: Piruvato; Q: Quinina; QH2: Quinol; RIBUP: Ribulosa 5-

fosfato; RP: Ribosa 5-fosfato; SHP: Sedoheptulosa 7-fosfato; SUCC: Succinato; SUCCCOA: Succinil-

CoA; TCAPYLCOA:Trans-2-hexenoil-CoA; XP: Xilosa 5-fosfato; las sustancias terminados en EX

hacen referencia a metabolitos externos que entran o salen por transporte celular (e.g. HEX:

Hidrógeno externo; OEX: Oxígeno externo); ATPM hace referencia al ATP utilizado por la célula

para sus procesos vitales.

El símbolo ‘<=>’ hace referencia a que la reacción es reversible. Mientras que el símbolo ‘=’ indica

irreversibilidad.