ANÁLISE DE AMOSTRAS FORENSES POR ESPECTROMETRIA DE … · anÁlise de amostras forenses por...

A N Á LI S E D E A M O S T R A S F O R E N S E S P O R

E S P E C T R O M E T R I A D E M A S S A D E A L T A R E S O LU Ç Ã O :

I D E N T I F I C A Ç Ã O D E P E S T I C I D A S U S A D O S P A R A A M O R T E

I N T E N C I O N A L / A C I D E N T A L D E A N I M A I S D O M É S T I C O S E S E L V A G E N S

AN A PAT R ÍC IA M AT OS A BR E U

D I S S E R T A Ç Ã O P A R A A O B T E N Ç Ã O D E G R A U D E M E S T R E E M

ENGENHARIA QUÍMICA

ORIENTADORES: Doutora Alexandra Maria Moita Antunes

Dr. Andrea Alexandre

JÚRI

PRESIDENTE: Professora Doutora Conceição Oliveira

ORIENTADOR: Doutora Alexandra Maria Moita Antunes

VOGAL: Professora Doutora Maria Joana Neiva Correia

OUTUBRO 2019

I

A N Á L I S E D E A M O S T R A S F O R E N S E S P O R E S P E C T R O M E T R I A D E

M A S S A D E A L T A R E S O L U Ç Ã O

RESUMO

Matar animais por envenenamento, incluindo espécies protegidas, é infelizmente um

comportamento criminoso frequente. No entanto, a maioria desses crimes não são convenientemente

penalizados devido, em grande parte, à indisponibilidade de metodologias analíticas adequadas para

a identificação dos agentes químicos suspeitos de terem causado a intoxicação.

Este trabalho foi realizado no âmbito de um protocolo estabelecido entre o Centro Química

Estrutural CQE-IST e o Laboratório de Polícia Científica da Polícia Judiciária (LPC / PJ), com o objetivo

final de desenvolver protocolos analíticos para a identificação de potenciais compostos tóxicos em iscos

envenenados, encontrados em locais públicos, ou em amostras obtidas após necropsia animal.

Utilizando a técnica de cromatografia líquida acoplada à espetrometria de massa de alta

resolução com ionização de electrospray, foi otimizado um protocolo analítico para a identificação de

diversos pesticidas. Este protocolo foi inicialmente utilizado para a preparação de uma base de dados,

por análise de pesticidas padrão. Posteriormente, foram analisadas amostras cedidas pelo LPC/PJ de

casos onde havia suspeita da utilização de pesticidas para a morte intencional/acidental de animais

domésticos ou selvagens.

Aplicando a metodologia analítica desenvolvida, e por comparação com a base de dados, foi

possível identificar pesticidas em 13 das 20 amostras analisadas, atestando a viabilidade da

metodologia desenvolvida para a identificação de pesticidas em amostras forenses.

Palavras chave: espectrometria de massa de alta resolução, amostras forenses, pesticidas,

envenenamento animal.

III

A N A L Y S I S O F F O R E N S I C S A M P L E S B Y H I G H R E S O L U T I O N M A S S

S P E C T R O M E T R Y

ABSTRACT

Unfortunately, killing animals by poisoning, including protected species, is a frequent criminal behavior.

However, most of these crimes are not conveniently penalized, due mainly to the unavailability of

suitable standard methodologies to identify the chemical agents suspected of having caused

intoxication.

This work was carried out under the scope of the protocol established between the Centro de Química

Estrutural CQE-IST and the Laboratório de Polícia Científica da Polícia Judiciária (LP /PJ), with the

ultimate goal of developing analytical protocols for the identification of potential toxic compounds in

poisoned baits found in public places or in samples obtained following animal necropsy.

An analytical methodology, based on liquid chromatography coupled with high resolution mass

spectrometry with electrospray ionization, was developed for the identification of multiple pesticides.

This methodology was initially used for the preparation of a data-base, using pesticides standards, and

was subsequently used for the analysis of forensic samples that were provided by LPC/PJ. These

samples were obtained from real cases, where the use of pesticides was suspected for the

intentional/accidental death of domestic or wild animals.

Pesticides were identified in 13 of the 20 samples analyzed, thereby attesting the viability of the

analytical methodology developed for the identification of pesticides in forensic samples.

Key-words: high resolution mass spectrometry, forensic samples, pesticides, animal intoxication.

V

AGRADECIMENTOS

À Professora Doutora Alexandra Antunes pela oportunidade de desenvolver este trabalho, por

todo o apoio e atenção que me deu durante a realização do trabalho experimental e durante a

elaboração desta tese.

À Doutora Andrea Alexandre pela maneira como me recebeu e me ajudou no Laboratório da

Polícia Judiciária.

À Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal, através dos

projetos UID/QUI/00100/2019 e PTDC/QUI-QAN/32242/2017 e do contrato como Investigador Principal

CEECIND/02001/2017 ( A. M. M. Antunes) .Agradeço também ao financiamento conjunto da FCT com

o Programa COMPETE pelo acesso à Rede de Massa (RNEM-LISBOA-01-0145-FEDER-022125).

A todos as pessoas que me ajudaram em tudo o que precisei durante esta viagem e me deram

apoio e motivação diariamente trabalhando ao meu lado.

Às minhas “migas” que, ao longo destes 5 anos, me acompanharam nesta vida de estudante

do IST, na firme convicção de que nos tornaríamos excelentes engenheiras. Em especial à Bia por ter

lavado a loiça nos dias em que fiquei a trabalhar até mais tarde.

À minha família que apesar de não perceberem muito sobre o tema, sempre me disseram as

palavras certas.

Por último, um profundo e sincero agradecimento, ao que é a base de tudo na minha vida, os

meus pais, pelo carinho, compreensão e apoio sem os quais nada teria sido possível.

VII

ÍNDICE 1. Introdução ....................................................................................................................................3

1.1. Enquadramento do Tema ....................................................................................................3

1.2. Pesticidas no contexto criminal de morte de animais ............................................................5

1.2.1. Europa .........................................................................................................................5

1.2.2. Espanha ......................................................................................................................5

1.2.3. Portugal .......................................................................................................................6

1.3. Identificação de pesticidas ...................................................................................................7

1.3.1. Caracterização dos pesticidas a serem incluídos no estudo .........................................7

1.3.2. Métodos de identificação de pesticidas por espetrometria de massa .......................... 10

1.4. Princípios gerais da espetrometria de massa de alta resolução ............................................... 14

2. Objetivo ..................................................................................................................................... 17

3. Parte experimental ..................................................................................................................... 19

3.1. Reagentes ......................................................................................................................... 19

3.2. Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa de alta resolução (LC-HRMS) 19

3.3. Preparação dos Padrões ................................................................................................... 20

3.4. Extração da Amostra ......................................................................................................... 20

4. Resultados e discussão ............................................................................................................. 23

4.1. Análise dos pesticidas padrão - preparação base de dados .................................................... 23

4.2. Análise de amostras forenses ............................................................................................ 26

4.2.1. Caso estudo 1: Isco encontrado num galinheiro ......................................................... 26

4.2.2. Caso estudo 2: Carne encontrada num prato de comida para cão .............................. 29

4.2.3. Caso estudo 3: Uma ave de rapina com suspeita de envenenamento ........................ 30

4.2.4. Caso estudo 4: Comida de cão com suspeita de envenenamento .............................. 32

4.3. Resultados das análises - Amostras forenses .................................................................... 33

5. Conclusões ................................................................................................................................ 34

6. Bibliografia ................................................................................................................................. 35

7. Anexos ...................................................................................................................................... 39

Anexo A: Base de dados ............................................................................................................... 40

Anexo B: Identificação dos pesticidas nas em amostras forenses .................................................. 50

Anexo C: Poster ............................................................................................................................ 53

IX

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Esquema das principais partes de um espectrómetro de massa [adaptado [31]] ................... 14

Figura 2. Ionização por Electrospray - [adaptado[31] ] ......................................................................... 15

Figura 3. Fotografia da amostra 13: diferentes partes de um milhafre real. ........................................ 22

Figura 4. Fotografia da amostra 8 (garras; glote; músculo) pertencentes ao mesmo animal . ............. 22

Figura 5. Fotografia da amostra 12: partes de uma águia imperial. .................................................... 22

Figura 6. Fotografia da amostra 14A e 14B diferentes partes de um milhafre real. ............................. 22

Figura 7. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 307,0965, obtido por ionização de electrospray no

modo negativo da amostra padrão de varfarina; (B) Espetro de massa da varfarina e sua estrutura; (C)

Espectro de MS/MS da varfarina, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao

fragmento maioritário. ....................................................................................................................... 25

Figura 8. A) Isco comercial de bromadiolona B) Isco comercial de Ratax .......................................... 27

Figura 9. I) Proposta de fragmentação para o brodifacume, erro associado da amostra 10 A1 e 10 A2

respetivamente; II) Proposta de fragmentação para o difenacume, erro associado da amostra 10 A1 e

10 A2 respetivamente ....................................................................................................................... 27

Figura 10. I)Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 443,1642 (difenacume-D) e m/z

521,0747 (brodifacume-B) obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão

de Ratax e das amostras 10A1 e 10A2; II) Comparação do espetro de MS/MS do Ratax com as

amostras 10 A1 e 10A2 quando extraído os iões de brodifacume e difenacume. ............................... 28


modo positivo da amostra forense de imidacloropride; (B) Espetro de massa do imidacloropride e sua

estrutura (C) Espectro de MS/MS do Imidacloropride, sendo apresentado a estrutura proposta dos iões

fragmentados. ................................................................................................................................... 29

Figura 12. Fotografia da amostra 2-A (garras e bico) e 2-B (conteúdo estomacal) pertencentes a uma

ave de rapina. ................................................................................................................................... 30

Figura 13. I) Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 541,1621 obtido por ionização

de electrospray no modo negativo da amostra padrão de flocumafeno com a amostra 2A; II) Espetro de

MS/MS do padrão de flocumafeno; III) Espectro de MS/MS da amostra 2A; IV) fragmentação proposta

do ião maioritário. ............................................................................................................................. 31

Figura 14. I) Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 543,1778 obtido por ionização

de electrospray no modo positivo da amostra padrão de flocumafeno com a amostra 2 A e 2B; II)

Comparação dos espetro de MS/MS do padrão de flocumafeno e das amostras 2 A e 2B ; III) Proposta

de fragmentação para os iões fragmentados maioritários da flocumafeno. ........................................ 31

Figura 15. Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 292,0403 (paratião-P) e m/z

262,0661 (aminoparatião-A) obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão

de E-605 forte com a amostra 1 ; II) Comparação dos espetro de MS/MS do padrão de paratião e do

seu metabolito aminoparatião com os da amostra 1 ; III) Proposta de fragmentação para o ião

fragmentado maioritário do paratião; IV) Proposta de fragmentação para o ião fragmentado maioritário

do aminoparatião .............................................................................................................................. 32

X


modo positivo da amostra padrão de terramicina; (B) Espetro de massa da terramicina e sua estrutura

(C) Espectro de MS/MS da terramicina, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao


Figura 17. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 292,0403 ,obtido por ionização de electrospray no

modo positivo da amostra padrão de paratião; (B) Espetro de massa do paratião e sua estrutura (C)

Espectro de MS/MS do paratião, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento

maioritário. ........................................................................................................................................ 40

Figura 18.(A) Cromatograma iónico extraído a m/z 256,0596, obtido por ionização de electrospray no

modo positivo da amostra forense de imidacloropride; (B) Espetro de massa do imidacloropride e sua

estrutura (C) Espectro de MS/MS do imidacloropride, sendo apresentado a estrutura plausível

correspondente ao fragmento maioritário. ......................................................................................... 41


modo negativo da amostra forense de imidacloropride; (B) Espetro de massa do imidacloropride e sua

estrutura (C) Espectro de MS/MS do imidacloropride, sendo apresentado a estrutura do seu fragmento

maioritário. ........................................................................................................................................ 41


modo positivo da amostra forense de imidacloropride; (B) Espetro de massa da acetamiprida e sua

estrutura; (C) Espectro de MS/MS da acetamiprida, sendo apresentado a estrutura plausível



modo positivo da amostra padrão de carbofurão; (B) Espetro de massa do carbofurão e sua estrutura;

(C) Espectro de MS/MS do carbofurão, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente a um

fragmento. ........................................................................................................................................ 42


modo negativo da amostra padrão de clorofacinona; (B) Espetro de massa de clorofacinona e sua

estrutura; (C) Espectro de MS/MS da clorofacinona, sendo apresentado a estrutura plausível



modo negativo da amostra padrão de bromodiolona; (B) Espetro de massa de bromodiolona e sua

estrutura (C) Espectro de MS/MS da bromodiolona, sendo apresentado a estrutura plausível



modo positivo da amostra padrão de estricnina; (B) Espetro de massa da estricnina e sua estrutura; (C)

Espectro de MS/MS da estricnina, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao


Figura 25. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 170,0213 obtido por ionização de electrospray no

modo positivo da amostra padrão de glifosato; (B) Espetro de massa do glifosato e sua estrutura. ... 44

Figura 26. A) Cromatograma iónico extraído a m/z 293,1172,obtido por ionização de electrospray no

modo positivo da amostra padrão de cumatetril; (B) Espetro de massa da cumatetril e sua estrutura;

XI

(C) Espectro de MS/MS do cumatetril, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao


Figura 27. A) Cromatograma iónico extraído a m/z 543,1777, obtido por ionização de electrospray no

modo positivo da amostra padrão de flocumafeno; (B) Espetro de massa do flocumafeno e sua

estrutura; (C) Espectro de MS/MS da flocumafeno, sendo apresentado a fragmentação plausível


Figura 28. A) Cromatograma iónico extraído a m/z 541,1621,obtido por ionização de electrospray no

modo negativo da amostra padrão de flocumafeno; (B) Espetro de massa da flocumafeno e sua

estrutura (C) Espectro de MS/MS da flocumafeno, sendo apresentado a estrutura plausível



modo negativo da amostra padrão de Ratax-brodifacume; (B) Espetro de massa do brodifacume e sua

estrutura; (C) Espectro de MS/MS do brodifacume, sendo apresentado a proposta de fragmentação.

......................................................................................................................................................... 46


modo positivo da amostra padrão de aldicarbe; (B) Espetro de massa do aldicarbe, sua estrutura e iões

aductos observados. ......................................................................................................................... 47

Figura 31. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 318,0130,obtido por ionização de electrospray no

modo positivo da amostra padrão de azinfos metilo ; (B) Espetro de massa do azinfos metilo e sua

estrutura; (C) Espectro de MS/MS do azinfos metilo, sendo apresentado a estrutura do ião fragmentado.

......................................................................................................................................................... 47


modo positivo da amostra padrão de azinfos etilo; (B) Espetro de massa do azinfos de etilo, sua

estrutura e iões aductos observados. ................................................................................................ 48


modo positivo da amostra padrão de deltamitrina; (B) Espetro de massa da deltamitrina e sua estrutura;

(C) Espectro de MS/MS da deltamitrina, sendo apresentado a estrutura do ião fragmentado............. 48


modo negativo da amostra padrão de RATAX ; (B) Espetro de massa do difenacume e sua estrutura.


modo positivo da amostra padrão de E-605 forte; (B) Espetro de massa do aminoparatião e sua

estrutura; (C) Espectro de MS/MS do aminoparatião, sendo apresentado a proposta de fragmentação.

......................................................................................................................................................... 49

Figura 36. I) Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 525,0695 (bromadiolona) obtido

por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de bromadiolona e das amostras:

4, 5, 6, 17 e 18; II) Eespetro de MS/MS do padrão de bromadiolona; III) Full scan da amostra 4,

distribuição isotópica característica de uma molécula contendo um átomo de bromo, exibindo o sinal

isotópico [M-H+2]- de igual abundância ao do monoisotópico a m/z 527,0688; IV) Espetro de MS/MS

do ião extraído da bromadiolona da amostra 5; V) Espetro de MS/MS do ião extraído da bromadiolona

da amostra 6; VI) Full scan da amostra 17, distribuição isotópica característica de uma molécula

XII

contendo um átomo de bromo, exibindo o sinal isotópico [M-H+2]- de igual abundância ao do

monoisotópico a m/z 527,0714; VII) Espetro de MS/MS do ião extraído da bromadiolona da amostra

18; VIII) Estrutura da molécula bromadiolona; IX) Estrutura do ião fragmento maioritário................... 50

Figura 37. I) Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 307, (varfarina) obtido por

ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de varfarina e das amostras: 14-A e

14-B; II) Espetro de MS/MS do padrão de varfarina; III) Espetro de MS/MS da amotra 14-A ; IV) Espetro

de MS/MS da amostra 14-B; V) Proposta de fragmentação para a varfarina, e erro associada ao

fragmento maioritário para ambas as amostras. ................................................................................ 51

Figura 38. Poster apresentado no CQE meeting ............................................................................... 53

1

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Pesticidas selecionados para este estudo. ...........................................................................8

Tabela 2. Compilação das condições experimentais reportadas na literatura para a identificação dos

pesticidas selecionados para este estudo, por LC-MS/MS ................................................................. 10

Tabela 3. Condições cromatográficas utilizadas para a análise de pesticidas. ................................... 20

Tabela 4. Identificação das amostras forenses .................................................................................. 22

Tabela 5. Parâmetros cromatográficos inseridos na base de dados................................................... 24

Tabela 6. Resultados das análises de todas as amostras forenses analisadas neste estudo:

identificação do pesticida .................................................................................................................. 33

Tabela 7. Erros associados aos valores de m/z identificados, para o ião precurssor de bromadiolona e

para o seu fragmento maioritário, em cada uma das amostras analisadas......................................... 51

2

ABREVIATURAS E SIGLAS

AR- Rodenticida anticoagulante

ESI- Ionização por electrospray

ESI (-)- Ionização por electrospray no modo negativo

ESI (+)- Ionização por electrospray no modo positivo

EU- União Europeia

FE- Fase estacionaria

FM- Fase móvel

GC- Cromatografia gasosa

GC-MS- Cromatografia gasosa acoplada à espetrometria de massa

HPLC- Cromatografia líquida de alta eficiência

HRMS- Espetrometria de massa de alta resolução

LC- Cromatografia líquida

LC-ESI(-)-HRMS- Cromatografia líquida acoplada a espetrometria de massa de alta

resolução com ionização por electrospray no modo negativo

LC-ESI(+)-HRMS- Cromatografia líquida acoplada a espetrometria de massa de alta

resolução com ionização por electrospray no modo positivo

LC-MS/MS- Cromatografia líquida acoplada à espetrometria de massa tandem

LD50- Dose letal 50

LPC-PJ- Laboratório da Polícia Científica- Polícia Judiciaria

MS- Espetrometria de massa

MS/MS- Espetrometria de massa tandem

ONGs- Organizações

OP- Organafosforados

PJ- Polícia Judiciária

Tr- Tempo de retenção

3

1. INTRODUÇÃO

1.1. ENQUADRAMENTO DO TEMA

A morte intencional de animais por envenenamento, incluindo espécies protegidas, é

infelizmente um comportamento criminoso frequente.

A toxicologia forense é uma área da toxicologia, multidisciplinar, de características

essencialmente analíticas e que tem como objetivo auxiliar no esclarecimento de questões judiciarias

e judiciais que possam estar relacionadas com intoxicações e suas potenciais consequências, fatais ou

não, no âmbito dos diversos domínios do Direito.[1]

O primeiro grande toxicologista foi, sem dúvida, Philippus Bombastus Von Hohenheim (1493-

1541) mais conhecido pelo seu pseudónimo Paracelso. Efetivamente, foi Paracelso quem definiu pela

primeira vez o conceito de “veneno”, afirmando que “todas as substâncias são venenos; não há

nenhuma que não seja veneno. A dose distingue o veneno do remédio”. Na verdade, a lei de Paracelso

é muito mais complexa, uma vez que a dose tóxica e a exposição global dependem de uma grande

variedade de fatores como a idade, género, espécie, entre outros. Um dos conceitos toxicológicos

subjacentes a esta lei é o conceito de dose letal 50 (LD50)[1] .Em toxicologia a DL50 é a dose necessária

de uma dada substância para matar 50% de uma população.

Uma intoxicação ou envenenamento ocorre quando se ultrapassa a dose máxima de segurança

de uma determinada substância [1]. Estima-se que os pesticidas são usados ilegalmente em até 68%

de todos os casos suspeitos de intoxicação animal [2]. De acordo com a Food and Agiculture

Organizaton (FAO), pesticida é qualquer agente (ou mistura) físico, químico ou biológico com

capacidade, para prevenir, destruir, repelir ou mitigar qualquer peste. Os agrotóxicos não são uma

invenção moderna. Os Sumérios antigos (ano 3300 a.c.) usavam o enxofre elementar para proteger as

plantações dos insetos, e fazendeiros e cientistas medievais experimentavam substâncias químicas

como arsénico [3]. No entanto, as primeiras intoxicações por pesticidas como conhecemos na

atualidade, na vida selvagem e doméstica, foram documentadas no início dos anos 50 [4], [5].

A análise toxicológica das amostras colhidas após a morte do animal permite determinar a

presença ou a ausência de substâncias tóxicas e dos seus metabolitos e avaliar se contribuíram para

a morte deste, ou seja, verificar se existe uma relação causa efeito entre o agente tóxico no organismo

e as alterações detetadas [6]. Existem várias razões para a utilização destes compostos como venenos

na vida animal. Estas práticas são levadas a cabo por caçadores e gestores de zonas de caça, ou por

criadores de gado. As espécies-alvo são principalmente cães selvagens, lobos e mamíferos de

pequeno e médio porte. A existência de conflitos entre caçadores, ou entre estes e as populações

locais, são a razão de inúmeros casos de envenenamento, assim como o controlo de roedores e aves

silvestres consideradas prejudiciais às atividades agrícolas[7], [8]. A crença de que para obter um

rendimento máximo de explorações de caça é necessária a eliminação dos predadores, leva também

à utilização de iscos envenenados, principalmente nas Zonas de Caça [9]. A escolha do veneno depende

de vários fatores, como o tipo de agricultura da região, o conhecimento popular da toxicidade de um

4

produto específico e a sua disponibilidade no mercado local [4]. As organizações governamentais

incentivam a utilização de pesticidas e financiam a compra desses produtos para agricultores e

pecuaristas. Esta situação leva a um uso extensivo desses artigos por pessoal não qualificado, sendo

muitas vezes utilizados de maneira incorreta [4].

Considerando que um Veneno é uma substância tóxica aplicada com a clara intenção de matar

um organismo, podemos classificar os envenenamentos de fauna em: Envenenamento primário e

Envenenamento secundário. No primeiro caso podemos ter dois padrões: o intencional, quando o

propósito é matar um determinado animal, e o acidental, quando há o objetivo de matar um animal e

outro por engano consome o veneno, acabando por morrer. No caso do Envenenamento Secundário,

há um objetivo claro de abater um animal, que posteriormente é consumido por outro. Desta forma, há

transferência de resíduos de um ser para outro, havendo assim envenenamento de forma secundária

[10]. Deste modo a utilização de venenos é um método não seletivo que pode provocar a morte de vários

animais [8].

Os pesticidas podem ser classificados de acordo com a praga a ser combatida. Sendo os mais

conhecidos: Inseticidas, Rodenticidas, Herbicidas e Fungicidas. Muitos dos produtos encontram-se no

mercado durante um período limitado de tempo, pois passam a ser proibidos devido à elevada

toxicidade ou ao elevado tempo de semivida, conjugado com o fenómeno da bioacumulação nos

tecidos gordos dos organismos, que os tornam bastante mais tóxicos[11].

Tanto as leis europeias como as leis nacionais proíbem o uso de venenos como forma de

extermínio. De acordo com o artigo 212-1º do Código Penal Português de 1995, o envenenamento de

um animal está previsto como crime de dano e como tal é punido por lei.

O uso ilegal de agrotóxicos é uma das maiores ameaças sob a qual se encontra a conservação

de algumas das espécies protegidas mais importantes da Península Ibérica. Como forma de contrariar

esta situação, e com o objetivo de avaliar os efeitos do uso do veneno sobre as populações de animais

selvagens em Portugal e estabelecer medidas de controlo para a minimização deste problema, foi

formado recentemente o Programa Antídoto Portugal. Este consiste numa plataforma de cooperação

entre várias organizações (ONGs) (onde se incluem as principais ONGs nacionais) e instituições

nacionais inseridas no âmbito de um programa internacional que se encontra em curso noutros países

europeus [9].

5

1.2. PESTICIDAS NO CONTEXTO CRIMINAL DE MORTE DE ANIMAIS

A classe de pesticidas mais frequentemente utilizada para a morte de animais selvagens varia

de continente para continente e, mais especificamente, entre países.

Nos países onde existe um programa de vigilância de envenenamento da fauna silvestre, os

dados são compilados e permanecem disponíveis na literatura científica. Noutros países, os relatos de

casos são publicados apenas de forma incidental, faltando visões gerais anuais, sendo por isso difícil

a análise de dados em termos estatísticos. Como no âmbito deste trabalho serão analisadas recolhidas

em Portugal, é importante fazer uma revisão bibliográfica dos pesticidas mais utilizados na Europa, e

depois devido a localização geográfica especificar a Espanha e, finalmente, Portugal.

1.2.1. EUROPA

Berny e colaboradores concluíram que na Europa, os inseticidas, organofosforados (OP) e

carbamatos (inibidores de colinesterase), seguida de rodenticidas anticoagulantes (AR) [2] constituem

as classes de pesticidas mais utilizadas para a morte de animais selvagens. Num estudo posterior, foi

especificado que os compostos mais utilizados da classe dos carbamatos foram o carbofurão e

aldicarbe, enquanto que, da classe dos AR, o mais frequente encontrado foi a estricnina [12].

1.2.2. ESPANHA

Foi comprovado que não existe relação entre as classes mais consumidas de Pesticidas na

Espanha (herbicidas e fungicidas) e a mais empregue para matar animais (inseticidas) [4]. No entanto,

foi identificada uma relação inversamente proporcional entre a frequência de envenenamento com a

dose letal de formulações específicas. Curiosamente, o uso ilegal intencional de alguns pesticidas como

venenos não foi afetado pela restrição comercial de suas formulações. Efetivamente, durante o período

de 1990 a 2006, o aldicarbe, o carbofurão e a estricnina foram encontrados em 98% dos casos

resultantes de incidentes de envenenamento de abutres Cinereous (Aegypius monachus) por pesticida

[13].

No período de 2010 a 2013, foi nas Ilhas das Canárias onde ocorreu o maior número de

mortes de animais por pesticidas da União Europeia[14]. Os agrotóxicos carbofurão, bromadiolona,

brodifacume e aldicarbe foram os mais detetados. As espécies ameaçadas são frequentemente

afetadas em incidentes de intoxicação. Os produtos químicos proibidos na União Europeia (EU);

carbofurão e aldicarbe, foram identificados em cerca de 75% dos casos e em quase 100% dos iscos, o

que sugere que esses pesticidas ainda estão disponíveis para a população.

Entre 2005 e 2010, foram registados os níveis de rodenticida anticoagulante no fígado de

animais selvagens e domésticos encontrados mortos em Espanha [15]. Tendo-se concluído que os mais

utilizados foram a clorofacinona (19,7% do total analisado), seguido da bromadiolona (11,0%) e

6

brodifacume (6,7%). Este estudo permitiu concluir que o aumento do envenenamento por AR

encontrado na Espanha em 2007 foi associado ao uso em larga escala de bromadiolona e clorofacinona

na região de Castela e Leão contra uma praga de ratos (argânia comum) em terras aráveis.

Um estudo conduzido por Ruiz et al. [16] teve como objetivo avaliar a exposição a rodenticidas

anticoagulantes de primeira e segunda geração (ARs) em seis espécies de aves rapina das Ilhas

Canárias, através de amostras de fígado. Não foram detetados ARs de primeira geração (ex: arfarin,

estricnina) nas amostras analisadas. No entanto a bromadiolona foi a razão da maior parte das mortes.

Este estudo permitiu concluir que o controle das populações de roedores por ARs sugere que esses

compostos entrarão na cadeia alimentar e, portanto, ameaçarão outras espécies mais vulneráveis.

1.2.3. PORTUGAL

Em 2004 foi criado o Programa Antídoto-Portugal em que uma das primeiras ações foi a

recompilação de dados sobre envenenamento de fauna que estavam dispersos por várias entidades[17].

Foram então reunidas informações anteriores ao início dos trabalhos, entre os anos 1992 a

2003. Apesar de não haver muita informação sobre os venenos utilizados nessa época, sabe-se que

em 2002 uma águia Real foi envenenada com estricnina [18].

Já em 2004, e com a intervenção do Programa Antidoto, realizou se um mapa com as zonas

mais criticas: Beira Baixa (Distrito de Castelo Branco), Alto Alentejo (Distrito de Portalegre), Alto Minho

(Distrito de Viana do Castelo) e Trás-os-Montes (Distritos de Bragança e Vila Real), tendo sido as áreas

que os efeitos dos venenos se fizessem notar com mais intensidade. No mesmo ano, foi reportado um

caso em Portalegre onde se utilizou diclorvos como veneno para matar raposas e cães[19].

Durante o ano de 2005 nos casos de envenenamento de fauna em que foi possível comprovar

laboratorialmente o envenenamento, a estricnina foi o agente tóxico detetado em mais de 60% dos

casos [20].

Em Portugal, são ainda frequentes os envenenamentos com organofosforados altamente

tóxicos já proibidos, e que supostamente não deveriam ser acessíveis, como o paratião (E-605 Forte)

ou como outros que incompreensivelmente ainda são legalizados [21].No que toca a herbicidas temos

como exemplo: o paraquato, um produto altamente tóxico, que se destaca pela elevada mortalidade

de fauna e pessoas que provoca, e que foi comercializado e aplicado sem qualquer tipo de controlo

sério e eficaz [22].

7

1.3. IDENTIFICAÇÃO DE PESTICIDAS

Existem vários métodos analíticos para a determinação de pesticidas. A escolha do melhor

método varia de acordo com a matriz onde se encontram e com as propriedades químicas e físicas do

composto analisado. Existem pesticidas acídicos, neutros ou básicos. Alguns compostos contêm

halogénios, outros fósforo, enxofre ou azoto. Estes heteroátomos podem ter relevância para a

deteção[23]. Essa diversidade causa sérios problemas no desenvolvimento de um método analítico

"universal".

Para detetar agrotóxicos nas amostras que possuem uma mistura de vários componentes numa

matriz complexa, é frequentemente utilizada a cromatografia gasosa ou a cromatografia líquida [24]. A

cromatografia Gasosa acoplada com a espetrometria de massa (GC-MS) e a cromatografia líquida

acoplada à espetrometria de massa tandem (LC-MS/MS) são as técnicas mais adequadas quando

falamos de análise de resíduos de pesticidas [23]. No entanto, o facto da maioria dos agrotóxicos ser

polar e termolábel faz com que atualmente a maioria das análises destes compostos sejam efetuadas

recorrendo a LC-MS/MS, em detrimento de GC/MS [25]. Efetivamente, estes dois métodos foram

comparados para a análise de cerca 500 pesticidas, tendo-se obtido melhores resultados qundo se

utilizou a técnica LC-MS/MS [23].

No presente trabalho vai recorrer-se à cromatografia líquida acoplada à espetrometria de

massa de alta resolução (LC-HRMS) para a determinação de pesticidas em diferentes amostras reco-

lhidas de casos onde havia suspeitado uso de pesticidas no envenenamento de animais. Nesta técnica

alia-se o poder da separação de misturas das técnicas cromatográficas com a sensibilidade, o poder

analítico e de identificação da espetrometria de massa de alta resolução (HRMS).

1.3.1. CARACTERIZAÇÃO DOS PESTICIDAS SELECIONADOS PARA ESTE

ESTUDO

Para identificar os pesticidas que têm mais probabilidade de serem encontrados em amostras

forenses de casos onde há suspeita de morte intencional/acidental por envenenamento, fez-se uma

recolha de dados no que toca aos pesticidas mais utilizados na Europa, Espanha e Portugal,

apresentados na secção 1.2. Foi também efetuado um levantamento junto da Polícia Judiciária sobre

quais os pesticidas que são mais frequentemente utilizados neste contexto criminal. Deste modo, na

Tabela 1 são apresentadas as propriedades físicas e químicas dos pesticidas que foram escolhidos

para a criação de uma base de dados neste trabalho.

8

Tabela 1. Pesticidas selecionados para este estudo.

Classe Nome Com-posto

Grupo Químico

Fórmula Molecular Estrutura Química Ref.

Rodenticida Clorfacinona Indano C23H15ClO3

I

Rodenticida Cumatetralil Cumarínico C19H16O3

II

Rodenticida Flocumafena Cumarínico C33H25F3O4

III

Rodenticida Estricinina Alcalóide C21H22N2O2

IV

Inseticida Carbofurão Carbamato C12H15NO3

V

Inseticida Aldicarbe Carbamato C7H14N2O2S

VI

rodenticida Bromadilona Cumarínico C30H23BrO4

VII

Inseticida Imidacloro-pride

Neonico-tinóide

C9H10ClN5O2

VIII

Inseticida Deltametrina Piretróide C22H19Br2NO3

IX

Inseticida Paratião Organofos-forado

C10H14NO5PS

X

Rodenticida Varfarina Cumarínico C19H16O4

XI

Herbicida Glifosato Glicina substituída

C3H8NO5P

XII

9

Inseticida Azinfos Metilo Organofos-forado

C10H12N3O3PS2

XIV

Inseticida Azinfos Etilo Organofos-forado

C12H16N3O3PS2

XV

Rodenticida Difena-cume/RATAX

Cumarínico C31H24O3

XVI

Inseticida Metomil Carbamato C5H10N2O2S

XVII

Inseticida Aldicarbe Sul-fona

Carbama-tos

C7H14N2O4S

XVIII

Herbicida Paraquat Bipiridílio C12H14Cl2N2

XX

Antibiótico Terrami-cina/oxitetraci-

clina

Tetracicli-nas

C22H24N2O9

XX

Rodenticida Brodifacume / RATAX

Cumarínico C31H23BrO3 XXI

10

1.3.2. MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO DE PESTICIDAS POR ESPETROMETRIA

DE MASSA

Uma vez escolhidos os compostos a incluir na base de dados, o próximo passo foi fazer o

levantamento bibliográfico de quais as condições experimentais mais adequadas à análise destes

compostos por LC-MS. Desta forma, a Tabela 2 resume os diferentes estudos realizados sobre a

análise destes agrotóxicos por LC-MS. A fonte de ionização utilizada em todos os casos foi o ESI.

Tabela 2. Compilação das condições experimentais reportadas na literatura para a identificação dos pesticidas selecionados para este estudo por LC-MS/MS

REFERENCIA TÍTULO COLUNA FASE MÓVEL MODO DE IONIZAÇÃO

ESI

PESTICIDA

ANALISADO

[14] Análise de 117 pesticidas -

envenenamentos vida selvagem

Analytic Accucore, C18 (2,6 µm,

150x3 mm)

A: Água e B: Metanol negativo I, II,

VII, XI

[14] Análise de 117 pesticidas -

envenenamentos vida selvagem

Analytic Synergy, C18 Hydro-RP

(4,0µm, 150x4,6mm)

A: 7,5mM formato amónio

em água e B:Metanol

C: 2% acido fórmico em

água

positivo V, VI,

VIII,

[37] Análise de 52 pesticidas Purospher STARRP-18e (2 μm, 150×

2,1mm)

A: 10% acetonitrilo em

água e B: Acetonitrilo

positivo VIII,

XIV, XV

[38] Determinação pesticidas em

comida

ACQUITY UltraPerformance UPLC

BEH C18, 2.1 x 50 mm, 1.7 µm

A: 0,1% ácido acético em

água e B: 0,1% ácido

acético em metanol

positivo VI, VIII,

XIV

[39] Análise 7 anticoagulantes

rodenticidas

Inertsil ODS-4, C18 (100 x1,5 mm; 3

μm)

A: 10 mM acetato de

amónio em água e

B: 10mM de acetato de

amónio em metanol

negativo I, VII,

XI, XXI

[40] Determinação de rodenticidas

anticoagulantes

Nucleodur C18 (2x125mm, 3μm) A: 5mM formato de

amónio (pH=9) em água

B: formato de amónio em

Metanol (3:7)

negativo II, III, VII, XI,

XVI, XXI


anticoagulantes

UPLC BEH C18 (1,0 x 50mm,

1,7μm)

A: hidróxido de amónio

em água

B: hidróxido de amónio

em metanol

negativo I, III, VII, XI,

XVI, XXI


anticoagulantes

XDB C18 (2,1x100mm, 3,5μm) A: 10 mM acetato de

amónio em água

B:Metanol

negativo II, VII,

XI, XVI, XXI

[41] Análise de Estricnina e seus

metabolitos

Waters X-terra MS-C8 reversed-

phase (100 x 2,1 mm, 3,5 μm)

A: 10 mM acetato de

amónio (pH 4,0) em água

B: Acetonitrilo

positivo IV,

[42] Análise Carbosulfan e seus

metabolitos

Zorbax Bonus-RP C18 (5 μm,

150×2,1 mm,)

A: 1 mM acetato de

amónio em água

B: 1 mM acetato de

amónio em metanol

positivo V,

[43] Análise abrangente de inseticidas KINETEX XB C18 (1,7 μm, 2,1 × 50

mm)

A: 0,2% ácido fórmico ou

5 mM formato de amónio

em água

B: 0,2% de ácido fórmico

ou 5 mM de formato de

amónio em metanol

positivo VIII,

IX,

[44] Análise de pesticidas Synergi Fusion RP 80A C18 (4 μm,

50 x 2,0 mm)

A: água: acetonitrilo

(80:20) com 5mM formato

de amónio

positivo V,

VI,

XVII, XVIII

B: 5mM formato de

amónio em metanol

[45] Análise de Glifosato, e Glifusinato Atlantic C18 (2,6 μm, 150 × 2,1 mm) A: acetonitrilo

B: 0,05 mM acetato de

amónia em água (pH=5)

positivo XII,

[46] Análise Quinolonas e tetraciclinas Zorbax Eclipse XDB C18 (5.0 µm

150×4.6 mm,)

A: 0,1% ácido

heptafluorobutírico em

água e B: acetonitrilo

positivo XIII,

[47] Determinação dos herbicidas:

Paraquat, Diquat, Chlormequat e

Mepiquat

Obelisc R (5 μm 150 × 2.1 mm) A: 20 mM formato de

amónia em água (pH=3) e

B: acetonitrilo

positivo XIX

[48] Análise de inseticidas KINETEX XB C18 (1,7 µm,

2.1×50mm).

A: 0,2% de ácido fórmico

ou 5 mM de formato de

amónio em água

B: 0,2% de ácido fórmico

e 5 mM de formato de

amónia em água

positivo V,

VIII,

X,

XVII

[15] Envenenamento primário e

secundário por rodenticidas

anticoagulantes

C6H5 (150×2.1 mm, 3 μm) A: 10 mM acetato de

amónio (pH: 6.8) em água

B: metanol

negativo I, II, III,

XI, XVI

14

1.4. PRINCÍPIOS GERAIS DA ESPETROMETRIA DE MASSA DE ALTA RESOLUÇÃO

O espectrómetro de massa é um instrumento destinado a separar os iões em fase gasosa

atendendo à sua razão massa carga (m/z). O analisador é a peça principal deste aparelho que utiliza

os campos elétrico, magnético ou uma combinação de ambos para separar os iões de acordo com o

seu valor de m/z [25].

A Figura 1. ilustra um esquema genérico e simplificado de um espectrómetro de massa (MS).

Uma vez introduzida a amostra na fonte de ionização do MS, são gerados iões que vão ser

posteriormente separados no analisador de acordo com o seu valor de m/z e posteriormente

encaminhados para deteção. Um software apropriado instalado num computador efetua os cálculos,

gera os espectros de massa a serem impressos e comanda as funções do espectrómetro [31].

Nos anos mais recentes tornou-se cada vez mais comum o acoplamento de dois ou mais

analisadores em conjunto, permitindo efetuar espetrometria de massas tandem (LC-MS/MS) [32]. O

padrão de fragmentação, obtido no espectro de MS/MS, é bastante informativo quanto à estrutura do

analito. Quando a espectrometria de massa de tandem é associada ao uso de analisadores de alta

resolução torna-se uma combinação poderosa. De facto, nestas condições, os valores de m/z, tanto

dos iões precursores como dos fragmentos podem ser determinados com uma resolução até à quarta

casa decimal. [25][29]

A IONIZAÇÃO POR ELECTROSRAY-ESI

O modo de ionização mais utilizada nas análises por LC-MS é a ionização por electrospray

(ESI; “Electrospray Ionization”) (Figura 2). Há essencialmente três particularidades que caracterizam a

ESI. A primeira destas particularidades é a capacidade para produzir iões multiplamente carregados,

reduzindo assim a razão m/z, de tal modo que é possível analisar compostos de elevada massa

molecular. A segunda característica é que as amostras a serem analisadas devem ser introduzidas em

solução, o que faz com que seja possível o acoplamento com muitas técnicas de separação. Por último,

SISTEMA DE VÁCUO

Entrada da Amostra

Fonte de

Ionização

Analisador

Detetor Sistema de Dados

ATMOSFERA

Figura 1. Esquema das principais partes de um Espectrómetro de massa [adaptado [31]]

15

ESI é uma técnica de ionização suave, provocando pouca (ou nenhuma) fragmentação dos analitos

estudados.

A ionização por este processo permite a criação de iões à pressão atmosférica. Neste processo

a amostra é dissolvida num solvente, e pressurizada num tubo capilar, ao qual é aplicado uma

voltagem. Como resultado, o líquido emerge do capilar à pressão atmosférica, na forma de aerossol.

As gotículas formadas perdem sucessivamente o solvente (são dessolvatadas) e os iões fluem para o

espetrómetro de massas induzidos pelos efeitos da atração electroestática e pelo vácuo. É importante

salientar que só o processo de ionização ocorre à pressão atmosférica; a partir deste ponto, o

espectrómetro de massas encontra-se sob “vácuo” [31]. Recorrendo a ionização por ESI as moléculas

são protonadas no modo de ionização positivo e desprotonadas no modo de ionização negativo,

podendo ocorrer a formação de iões adutos que vão surgir no espectro de massa. A utilização em

simultâneo dos modos de ionização positivo e negativo pode também facilitar a identificação de

compostos em estudo. Na grande maioria dos casos, a ionização no modo negativo resulta produz

moléculas desprotonadas [M- H]-, e no modo positivo, são criadas moléculas protonadas [M+ H]+. No

entanto, podem surgir outros tipos de adutos, como a molécula sodiada, [M+Na]+, ou o aduto formado

com amónio [M+NH4]+, dependendo das características da amostra e do solvente. [25].

Figura 2- Ionização por Electrospray - [adaptado[31] ]

ANALISADOR DE MASSA Q-TOF

Após serem gerados na fonte de ionização, os iões são transferidos para uma região do

equipamento, conhecida como analisador, onde são separados de acordo com o seu valor de m/z. Os

instrumentos Q-TOF oferecem uma ampla gama de recursos devido à combinação de alta

sensibilidade, alta resolução e alta precisão de m/z para iões precursores e dos seus fragmentos[33].

Os analisadores Quadrupolo-Tof conjugam o quadrupolo (célula de colisão) com um analisador

de tempo de voo, permitindo a análise de alta resolução e alta precisão de m/z de todos os iões

16

simultaneamente. O Quadrupolo não é utilizado como analisador, mas atua no modo MS/MS, como um

filtro iónico seletivo, focalizando o feixe de iões para o TOF. O princípio de operação do TOF baseia-se

na medida do “tempo de voo” de um ião dentro do espectrómetro de massa. Uma vez que as dimensões

do tubo e a energia cinética dos iões são bem conhecidas, o cálculo da razão m/z torna-se simples. Os

iões mais leves aceleram mais rápido no tubo de voo até o detetor. Os sistemas Q-TOF MS/MS

possuem uma capacidade de medir a fórmula elementar de um analito desconhecido com um erro até

5 ppm[34]. Esse tipo de resolução permite a medição do valor de m/z do ião com um elevado grau de

exatidão e, assim, uma identificação inequívoca de sua composição elementar[35].

17

2. OBJETIVO

Este trabalho realizou-se no âmbito de um protocolo estabelecido entre o CQE-IST e o LPC/PJ,

com o objetivo final de desenvolver protocolos analíticos para identificação de potenciais compostos

tóxicos em amostras recolhidas de casos onde tenha havido a suspeita de envenenamento de animais

domésticos ou selvagens.

Usando a técnica de em espectrometria de massa de alta resolução acoplado à cromatografia

líquida (LC-HRMS), este trabalho teve três objetivos principais:

1. Preparação de uma base de dados de HRMS e cromatográficos dos pesticidas mais frequentemente

utilizados para o envenenamento de animais.

2. Desenvolvimento de protocolos para preparação de amostras.

3- Identificação da substância utilizada para o envenenamento de animais em amostras reais obtidas

através do LPC/PJ.

19

3. PARTE EXPERIMENTAL

3.1. REAGENTES

Os solventes utilizados foram: acetonitrilo (OPTIMA® LC/MS GRADE, Fisher Chemical),

metanol (OPTIMA® LC/MS GRADE, Fisher Chemical ), ácido fórmico (OPTIMA® LC/MS GRADE,

Fisher Chemical), acetato de amónio (OPTIMA® LC/MS GRADE, Fisher Chemical). Foi utilizada a

água ultrapura (OPTIMA® LC/MS, Fisher Chemical) para a cromatografia.

Os padrões de pesticidas foram disponibilizados pelo LPC/PJ exceto o carbofurão que foi

adquirido da Aldrich (Espanha).

3.2. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSA

DE ALTA RESOLUÇÃO (LC-HRMS)

Para as análises por LC-HRMS utilizou-se um analisador híbrido de quadrupolo-tempo de voo

(QTOF) IMPACT II (Bruker Daltoniks, Bremen, Alemanha) com uma fonte de ionização por electrospray

(Bruker Daltoniks, Bremen, Alemanha) acoplado a um sistema de UPLC Elute (Bruker, Bremen,

Alemanha). A coluna e o autosampler foram mantidos a 45ºC e a 8ºC, respetivamente. O volume de

injeção foi de 5-10 μL. As amostras foram separadas numa coluna UPLC Kinetex (Phenomenex) Polar

C18 100A, 100x2.1mm. Foi utilizado um fluxo para a fase móvel de 400 μL/min, utilizando-se o seguinte

gradiente: Iniciando com 100% de ácido fórmico em água (0,1%), ou acetato de amónio 5mM (pH 6.5)

(eluente A) que foi mantido durante 1 min, seguido de um gradiente linear de 4 min de gradiente linear

até 80% de acetonitrilo (eluente B), seguindo de um gradiente de 5 min até 100% de B, mantendo estas

condições por 2 min, gradiente de 1 min até 100% de B seguido de 3 min de eluição isocrática nestas

condições. Resumidamente as condições cromatográficas encontram-se representadas na tabela 4.

.

20

Tabela 3. Condições cromatográficas utilizadas para a análise de pesticidas.

Os espectros de MS foram adquiridos nos modos positivo e negativo com os seguintes

parâmetros: voltagem do capilar, ± 4,5 kV; gás nebulizador, 2,9 psi; fluxo do gás de secagem, 8 L/min,

temperatura do gás de secagem, 200 ºC. A calibração interna foi efetuada com formato de sódio

introduzido na fonte de ionização via um loop de 20 µL no início de cada análise, usando a divert valve.

A calibração foi feita usando o modo high-precision calibration (HPC). As aquisições foram efetuadas

numa janela a m/z 50-1000 com uma taxa de aquisição de 3 Hz usando um método dinâmico com um

tempo de ciclo fixo de 3s em modo data-dependent (DDA) ou broadband CID (BBCID).

3.3. PREPARAÇÃO DOS PADRÕES

Numa fase inicial do trabalho experimental foram preparadas soluções padrão de cada um dos

pesticidas em acetonitrilo com uma concentração de 1 × 10−3𝑚𝑜𝑙𝑑𝑚−3. Cada uma destas soluções foi

depois diluída de forma a se otimizar o sinal obtido para cada um dos pesticidas.

3.4. EXTRAÇÃO DA AMOSTRA

Foram utilizadas duas metodologias diferentes para a extração das distintas amostras. Uma

realizada no LPC/PJ, extração com metanol, e outra efetuada para as amostras em que havia suspeita

de envenenamento por rodenticidas anticoagulantes, tendo-se executado uma extração adicional com

PARÂMETRO DESCRIÇÃO

Coluna UPLC Kinetex (Phenomenex) Polar C18

Fase móvel A 0,1% ácido fórmico

Ou acetato de amónio 5mM (pH 6.5)

Fase móvel B Acetonitrilo

Volume de injeção 5 µl

Fluxo 400 µl/min

Temperatura da coluna 45º

Gradiente

Tempo (min) %Fase

móvel A

%Fase

móvel B

0 100 0

1 100 0

5 80 20

10 0 100

12 0 100

13 100 0

16 100 0

21

água/acetona e diclorometano[49] . Esta extração foi feita para as amostras número 10 A1, 10 A2 e 18

pois havia suspeita que nestas se encontrasse rodenticidas, assim como para o padrão de brodifacume

(Ratax). Para tal, a amostra de rodenticida foi pulverizada num almofariz, colocada num tubo de ensaio

e dissolvida com 1 ml de água desionizada. Seguidamente, juntou-se uma solução de 2ml (1:1, v/v) de

acetona e diclorometano. A mistura foi colocada num banho de utrasons e foi posteriormente

centrifugada durante 3 min, tendo-se obtido 3 fases distintas (aquosa, orgânica e solida). Por fim

separou-se a fase orgânica das restantes e analisou-se a mesma no LC-HRMS.

Na tabela 4, encontra-se a identificação das amostras cedidas pelo LPC/PJ, importante referir

que cada número corresponde a um animal diferente.

22

Tabela 4.Identificação das amostras forenses

Identificação Proveniência

1 Comida no quintal

2-A Garras e bico

2-B Conteúdo estomacal

4 Veneno em via publica

5 Isco carne casa particular

6 Rodenticida no quintal

7 Águia Imperial

8 Garras; glote; musculo

9 Vomitado canídeo em terreno par-ticular

10-A1 Isco em quintal

10-A2 Isco em quintal

11 Poço- líquido azul

12 Águia Imperial

13 Milhafre Real

14-A Milhafre Real

14-B Milhafre Real

16 Milhafre Real

17 Cadáver de ovídeo

18 Isco quintal

19 Comida de cão

Figura 4. Fotografia da amostra 8 (garras; glote; músculo) pertencentes ao mesmo animal .

Figura 3. Fotografia da amostra 13: diferentes partes de um milhafre real.

Figura 5. Fotografia da amostra 12: partes de uma águia imperial.

Figura 6. Fotografia da amostra 14A e 14B diferentes partes de um milhafre real.

23

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O procedimento da análise de resultados implicou dois passos importantes: o primeiro foi a

análise inicial dos pesticidas padrão por LC-HRMS/MS, nas condições estipuladas para este trabalho.

Com esta informação foi possível criar uma base de dados. O segundo passo teve como objetivo a

identificação de pesticidas em diferentes amostras forenses por comparação com o a base de dados

dos padrões.

4.1. ANÁLISE DOS PADRÕES-PREPARAÇÃO BASE DE DADOS

Para a preparação da base de dados foram analisadas, nas condições experimentais

estipuladas para este trabalho, as soluções padrão de cada um dos pesticidas selecionados (Tabela

1). Cada amostra padrão foi analisada por LC-HRMS/MS por ESI (+) e ESI (-), tendo-se utilizado como

eluente aquoso uma solução de ácido fórmico (0,1%) ou de acetato de amónio 5mM pH 6,5. Foi utilizada

uma coluna Kinetex (Phenomenex) Polar C18, uma vez que este tipo de fase estacionária garante a

eluição de compostos muito polares, que em colunas C18 standard não são retidos, oferecendo assim

possibilidade de analisar com uma só coluna um maior número de compostos de polaridade muito

distinta.

Depois de cada um dos padrões ter sido analisado nas condições anteriormente descrito foi

construída uma base de dados contendo a seguinte informação (Tabela 5): Valores de m/z teóricos da

molécula protonada ou desprotonada, tempo de retenção (Tr), modo de ionização preferencial - ESI(+)

ou ESI (-) - e valores de m/z experimentais para os fragmentos mais abundantes (obtidos no espetro

de HRMS/MS).

A identificação dos compostos foi possível devido a um dos principais atributos dos

instrumentos Q-TOF, que é a alta resolução, dando a composição elementar do ião precursor e dos

seus fragmentos. A identificação estrutural é valiosa (fragmentação característica de cada pesticida),

tornando possível a obtenção dos valores de m/z com grande exatidão (com erros inferiores a 5 ppm)

tanto dos iões precursores como dos fragmentos, permitindo chegar à sua composição elementar.

Assim, o risco de relatar resultados falso-positivos é extremamente baixo.

24

Tabela 5. Parâmetros inseridos na base de dados

Composto m/z [M+H]

teórico

m/z [M-H]

teórico

Modo de

Ionização

Tr

(min)

Ião precursor

m/z

experimental

Fragmento 1

m/z

experimental

fragmento 2

m/z

experimental

Varfarina

309,1121

307,0965 negativo

positivo

6,1

6,1

307,097

309,1128

250,0627

251,0704

117,0395

163,0392

Terramicina 461,1555 459,1398 positivo 3,3 461,1562 426,124 201,0573

Brodifacoum 523,0903 521,0747 negativo 7,6 521,0766 135,044 187,037

Difenacoum 445,1798 443,1642 negativo 7,2 443,1644 293,1309 135,0458

Paratião 292,0403 290,0247 positivo 6,7 292,0401 235,9769 189,9836

Amino-paratião 262,0661 260,0505 positivo 5,9 262,0654 187,9923 172,0153

Imidacloropride 256,0596

254,0439

positivo

negativo

4,2

4,5

256,0601

254,0451

209,0586

207,0435

175,0970

179,9947

Acetamipride 223,0745 221,0589 positivo 4,4 223,0733 126,0129 144,0225

Glifosato 170,0213 168,0056 positivo 0,7 170,0204 87,1327 135,1247

Flocumafena

543,1778

541,1621

positivo

negativo

7,5

7,6

543,1764

541,1638

355,1314

382,1210

159,0417

289,0872

Estricnina 335,1754 333,1598 positivo 3,7 335,1762 184,0756 264,102

Deltamitrina 503,9804 501,9648 positivo 7,8 503,9803 280,8991 171,9864

Cumatetril 293,1172 291,1016 positivo 6,2 293,1164 175,04 121,0318

Clorofacinona 375,0782 373,0626 negativo 7,4 373,065 201,047 145,0284

Carbofurano 222,1125 220,0968 positivo 5,2 222,1134 123,0452 77,0395

Azinfos metilo 318,0130 315,9974 positivo 1,4 318,0138 162,0581 134,0511

Aldicarbe 191,0849 189,0692 positivo 4,7 *191.0851

*O aldicarbe é o composto que não tem MS/MS. Mas contem o ião m/z 213,0671 com maior intensidade que corresponde ao ião

aducto [M+Na], e contem também o ião [M+NH4 ] com m/z 208,1112, com uma intensidade inferior mas ainda maior que a do

próprio ião m/z 191,0851.

negrito: modo de ionização preferencial

25

A título ilustrativo, de seguida será explicado como foram recolhidas as informações para a construção

da base de dados, no caso do rodenticida bromodiolona.

Todos os cromatogramas foram analisados no programa Data Analysis. No cromatograma

iónico extraído a m/z 307,0965, por análise de ESI (-) do padrão da varfarina (Figura 7 A), foi possível

identificar um sinal a 6,1 min que apresenta no espectro de full scan (B), um ião a m/z 307,0970 ± 1,67

ppm correspondente à molécula desprotonada de varfarina. Os sinais observados no espectro de

MS/MS (C), vieram completar a informação, sendo observado o pico base deste espectro a m/z

250,0627 ± 1,02 ppm, que corresponde à saída do grupo acetilo, a partir da molécula desprotonada.

De modo análogo, foram recolhidas manualmente todas a informações necessárias dos diferentes

padrões para a realização da base de dados. O modo de ionização preferencial, ESI(+) ou ESI(-),

depende das características estruturais de cada composto. No anexo A encontram-se representado

todos os cromatogramas iónicos obtidos para os pesticidas padrão assim como os espectros de HRMS

de full scan e de MS/MS.

Figura 7. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 307,0965, obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de varfarina; (B) Espetro de massa da varfarina e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS da varfarina, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.

311.2184

307.0970

WARFARINA NEG AA_49_01_16548.d: -MS, 6.1min #432

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

6x10

Intens.

250 300 350 400 450 500 m/z

m/z 307,097 ± 1,67ppm

117.0395

161.0273

206.0733

250.0627

-MS2(307.0970), 6.1min #434

0

2

4

6

4x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z

m/z 250,0627 ± 1,02ppm

Tempo de retenção= 6,1 min

Varfarina

Fragmento 1

A

B

C

26

4.2. ANÁLISE DAS AMOSTRAS FORENSES

Foram analisadas 20 amostras cedidas pelo LPC-PJ e será seguidamente explicado, com

maior detalhe, o processo de identificação dos pesticidas presentes em quatro destas amostras.

De modo a garantir que as amostras forenses eram analisadas nas condições favoráveis à

identificação do maior número possível de pesticidas, foram todas analisadas tanto no modo de

ionização de ESI (+) como por ESI (-), utilizando como fase móvel aquosa tanto uma solução de ácido

fórmico como uma solução de acetato de amónio.

Todos os cromatogramas inspecionados manualmente utilizando o programa Data Analysis.

Em cada um dos modos de ionização – ESI (+) ou ESI (-) - procurou-se extrair os diferentes iões que

correspondiam ao valor de m/z da molécula protonada, [M+H]+, ou desprotonada, [M-H]-, de cada um

dos pesticidas. A identificação teve como base a existência de sinais com o mesmo tempo de retenção,

m/z e padrão de fragmentação similar aos observados para as amostras padrão. Houve um caso em

que, embora não se tivesse o padrão do pesticida, a identificação foi possível tendo em conta os baixos

valores de erros associados à identificação tanto da molécula protonada como dos iões fragmento (no

espectro de MS/MS) assim como o perfil isotópico dos sinais referentes ao ião precursor e aos

fragmentos.

4.2.1. CASO ESTUDO 1: ISCO ENCONTRADO NUM GALINHEIRO

Este caso é um exemplo ilustrativo do fato do método de extração poder ter efeitos dramáticos

na identificação. As amostras 10-A1 e 10-A2, foram identificadas como possíveis iscos envenenados,

que foram encontradas no mesmo galinheiro. Havia a hipótese inicial de se poder tratar de uma amostra

contendo bromadiolona, uma vez que as amostras recolhidas tinham um aspeto muito similar aos iscos

de bromadiolona comerciais (Figura 8 A).

Inicialmente estas amostras foram extraídas no LPC/PJ utilizando como solvente o metanol.

Uma vez que a análise de LC-HRMS deste extrato não permitiu a identificação de qualquer pesticida

foi testado um método de extração alternativo. Tendo em conta o aspeto das provas recolhidas, havia

a suspeita de se tratar de um isco de rodenticida adaptou-se o método que está descrito na literatura

para a extração deste tipo de pesticidas, utilizando-se uma mistura de água/acetona e diclorometano[49].

Quando este novo extrato foi analisado por LC-ESI(-)-HRMS, usando como fase móvel o

acetato de amónio pH=5,6, continuou-se a não ter evidencias da presença de bromadiolona, mas foi

possível identificar os dois pesticidas que estão na composição do isco comercial RATAX: o Brodifcoum

(B) e Difenacume (D). Este fato foi provado quando uma amostra padrão de RATAX comercial foi

extraído e analisado exatamente nas mesmas condições utilizadas para a amostra forense.

Efetivamente, os iscos comerciais de RATAX e bromadiolona (Figura 8) têm aspetos muito similares,

mas o resultado da análise foi indiscutível tratando-se de um isco de RATAX.

27

Da análise efetuada, conclui-se que a amostra 10-A1 e 10-A2 contêm os mesmos compostos

identificados no isco RATAX. Na Figura 10 estão representados os cromatogramas comparados com

o padrão Ratax, e o espetro de MS/MS para cada uma das amostras. Efetivamente, quando analisadas

por LC-ESI(-)-HRMS tanto as amostras forenses A1 e A2 como RATAX, foi possível identificar o

Brodifacume, que elui a Tr= 7,7 min nas condições cromatográficas utilizadas, e apresenta no espectro

de full scan o ião correspondente à molécula desprotonada a m/z 521,0766 ± (3,64-2,30) ppm. Este

sinal apresenta uma distribuição isotópica característica de uma molécula contendo um átomo de

bromo, exibindo o sinal isotópico [M-H+2]- de igual abundância ao do monoisotópico. A molécula

desprotonada do difenacume elui com um Tr=7,3 min e foi identificada a m/z 443,1663 ± (4,73-4,51)

ppm. Os espectros MS/MS destes dois pesticidas têm os mesmos iões fragmentos a m/z 135,0430 e

187,0393 identificados em todas as amostras com um erro inferior a 5 ppm. Na figura 9, está

representado o esquema de fragmentação tanto para o brodifacume como para o difenacume com o

respetivo erro associado para ambas as amostras.

M-H

m/z 187,0393 ± (2,83-1,76) ppm

m/z 187,0395 ± (2,29-1,76) ppm

M-H

I II

Figura 9. I) Proposta de fragmentação para o brodifacume, erro associado da amostra 10 A1 e 10 A2 respetivamente; II) Proposta de fragmentação para o difenacume, erro associado da amostra 10 A1 e 10 A2 respetivamente

A B

Figura 8. A) Isco comercial de bromadiolona B) Isco comercial de Ratax

28

135.0490

187.0416

219.0821523.0770

-MS2(523.0764), 7.7min #554

0

2

4

4x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 m/z

187.0386219.0799

245.0944

293.1311

319.1478 399.1649

443.1573

-MS2(443.1593), 7.2min #523

0

1000

2000

3000

Intens.

200 250 300 350 400 m/z

135.0428

187.0395

523.0741

-MS2(521.0773), 7.6min #548

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

5x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 m/z

187.0367 219.0795

281.2454

399.1691

444.1625

-MS2(443.1598), 7.4min #527

0.0

0.5

1.0

1.5

4x10

Intens.

200 250 300 350 400 m/z

135.0449

187.0374

219.0779

263.0682

523.0775

-MS2(521.0796), 7.6min #548

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

5x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 m/z

187.0382219.0789

293.1310

399.1737

443.1641-MS2(443.1641), 7.3min #520

0

1

2

3

4

55x10

Intens.

200 250 300 350 400 m/z

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Amostra 10-A1-B

Amostra 10-A2-B

Amostra 10-A2-D

Amostra 10-A1-D

Amostra 10-A2

Amostra 10-A2

Amostra 10-A1

Amostra 10-A1

Ratax-Padrão

Ratax-Padrão Difencume-D

D

D

Brodifacume-B

B

B

Ratax-Padrão-B

Ratax-Padrão-D

I

II

Figura 10. I)Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 443,1642 (difenacume-D) e m/z 521,0747 (brodifacume-B) obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de Ratax e das amostras 10A1 e 10A2; II) Comparação do espetro de MS/MS do Ratax com as amostras 10 A1 e 10A2 quando extraído os iões de brodifacume e difenacume.

29

4.2.2. CASO ESTUDO 2: CARNE ENCONTRADA NUM PRATO DE COMIDA

PARA CÃO

Este caso corresponde a uma amostra obtida por extração com metanol de carne encontrada

no prato de um cão, com suspeita de envenenamento.

No cromatograma iónico extraído a m/z 256,0595, por análise de ESI (+) da amostra (Figura

11), foi possível identificar um sinal a 4,2 min que apresenta no espectro de full scan um ião a m/z

256,0601 ± 2,34 ppm correspondente à molécula protonada do imidacloropride. Efectivamente este

sinal tem a distribuição isotópica compatível com uma molécula contendo cloro. Os fragmentos obtidos

no espetro de MS/MS foram então analisados para a confirmação da identificação, tendo-se obtido os

seguintes fragmentos a m/z 209,0576 ± 3,82 ppm e 175,0969 ± 5,13 ppm. De facto o padrão de

fragmentação obtido para a molécula protonada do imidaclorpride é compatível com o padrão de

fragmentação referido na literatura [50]. O primeiro fragmento corresponde à perda do grupo NO2, e ao

segundo onde a perda de água é acompanhada também pela perda do cloro.

A identificação do inseticida imidacloropride foi assim possível tendo em conta não só o grau

de exatidão obtido para os valores de m/z obtidos para a molécula protonada e os iões fragmentos

511.1094

256.0589

210.0654

IMICLORPRIDE auto AA_26_01_16617.d: +MS, 4.2min #305

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

6x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 m/z

175.0969

209.0576

+MS2(256.0589), 35.0eV, 4.2min #306

0

2

4

6

85x10

Intens.

170 180 190 200 210 220 230 m/z

m/z 209,0576± 3,82ppm m/z 175,0969± 5,13ppm

m/z 256,0589 ±2,34ppm

Figura 11. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 256,0595, obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra forense de imidacloropride; (B) Espetro de massa do imidacloropride e sua estrutura (C) Espectro de MS/MS do Imidacloropride, sendo apresentado a estrutura proposta dos iões fragmentados.

A

B

C

30

obtidos no HRMS full scan e no espectro MS/MS, respetivamente, mas também a distribuição isotópica

dos picos referentes ao ião precursor e aos fragmentos.

4.2.3. CASO ESTUDO 3: UMA AVE DE RAPINA ENCONTRADA MORTA

COM SUSPEITA DE ENVENENAMENTO

Este é um caso de uma ave de rapina encontrada morta com suspeita de envenenamento. A

amostra 2 A foi obtida pela lavagem das garras e bico com metanol e a 2B foi através da extração do

conteúdo estomacal com o mesmo solvente (Figura 12).

O rodenticida flocumafeno foi identificado em ambas as amostras, tanto na análise de LC-ESI

(+)-HRMS como por LC-ESI (-)-HRMS, usando como fase móvel o acetato de amónio pH=5,6. O

composto foi então reconhecido por comparação com o padrão analisado nas mesmas condições.

Ambas as amostras forenses deram origem aos mesmos resultados, tendo sido identificado o

ião correspondente à molécula desprotonada do flocumafeno com o mesmo tempo de retenção

apresentado para o padrão deste rodenticida. Embora o erro associado à determinação do valor de m/z

da molécula desprotonada nas amostras forenses seja superior ao admissível por HRMS, na amostra

2A (garras e bico) foi também possível identificar o espectro de MS/MS deste ião, que por ser

sobreponível ao exibido pelo padrão, dá mais segurança à atribuição efetuada.

Figura 12. Fotografia da amostra 2-A (garras e bico) e 2-B (conteúdo estomacal) pertencentes a uma ave de rapina.

31

No entanto, na análise por LC-ESI (+)-HRMS os erros associados à determinação do m/z da

molécula protonada do flocumafeno não deixaram qualquer dúvida. Efetivamente, no espetro de full

scan observou-se um ião m/z 543,1764 ± 2,52 ppm para a amostra 2A, e um ião 543,1792 ± 2,63 ppm

para a amostra 2B. Os fragmentos obtidos nos espetros de MS/MS para cada uma das amostras são

sobreponíveis. A figura 14 apresenta a comparação dos espetros de MS/MS obtidos por ESI (+) para

amostras e para o padrão, assim como a estrutura dos dois fragmentos maioritários. É importante

reparar que o tempo de retenção é o mesmo (Tr=7,6 min) no padrão e para cada uma das amostras.

161.0243219.0814

289.0872

382.1212

541.1637

-MS2(541.1644), 7.6min #541

0.0

0.5

1.0

6x10

Intens.

150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z

Figura 13. I) Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 541,1621 obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de flocumafeno com a amostra 2A; II) Espetro de MS/MS do padrão de flocumafeno; III) Espectro de MS/MS da amostra 2A; IV) fragmentação proposta do ião maioritário.

m/z 161,0252 ± 14,78ppm

m/z 541,1654 ± 6,06ppm

161.0252

219.0830

289.0861382.1231

-MS2(541.1636), 7.4min #538

0

1000

2000

3000

4000

5000

Intens.

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z

Amostra 2 A Amostra 2 A

Padrão Flocumafeno

ESI (-)

[M-H]-

Padrão Flocumafeno

159.0420 291.1011

355.1301+MS2(543.1772), 36.3eV, 7.6min #556

0.0

0.5

1.0

1.5

4x10

Intens.

150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z

159.0413 291.1023

355.1310

409.1238 503.1656

+MS2(543.1781), 36.3eV, 7.7min #473

0

1

2

3

46x10

Intens.

150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z

159.0421 291.1027

355.1316

383.2696 429.1306

546.4888

+MS2(543.1779), 36.3eV, 7.7min #473

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

5x10

Intens.

150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z

ESI (+) Padrão-Flocumafeno

m/z 355,1313 ± 3,90 ppm [M+H]

+

m/z 543,1764 ±2,52ppm

Amostra 2A

m/z 159,0417 ± 2,89ppm [M+H]

+

m/z 543,1792 ±2,63ppm

Amostra 2A

Amostra 2B

Amostra 2B

Padrão Flocumafeno

Figura 14. I) Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 543,1778 obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de flocumafeno com a amostra 2 A e 2B; II) Comparação dos espetro de MS/MS do padrão de flocumafeno e das amostras 2 A e 2B ; III) Proposta de fragmentação para os iões fragmentados maioritários da flocumafeno.

I

II III

32

4.2.4. CASO ESTUDO 4: COMIDA DE CÃO

Este caso diz respeito a uma suspeita de envenenamento dum cão. A comida descoberta na

taça do cão foi extraída com metanol e depois analisada no laboratório por LC-ESI(+)-HRMS, tendo-se

utilizado como fase móvel ácido fórmico (0,1%). Foi possível a identificação do paratião, um potente

inseticida e acaricida pertencente ao grupo dos organofosforados.

Tanto o paratião (P) como o seu metabolito aminoparatião (A) foram identificados aquando a

comparação com um padrão de E-605 Forte (Figura 15). O primeiro (P) elui a Tr=6,7 min e apresenta

no espectro de full scan o ião correspondente à molécula protonada a m/z 292,0403 ± 2,42 ppm. Já o

aminoparatião, nas mesmas condições cromatográficas elui a um Tr=5,9 min e apresenta no espetro

de full scan o ião a m/z 262,0654 ± 1,42 ppm. Os espetros de MS/MS, assim como a estrutura dos

fragmentos maioritários encontra-se na Figura 15.

Conclui-se assim queesta amostra forense continha o paratião e o seu metabolito

aminoparatião. Muito embora este composto seja de venda proibida no nosso país, infelizmente são.

124.0283 156.0220

172.0156

187.9930

206.0035

+MS2(262.0665), 35.0eV, 6.1min #380

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

4x10

Intens.

100 120 140 160 180 200 220 240 260 m/z

140.0349171.9761

189.9852

235.9777

261.0631 292.9053

+MS2(292.0403), 35.0eV, 6.7min #540

0

100

200

300

400

500

Intens.

100 125 150 175 200 225 250 275 300 m/z

124.0248156.0210

172.0148

187.9916+MS2(262.0653), 35.0eV, 5.8min #441

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

4x10

Intens.

100 120 140 160 180 200 220 240 260 m/z

123.0346

140.0352

155.9975

171.9734

189.9836 217.9659

235.9769

253.9878

+MS2(292.0391), 35.0eV, 6.8min #514

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

4x10

Intens.

100 125 150 175 200 225 250 275 300 m/z

Padrão-Paratião

Amostra 1

Amostra 1

Padrão-Paratião A

A

P

P

m/z 292,0396 ± 2,42 ppm

MH+

m/z 235,9782 ± 2,09ppm

m/z 262,0654 ± 1,42ppm

MH+

m/z 187,9931 ± 1,06ppm

Padrão-P

Padrão-A

Amostra 1-P

Amostra 1-A

Figura 15. Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 292,0403 (paratião-P) e m/z 262,0661 (aminoparatião-A) obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de E-605 forte com a amostra 1 ; II) Comparação dos espetro de MS/MS do padrão de paratião e do seu metabolito aminoparatião com os da amostra 1 ; III) Proposta de fragmentação para o ião fragmentado maioritário do paratião; IV) Proposta de fragmentação para o ião fragmentado maioritário do aminoparatião

33

4.3. RESULTADOS DAS ANÁLISES- AMOSTRAS FORENSES

As restantes 16 amostras de casos em que houve suspeita de envenenamento de animais

foram analisadas de modo análogo. Na Tabela 6 são identificados os pesticidas detetados em todas as

amostras avaliadas neste estudo. Das 20 amostras mistério analisadas foi possível fazer a identificação

de pesticidas em 13. No anexo B encontram-se todos os cromatogramas iónicos, espectros de full scan

e de MS/MS que serviram de base para a identificação dos pesticidas nas restantes amostras.

É de salientar que os agrotóxicos mais frequentemente detetados pertencem ao grupo dos

rodenticidas anticoagulantes: bromadiolona, brodifacume, difenacume varfarina e flocumafeno.

Tabela 6. Resultados das análises de todas as amostras forenses analisadas neste estudo: identificação do pesticida

Identificação Proveniência Pesticida encontrado

1 Comida num quintal Paratião/ Aminoparatião

2-A Garras e bico Flocumafeno

2-B Conteúdo estomacal Flocumafeno

4 Veneno em via pública Bromadiolona

5 Isco de carne (particular) Bromadiolona

6 Rodenticida no quintal Bromadiolona

7 Águia imperial ?

8 Garras, glote músculo ?

9 Vomitado em terreno particular ?

10-A1 Isco num quintal Brodifacume/Difenacume

10-A2 Isco num quintal Brodifacume/Difenacume

11 Líquido azul ?

12 Águia Imperial ?

13 Milhafre Real ?

14-A Milhafre Real Varfarina

14-B Milhafre Real Varfarina

16 Milhafre Real ?

17 Cadáver ovideo Bromadiolona

18 Isco quintal Bromadiolona

19 Comida de cão Imidacloropride/ Acetamiprida

34

5. CONCLUSÕES

O uso de pesticidas pode resultar no envenenamento de animais selvagens e domésticos. Isso

pode ser devido ao uso indevido do produto, ou por falha descuidada, acidental ou intencional.

Deliberadamente e ilegalmente, muitos pesticidas são empregues para o envenenamento animal. A

colocação ilegítima de iscos contaminados no campo continua a ser um problema persistente e sério.

A natureza dessas ações leva a que que outros animais selvagens e pessoas também estejam

potencialmente em risco. Em alguns casos, pesticidas podem ser encontrados em tecidos de animais,

garras e bicos, mas a origem da substância não é clara e a causa da morte será desconhecida ou não

especificadaO LC-HRMS/MS foi o método analítico escolhido para a deteção e caracterização de

pesticidas em matrizes biológicas complexas, tendo-se revelado muito adequado para este fim.

Existem vários fatores a ter em conta quando se inicia um processo de análise analítica, tais

como a escolha das condições cromatográficas, de que se destacam a coluna cromatográfica e as

fases móveis. Neste trabalho, a utilização de uma coluna Kinetex C18 polar permitiu aliar as condições

de separação de fase reversa com as interações hidrofilicas, permitindo reter até os compostos mais

polares. Constatou-se também que a grande maioria dos pesticidas foi mais facilmente detetado

quando se utilizou como fase aquosa uma solução de acetato de amónio 5mM pH 6,5.

Foram então analisadas nas condições experimentais estipuladas para este trabalho soluções

padrão de cada um dos compostos pertencentes à lista anteriormente estabelecida. Cada amostra

padrão foi analisada por LC-HRMS/MS por ESI (+) e ESI (-), sendo a identificação da espécie proposta

realizada através de vários fatores: massa precisa da molécula protonada ou desprotonada, modo de

ionização preferencial, tempo de retenção e o valor de m/z experimental dos fragmentos característicos

- esta opção é possível devido ao facto de a utilização de um analisador de Q-TOF-MS alcançar um

elevado grau de exactidão nos valores de m/z medidos (inferior a 5 ppm).

O método desenvolvido foi aplicado com sucesso à análise de amostras reais. Das 20 amostras

mistério analisadas foi possível a identificação de pesticidas em 13. Foram encontrados 5 rodenticidas

diferentes: flocumafeno, bromadiolona, brodifacume, difenacume, varfarina e 3 inseticidas: paratião,

imidacloropride e acetamiprida. Infelizmente comprovou-se que existe uma facilidade de acesso a

produtos químicos proibidos, como o paratião.

Como trabalho futuro sugere-se um estudo de quais as melhores condições de extração para

as diferentes classes de pesticidas e para as diferentes matrizes biológicas em que estes são

encontrados para posterior análise por LC-HRMS.

35

6. BIBLIOGRAFIA

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Dynamics,” vol. 6076, no. March, 2017.

39

7. ANEXOS

40

ANEXO A: BASE DE DADOS

• Terramicina

• Paratião

235.1813

461.1562

443.1455

TERRAMICINA auto novo_27_01_16400.d: +MS, 3.3min #334

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

5x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 m/z

154.0523

201.0573

226.0743

267.0685

283.0635

307.0640

337.0749

365.0701

381.0659

408.1133

426.1240

444.1348

+MS2(461.1562), 35.0eV, 3.4min #335

0.0

0.5

1.0

1.5

5x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 m/z

m/z 426,1240 ± 13 ppm

m/z 461,1562 ± 1,61ppm

A

B

C

Figura 16 (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 461,1555, obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de terramicina; (B) Espetro de massa da terramicina e sua estrutura (C) Espectro de MS/MS da terramicina, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.

189.9836217.9662

235.9768

+MS2(292.0396), 35.0eV, 6.0min #451

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

4x10

Intens.

200 250 300 350 400 450 500 m/z

m/z 235,9768 ± 3,83 ppm

235.9763

264.0081 292.0396

PARATIAO auto novo AA_50_01_16618.d: +MS, 5.9min #449

0

1

2

3

5x10

Intens.

200 250 300 350 400 450 500 m/z

m/z 292,0396 ± 2,42 ppm m/z 264,0081 ± 3,43 ppm

A

B

C

Figura 17. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 292,0403 ,obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de paratião; (B) Espetro de massa do paratião e sua estrutura (C) Espectro de MS/MS do paratião, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.

41

• Imidacloropride(+)

• Imidacloropride(-)

256.0601

511.1125209.0592175.0965 363.0965274.0716280.0386 515.1068

IMICLORPRIDE ato_26_01_16397.d: +MS, 4.2min #261

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

5x10

Intens.

200 250 300 350 400 450 500 m/z

m/z 256,0601 ± 2,03ppm [2M+H]

175.0970

209.0586

+MS2(256.0601), 35.0eV, 4.2min #262

0

500

1000

1500

2000

2500

Intens.

100 200 300 400 500 600 m/z

m/z 209,0586 ± 1,20ppm

A

B

C

Figura 18.(A) Cromatograma iónico extraído a m/z 256,0596, obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra forense de imidacloropride; (B) Espetro de massa do imidacloropride e sua estrutura (C) Espectro de MS/MS do imidacloropride, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.

254.0418

290.0180 509.0950354.2003 531.0772312.0015215.0082

PJImidoclorpride auto neg_26_01_11071.d: -MS, 4.5min #285

0.0

0.5

1.0

1.5

6x10

Intens.

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

77.2602

117.0483

153.0220 179.9937

207.0412

254.0394

299.0021

-MS2(254.0418), 4.5min #286

0

250

500

750

1000

1250

Intens.

100 150 200 250 300 m/z

m/z 254,0418 ± 8,26 ppm

m/z 207,0412 ± 9,65 ppm

A

B

C

Figura 19.(A) Cromatograma iónico extraído a m/z 254,0439, obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra forense de imidacloropride; (B) Espetro de massa do imidacloropride e sua estrutura (C) Espectro de MS/MS do imidacloropride, sendo apresentado a estrutura do seu fragmento maioritário.

42

• Acetamiprida

• Carbofurão

238.0732

256.0595

223.0751

IMICLORPRIDE auto novo_26_01_16398.d: +MS, 4.3min #364

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

4x10

Intens.

220 230 240 250 260 m/z

126.0105

+MS2(223.0751), 35.0eV, 4.3min #365

0

50

100

150

200

250

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 m/z

m/z 223,0751 ± 5,37ppm

m/z 126,0105 ± 0,02 ppm

A

B

C

Figura 20. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 223,0745, obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra forense de imidacloropride; (B) Espetro de massa da acetamiprida e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS da acetamiprida, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.

1+

1+

1+

123.04501+

165.09241+

222.11341+

CARBOFURAN_24_01_16392.d: +MS, 5.2min #2103

0.0

0.5

1.0

4x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z

m/z 222,1134 ± 4,18ppm

55.05541+

77.03951+

91.05531+

105.03491+

123.04521+

165.09171+

+MS2(222.1134), 17.5-52.5eV, 5.2min #2106

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

5x10

Intens.

0 50 100 150 200 250 m/z

m/z 165,0917 ± 4,20ppm

C

B

A

Figura 21.(A) Cromatograma iónico extraído a m/z 222,1125, obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de carbofurão; (B) Espetro de massa do carbofurão e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS do carbofurão, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente a um fragmento.

43

• Clorofacinona

• Bromadiolona

373.0650

769.1177

CLOROFACINONA NEG_40_01_16530.d: -MS, 7.4min #531

0

1

2

3

4

6x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z

m/z 373,0650 ± 6,43ppm

145.0284

201.0470

373.0638

-MS2(373.0650), 7.5min #532

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

6x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z

m/z 201,0470 ± 1,98 ppm

A

B

C

Figura 22. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 373,0626 ,obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de clorofacinona; (B) Espetro de massa de clorofacinona e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS da clorofacinona, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.

Figura 23. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 525,0695, obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de bromodiolona; (B) Espetro de massa de bromodiolona e sua estrutura (C) Espectro de MS/MS da bromodiolona, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.

526.0749

527.0699

528.0732

529.0768

525.0717

BROMADIOLONA AUTO NEG_47_01_16497.d: -MS, 6.9min #492

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

5x10

Intens.

515 520 525 530 535 540 m/z

m/z 525,0717± 4,00ppm

250.0641

525.0718

-MS2(525.0717), 7.0min #494

0

1

2

3

4

5

5x10

Intens.

0 200 400 600 800 1000 m/z

m/z 250,0641± 4,ppm

A

B

C

44

• Estricnina

• Glifosato

336.1791

337.1815

335.1762

estricnine auto pos_15_01_17082.d: +MS, 3.7min #267

0

2

4

6

6x10

Intens.

322.5 325.0 327.5 330.0 332.5 335.0 337.5 340.0 342.5 345.0 m/z

m/z 335,1762 ± 2,37ppm

184.0756 264.1020

335.1761 +MS2(335.1762), 35.0eV, 3.8min #269

0.0

0.5

1.0

1.5

7x10

Intens.

200 300 400 500 600 700 m/z

m/z 264,1020 ± 1,71ppm

A

B

C

Figura 24. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 335,1754, obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de estricnina; (B) Espetro de massa da estricnina e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS da estricnina, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.

Figura 25. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 170,0213 obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de glifosato; (B) Espetro de massa do glifosato e sua estrutura.

170.0211

184.0362

PJ glifosato auto pos_24_01_11147.d: +MS, 0.9min #54

0

1

2

3

4x10

Intens.

120 140 160 180 200 220 m/z

m/z 170,0211 ± 1,88ppm

A

B

45

• Cumatetril

• Flocumafeno (+)

163.0403 291.1008

543.1764

355.1317

fLUOCUMAFEN auto novo_38_01_16426.d: +MS, 7.5min #551

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

4x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z

m/z 543,1764 ± 2,52ppm

159.0417

291.1019

327.1357

355.1314

+MS2(543.1764), 36.3eV, 7.5min #552

0

1

2

3

4

4x10

Intens.

200 300 400 500 600 700 m/z

m/z 355,1314 ± 5,63 ppm

A

B

C

Figura 27. A) Cromatograma iónico extraído a m/z 543,1777, obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de flocumafeno; (B) Espetro de massa do flocumafeno e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS da flocumafeno, sendo apresentado a fragmentação plausível correspondente ao fragmento maioritário.

Figura 26. A) Cromatograma iónico extraído a m/z 293,1172,obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de cumatetril; (B) Espetro de massa da cumatetril e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS do cumatetril, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.

293.1164

315.0987

CUMATETRIL auto novo_34_01_16418.d: +MS, 6.2min #453

0.0

0.5

1.0

6x10

Intens.

270 280 290 300 310 320 330 340 350 m/z

m/z 293,1164 ± 2,80ppm

121.0318

175.0400

+MS2(293.1164), 35.0eV, 6.2min #454

0

2

4

6

5x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 m/z

m/z 175,0400 ± 6,28ppm

A

B

C

46

• Flocumafeno (-)

• Brodifacume

311.1688

541.1637FLUOROMAFEN NEG_38_01_16524.d: -MS, 7.5min #534

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

6x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z

161.0243

289.0874

382.1212

541.1637

-MS2(541.1637), 7.5min #536

0.0

0.5

1.0

1.5

6x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z

m/z 541,1637± 2,92ppm

A

B

C

Figura 28. A) Cromatograma iónico extraído a m/z 541,1621,obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de flocumafeno; (B) Espetro de massa da flocumafeno e sua estrutura (C) Espectro de MS/MS da flocumafeno, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.

m/z 161,0243 ±4,78ppm

[M-H]

135.0449

187.0374

219.0779

263.0682

523.0775

-MS2(521.0796), 7.6min #548

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

5x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 m/z

522.0833

523.0782

524.0817

525.0843

521.0796

PJ 201802102A1 nova ext AA autoMS NEG_14_01_18639.d: -MS, 7.5min #546

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

4x10

Intens.

515.0 517.5 520.0 522.5 525.0 527.5 530.0 532.5 535.0 m/z

m/z 521,0796 ±5,43 ppm

m/z 187,0395 ± 2,83ppm

Figura 29. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 521,0796 ,obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de Ratax-brodifacume; (B) Espetro de massa do brodifacume e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS do brodifacume, sendo apresentado a proposta de fragmentação.

A

B

C

47

• Aldicarbe

• Azinfos Metilo

B

191.0851

229.0398

213.0671

208.1112

ALDICARB AA auto_23_01_16613.d: +MS, 4.7min #454

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

4x10

Intens.

120 140 160 180 200 220 240 260 m/z

m/z 213,0671± 1,31ppm

m/z 191,0851± 1,17ppm

[M+Na] [M+NH4]

Figura 30. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 191,0849 ,obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de aldicarbe; (B) Espetro de massa do aldicarbe, sua estrutura e iões aductos observados.

A

B

230.1127

318.0132

162.0582

PJ azinfos metilo AA pos auto_29_01_18726.d: +MS, 1.4min #96

0.0

0.5

1.0

1.5

5x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z

m/z 318,0129 ± 0,45ppm

134.0511

162.0581

+MS2(318.0132), 35.0eV, 1.4min #97

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

5x10

Intens.

50 100 150 200 250 300 m/z

m/z 318,0132 ± 0,48ppm

m/z 162,0581 ± 5,25ppm

A

B

C

Figura 31. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 318,0130,obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de azinfos metilo ; (B) Espetro de massa do azinfos metilo e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS do azinfos metilo, sendo apresentado a estrutura do ião fragmentado.

48

• Azinfos Etilo

• Deltamitrina

132.0470

160.0502

170.9691199.0005

232.9480

318.0380

346.0437

368.0259

289.0109

260.9796

AZINFOS ETILO auto novo_33_01_16416.d: +MS, 6.4min #471

0

2

4

6

4x10

Intens.

150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

m/z 346,0437± 1,86ppm [M+Na] m/z 368,259± 1,06ppm

Figura 32. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 346,0443 ,obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de azinfos etilo; (B) Espetro de massa do azinfos de etilo, sua estrutura e iões aductos observados.

A

B

A

B

C

503.9803

504.9827

506.9815

507.9756

508.9807

505.9775

DELTAMITRINA auto AA_35_01_16616.d: +MS, 7.8min #579

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

4x10

Intens.

504 506 508 510 512 514 516 m/z

m/z 503,9803 ± 0,28ppm

74.8879

171.9864

280.8991

670.1458

+MS2(505.9781), 35.2eV, 7.9min #584

0

200

400

600

800

1000

Intens.

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z

m/z 280,8991±1,06ppm

Figura 33. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 503,9804 obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de deltamitrina; (B) Espetro de massa da deltamitrina e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS da deltamitrina, sendo apresentado a estrutura do ião fragmentado.

A

B

C

49

• Difenacume

• Amino paratiao

206.0021

262.0648

234.0335

PJ201701459 AUTO NOVO AA_25_01_16607.d: +MS, 5.8min #760

0.0

0.5

1.0

1.5

5x10

Intens.

160 180 200 220 240 260 280 m/z

124.0243 156.0204

172.0150

187.9920

206.0016

+MS2(262.0648), 35.0eV, 5.9min #761

0

1

2

3

4x10

Intens.

120 140 160 180 200 220 240 260 280 m/z

m/z 262,0648±4,96ppm

m/z 187,9920 ±4,78ppm

Figura 35. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 262,0661 obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de E-605 forte; (B) Espetro de massa do aminoparatião e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS do aminoparatião, sendo apresentado a proposta de fragmentação.

B

A

C

Figura 34. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 443,1642 obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de RATAX ; (B) Espetro de massa do difenacume e sua estrutura.

A

B

50

ANEXO B: IDENTIFICAÇÃO DOS PESTICIDAS NAS AMOSTRAS FORENSES

• Identificação das amostras: 4; 5; 6; 17 e 18 – pesticida identificado: bromadiolona

+

525.0702

526.0745

527.0688

528.0728 530.9924 532.9937 534.9998

537.3435

538.3462

539.3509540.9931

PJ 201806801 AUTO NEG_42_01_16482.d: -MS, 6.9min #495

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

4x10

Intens.

524 526 528 530 532 534 536 538 540 m/z

250.0637

527.0692

-MS2(525.0718), 7.0min #499

0

1

2

3

4

6x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z

Amostra 5

250.0637

378.9807

525.0712

-MS2(525.0712), 7.0min #496

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

5x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z

250.0611

527.0689

-MS2(525.0712), 6.9min #490

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

6x10

Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z

Amostra 18

523.3509

525.0725

526.0760

527.0714

528.0734

531.0126 535.3551

PJ 2018112554 AA autoMS NEG_6_01_18541.d: -MS, 6.9min #492

0

1

2

3

4x10

Intens.

524 526 528 530 532 534 536 538 540 m/z

Amostra 6

Amostra 17

Amostra 4

Padrão bromadiolona

Amostra 4

Amostra 6

Amostra 17

Amostra 18

Amostra 5

250.0641

525.0718

-MS2(525.0717), 7.0min #494

0

1

2

3

4

5

5x10

Intens.

0 200 400 600 800 1000 m/z

Padrão-bromadiolona

I

II

III

IV

V

VI

VII

Figura 36. I) Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 525,0695 (bromadiolona) obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de bromadiolona e das amostras: 4, 5, 6, 17 e 18; II) Eespetro de MS/MS do padrão de bromadiolona; III) Full scan da amostra 4, distribuição isotópica característica de uma molécula contendo um átomo de bromo, exibindo o sinal isotópico [M-H+2]- de igual abundância ao do monoisotópico a m/z 527,0688; IV) Espetro de MS/MS do ião extraído da bromadiolona da amostra 5; V) Espetro de MS/MS do ião extraído da bromadiolona da amostra 6; VI) Full scan da amostra 17, distribuição isotópica característica de uma molécula contendo um átomo de bromo, exibindo o sinal isotópico [M-H+2]- de igual abundância ao do monoisotópico a m/z 527,0714; VII) Espetro de MS/MS do ião extraído da bromadiolona da amostra 18; VIII) Estrutura da molécula bromadiolona; IX) Estrutura do ião fragmento maioritário.

Ião precussor: Bromadiolona

Fragmento 1

VIII

IX

51

Tabela 7. Erros associados aos valores de m/z identificados para o ião precurssor de bromadiolona e para o seu fragmento maioritário em cada uma das amostras analisadas.

• Identificação das amostras: 14-A e 14-B: pesticida identificado: varfarina

amostras

m/z exp. m/z teorico erro (ppm)

padrão ião precursor 525,0717 525,0695 4,00

fragmento 1 250,0641 250,0630 4,39

4 ião precursor 525,0701 525,0695 0,95

5 ião precursor 525,0718 525,0695 4,19

fragmento 1 250,0637 250,0630 2,79 6 ião precursor 525,0712 525,0695 3,05

fragmento 1 250,0637 250,0630 2,79 17 ião precursor 525,0725 525,0695 5,52

18 ião precursor 525,0712 525,0695 3,05

fragmento 1 250,0611 250,0630 7,59

I II

III

IV

V

Figura 37. I) Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 307, (varfarina) obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de varfarina e das amostras: 14-A e 14-B; II) Eespetro de MS/MS do padrão de varfarina; III) Espetro de MS/MS da amotra 14-A ; IV) Espetro de MS/MS da amostra 14-B; V) Proposta de fragmentação para a varfarina, e erro associada ao fragmento maioritário para ambas as amostras.

53

ANEXO C: POSTER

Figura 38.Poster apresentado CQE meeting

ANÁLISE DE AMOSTRAS FORENSES POR ESPECTROMETRIA DE … · anÁlise de amostras forenses por...

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