Análisis Forense del ADN - fm.uach.mx · Flujograma de trabajo Evaluación de las muestras ....
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Genética Forense
M. en C. GUILLERMO EDUARDO CUÉLLAR NEVÁREZ MEDICINA GENÓMICA
GENÉTICA FORENSE
Herramientas tecnológicas
Herramientas científicas
Usos
• Método para identificar orígenes • Casos civiles y penales
Tipos de muestras
• Saliva • Manchas de sangre • Manchas de origen biológico
Apoyo judicial
• Determinar la identidad • Inocencia • Culpabilidad
Identificar víctimas de catástrofes •Tsunami de Asia en
2004 •Ataques terroristas 11
septiembre 2001 NY.
Métodos
Huella basada en VNTR
Regiones no codificantes del
genoma
Secuencias repetidas de ADN entre 15 y 100
pb.
Los VNTR varían desde 1 y 20 kb
Usa enzimas de restricción
Perfiles mediante STR autosómicos
Regiones no codificantes del
genoma
Microsatélites o repeticiones cortas en
tándem.
Varían desde 2 y 9 nucleótidos repetidos
desde 7 y 40 veces.
Utiliza la PCR y electroforesis capilar
Perfil STR cromosomas sexuales
Cromosomas sexuales X e Y
Microsatelites o repeticiones en
tándem.
Varían desde 2 y 9 nucleótidos repetidos
de 7 y 40 veces
Utiliza la PCR y electroforesis capilar.
Perfil ADN mitocondrial
Polimorfismos de un solo nucleótido
Instrucciones: Rellena los recuadros faltantes.
Investigación Integral y Científica
Genética
Química
Medicina
Criminalística
Genética Forense “El uso de técnicas de biología molecular
para la identificación de individuos con base en el análisis de los polimorfismos del ADN.”
¿Qué es una Prueba de ADN?
• Prueba compleja que se compone de una batería de pruebas y procedimientos analíticos (Biología molecular). Se parte de una muestra de origen biológico y siempre se basa en la Comparación de Perfiles Genéticos.
¿Por qué el ADN?
• Es individualizador (excepto gemelos
univitelinos).
• Se encuentra en todas las células del
cuerpo.
• Herencia mendeliana (paterna, materna).
• Se aprovecha el principio de intercambio de
Locard.
El ADN en la Célula
a) Nuclear b) Mitocondrial Sexual y Autosómico = STR´s HV1 y HV2 = Secuenciación
2 Tipos de DNA
ADN Nuclear (AUTOSÓMICO)
• Contenido en el núcleo celular. • Incluye los 22 pares de cromosomas
autosómicos y el par sexual (cromosoma Y).
• Se hereda según las Leyes Mendelianas: 50 % madre y 50 % padre.
Herencia ADN Autosómico
Cromosoma Y (vía Paterna) Sus aplicaciones son: Determinación de vínculos de filiación en
ausencia de progenitor Investigación de identidad y sexo en desastres
masivos Identificación de sospechosos en casos de
violación hetero y homosexual o en agresiones tumultuarias.
Estudios de migración poblacional.
Herencia Cromosoma Y
+ + + +
+
ADN mitocondrial (vía Materna) Sus aplicaciones son: Determinación de vínculos de filiación en
ausencia de progenitor Investigación de identidad y sexo en desastres
masivos Identificación en muestras degradadas Estudios de migración poblacional.
+ + + +
+
Herencia ADN mitocondrial
¿Objetivo de la prueba?
Utilización del ADN
• Casos de Violación • Homicidio • Pruebas de paternidad • Desastres masivos • Reportes de Desaparecidos. • Actualmente se están creando bases de Datos.
“Se busca en cualquier caso la comparación entre evidencia y sospechoso. “
Tipos de Muestras
Evidencia Biológica Muestras de REFERENCIA
(Muestras Indubitadas)
Fuentes de muestra biológica • Sangre • Semen • Saliva • Pelo • Diente • Hueso • Médula • Tejido • Raspado de Uñas
Sangre en FTA
Muestras indubitadas (Víctima-Agresor-familiares )
MUCOSA ORAL
Muestras indubitadas (Víctima-Agresor-familiares )
Muestras indubitadas (Víctima-Agresor-familiares )
SANGRE LÍQUIDA
CABELLO
Flujograma de trabajo
Evaluación de las muestras Extracción del ADN Cuantificación del DNA
Amplificación por PCR de múltiples
marcadores STR Separación y detección de productos de PCR
Determinación del genotipo
Purificación del Material Genético
Extracción por afinidad DNA-IQ ™
Extracción Orgánicas
Fenol :Cloroformo:A. Isoamilico (25:24:1)
Extracción Diferencial Lisis Diferencial
Antes de realizar cualquier tipo de análisis, el DNA debe ser aislado de los componentes celulares así como de cualquier tipo de material no
biológico.
Métodos de Extracción utilizados en el Laboratorio
Orgánica
Lisis Diferencial
Purificación
Afinidad
IQ DNA
Afinidad iónica
Perlas magnéticas
Positivamente
Purificar ADN
Métodos automatizados de extracción de ADN
Electroforesis en Gel de Agarosa
• Se verifica la cantidad e integridad del ADN que se extrajo de las muestras.
• El gel cargado con las muestras se somete a un campo eléctrico y debido a la carga del ADN, éste migra hacia el ánodo.
PCR Tiempo Real • Hibridación con sondas específicas.
• Sondas para DNA humano y se establecen concentraciones control para calcular la concentración de DNA de la muestra.
• Sistema de detección por fluorescencia.
• Analiza ciclo a ciclo los cambios en la señal de fluorescencia
La señal es detectada y aumenta de manera directamente proporcional al aumento del producto de PCR. Eficiencia alta y constante.
La reacción es limitada, existe decaimiento de la actividad enzimática.
La señal fluorescente permanece relativamente constante. La amplificación concluye.
Quantifiler® Duo DNA Quantification
• Cuantifica simultanemente la cantidad total de ADN humano y ADN masculino.
• Cantidad relativa de ADN masculino o femenino. • Presencia de inhibidores.
VIC
FAM
Amplificación del ADN por PCR
Se amplifican marcadores moleculares contenidos en el ADN extraído por medio de PCR Se utilizan primers específicos para 15 STR´s multiplex, loci (D8S1179,
D2S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, THO1, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818 y FGA ) y un marcador de sexo (AMEL).
Los primers están marcados con 4 fluorocromos (6FAM (blue), VIC
(green), NED (yellow), PET (red)) para que puedan detectarse los fragmentos amplificados por CE.
Analizador Genético Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer ABI Prism 310 Genetic Analyzer
capillary
Syringe with polymer solution
Autosampler tray
Outlet buffer
Injection electrode
Inlet buffer
Detección de la Muestra
CCD Cámara
Separación por Color
Ar+ LASER (488 nm)
Fluorescencia
Capilar
Separación
por tamaño
Región detectora
Ar+ LASER (488 nm)
Fragmentos de ADN marcados (productos de PCR )
Electroferograma Representación grafica de la migración de cada una de las moléculas
presentes en un amplificado.
MAMA
HIJO
PRESUNTO
PADRE
ADN en Identificaciones
DIRECCIÓN DE SERVICIOS PERICIALES Y CIENCIAS FORENSES
“2015, Año de José María Morelos y Pavón”
Tres posibles conclusiones:
Exclusión.
No concluyente.
Inclusión.
VALIDACIÓN ESTADÍSTICA.
JOSÉ MARÍA
víctima
PACO
Victima 1
Víctima 2 SOLE
VÍCTOR
GMO ALY
Víctima 1 ROB
Víctima 2
Víctima 3
Víctima 1
GPE
Víctima 2
ANA
MADRE VÍCTIMA PADRE D8S1179 10,11 10,12 12,15 D21S11 30,30 30,33.2 33.2,33.2 D7S820 11,13 11,13 8,11 CSF1PO 12,12 12,12 10,12 D3S1358 16,17 15,17 15,16 TH01 7,7 6,7 6,7 D13S317 12,14 10,12 10,14 D16S539 11,12 11,12 11,12 D2S1338 23,23 23,23 17,23 D19S433 14,14 13.2,14 12,13.2 vWA 16,17 17,17 16,17 TPOX 8,8 8,8 8,11 D18S51 12,12 12,17 15,17 Amel X,X X,Y X,Y D5S818 11,11 11,11 11,12 FGA 22,26 22,26 21,22
Perfiles genéticos de un trio para identificación de una víctima.
VÍCTIMA VAGINAL 1 Y VAGINAL 2
HISOPADO PERIVULVAR, MANCHA DE SEMEN EN ABDOMEN,
CHAMARRA Y PANTALÓN
SANGRE EN CHAMARRA,
Y EN PANTALON
SOSPECHOSO 1
SOSPECHOSO 2
SOSPECHOSO 3
D8S1179 14,15 12,14,15 12,14 14,15 11,15 11,14 12,14 D21S11 30,30 28,30,31.2 28,31.2 30,30 29,30 30,31.2 28,31.2 D7S820 10,11 10,11,12 11,12 10,11 11,12 10,12 11,12 CSF1PO 11,12 10,11,12 10,10 11,12 11,13 10,12 10,10
D3S1358 16,16 15,16,17 15,17 16,16 16,19 14,15 15,17 TH01 7,9 6,7,8,9 6,8 7,9 7,9 7,9 6,8
D13S317 11,13 11,12,13 12,13 11,13 8,8 13,14 12,13 D16S539 9,12 9,11,12 9,11 9,12 11,12 9,11 9,11 D2S1338 16,24 16,22,23,24 22,23 16,24 23,23 23,23 22,23 D19S433 13,14 13,14,15,15.2 15,15.2 13,14 13,16 13,15.2 15,15.2
vWA 17,19 17,19 17,19 17,19 18,19 16,17 17,19 TPOX 8,12 7,8,11,12 7,11 8,12 8,12 8,8 7,11
D18S51 12,15 12,15,16 15,16 12,15 14,16 15,17 15,16 Amel X,X X,Y X,Y X,X X,Y X,Y X,Y
D5S818 11,11 11,13 11,13 11,11 10,11 11,11 11,13 FGA 23,24 21,23,24 21,24 23,24 18,23 24,25 21,24
Perfiles genéticos de un caso de agresión sexual con tres sospechosos.
Con base a los resultados anteriores, determine: 1. ¿Cuál sospechoso es el donador de la muestra? 2. Explique la presencia de mas de dos alelos en las muestras de
VAGINAL 1 Y VAGINAL 2. 3. ¿Cómo validaría estadísticamente su conclusión? 4. ¿Cuál es la frecuencia del perfil genético encontrado en las
muestras?
• Calcular las frecuencias genotípicas del perfil genético obtenido de la evidencia considerando que la población se encuentra en equilibrio H/W.
Alelo 1 Alelo 2 Frecuencia 1 Frecuencia 2 D8S1179 14 15 0.29193 0.11801 2pq D21S11 30 30 0.29503 0.29503 p2
D7S820 10 11 0.30124 0.27019 2pq CSF1PO 11 12 0.29193 0.34783 2pq
D3S1358 16 16 0.26087 0.26087 p2 TH01 7 9 0.30435 0.1646 2pq
D13S317 11 13 0.26398 0.09627 2pq D16S539 9 12 0.1118 0.2764 2pq D2S1338 16 24 0.03106 0.05901 2pq D19S433 13 14 0.2236 0.31056 2pq
VWA 17 19 0.30745 0.07143 2pq TPOX 8 12 0.58385 0.06211 2pq
D18S51 12 15 0.13975 0.1646 2pq D5S818 11 11 0.40994 0.40994 p2
FGA 23 24 0.17391 0.15839 2pq
Alelo 1 Alelo 2 Frecuencia 1 Frecuencia 2 Frec genotipo
D8S1179 14 15 0.29193 0.11801 6.89013E-02 D21S11 30 30 0.29503 0.29503 8.70427E-02 D7S820 10 11 0.30124 0.27019 1.62784E-01 CSF1PO 11 12 0.29193 0.34783 2.03084E-01
D3S1358 16 16 0.26087 0.26087 6.80532E-02 TH01 7 9 0.30435 0.1646 1.00192E-01
D13S317 11 13 0.26398 0.09627 5.08267E-02 D16S539 9 12 0.1118 0.2764 6.18030E-02 D2S1338 16 24 0.03106 0.05901 3.66570E-03 D19S433 13 14 0.2236 0.31056 1.38882E-01
VWA 17 19 0.30745 0.07143 4.39223E-02 TPOX 8 12 0.58385 0.06211 7.25258E-02
D18S51 12 15 0.13975 0.1646 4.60057E-02 D5S818 11 11 0.40994 0.40994 1.68051E-01
FGA 23 24 0.17391 0.15839 5.50912E-02
Frecuencia del perfil genético = 2.9332E-18
Índice forense (LR) = 3.4092E+17
1. Es aproximadamente 340 mil billones de veces mas probable que el SOSPECHOSO 3 sea el donador de la muestra de semen encontrada en las prendas y en el cuerpo de la víctima a que si procede de un individuo tomado al azar de la población de Chihuahua.
BIBLIOGRAFÍA
1. GUTIÉRREZ-ALARCÓN, AB., MOGUEL-TORRES, M., LEÓN-JIMÉNEZ, AK., CUÉLLAR-NEVÁREZ, GE., RANGEL-VILLALOBOS, H. ALLELE AND HAPLOTYPE DISTIBUTION FOR 16 Y-STRs (AmpFISTR Y-filer kit) IN THE STATE OF CHIHUAHUA AT NORTH CENTER OF MEXICO. LEG. MED (TOKYO), 2007, MAY; 9(3): 154-7. 2007 Jan 2.
2. KLUG, W. S., CUMMINGS, M. R., SPECER, C. A., PALLADINO, M. A. “CONCEPTOS DE GENÉTICA”, 10ª EDICIÓN. PEARSON EDUCACIÓN. S.A., MADRID. 2013. PG 544-555.
3. LUIS J. MARTÍNEZ-GONZÁLEZ Y COLS. MEXICAN POPULATION DATA ON FIFTEEN STR LOCI (IDENTIFILER KIT) IN A CHIHUAHUA (NORTH CENTRAL MEXICO) SAMPLE. J. FORENSIC SCI, 2005, VOL 50, NO.1.