Simposio: Actualizacin de Anlogos de GnRHFISIOLOGA DEL GnRH, MECANISMOS DE ACCIN DE AGONISTAS Y ANTAGONISTAS. Dr. Carlos LibertunIBYME-CONICET y Departamento de Fisiologa, Facultad de Medicina, UBA.

Introduccin Quisiera referirme en esta charla a una molcula que modific profunda y positivamente el ejercicio de la medicina de la reproduccin: la hormona hipotalmica liberadora de gonadotrofinas o GnRH. Su hallazgo y la dilucidacin de la estructura qumica primaria fue un hito fundamental. Tres dcadas despus, aun nos sorprenden los aportes conceptuales que este descubrimiento hace a la comprensin de la fisiologa y fisiopatologa de distintos cuadros nosolgicos, y a la potencial aplicacin teraputica de las molculas anlogas derivadas del GnRH. El GnRH es un decapptido, (piro) Glu - His Trp - Ser - Tir - Gli - LeuArg - Pro - Gli - NH2, que es secretado por un pequeo nmero de neuronas enceflicas a la circulacin portal, por la que llega a la adenohipfisis y libera LH y FSH por accin directa sobre los gonadotropos. Al actuar sobre sus receptores especficos en la adenohipfisis ejerce variadas acciones, algunas bien caracterizadas mientras que otras no totalmente esclarecidas. Se conocen las acciones sobre la sntesis y secrecin de FSH y LH, como tambin sobre la expresin de sus propios receptores. Adems, mantendra la integridad estructural y funcional de los gonadotropos (1). La neurona decapeptidrgica

frecuencia de descarga se acelera por la accin fundamental de los estrgenos. Tambin sera de importancia la relacin de la neurona decapeptidrgica con la gla y endotelio adyacentes. La importancia de esta discreta red neuronal, que utiliza distintos neurotrasmisores, es crtica para la regulacin de la secrecin de gonadotrofinas y consecuentemente para la gametognesis y secrecin gonadal, y debe considerarse en la prctica que todo frmaco que acta sobre el sistema nervioso central puede, potencialmente, alterarla. Durante el desarrollo, las neuronas decapeptidrgicas son un caso nico de migracin centrpeta en el encfalo, pues se originan por fuera del mismo en la placoda olfatoria. Migran a travs del primer par craneano hasta ubicarse, aproximadamente la mitad de las neuronas migrantes, en la regin hipotalmica. Desde aqu envan sus axones al plexo portal primario. La otra mitad de neuronas GnRH se ubican en otras regiones, no llegando a tener terminaciones secretoras en el plexo portal; utilizaran al decapptido como neurotransmisor o neuromodulador en circuitos neurolgicos relacionados con la reproduccin y la conducta sexual. El origen de estas neuronas en la placoda, explicara los hallazgos de los casos clnicos en los que, trastornos de la olfacin, se asocian con hipogonadismo como en el Sndrome de Kallman (2-3). El GnRH y sus variantes moleculares naturales

En el adulto los somas de la neurona GnRH se distribuyen difusamente a travs de la base del cerebro anterior. Un grupo, de 500 a 1000 neuronas, se organizan en un centro pulstil, nico, en la regin basal del hipotlamo. Si bien cada neurona tiene una pulsatilidad intrnseca, propia, individual, todas ellas se coordinan en dicho centro, intercomunicadas como una red, para liberar GnRH a la circulacin portal, sincrnicamente cada 45-60 minutos. Sobre dicho centro actan influencias centrales y perifricas que modulan la pulsatilidad del mismo. Por ejemplo, hacia la mitad de ciclo menstrual y antes y durante el pico de FSH y LH, la18 Revista de Endocrinologa Ginecolgica y Reproductiva

La GnRH se cliva de una preprohormona en las neuronas hipotalmicas. El cDNA de la preproGnRH humana fue clonado. Codificara una protena de 921 aminocidos en la que el decapptido es precedido por un pptido seal de 23 aminocidos y continuado por una secuencia Gly-Lys-Arg donde se cliva y procede la amidacin del terminal carboxlico, y un fragmento asociado de 56 aminocidos (GAP). Este ltimo, el pptido asociado GAP, fue postulado como inhibidor de la secrecin prolactnica pero esto no se confirm in vivo. El gen GnRH humano descripto originalmente

(GnRH I), tendra una compleja regulacin de su expresin por acciones de los factores de transcripcin y las hormonas esteroides y peptdicas relacionadas con la reproduccin. Estudios filogenticos indican que el GnRH es una molcula muy antigua y que durante la evolucin, a partir de un gen ancestral comn, se derivaron distintas formas moleculares. Hasta hoy se describieron 15 distintas variantes moleculares del GnRH, desde peces a mamferos, y al menos dos, incluyendo la descripta precedentemente (GnRH I), se hallan en los antropoides. Al GnRH I, aislado originalmente de mamferos y presente en humanos, se suma el encontrado primeramente en aves y luego en mamferos, llamado cGnRH II. Se postula que durante la evolucin estos pptidos adquirieron distintas funciones reguladoras en el SNC, y fuera del mismo donde tambin se los halla. En SNC acta como hormona reguladora de las g o n a d o t rofinas y como neuro t r a n s m i s o r / neuromodulador; en gnadas, placenta y en ciertos tumores actuara como regulador paracrino (4-5). Receptores al GnRH La primera accin del GnRH para ejercer su efecto en el gonadotropo, es reconocer y unirse con gran afinidad y especificidad a un receptor de membrana, el GnRH-R. Es ste una estructura de 328 aminocidos en el humano, con variantes segn la especie, y siete dominios transmembrana acoplados a la protena G. El primer receptor hallado, GnRH I-R, carece de una regin C terminal intracitoplasmtica como se encuentra en otros receptores ligados a protena G. Tambin el tercer loop intracelular es relativamente corto. Ambas caractersticas son importantes para la internalizacin y desensibilizacin de los receptores que utilizan la protena G. En cambio, un receptor recientemente descripto en peces, anfibios y tambin en primates, el GnRH II-R, tiene una pequea cola carboxlica citoplasmtica y luego de su unin al GnRH II, se fosforila, internaliza y desensibiliza. En resumen, el hallazgo de variantes moleculares del GnRH en las diversas especias, ms el distinto efecto del decapptido segn el tejido, llev lgicamente a postular la posibilidad de ms de un GnRH-R. As se identificaron algunos de ellos en vertebrados, que difieren en el tercer loop extracelular y la cola intracelular, que podra distinguir entre las distintas variantes del pptido. Se postula que un GnRH-R ancestral, dio origen a distintos receptores que evolucionaron en paralelo con sus ligandos. El GnRH-R se identific primero en los gonadotropos adenohipofisarios. Con el aislamiento

del GnRH-R cDNA, la expresin de GnRH-R mRNA fue hallado en otras reas como distintas regiones cerebrales y rganos tales como ovario, testculo y placenta. Experimentalmente se observ que en muchos rganos el efecto del GnRH inhibe la diferenciacin y crecimiento celular. Esto se debera a la existencia de distintos receptores o cascada de segundos mensajeros, diferentes a la que empleara el decapptido en el gonadotropo. Estas diferencias en el receptor GnRH y/o en el segundo mensajero segn el rgano, tiene enorme importancia prctica pues abre la posibilidad de hallar anlogos con efecto selectivo y exclusivo sobre un grupo celular. Nuevos estudios sern necesarios para precisar la importancia relativa de estos receptores en la fisiologa reproductiva del humano, y los efectos farmacolgicos de los anlogos. En cuanto al modelo tridimensional molecular del receptor, incluye la disposicin hacia el exterior de un bolsillo hidrioflico determinado por la disposicin de los loops, con cuatro lugares de interaccin con el agonista, y que resulta de importancia para la unin de los frmacos. El nmero de GnRH-R en la hipfisis es regulado por el estado endcrino. Aumentan justamente antes del pico preovulatorio de gonadotrofinas y luego decrece. Su cantidad aumenta por la gonadectoma y decrece por los andrgenos, la preez y la lactancia. Muy importante es el efecto que ejerce el propio decapptido sobre su receptor. La accin dependera de la concentracin y frecuencia del los pulsos que llegan a los receptores. As, se ha observado que la respuesta secretora es mayor ante un segundo pulso de GnRH que ante el primero, si los pulsos estn separados por un tiempo definido. A este efecto se lo denomina de self-priming o autopotenciacin. A cantidades fisiolgicas del pptido, se observa inicialmente una cada en el nmero de receptores (down regulation), con menor respuesta del gonadotropo. Esta fase primera es seguida por una segunda de aumento en el nmero de receptores (upregulation), pero que no implica un mayor sensibilidad del gonadotropo. Esto se debera a que los gonadotropos responden cerca del mximo secretor, con slo 20 % de los receptores ocupados. Concentraciones pequeas, fisiolgicas, del decapptido estimulan la sntesis del receptor y lo mantiene a niveles fisiolgicos, en cambio concentraciones altas y constantes provocan downregulation de los receptores y desensibilizacin de los gonadotropos, por complejos mecanismos como la internalizacin del complejo receptorGnRH y modificaciones en los segundos mensajeros.Revista de Endocrinologa Ginecolgica y Reproductiva

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La importancia de estos eventos es que explicaran la base del uso farmacolgico del GnRH y de sus agonistas, ya que su administracin masiva y continua lleva, luego de una descarga inicial de FSH y LH, a la supresin de la secrecin gonadotrofica (6-10). Mensajeros secundarios en el gonadotropo Luego del estmulo con GnRH se incrementa el metabolismo de los fosfolpidos, el calcio intracelular, y se acumula inositol fosfato en el gonadotropo. Al unirse el GnRH a su receptor y mediado por las protenas G (Gq y G11), activa la fosfolipasa C y la hidrlisis del fosfatidilinositol en inositoltrifosfato y diacilglicerol, que activan finalmente la proteinquinasa C. El calcio intracelular, movilizado desde sus depsitos e ingresado desde el exterior por canales voltaje dependientes, juega un papel fundamental tanto en los procesos de transmisin de seales intracelulares como en los secretorios de FSH y LH. Tambin se ha demostrado que el GnRH-R puede acoplarse a otras protenas G como la Gi y la Gs, inhibiendo o estimulando la adenilato ciclasa, adems de activar otras fosfolipasas, la va de las quinasas activadas por mitgenos (MAPK) y la va de las tirosina quinasas. Por lo tanto, distintos segundos mensajeros pueden estar involucrados en generar la multiplicidad de respuestas observadas ante un estmulo de GnRH (11). Anlogos Peptdicos El uso farmacolgico, clnico, de molculas anlogas al decapptido es muy frecuente. Se han desarrollado anlogos al decapptido original por sustitucin de uno o varios aminocidos del mismo, que son activos por va endovenosa, intramuscular, subcutnea o por va nasal, pero no por va bucal. El uso clnico del GnRH y sus anlogos puede ser con fines teraputicos, para inducir la descarga de LH y la ovulacin; o en otros casos para provocar hipogonadismo hipogonadotrfico en ciertos tumores hormonodependientes, endometrosis, pubertad precoz, etc. y como medio de diagnstico, para distinguir un trastorno de la secrecin gonadotrfica de origen hipofisario de otro extrahipofisario. Con estos anlogos se busca alguna ventaja sobre el decapptido original para su utilizacin mdica; por ejemplo aquellos de larga duracin pueden requerir slo una aplicacin mensual. En general los anlogos tienen mayor afinidad por el receptor que la hormona endgena y permanecen unidos ms tiempo. En una primera fase, el anlogo se une al receptor y descarga FSH y20 Revista de Endocrinologa Ginecolgica y Reproductiva

LH, a veces masivamente (accin agonista), pero luego de agotado el gonadotropo y permanecer unido al receptor evita la accin del GnRH endgeno, llevando a la hiposecrecin gonadotrfica, a veces duradera, e hipogonadismo (accin antagonista). El mecanismo sera de down regulation y desensibilizacin, implicando mecanismo de recepcin y postrecepcin en el gonadotropo, y que llevan al hipogonadismo farmacolgico. Primeramente se logro el bloqueo selectivo de la secrecin gonadotrfica mediante el empleo contnuo del GnRH original, poco prctico, y luego ms fcilmente mediante agonistas de larga duracin. En ambos casos el GnRH o el agonista se une al receptor del gonadotropo persistente, pero reversiblemente, de tal manera que desaparecido el frmaco desaparece la hipogonadotrofinemia y el hipogonadismo. La modificacin de la secuencia aminoacdica, aun el cambio de un solo aminocido, puede alterar la conformacin tridimensional del pptido y la interaccin con el bolsillo exterior en el receptor. Puede actuar como agonista o antagonista, dependiendo del segundo loop extracelular del receptor. Esquemticamente la re p re s e n t a c i n tridimensional del decapptido indica un plegamiento alrededor de la glicina en posicin 6, y as es unido al receptor. La substitucin en dicha posicin por D aminocidos estabiliza la molcula y decrece su metabolismo. Mientras que ambos extremos estn involucrados en la unin al receptor, el amino terminal tambin lo est en la activacin y el reemplazo aqu da lugar a los antagonistas. P e ro el uso de agonistas tiene ciertos inconvenientes. Primeramente, hay una estimulacin inicial de la secrecin gonadotrfica que puede durar das o semanas, y provocar efectos indeseables y contraproducentes al comienzo del tratamiento. Por otro lado, al ser slo activo por va inyectable o por va nasal hace mas difcil su dosificacin, con posible aparicin de efectos locales en la zona de inyeccin. En general son frmacos caros. Todas estas razones afecta la aceptacin por parte del paciente. Llev aos conseguir antagonistas que renan las condiciones para su uso ventajoso en clnica. Estos antagonistas se unen al GnRH-R y bloquean la llegada del decapptido endgeno, lo que lleva directamente a la hiposecrecin de FSH y LH, es decir sin la descarga inicial de las mismas como lo hacen los agonistas. Actuaran por competencia del antagonista con el pptido endgeno por unirse al receptor y el efecto es reversible. La primera generacin de antagonistas eran molculas hidroflicas y

reemplazaban His en posicin 2 y Trp en 3. Luego, la incorporacin de D-aminocidos en posicin 6, como el detirilex, aumentaba la actividad antagonista, pero incrementaba tambin el efecto liberador de histamina lo que limitaban su uso clnico. En una tercera y reciente generacin de antagonistas este efecto indeseable se neutraliz reemplazando el D Arg por D-ureideoalkil aminocidos en posicin 6, como el Abarelix, Antarelix, Cetrorelix, Genirelx e Iturelix. Llamativamente si bien ambas gonadotrofinas caen abruptamente por los antagonistas, el descenso es menos drstico para la FSH, sugiriendo la coexistencia de otro mecanismo regulador para esta hormona. Los nuevos antagonistas brindaran una mejor farmacodinamia, baja toxicidad y mayor tolerabilidad y permitiran una amplia aplicacin clnica. El empleo sera en las situaciones en las que se desea inhibir reversiblemente la secrecin gonadotrfica; por ejemplo, la prevencin inmediata del pico normal de LH en tratamientos de fertilidad o, ms indirectamente, bloqueo de la secrecin gonadal por hipogonadotrofinemia en casos de patologas dependientes de las hormonas ovricas y testiculares. Otro indicacin es la inhibicin directa del antagonista sobre ciertos tumores (12-14). Antagonistas no peptdicos Los agonistas y antagonistas peptdicos requieren su administracin, muchas veces como preparados de larga duracin. Un gran esfuerzo se est desarrollando para la obtencin de antagonistas no peptdicos que pueda ser administrado por va oral. Esto representara una enorme ventajas sobre los inyectables, como mayor aceptacin por los pacientes, mayores facilidades de dosificacin y economa. El comienzo y terminacin de accin del frmaco puede ser facilitado por su administracin oral en lugar del depot. Las molculas no peptdicas que se estn estudiando como base para el desarrollo de los antagonistas, varan enormemente en su qumica, y van desde algunas molculas emparentadas con las benzodiazepinas, hasta otras como la relacionadas con el antimictico ketocanazol. En general son molculas pequeas que ocuparan el bolsillo hidroflico del receptor de GnRH. Si bien observamos hoy el advenimiento de los nuevos antagonistas que comienzan a adquirir preeminencia en la prctica diaria debida a sus ventajas sobre los agonistas, debemos considerar en los prximos aos la posibilidad de contar con un nuevo grupo de antagonistas no peptdicos, activos por va bucal y que se hallan actualmente en investigacin (15).

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