ANBIOGRAMA-SEMINARIO

5/17/2018 ANBIOGRAMA-SEMINARIO - slidepdf.com

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OBJETIVOS1. Determinar la sensibilidad a diversos antibióticos de un microorganismo

2.

Comprender el concepto de antibiótico y su especificidad de acción sobre determinadasbacterias.

3. Conocer el concepto de cepa sensible y resistente.

4. Entender el concepto de halo de inhibición.

5. Ser consciente de la importancia de la higiene y el cuidado en la manipulación de

materiales biológicos.

6. Comprender la importancia de la eliminación de los residuos orgánicos

7. Conocer el instrumental de laboratorio necesario en microbiología y los procedimientos

para su utilización

ANTIBIOGRAMA

ANTIBIOGRAMA: Consiste en el estudio de la sensibilidad o resistencia de determinadomicroorganismo (o grupo de ellos) a varios antibióticos. Se puede utilizar para tratar un

patógeno, añadir a alimentos, en definitiva para saber como se comporta un germen frente a

determinado antibiótico.

Los antibióticos en general pueden ser de amplio espectro o de espectro reducido, estos

últimos van a matar gérmenes más específicamente. Dependiendo del origen o localizaciónde la infección, se va a utilizar uno u otro. Por ejemplo en una infección de garganta no se

debería utilizar uno de amplio espectro ya que mataría también a la microbiota tan

importante para nosotros.

El antibiograma se puede hacer tanto en medio líquido como en medio sólido. En nuestro

caso vamos a utilizar un agar ordinario pero modificado de manera que gérmenes y

antibióticos puedan difundir correctamente: agar de Muëller-Hinton.

Se utilizan para poner los antibióticos, unos discos impregnados que llevan unas letras que

nos indican el antibiótico del que se trata y un número que indica la concentración enmg/ml que tenía la disolución en la que se impregnaron.

Ej: Cloranfenicol a concentración 30mg/ml

Además utilizamos unas pinzas para poner los discos sobre el agar. Pipetas estériles parasembrar la placa. Un hisopo estéril para extender por la superficie el inóculo. Y asa de

siembra y mechero para esterilizar.

Partimos de un cultivo puro de 48 horas. La cepa es potencialmente patógena de humano y

como crece en nuestro cuerpo, la incubación se ha hecho a 37ºC. Vamos a sembrar 0.5ml

que cogemos con la pipeta (agitando para resuspender las células del fondo) y lo vertemossobre la placa. Con el hisopo estéril extendemos bien el inóculo por toda la superficie de la



placa. Con las pinzas cogemos los cuatro discos de antibióticos y los ponemos en la placa

bien separados entre si y de los bordes.

La placa se pone a incubar 48 horas a 37ºC y en posición invertida. Tras la incubación va a

aparecer toda la superficie llena de colonias y alrededor de cada disco aparecerá o no un

halo de inhibición dependiendo de que el germen sea sensible a ese antibiótico.

El tamaño del halo nos va a permitir conocer el grado de sensibilidad al antibiótico o si esresistente. Puede aparecer un pequeño halo aun siendo resistente, esto se debe a la altaconcentración de antibiótico en el medio inmediato al disco.

Resultados, los antibióticos utilizados han sido:

C30: Cloranfenicol 30mg/ml Halo >> 19cm, alta sensibilidad.

MA30: Cefamandoles 30mg/ml > 19cm, alta sensibilidad.

CAZ30: Ceftadina 30mg/ml > 19cm, alta sensibilidad.

CIP5: Ciprofloxacin 5mg/ml Resistente, aparece un halo muy pequeño que no essiginificativo.

Puede aparecer alguna colonia dentro de los halos, esto se debe a mutaciones espontáneasque hacen a algunas bacterias resistentes.

EL ANTIBIOGRAMA: CONCEPTO, APLICACIONES Y NECESIDADES

Las técnicas de antibiograma son las utilizadas en el laboratorio de microbiología para

estudiar la actividad de los antimicrobianos frente a los microorganismos responsables delas infecciones.

Se considera como antimicrobiano cualquier sustancia con capacidad de matar o al menosde inhibir el crecimiento de los microorganismos y que sea susceptible de utilización como

tratamiento en los pacientes. Pueden ser naturales, sintéticos o semisintéticos (modificación

química de un compuesto natural). La historia moderna de los antibióticos comienza con eldescubrimiento de sustancias presentes en unos microorganismos capaces de matar a otros

microorganismos. La utilización de antibióticos supuso un avance enorme en la esperanza



de vida de las personas que padecías procesos infecciosos, aunque desgraciadamente

también supuso un aumento en los niveles de resistencia antibiótica.

El antibiograma tiene cuatro utilidades principales:

La utilidad básica del antibiograma es la instauración de un tratamiento antibióticocorrecto al paciente. Es necesario conocer si el microorganismo responsable de la infección

posee mecanismos que le confieran inmunidad frente a algún antibiótico para no incluirlocomo terapia.

En cuanto al tratamiento el antibiograma no sólo es necesario en la instauración, también

resulta útil en el seguimiento e incluso en la confirmación de tratamientos empíricos. Enocasiones la enfermedad infecciosa resulta grave y se comienza el tratamiento antes de

conocer los datos de sensibilidad de la cepa. El antibiograma tiene que confirmar, o en su

caso corregir el tratamiento.

Otra aplicación de las técnicas de estudio de resistencia es la epidemiología. Es necesario

detectar el aumento de los niveles de resistencia en los aislamientos clínicos para tomar

medidas correctoras.

Por otro lado también puede tener utilidad diagnóstica porque el perfil de resistenciapuede en algún caso orientar en la identificación bacteriana.

Existen multitud de antimicrobianos en el mercado y el número sigue creciendo porque eldesarrollo de más mecanismos de resistencia por parte de los microorganismos se traduce

en un esfuerzo mayor por fabricar más y mejores antibióticos. No es necesario contrastar la

eficacia de todos los antibióticos para cada aislamiento bacteriano. Los criterios que sesiguen para seleccionar que antimicrobianos se ensayan respondes a factores de diversa

índole:

Factores microbiológicos: Tipo de agente infeccioso y mecanismos de resistencia

descritos previamente en su especie.

Factores farmacológicos: Tipo de antimicrobiano y parámetros de absorción, distribución

y eliminación.

Factores del paciente: Tipo de infección. Factores de riesgo y estado general de salud.

Situación inmunológica e hipersensibilidad.

Experiencia anterior referente a los patrones de resistencia antibiótica mas habituales

para cada especie.



PRINCIPALES FAMILIAS ANTIBIÓTICAS. MECANISMOS DE ACCIÓN

Los antibióticos son sustancias que a través de diversos mecanismos logran destruir o almenos neutralizar el crecimiento bacteriano. Actúan a diversos niveles estructurales de las

bacterias:

Antibióticos que actúan sobre la pared bacteriana. Las penicilinas y la vancomicina

impiden la polimerización de las moléculas que constituyen la pared bacteriana, ycondicionan así su lisis

Antibióticos que actúan a nivel de membrana. La colistina se une a la membrana

plasmática por debajo de la pared y la disgrega comprometiendo la viabilidad de la bacteria

Antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas. Los macrólidos por ejemplo se unen

irreversiblemente a los ribosomas bacterianos y no les permiten sintetizar proteínas.

Antibióticos que se unen específicamente al ADN bacteriano e impiden su replicación. Es

el caso de las quinolonas

Antibióticos que bloquean una ruta metabólica esencial para la bacteria de modo que leresulta imposible sobrevivir sin ella. Las sulfamidas se clasifican en este grupo.

Para medir objetivamente la capacidad antimicrobiana de los antibióticos se han establecidoparámetros específicos que dan idea de la potencia de cada fármaco respecto frente a cada

cepa.



La concentración mínima inhibitoria (CMI) es la concentración de antibiótico necesario

para provocar la inhibición del 90% de los microorganismos en el ensayo. Es el parámetro

más empleado en el laboratorio de microbiología porque es el que se ha aplicado para fijar

los criterios que definen a cada cepa dentro de las categorías clínicas de sensibilidad,sensibilidad parcial o resistencia. Gracias a estudios con gran número de cepas se

establecieron criterios de manera que conociendo la CMI frente a un determinado

antibiótico podemos saber si el microorganismo en cuestión es o no resistente a dicho

fármaco.

La concentración mínima bactericida (CMB). Es la concentración de antibiótico necesariapara asegurar la muerte de todos los microorganismos del inóculo empleado. No tiene

utilidad en el laboratorio porque no esta estudiada su correlación con la interpretación

clínica.

Factores de influencia

Para la correcta realización e interpretación de las técnicas de antibiograma deben

considerarse los siguientes factores:

Inoculo. El número de microorganismos aplicados en el ensayo debe reproducir lo más

posible las condiciones en el paciente. El inóculo estandarizado es de 108 células/ml.

Inóculos mayores o menores pueden derivar en falsos niveles de resistencia o sensibilidad.

Medio de cultivo. El medio de Mueller-Hinton es el estandarizado para los métodos deantibiograma. Se dispone en forma líquida y sólida. En función de los requerimientos del

microorganismo puede enriquecerse con sangre.

Antibiótico. Ha de tener la concentración previamente establecida. Debe conservarse en

buenas condiciones. Si pierde actividad cepas sensibles pueden informarse como

resistentes.

Incubación. Las estandarizadas son 37ºC y 20-24 h en atmósfera aerobia o rica en CO2

según el microorganismo.

En ocasiones la actividad antimicrobiana de dos antibióticos se potencia si se administran

simultáneamente. Esta circunstancia se conoce como sinergia y se produce por ejemplo conlos antibióticos ß-lactámicos y los glicopéptidos (vancomicina). Otras veces el efecto es el

contrario, se produce antagonismo entre los dos antibióticos. En las terapias combinadas

hay que tener muy presentes los posibles efectos sinérgicos y antagónicos.

MÉTODOS DE ANTIBIOGRAMA BASADOS EN DIFUSIÓN

Los métodos de difusión se basan en la distribución homogénea del antibiótico sobre losmedios sólidos de cultivo. En términos generales los antibióticos se impregnan en discos de

papel que se colocan sobre placas de medio de cultivo en las que previamente se ha

extendido la bacteria que se considera. Tanto la cantidad de antibiótico como el número de



bacterias (inóculo) deben controlarse cuidadosamente. El antibiótico difunde por el agar

creando un gradiente de concentración decreciente según se aleja del disco. La bacteria si

resulta susceptible no crece en las inmediaciones del disco y forma un halo de inhibición.

Dicho halo es más grande cuanto mayor es el grado de sensibilidad de la cepa alantimicrobiano.

Esta técnica, denominada de disco-difusión es fácil de realizar, barata, aceptada por losorganismos de estandarización y abierta en el sentido que permite analizar cualquier

microorganismo y cualquier antibiótico. Incluso puede aplicarse directamente sobre

muestras clínicas en infecciones graves como la meningitis.

Los discos con antibiótico deben conservarse en frió. El inóculo para sembrar las placas

suele ajustarse por turbidez y debe corresponder con el nivel 0,5 en la escala arbitraria deMcFarland. Tras la incubación se miden los diámetros de los halos de inhibición y se

interpretan los resultados con ayuda de los puntos de corte establecidos internacionalmentepara cada microorganismo y para cada antibiótico.

El principal inconveniente es su carácter sólo cualitativo y su limitación en bacterias

anaerobias y de crecimiento lento. También presenta problemas con antibióticosmolecularmente grandes que difunden poco sobre el agar.



El sistema Epsilon-Test es un ingenioso método de antibiograma por difusión que en lugarde discos utiliza tiras de papel graduadas con valores de CMI e impregnadas con un

antibiótico en forma de gradiente de concentración. La intersección del halo de inhibición

con la tira de papel indica la CMI del microorganismo para dicho antibiótico.

Métodos de antibiograma basados en dilución

Son los métodos clásicos de antibiograma. En términos generales consisten en fabricar

varios tubos de medio de cultivo con diferentes concentraciones del antibiótico en cuestióne inocularlos con la cepa que se estudia. Pueden utilizarse medios líquidos o sólidos. La

CMI corresponde con el tubo de concentración más baja que logre inhibir el 90% del

crecimiento bacteriano.

En función del soporte donde se realizan los sistemas de dilución se consideran métodos demacrodilución con tubos independientes y métodos de microdilución que usan placas

integradas con múltiples pocillos en cada uno de los cuales se coloca una concentración



diferente de antibiótico Los sistemas automatizados de antibiograma se basan en métodos

de microdilución.

Los métodos de dilución son en muchos casos los de referencia por su mayor exactitud y

por su carácter cuantitativo (CMI). Se utilizan para confirmar resultados de difusión y en

los estudios de sinergia y antagonismo antibiótico. Son mas caros y más laboriosos. Tienen

más facilidad para contaminarse y no son tan abiertos como la difusión en cuanto al número

de antibióticos. Las técnicas de dilución no pueden aplicarse directamente sobre muestrasclínicas y en ocasiones la interpretación de resultados es difícil.

La lectura del antibiograma se realiza por turbidez si el medio de cultivo es líquido y por

recuento de colonias en medios sólidos. Una vez obtenida la CMI correspondiente a cadaantibiótico se interpreta siguiendo los puntos de corte establecidos y la cepa se clasifica

como sensible o resistente a efectos clínicos.

Sistemas automatizados

Los laboratorios grandes con muchas muestras clínicas están obligados a realizar muchas

pruebas de antibiograma y necesitan sistemas automatizados que ahorren tiempo. Aunqueexisten muchos todos ellos se parecen bastante entre si. La inoculación, la incubación y la

lectura están automatizadas. Se basan en métodos de microdilución e incluso algunos

integran en el mismo panel pruebas bioquímicas de identificación de modo que ofrecenresultados completos de diagnóstico.

Antibiograma de microorganismos exigentes

Anaerobios

Pueden utilizarse técnicas de dilución (microdilución) y de difusión (Epsilon-Test). Sólo se

realizan en aislamientos valorables clínicamente en los no existe intervención de

microorganismos aerobios. Se utilizan medios de cultivo específicos muy enriquecidosporque suele tratarse de microorganismos exigentes. Se testan los antibióticos más eficaces

frente a estos agentes. Por supuesto todos los métodos deben realizarse asegurando la

ausencia de oxígeno.

Micobacterias

Las micobacterias crecen muy lentamente, lo que dificulta enormemente las técnicas de

antibiograma y las limita a laboratorios de referencia. Existen varios sistemas pero ningunode ellos esta estandarizado, de modo que hay que tomar los resultados con precaución. Elmás utilizado es el método de las proporciones que compara crecimiento en tubos con y sin

antibiótico. El aumento en los últimos años del número de casos de tuberculosis hace que se

trabaje cada vez más en la resistencia antibiótica de M.tuberculosis.

Hongos



Sólo se dispone de métodos estandarizados para levaduras. Aun no para hongos

filamentosos. Son sistemas de microdilución en los que el crecimiento de la levadura se

detecta por turbidez. Las técnicas de difusión tienen dificultades porque los antifúngicos

difunden mal por el agar.

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