UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: ODONTOLOGIA PREVENTIVA E SOCIAL

EFICÁCIA DO BOCHECHO DE QUITOSANA A 0,4%

SOBRE O BIOFILME E BACTÉRIAS ORAIS

NATAL/RN

2005

2

LIZA BARRETO VIEIRA

EFICÁCIA DO BOCHECHO DE QUITOSANA A 0,4% SOBRE O BIOFILME E BACTÉRIAS ORAIS

Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Odontologia da

UFRN como requisito para

obtenção do grau de Mestre em

Odontologia, área de concentração em

Odontologia Preventiva e Social.

Orientador: Prof°. Dr°. Kenio Costa Lima

Natal/RN

2005

3

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Setorial de Odontologia Vieira, Liza Barreto Eficácia do bochecho de quitosana a 0,4% sobre o biofilme e bactérias orais / Liza Barreto Vieira. – Natal, RN, 2005 106 f. : il. Orientador: Kenio Costa Lima. Tese ( Mestrado ) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde. Departamento de Odontologia. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. 1. Biofilme - Tese. 2. Bactérias orais – Tese. 3. Quitosana - Tese. 4. Antissépticos bucais - Tese. 5. Agente antimicrobiano – Tese. Higiene Oral – Tese. I Lima, Kenio Costa. II. Título. Black D51 RN/UF/BSO

4

DEDICATÓRIA

Aos meus pais e avós.

5

AGRADECIMENTOS A Deus que sempre me guiou, me protegeu, me iluminou nessa caminhada, me segurando

nos braços quando eu mais precisei de ajuda.

A minha família pelo amor e carinho. A minha mãe por todas as pipetas e tubos de ensaio

embuchadas no laboratório. Ao meu pai por todas as palavras que me ajudou a digitar e por

dividir comigo o peso do material da pesquisa. A minha irmã Ivana pelo carinho, apóio e ajuda na

escola com os alunos.

Ao meu namorado Moacir pelo amor, apóio, carinho e principalmente pela paciência.

Ao meu orientador Kenio pelos ensinamentos, a paciência e principalmente pela amizade

e o bom humor. As palavras se tornam pequenas para o tamanho do meu agradecimento.

Aos professores do Programa de Pós-graduação em Odontologia pelos ensinamentos e

pelas fantásticas aulas: Dr. Kenio, Dr. Ângelo, Drª. Ângela, Drª. Betinha, Drª. Delane, Drª.

Socorro, Drª. Edna e principalmente a Drª. Íris pelo apóio com o material da pesquisa, pelas

conversas e pela amizade sincera.

A todos os meus colegas do mestrado: Júnior, Perboyre, Ewerton, Luana, Ana Larissa,

Rossana, Tatyana, Guilherme, Rubiane, Adriana, Roberta, Yanne, Shirley, Cláudia, Daniela,

Amanda e Rejane.

Ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia e a Universidade Federal do Rio Grande

do Norte. Ao ex-chefe de departamento de Odontologia Dr. Pedrinho e ao atual Dr. Costinha.

Ao meu bolsista Márcio Gutemberg pela valiosa ajuda durante o mestrado, pela

companhia e principalmente pela sua amizade. As bolsistas voluntárias Kelly e Marina pela

colaboração durante a pesquisa e pela amizade.

A Dona Nazilde pela ajuda no laboratório de Preventiva. A Aline, Sandra e Neusa pela

colaboração e simpatia. A Floriano pela ajuda no laboratório de informática. A Manuel pelas

traduções em espanhol dos trabalhos enviados para as revistas. A Evil pela ajuda na medição do

pH da solução e principalmente pelas conversas no laboratório. As funcionárias Clécia e Íris pela

ajuda.

Aos meus amigos de Natal: Ana Daniela, pela ajuda na confecção dos gráficos, pela

amizade e companherismo; a Gilmara e Dyego pela ajuda na escola com os alunos; a Samarinha

pelas orações. A Joás pela oportunidade de continuar essa linha de pesquisa sobre a quitosana e

pela amizade e confiança.

6

Ao professor Marconi, do departamento de química, pela ajuda na dissolução da

quitosana, pelas orientações e simpatia.

As professoras e amigas, Isauremi e Auxiliadora, meu singelo agradecimento. Ao

professor Brasil pelos incentivos nos corredores da faculdade.

Aos meus amigos de Fortaleza pelo incentivo e amor apesar da distância: Lauro, Melissa,

Aline, Kelma, Xalalá, Kaká e Renato.

A Escola Estadual Nestor Lima, aos professores, funcionários e alunos, por terem me

recebido tão calorosamente e pela oportunidade de realizar a pesquisa nesta escola.

A Cecília pela ajuda, paciência e simpatia durante todo o curso do mestrado e pelas

correções na dissertação. A todos os funcionários da biblioteca de Odontologia pela grandiosa

ajuda e dedicação: Ailton, Lucinha, Ocean, Graça e Onélia.

Aos professores que participaram da minha banca de qualificação e que irão participar da

minha banca de defesa: Drª. Dulce, Drª. Ângela, pelas orientações e considerações sobre minha

pesquisa, e ao professor Milton de Uzeda pela simpatia e disponibilidade de vir a Natal.

A todos que eu não me lembrei de agradecer, sintam-se homenageados.

7

“Tudo posso naquele que me fortalece.”

Fp 4, 13

8

RESUMO

O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia do bochecho de quitosana a 0,4% com alto peso molecular e alto grau de desacetilação sobre a redução do total de estreptococos, Streptococcus mutans, total de lactobacilos e sobre os índices de placa visível e sangramento gengival. Para tanto, foram selecionados 68 estudantes saudáveis, com idade entre 11 e 13 anos, não alérgicos a crustáceos e que não tivessem usado antibiótico ou antimicrobiano nos últimos três meses ou durante o tratamento. Trinta e dois indivíduos utilizaram o bochecho teste e trinta e seis o controle. Os participantes bochecharam 10 mL das soluções duas vezes ao dia, um pela manhã (supervisionado) e outro à tarde (não-supervisionado), durante quinze dias. A coleta de saliva para análise microbiológica, bem como a aferição dos índices de placa visível e de sangramento gengival, deu-se antes do uso dos bochechos (linha base), no dia imediatamente após o último bochecho (tempo zero) e quinze dias após (tempo quinze). Esses dados foram coletados na escola e a saliva transportada em gelo até o laboratório. As amostras de saliva foram diluídas e 0,1mL da diluição 10-1 foi semeada em Rogosa SL ágar para a posterior análise do total de lactobacilos; 0,1mL da diluição 10-4 em Mitis Salivarius com bacitracina, para análise de S. mutans, e 0,1mL da diluição 10-6 em Mitis Salivarius, para análise do total de estreptococos. As placas de Rogosa SL ágar foram incubadas em aerobiose a 37°C por 72 horas e as de MSB e MS foram incubadas em anaerobiose em jarras Gaspak® a 37°C, por 48 horas, para posterior contagem das unidades formadoras de colônias (UFCs). O ensaio foi feito em duplicata para cada grupo bacteriano analisado. O número de UFCs transformados em LOG10 foi analisado mediante os seguintes testes: ANOVA, t de Student emparelhado e não-emparelhado, Friedman, Man-Whitney e teste do qui-quadrado. Na linha base, todas as variáveis analisadas no estudo foram semelhantes nos dois grupos testados. Em ambos os grupos, para o total de estreptococos não houve diferença significativa ao longo do tempo; para o S. mutans, houve aumento estatisticamente significativo das UFCs da linha base para o T0. Para o total de lactobacilos, não houve diferença significativa no grupo teste ao longo do tempo e, no controle, houve aumento significativo das UFCs da linha base para o T0. Em ambos os grupos, houve diminuição significativa do IPV ao longo do tempo. O ISG também apresentou redução ao longo do tempo, porém não foi significativa. Portanto, este estudo concluiu que o bochecho de quitosana a 0,4% não foi eficaz na redução das UFCs dos três grupos bacterianos analisados, assim como, na redução do IPV e ISG. Palavras-chaves: quitosana, bochecho, agente antimicrobiano, bactérias orais e biofilme.

9

ABSTRACT The purpose of this study was evaluate the effectiveness of the chitosan at 0.4 with high molecular weight and high deacetylation degree mouthrinse over the total decrease of the streptococci, Streptococcus mutans, lactobacilli and over the perceptible bacterial film and gingival bleeding indices. For that, a total of 68 healthy students between 11 and 13 years old, not allergic to crustacean and not users of antibiotics or antimicrobial agent for the last three months or during the treatment, was selected. From those, thirty two individuals used the mouthrinse test, and thirty six, the control one. The participants rinsed 10 mL of the solutions twice a day, one during the morning (which was supervised), and another one during the afternoon (which was not supervised), for fifteen days. The saliva collect for the microbiological analysis, as well as the perceptible bacterial film and gingival bleeding indices check, were made before the use of the mouthrinses (base line), immediately after the last mouthrinse on the day (zero time) and fifteen days after (fifteen time). These data were collected at school and the saliva was carried inside the ice to the laboratory. The samples were diluted, and 0.1 mL of the 10 -1 dilution was seeded in Rogosa SL agar, for further analysis of the total of lactobacillus; 0.1 mL of the 10-4 dilution in Mitis Salivarius with bacitracin, for S. mutans analysis; and 0.1 mL of the 10-6 dilution in Mitis Salivarius for the analysis of the total of streptococcus. The Rogosa SL agar plates were incubated in aerobic at 37ºC for 72 hours and the MSB and the MS were incubated in anaerobic in Gaspak® jars at 37ºC for 48 hours for further count of Colonies Former Units (CFUs). The assay was made in duplicate for each bacterial group analyzed. The number of CFUs transformed in LOG10 was analyzed according to the following tests: ANOVA, t of Paired and Not Paired Student, Friedman, Man-Whitney and square-qui test. On the base line, all the variables analyzed were similar on both tested groups. On both groups, for the total of streptococcus there was no significant difference along the time and for S. mutans there was a statistic significant increase of the CFUs from the base line to the zero time. For the total of lactobaccilus there was no significant difference on the test group along the time, and on the control there was a significant increase of the CFUs from the base line to the zero time. For both groups, there was significant decrease of the perceptible bacterial film index along the time, and that can be explained by the mechanic effect of the mouthrinse over the bacterial film and by the participation of the students on the research which could have motivated him to a better toothbrushing (Hawthorne effect). The gingival bleeding index also showed a decrease along the time, even though it was not significant. Therefore, the conclusion of this study was that the chitosan at 0.4 % mouthrinse was not effective on the CFUs reduction of the three bacterial groups analyzed, as well as on the reduction of the perceptible bacterial film and gingival bleeding indices. KEY WORDS: chitosan, mouthrinse, antimicrobial agent, oral bacteria, biofilm.

10

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura química da quitina. Natal/RN, 2005.................................................................19 Figura 2: Estrutura química da quitosana. Natal/RN, 2005............................................................ 20 Figura 3: Índice de Placa Visível. Natal/RN, 2005......................................................................... 52 Figura 4: Índice de sangramento gengival. Natal/RN, 2005........................................................... 52 Figura 5: Quitosana da Polymar®. Natal/RN, 2005....................................................................... 55 Figura 6: Soluções teste e controle. Natal/RN, 2005...................................................................... 57 Figura 7: Média e Desvio Padrão das Unidades Formadoras de Colônias do Total de Estreptococos nos Tempos Linha Base, Tempo Zero e Tempo Quinze para os Grupos Teste e Controle. Natal/RN, 2005................................................................................................................ 72 Figura 8: Média e Desvio Padrão das Unidades Formadoras de Colônias de S. mutans nos Tempos Linha Base, Tempo Zero e Tempo Quinze para os Grupos Teste e Controle. Natal/RN, 2005…………………………………………………………………………………………….… 73 Figura 9: Média e Desvio Padrão das Unidades Formadoras de Colônias do Total de Lactobacilos nos Tempos Linha Base, Tempo Zero e Tempo Quinze para os Grupos Teste e Controle. Natal/RN, 2005................................................................................................................................ 74 Figura 10: Média e Desvio Padrão do Índice de Placa Visível dos Tempos Linha Base, Tempo Zero e Tempo Quinze para os Grupos Teste e Controle. Natal/RN, 2005...................................... 75 Figura 11: Média e Desvio Padrão do Índice de Sangramento Gengival dos Tempos Linha Base, Tempo Zero e Tempo Quinze para os Grupos Teste e Controle. Natal/RN, 2005......................... 76

11

LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Referências bibliográficas, objetivos, metodologia e resultado dos trabalhos selecionados para a revisão sistemática da ação antimicrobiana da quitosana e dos derivados da quitina sobre bactérias orais. Natal/RN, 2005................................................................................32 Quadro 2: Referências bibliográficas, objetivos, metodologia e resultado dos trabalhos selecionados para a revisão sistemática da ação da quitosana e dos derivados da quitina sobre a inibição da adsorção bacteriana à superfície dentária. Natal/RN, 2005.........................................38 Quadro 3: Referências bibliográficas, objetivos, metodologia e resultado dos trabalhos selecionados para a revisão sistemática da ação da quitosana e dos derivados da quitina sobre a inibição da adsorção bacteriana à superfície dentária. Natal/RN, 2005.........................................45 Quadro 4: Variáveis dependentes analisadas no estudo. Natal/RN, 2005...................................... 60 Quadro 5: Variáveis independentes analisadas no estudo. Natal/RN, 2005...................................61

12

LISTA DE TABELAS Tabela 1: Tamanho da amostra, médias, desvios-padrões, intervalos de confiança de 95% e valor de p das unidades formadoras de colônias (UFCs) em LOG10 para o total de lactobacilos, S. mutans, total de estreptococos e dos IPV E ISG em relação aos grupos teste e controle na linha base. Natal/RN, 2005...................................................................................................................... 66

Tabela 2: Tamanho da amostra, médias, desvios-padrões, intervalo de confiança de 95% e valor de p para as variáveis independentes quantitativas idade, severidade de cárie inicial, freqüência de escovação inicial, componente cariado inicial na linha base em relação aos grupos teste e controle. Natal/RN, 2005............................................................................................................................... 66 Tabela 3: Número absoluto e relativo, valor de p das variáveis independentes categóricas sexo, dentifrício com antimicrobiano, atividade de cárie e experiência de cárie na linha base entre os grupos teste e controle. Natal/RN, 2005.........................................................................................67

TABELA 4: Médias, desvios-padrões e intervalo de confiança de 95% das unidades formadoras de colônias (UFCs) em LOG10 do total de estreptococos, S. mutans e total de lactobacilos e dos IPV e ISG no tempo zero para os bochechos teste e controle. Natal/RN, 2005............................. 67

Tabela 5: Tamanho da amostra, médias, desvios-padrões, intervalo de confiança de 95% e valor de p para as variáveis independentes quantitativas freqüência de escovação final e uso dos bochechos entre os grupos teste e controle no tempo zero. Natal/RN, 2005.................................. 68

TABELA 6: Média, desvio-padrão, intervalo de confiança de 95% e valor de p das unidades formadoras de colônias (UFCs) em LOG10 do total de estreptococos, S. mutans e total de lactobacilos e do IPV e ISG no tempo quinze para os bochechos teste e controle. Natal/RN, 2005................................................................................................................................................. 69

Tabela 7: Médias, desvios-padrões, intervalo de confiança de 95% e valor de p das unidades formadoras de colônias (UFCs) em LOG10 do total de estreptococos, S. mutans e total de lactobacilos e do IPV e ISG nos tempos linha base, tempo zero e tempo quinze para o bochecho teste. Natal/RN, 2005...................................................................................................................... 70

Tabela 8: Médias, desvios-padrões, intervalo de confiança de 95% e valor de p das unidades formadoras de colônias (UFCs) em LOG10 do total de estreptococos, S. mutans e total de lactobacilos e dos IPV e ISG nos tempos linha base, tempo zero e tempo quinze para o bochecho controle. Natal/RN, 2005................................................................................................................ 71

13

SUMÁRIO 1. Introdução.................................................................................................................................15 2. Revisão de Literatura...............................................................................................................18 2.1. Considerações gerais sobre a quitina e seu principal derivado, a quitosana............................ 18 2.2. A quitosana e seus múltiplos usos............................................................................................ 21 2.3. Toxicologia da quitosana......................................................................................................... 23 2.4. Estabilidade da quitosana......................................................................................................... 24 2.5. O caráter antimicrobiano da quitosana e seus possíveis mecanismos de ação.........................25 2.6. Ação antimicrobiana da quitosana e dos derivados da quitina sobre as bactérias orais...........30 2.7. Ação da quitosana e dos derivados da quitina sobre a inibição da adsorção bacteriana à superfície dentária........................................................................................................................... 36 2.8. Ação da quitosana sobre variáveis clínicas.............................................................................. 43 3. Objetivos.................................................................................................................................... 47 3.1. Objetivo Geral.......................................................................................................................... 47 3.2. Objetivos Específicos............................................................................................................... 47

4. Procedimentos Metodológicos.................................................................................................. 48 4.1. Tipo de estudo.......................................................................................................................... 48 4.2. Amostra.................................................................................................................................... 48

4.2.1. Caracterização da amostra......................................................................................... 48 4.2.2. Critérios de inclusão.................................................................................................. 49 4.2.3. Critérios de exclusão................................................................................................. 49 4.2.4. Cálculo do tamanho da amostra................................................................................ 49

4.3. Fase Experimental.................................................................................................................... 50 4.3.1. Randomização........................................................................................................... 50 4.3.2. Coleta de dados.......................................................................................................... 50 4.3.3. Preparação das soluções para bochecho teste e controle e esquema terapêutico

adotado............................................................................................................................................ 55 4.3.4. Intervenção................................................................................................................ 56 4.3.5. Teste de estabilidade do bochecho de quitosana....................................................... 57 4.3.6. Teste de esterilidade dos bochechos teste e controle.................................................58

5. Elenco de variáveis.................................................................................................................... 60 6. Análise Estatística..................................................................................................................... 62 7. Considerações éticas................................................................................................................. 64 8. Resultados.................................................................................................................................. 65

14

9. Discussão....................................................................................................................................77 10. Conclusões...............................................................................................................................88 11. Referências..............................................................................................................................89 ANEXOS.......................................................................................................................................95

ANEXO A ANEXO B ANEXO C ANEXO D

15

1. INTRODUÇÃO

O biofilme dentário é um acúmulo de bactérias organizadas que se depositam sobre a

superfície dos dentes ou em qualquer outra superfície dura e que não descame. Na presença de

sacarose, que é substrato para as bactérias, e ausência de escovação, pode ocorrer o

desenvolvimento das doenças bucais mais prevalentes como a cárie e as doenças periodontais.

A cárie dentária é reconhecida como uma doença infectocontagiosa, resultado de uma

perda mineral localizada, cuja causa são os ácidos orgânicos provenientes da fermentação

microbiana dos carboidratos da dieta27. Já as doenças periodontais, gengivites e periodontites, são

infecções nos tecidos de suporte e/ou sustentação causadas pelo desequilíbrio da microbiota

periodontopatogênica, devido ao acúmulo desse biofilme.

Nesse sentido, ressalta-se a importância do controle do biofilme bacteriano na prevenção

das doenças bucais, uma vez que este é o agente etiológico primário de ambas, cárie e doenças

periodontais.

Desse modo, entende-se por controle do biofilme o conjunto de medidas que tem por

objetivo sua remoção e a prevenção de sua recorrência, podendo ser realizado através de meios

mecânicos ou químicos3.

No que se refere ao controle químico do biofilme, esse é considerado um coadjuvante na

prevenção e terapêutica das cáries e das doenças periodontais. Logo, pode ser feito tanto de forma

profilática como terapêutica.

O controle químico profilático do biofilme é empregado quando os atos mecânicos, no

sentido de evitar o acúmulo de bactérias, forem ineficientes, prevenindo assim o desequilíbrio da

microbiota. O controle profilático leva em consideração que as bactérias fazem parte da

microbiota anfibiôntica da cavidade oral e, seu objetivo não é a eliminação das mesmas, mas,

sim, evitar que ocorra um desequilíbrio29.

Já o controle terapêutico é utilizado quando o indivíduo apresenta uma microbiota

desequilibrada, tanto em relação a cárie ou a periodontite, com o objetivo de propiciar o

reequilíbrio da microbiota e sua harmonia com o hospedeiro8.

16

Assim, o objetivo do controle químico seria atingir as bactérias predominantes

responsáveis pela etiologia dessas principais doenças, propiciando o reequilíbrio da microbiota e

sua harmonia com o hospedeiro3.

Desse modo, uma diversidade de agentes antimicrobianos é usada para o controle

químico, preventivo ou profilático e terapêutico do biofilme dentário. Essas substâncias agem no

controle e na formação do biofilme através de algumas estratégias, que são: a redução da

colonização primária e/ou subseqüente de colonizadores bacterianos na superfície dentária;

prevenção ou inibição do crescimento e proliferação de microrganismos nas superfícies dentárias;

prevenção ou inibição da formação da matriz do biofilme dentário; e modificação bioquímica das

bactérias organizadas em biofilme, o que resulta numa microbiota menos patogênica7.

Muitas substâncias antimicrobianas são usadas no controle químico dos biofilmes. Dentre

essas, têm-se destacado as substâncias naturais, as quais têm se constituído numa alternativa

biologicamente viável. Um de seus exemplos é a quitosana, uma substância natural obtida a partir

da desacetilação da quitina, a qual é encontrada nos insetos, carapaça dos crustáceos e parede

celular de fungos.

Nessa perspectiva, a descoberta de agentes antimicrobianos com espectro de ação limitado

e sem efeitos colaterais, a fim de substituir substâncias utilizadas atualmente como a clorexidina,

pode estar nas substâncias naturais, as quais são muitas vezes amplamente disponíveis e obtidas a

partir de processos de baixo custo. A quitosana é uma substância promissora devido as suas

propriedades biológicas – sua capacidade de adesão e ativação celular – o que tem levado a

muitas aplicações na área biomédica35.

A quitina e a quitosana são biologicamente sintetizadas em um total de aproximadamente

1 bilhão de toneladas anualmente, sendo biodegradadas sem acúmulo excessivo na natureza,

através do “ciclo da quitina”. As enzimas hidrolíticas envolvidas nesse processo estão largamente

distribuídas nos tecidos e fluidos corporais dos animais e plantas, assim como no solo. A

disponibilidade mundial de quitina é estimada em mais de 39.000 toneladas, anualmente, a partir

de carapaças de crustáceos6.

Logo, a quitosana extraída da quitina, obtida de matéria-prima regional, representa lixo

orgânico que não é reaproveitado. Sob a forma de rejeitos de pesca, toneladas de quitina e seus

derivados são desperdiçados em nosso país a cada ano. Isso poderia ser evitado pelo

17

beneficiamento racional desse rejeito, mediante processos químicos de pouca complexidade e de

baixo custo para a obtenção de produtos naturais de largo espectro de ação antimicrobiana,

podendo os mesmos substituírem a clorexidina, um potente agente químico com ação

antimicrobiana53.

Nessa perspectiva, alguns trabalhos in vitro ressaltam a ação antimicrobiana e antiadesiva

da quitosana e dos derivados da quitina sobre as bactérias orais 5, 10, 15, 41, 42, 44, 51, 52 e 53. Contudo,

estes estudos por serem in vitro não conseguem reproduzir com verossimilhança a dinâmica do

ecossistema oral, portanto deixando a desejar em alguns aspectos. E, de acordo com a literatura

consultada, apenas dois estudos in vivo 43, 45 abordam a ação antibiofilme da quitosana. Algumas

críticas podem ser feitas a esses estudos acerca da metodologia utilizada e do tamanho da amostra

demonstrando a precariedade das pesquisas clínicas sobre a ação antimicrobiana, antiadesiva e

antibiofilme da quitosana. Nesse sentido, faz-se mister mais estudos que investiguem essas ações

da quitosana sobre as bactérias orais e o biofime.

Portanto, dando continuidade à linha de pesquisa sobre ação antimicrobiana dos derivados

da quitina, o presente trabalho buscou maiores informações acerca do uso clínico do biopolímero

derivado da quitina, enquanto agente antimicrobiano. Para tanto, a quitosana foi incorporada à

formulação de uma solução para bochecho, com o intuito de testar a eficácia desse biopolímero

sobre o biofilme e bactérias orais. Dessa forma, dando continuidade a este tema, ressalta-se o

investimento no desenvolvimento de uma solução natural para controle químico do biofilme

dentário, cuja matéria-prima é abundante na natureza local e pouco aproveitada.

18

2. REVISÃO DE LITERATURA

A revisão de literatura deste trabalho foi dividida, didaticamente, em duas partes. A

primeira delas trata-se de uma revisão tradicional e, a segunda, de uma revisão sistemática.

Dessa forma, as considerações gerais sobre a quitina e quitosana, seus múltiplos usos,

toxicologia, estabilidade do biopolímero, seu caráter antimicrobiano, em geral e seus mecanismos

de ação serão descritos através da revisão narrativa tradicional.

As pesquisas relacionadas com a ação antimicrobiana da quitosana e dos derivados da

quitina sobre as bactérias orais, a capacidade de inibição da adsorção bacteriana à superfície

dentária e suas ações sobre as variáveis clínicas serão analisadas através de uma revisão

sistemática.

Nesse sentido, uma revisão sistemática permite localizar, analisar e sintetizar evidências

de artigos originais, de acordo com critérios científicos desenhados a priori e relatados na

apresentação dos resultados, sendo, portanto, reprodutível em outros locais, empregando-se a

mesma metodologia. Os critérios metodológicos estabelecidos têm como objetivo alcançar

abrangência de todos os estudos relevantes à questão investigada e ausência de tendenciosidade

na inclusão/exclusão de artigos e na análise e síntese dos resultados46.

2.1. Considerações gerais sobre a quitina e seu principal derivado, a quitosana

A celulose e a quitina são os materiais poliméricos mais importantes na natureza, devido a

sua surpreendente abundância e fácil acesso24. Esses materiais são semelhantes em sua natureza

funcional (baixa solubilidade e baixa reatividade química) e na sua estrutura polimérica, porém a

quitina difere da celulose pela substituição da hidroxila por um grupo acetamina no carbono de

posição dois23 (figura 1).

19

HOHO

OOH

NH

CCH3

O

OHOHO

OO OO

CCH3

OCCH3

O

NHNH HOHO

HOO

OH

NH

CCH3

O

OHOHO

OO OO

CCH3

OCCH3

O

NHNH HO

Figura 1: Estrutura química da quitina. Natal/RN, 2005.

A quitina é uma substância natural encontrada em grande abundância na natureza,

principalmente, em áreas costeiras, e tem como principais fontes as carapaças de crustáceos

(notadamente o caranguejo, o camarão e a lagosta), sendo também encontrada em insetos,

moluscos e na parede celular de fungos6.

Esse biopolímero tem sido bastante pesquisado, uma vez que trata-se de um

aminopolissacarídeo que apresenta importantes propriedades estruturais como a

biodegradabilidade, biocompatibilidade aos tecidos e a bioatividade. Suas propriedades incluem a

formação de polioxisais e filmes e quelação de íons metálicos, devido a altas porcentagens de

nitrogênio (cerca de 6,89%) e características estruturais ópticas23.

Todavia, as modificações químicas da quitina são difíceis devido à baixa solubilidade e

reações em condições heterogêneas, dificultando a substituição regioseletiva e sua degradação

parcial24.

Esse biopolímero natural é altamente hidrofóbico, insolúvel em água e nos solventes

orgânicos. É solúvel em hexafluorisopropanol, hexafluoracetona, cloroálcoois adicionados a

soluções aquosas de ácidos minerais e dimetilacetamida contendo 5% de cloridrato de lítio23.

A partir da desacetilação da quitina, obtém-se a quitosana, que é um heteropolissacarídeo

linear, constituído de unidades ß-(1→4)-2-deoxi-D-glicose e ß-(1→4)-2-amino-D-glicose40. Essa

20

é solúvel em diluições ácidas como o ácido acético e o ácido fórmico e, relativamente, insolúvel

em água23.

OH OHOHOH OHOH

Q

poliamin

em sua

no entan

sejam:

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bacterio

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O

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que o a

biopolím

Portanto

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E

tempera

flexíveis

contend

HOHO

ONH2

OOO O

ONH2 NH2HO

HOHO

ONH2

OOO O

ONH2 NH2HO

Figura 2: Estrutura química da quitosana. Natal/RN, 2005

uimicamente, a quitosana é um biopolímero de alto peso molecular (PM), sendo uma

a que apresenta propriedades que se relacionam com a presença de grupos amino livres

estrutura (figura 2), o que a torna apta à aplicação em diversas áreas. Seu uso mais nobre,

to, está na área biomédica. O seu largo emprego deriva de suas propriedades únicas, quais

biopolímero de fonte natural, baixa toxicidade (dose de 15g/kg em ratos), ação

otetora, ativadora celular, hemostática, indutora de aumento da resposta humoral,

stática e espermicida, efetiva no metabolismo de células tumorais e passível de ser

urada na forma de fibras, filmes, lâminas e géis22,40.

utrossim, outra característica marcante refere-se à sua biodisponibilidade. Diante disso,

alho in vitro desenvolveu filmes e hidrogéis contendo quitosana e clorexidina para serem

a cavidade oral. Foi observado que os géis de quitosana exibem fluidez pseudoplástica e

umento da viscosidade é diretamente proporcional ao aumento da concentração do

ero, aumentando significativamente a liberação de clorexidina por três a quatro horas.

, os resultados indicaram que géis e filmes de quitosana a 2% prolongam a liberação da

ina e mantém os filmes intactos, por até 4 horas, podendo ser muito promissores nas

periodontais47.

m relação à sua viscosidade, foi observado que quanto maior a viscosidade, menor a

tura e maior a energia de ativação dos filmes. Os filmes de quitosana são bastantes

e podem ser usados como pacotes biodegradáveis ou como suportes para filmes

o agentes antimicrobianos2.

21

Ainda nesse sentido, um estudo in vitro avaliou a viscosidade de géis e filmes de

quitosana com diferentes pesos moleculares e graus de desacetilação sobre Porphyromonas

gingivalis. Observaram que quanto maior o peso molecular e a concentração da quitosana, maior

sua viscosidade. Com isso, concluíram que a viscosidade é uma propriedade apresentada pelos

géis de quitosana, e que a torna ideal para a introdução de materiais nas bolsas periodontais15.

Outro estudo in vitro verificou que as soluções de quitosana mais diluídas apresentaram

maiores halos de inibição em comparação com as mais concentradas para o Streptococcus mutans

e Streptococcus sanguinis. Nesse sentido, quanto maior a viscosidade da solução, menor a ação

antimicrobiana53.

2.2. A quitosana e seus múltiplos usos

Dentre as diversas aplicações da quitosana, podem-se destacar uma eficácia comprovada

na confecção de biomateriais, o que se deu através de membranas renais, pele artificial, lentes de

contato e outros produtos. No tratamento e regeneração de ferimentos (hemostáticos), a quitosana

é aplicada na forma de bandagens, que além de proteger contra agentes externos (bactérias),

promove e induz uma rápida cicatrização6.

A quitosana é utilizada ainda como agente imobilizador para liberação controlada de

medicamentos; auxiliar na redução de peso em tratamentos de obesidade, através da captura das

gorduras contidas nos alimentos; regenerador de ferimentos; antiácido; auxiliar no controle da

pressão arterial; regenerador da estrutura óssea; redutor do nível de ácido úrico; redutor do

colesterol LDL; bactericida/antiviral; inibidor da formação de biofilme bacteriano; incrementador

da absorção de cálcio pelo organismo, além de ser utilizado como matéria-prima de membranas

artificiais6.

A quitosana é considerada como uma fibra de origem animal, pois possui uma estrutura

química muito semelhante à celulose, não sendo também digerida pelas enzimas digestivas31.

Sendo assim, por se tratar de uma fibra, contribui, caso haja uma dieta rica nesse

composto, para o aumento do bolo fecal, diminuição do tempo de trânsito dos alimentos através

22

do trato gastrintestinal, redução dos níveis de colesterol séricos e controle dos teores de açúcar no

sangue6.

Seguindo a linha de raciocínio anterior, uma dieta rica em fibras está diretamente

associada à redução da incidência de algumas doenças. Dessa forma, a quitosana por ser uma fibra

solúvel, aumenta a viscosidade do conteúdo gastrointestinal, provocado pelo gel formado a partir

da solubilização da fibra, a qual retarda o esvaziamento gástrico, diminuindo, desse modo, a

absorção da glicose no processo da digestão e reduzindo a necessidade de insulina em alguns

pacientes com Diabetes mellitus30.

Essa mesma fibra, quando presente no trato gastrointestinal, se liga aos ânions dos ácidos

graxos (gorduras) e aos ácidos biliares carregados negativamente. A partir dessa ligação, forma-se

assim um complexo não absorvido pelo organismo que é, então, excretado junto com as fezes,

reduzindo, conseqüentemente, os níveis de colesterol LDL na corrente sangüínea11.

No primeiro estudo em seres humanos sobre o efeito hipocolesterolêmico da quitosana,

foram administradas doses de quitosana a voluntários por 14 dias e se observou que o nível médio

de colesterol sérico reduziu-se de 189 ± 3mg/dL para 177 ± 4mg/dL, havendo um aumento

significativo nos níveis de colesterol HDL e na excreção de ácidos biliares. O estudo concluiu que

a quitosana é capaz de baixar os níveis de colesterol séricos sem nenhum efeito colateral28.

A quitosana age também como agente hipotensor, através da ligação ao íon cloreto,

carregado negativamente, propiciando assim sua excreção do organismo e, reduzindo, dessa

forma, a pressão arterial6.

Ademais, alguns estudos clínicos demonstraram que a quitosana, quando acrescida à dieta,

aumenta a absorção do cálcio pelo organismo, o que proporciona melhor qualidade do tecido

ósseo, prevenindo assim a osteoporose. Portanto, baseado nesses resultados, os pesquisadores têm

indicado a quitosana como suplemento alimentar na prevenção e tratamento da osteoporose32.

A quitosana tem ainda uma propriedade de se ligar às células cancerosas, as quais possuem

uma carga superficial negativa maior do que as células normais. Desse modo, existe seletividade e

maior tendência de adesão da quitosana sobre essas células em relação às células normais. Devido

a isso, estão sendo desenvolvidas drogas específicas para o combate a células cancerosas,

conhecidas na comunidade científica como “mísseis”. O complexo quitosana-5FU, também

denominado “pró-droga” macromolecular, exibiu forte atividade antitumoral (maior do que a

23

droga na forma livre); prolongou a atividade da droga através da lenta liberação da mesma; e

ainda envolveu as células alteradas, não afetando as células normais, como, geralmente, ocorre

com as drogas anticancerígenas administradas na forma “livre”37.

Outra característica da quitosana é atuar como antiácido natural. Dessa maneira, em

contato com o meio bucal, devido ao seu caráter básico, eleva seu pH, ligando-se aos ácidos

oriundos do metabolismo bacteriano e às bactérias, que são carregadas negativamente, prevenindo

a formação do biofilme e atuando como um importante coadjuvante na higiene oral48.

Em Odontologia, a quitosana possui várias aplicações, sobretudo na Periodontia, em que é

utilizada na forma de membranas reabsorvíveis para o tratamento de seqüelas da doença

periodontal. Quando associada a outras substâncias como óxido de zinco, óxido de cálcio e

hidroxiapatita, a quitosana revela-se como um substituto em potencial do tecido ósseo para o

tratamento de defeitos periodontais16.

Essa aplicação da quitosana na Odontologia está bastante relacionada com a

bioadesividade deste biopolímero. Um estudo in vitro testou esta propriedade através da

incorporação da quitosana em géis e filmes, detectando-se um aumento da bioadesividade dos géis

em comparação com os filmes quando da sua incorporação. Portanto, foi constatado que géis e

filmes de quitosana têm significativa propriedade bioadesiva, promovendo a retenção da droga no

sítio de ação, assim como sua liberação em tempo prolongado. Isso contribui para o efeito

contínuo da quitosana sobre a permeabilidade epitelial depois da sua remoção física sobre a

superfície oral, vindo a ser um sistema promissor nas terapias periodontais15.

2.3. Toxicologia da quitosana

A quitosana é benéfica e segura para o consumo humano e tem sido utilizada em

numerosas aplicações na indústria, na área de saúde e em produtos alimentícios. Na indústria

alimentícia, a quitosana é utilizada em biscoitos, tortas, bolos, macarrões, molhos e pasta de soja,

dentre outros. Nessa área, o maior destaque se deve à utilização da quitosana como alimento

funcional e potente auxiliar na perda de peso e na redução de colesterol. Principalmente, no Japão,

onde o produto está bem regulamentado, os produtos referidos são comercializados livremente e

24

facilmente adquiridos, proporcionando à população grandes efeitos benéficos em termos de

saúde6.

Ainda nesse sentido, refere-se que a toxicidade da quitosana é menor do que a glicose

(açúcar comum) ou sacarose. A dose letal de glicose em mamíferos é da ordem de 8 a 12 gramas,

enquanto que 18 gramas de quitosana por quilograma de massa corporal em mamíferos não

apresenta qualquer sinal de toxicidade ou mortalidade. Os únicos problemas relatados até hoje,

decorrentes de doses excessivas da quitosana, foram causados por desidratação gástrica e pelo

impacto em decorrência do aumento do volume da mesma6.

É recomendado, também, que não se deva usar quitosana em indivíduos que tenham

qualquer tipo de alergias a crustáceos, em períodos de gravidez ou amamentação6.

2.4. Estabilidade da quitosana

A estabilidade da quitosana diz respeito ao comportamento físico-químico deste

biopolímero durante um certo período de tempo. A alteração desta propriedade resulta na quebra

das cadeias químicas da quitosana, havendo diminuição no tamanho das partículas, e, dessa

forma, alterando sua bioatividade.

Dessa maneira, alguns trabalhos acerca da estabilidade da quitosana foram analisados com

o intuito de obter melhor embasamento teórico sobre este assunto, uma vez que esta pesquisa

utilizou um bochecho de quitosana durante quinze dias e fez-se necessário testar a estabilidade

deste durante este período de tempo.

Uma das aplicações da quitosana é como matriz de captura de células no tratamento de

água contaminada. Nesse sentido, o sucesso do biotratamento da água foi devido à estabilidade

química significativa dos géis de quitosana em altas concentrações, durante o período de um

mês20.

Um outro estudo analisou a estabilidade físico-química da emulsão quitosana-lipídio, após

processos de esterilização em autoclave. Foi observado que essa combinação quitosana-lipídio foi

estável suficiente para resistir ao choque térmico induzido durante os processos de esterilização,

sem mudança significativa no tamanho das partículas, devido à propriedade da quitosana de se

25

ligar à carga negativa dos lipídios e sem fase de separação, formando uma interface com toda a

superfície carregada positivamente18.

Ainda nesse sentido, quando ocorre aumento da concentração de quitosana, este deve ser

acompanhado de um aumento na quantidade de lipídios para produzir uma formulação estável.

Portanto, a quitosana tem ampla margem de segurança, abrindo caminho às pesquisas para

formulações de emulsões carregadas positivamente, sem toxicidade significativa e com boa

estabilidade físico-química18.

Dentro dessa perspectiva, observou-se que filmes de quitosana-amilase mudaram a

cristalinidade dentro de três meses de armazenamento e que essas mudanças são dependentes da

plastificação e das condições de armazenamento. Os filmes plastificados com glicerol e

armazenados a 25°C com umidade relativa de 60% permaneceram flexíveis e amorfos por três

meses4.

2.5. O caráter antimicrobiano da quitosana e seus possíveis mecanismos de ação

O caráter antimicrobiano da quitosana é de particular interesse. Diante disso, algumas

pesquisas que abordaram essa temática foram analisadas a seguir.

Foi relatado que a ação bactericida e bacteriostática da quitosana pode prevenir infecções e

abscessos experimentais contendo estafilococos, quando tratados com quitosana, apresentando

ação semelhante à ampicilina21. Outro estudo verificou que a quitosana inibiu o crescimento de

Escherichia coli e Helminthosporium, devido a uma provável ligação do grupo amino catiônico

do biopolímero aos grupos aniônicos destes microrganismos23.

Ainda nesse contexto, uma pesquisa in vitro avaliou a atividade antibacteriana de sais

quaternários de amônia de quitosana e determinou a CIM (capacidade mínima inibitória) e CBM

(concentração bactericida mínima) desses sais sobre E. coli. Foi observado que a

propildimetilquitosana apresentou ação antimicrobiana sobre E. coli maior do que a

trimetilquitosana. Demonstrou-se que a extensão da cadeia acil afeta fortemente a capacidade

bactericida dos derivados da quitina. A ação antibacteriana da propildimetilquitosana sobre E.

26

coli foi vinte vezes maior do que a da quitosana, indicando que os quaternários de amônia de

quitosana, devido à sua alta carga catiônica, exibem alta atividade bactericida17.

Nesse contexto, a eficácia antimicrobiana in vitro da quitosana em soluções aquosas e

lipídicas foi testada com o intuito de produzir formulações com ações mais efetivas na redução do

número de microrganismos. Um estudo observou que a quitosana com peso molecular de 8,7X104

g/mol, alto grau de desacetilação e baixa viscosidade apresentou melhor atividade antimicrobiana

e que as formulações sem quitosana aumentaram o número de microrganismos19.

Verificou-se também que a quitosana com alto peso molecular, alto grau de desacetilação

e baixa viscosidade apresentou maior atividade antimicrobiana sobre Pseudomonas aeruginosa

em comparação a uma quitosana com características opostas. Portanto, estes resultados favorecem

o uso da quitosana como agente antimicrobiano a ser utilizado em formulações para aplicações na

mucosa e por via parenteral19.

A atividade antimicrobiana da quitosana sobre os microrganismos, constatada por alguns

autores, pode sofrer influência de alguns fatores, tais como: peso molecular (PM), grau de

desacetilação (GD), concentração e pH da solução de quitosana. Nesse contexto, seguem-se

algumas pesquisas que foram analisadas com o objetivo de avaliar a influência de tais fatores.

Um estudo realizado in vitro avaliou a ação antibacteriana da quitosana e da

carboximetilquitosana com diferentes pesos moleculares sobre a E. coli. Foi observado que

quanto maior o PM, maior a ação bactericida. Porém, quando o PM excedeu 9,16 X 104 g/mol, os

grupos amino da quitosana em grande quantidade, promoveram uma forte ligação dos

hidrogênios intramoleculares, impedindo a fixação da quitosana à superfície bacteriana e

diminuindo, então, o efeito bactericida. Constatou-se também que quanto maior o GD, maior a

ação antimicrobiana do biopolímero, devido ao aumento da concentração de grupos NH2

protonados que podem se ligar à superfície bacteriana26.

Foi verificado ainda que, quanto maior a concentração da quitosana, maior a ação

antimicrobiana da mesma. Diante disso, demonstrou-se o mecanismo de ação da quitosana em

diferentes concentrações em solução. Em baixa concentração, a quitosana se liga à carga negativa

da superfície bacteriana, perturbando a atividade de membrana celular e propiciando a saída dos

componentes intracelulares. Em alta concentração, a quitosana se adiciona à membrana da

superfície bacteriana, impedindo a transferência dos íons através da membrana celular, tendo

27

como conseqüência a morte bacteriana. Portanto, essa ação sobre as bactérias depende do PM,

GD e da concentração de NH2 protonado em solução26.

Seguindo essa lógica, testou-se in vitro a ação antimicrobiana da quitosana com diferentes

pesos moleculares sobre bactérias gram positivas e gram negativas. Em relação às bactérias gram

negativas, a atividade antibacteriana aumentou com o decréscimo do PM, porém essa tendência

não foi observada para as gram positivas. A quitosana com alto PM mostrou efeito bactericida

mais forte para as bactérias gram positivas do que sobre as gram negativas. Foi observado que a

quitosana inibiu o crescimento da maioria das bactérias em teste, contudo, essa inibição teve

relação com o PM e a espécie bacteriana34.

Num outro estudo, a capacidade mínima inibitória da quitosana com diferentes pesos

moleculares foi testada sobre onze bactérias. Observou-se que para as bactérias gram negativas, a

quitosana com baixo PM apresentou maior ação antimicrobiana do que as de alto PM. A

quitosana com mais baixa concentração (0,05-0,08%) e com alto PM foi mais efetiva na inibição

do crescimento de bactérias gram positivas (Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Staphylococcus

aureus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus bulgaricus) do que sobre

gram negativas (E. coli, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhimurium, Vibrio

parahaemolyticus) 34.

Em outro estudo, foi demonstrado in vitro que a solução de quitosana a 0,5% com PM

acima de 48,5 KDa apresentou maior efeito bactericida sobre S. aureus do que sobre E. coli.

Quando houve uma diminuição do PM da quitosana (PM < 5KDa), melhor ação antimicrobiana

sobre bactérias gram negativas pode ser observada. Para bactérias gram positivas, a atividade

antibacteriana melhora com o aumento do PM. Ainda nesse sentido, a solução de quitosana

apresentou efeito bactericida diretamente proporcional à concentração do biopolímero na

solução54.

Um ensaio in vitro analisou a ação antimicrobiana da dietilmetilquitosana e da quitosana

sobre a E. coli e observou não haver diferença significativa entre a ação antimicrobiana da

quitosana e seu derivado com baixo e médio PM1.

Calcado nos achados sobre a atividade bactericida da quitosana, muitos mecanismos de

ação foram propostos para explicar esse fato.

28

Algumas propostas de mecanismos de ação antimicrobiana da quitosana foram

enfatizadas, tais como: interação da quitosana com a membrana das células, alterando a

permeabilidade celular; a natureza policatiônica da quitosana, o qual interfere com os resíduos de

cargas negativas das macromoléculas de superfície; e união da quitosana com o DNA da célula,

inibindo a síntese de RNA26.

Conforme outros achados, o mecanismo de ação antimicrobiana postulado para a

quitosana consiste em inativação enzimática, quelação de íons metálicos essenciais e formação de

complexos de polieletrólitos nas superfícies bacterianas51.

Ainda sob essa lógica, alguns autores afirmaram que a quitosana age sobre fungos, algas e

bactérias, tendo como sítio de ação a parede celular desses microrganismos. Em bactérias gram-

negativas, a quitosana se liga à parede celular, alterando sua superfície e formando estruturas

vesiculares que determinam a perda de sua função de barreira13.

De acordo com outras descobertas, a quitosana de alto PM apresenta macromoléculas

rígidas e assimétricas que se aderem facilmente a compostos aniônicos. Sendo assim, pode-se

imaginar que a atividade antimicrobiana destes biopolímeros também pode estar relacionada com

suas características físico-químicas9.

Dando continuidade à ação antimicrobiana da quitosana, muitas pesquisas constataram

que esta ação está diretamente relacionada com o pH da solução.

Nesse contexto, um trabalho avaliou a atividade antimicrobiana da quitosana e seus

derivados sobre E. coli em relação ao pH da solução. Foi observado que em pH baixo, o grupo

NH2 da quitosana apresenta-se protonado, o que favorece interações com a superfície negativa

das células bacterianas. Os autores de tal trabalho relataram que quanto menor o pH da solução,

menor a CIM. Verificou-se ainda que o ácido acético, utilizado para solubilizar a quitosana,

também apresenta atividade antimicrobiana, sugerindo um efeito antibacteriano mútuo entre este

ácido e os derivados da quitosana17.

Seguindo a idéia anterior, foi investigado in vitro a relação do pH com a capacidade

bactericida da quitosana e carboximetilquitosana sobre E. coli. Quando o pH da solução foi maior

que 6,3 , a quantidade de NH2 protonado diminuiu e a solubilidade da quitosana também,

constatando uma diminuição da ação inibitória do biopolímero sobre as bactérias. Não foi

observada nenhuma capacidade antimicrobiana da quitosana em pH 7 ou acima devido à pobre

29

solubilidade nessas condições. Por conseguinte, a solubilidade da quitosana influencia na sua

ação antimicrobiana e quanto menor o pH, maior a atividade antibacteriana da mesma26.

Em uma outra análise in vitro sobre o efeito do pH da solução de quitosana e sua relação

com a atividade antimicrobiana, foi observado que o grupo controle, com ácido lático, sem

quitosana e pH abaixo de 5,0 , causou redução do número de microrganismos em torno de 4

LOGs. A quitosana a 0,014% obteve ação antimicrobiana sobre P. aeruginosa e S. aureus em pH

5,0, com redução das UFCs maior do que 5 LOGs. Logo, o estudo mostrou que a atividade

antimicrobiana da quitosana é afetada pelo valor do pH e, que soluções de quitosana com valores

de pH maiores que 5,5 causaram precipitação da quitosana dissolvida19.

É sabido que a quitosana só se dissolve em soluções ácidas. Dessa maneira, o estudo de

No e colaboradores34 avaliou a atividade antimicrobiana dos ácidos solventes da quitosana sobre

seis bactérias selecionadas. Foi observado que os ácidos acético, lático e fórmico foram mais

efetivos na inibição bacteriana do que os ácidos propiônico e ascórbico. Segundo ele, o ácido

acético foi efetivo na inibição do crescimento da maioria das bactérias, porém não neutralizou o

ácido lático produzido pelo metabolismo bacteriano34.

Nesse mesmo estudo, foi avaliado o efeito do pH da solução sobre a atividade

antimicrobiana da quitosana a 0,03%. Constatou-se que quanto menor o valor do pH, maior a

atividade antimicrobiana da quitosana34.

Uma outra pesquisa mostrou que a ação antimicrobiana in vitro sobre E. coli da

dietilmetilquitosana é maior do que a quitosana e que essa ação aumenta com o aumento da

concentração do ácido acético. Desse modo, reconhece-se a capacidade antimicrobiana do ácido

acético, porém aponta-se que tal atividade é significativamente maior na presença de quitosana e

seus derivados. Por isso, a ação bactericida da quitosana e seus derivados é pH dependente e o

aumento na concentração de ácido acético resultou num significativo decréscimo dos valores da

CIM e CBM1.

Ainda se tratando da relação quitosana e pH, alguns estudos apontam o efeito tampão

desse biopolímero em biofilmes.

Nesse sentido, um estudo in vivo avaliou a eficácia da goma de quitosana a 1% e 3% de

baixo PM sobre o pH do biofilme após exposições a carboidratos fermentáveis. Houve uma

rápida neutralização dos ácidos proveniente do metabolismo bacteriano após a mastigação da

30

goma de quitosana e o valor do pH aumentou para valores acima de 5,5. Os achados indicaram

que a quitosana promove o restabelecimento do pH a valores normais, mantendo, pois, o pH do

biofilme neutro49.

Uma outra pesquisa realizada tanto in vitro como in vivo, verificou as propriedades físicas

da quitosana de baixo PM sobre o pH do biofilme na presença ou ausência de carboidratos

fermentáveis. Foram testados seis tipos de quitosana de baixo PM e com GD entre 50 e 95%. Na

presença de glicose houve rápida queda de pH chegando até 4,5 , porém com a adição da

quitosana de baixo PM houve a redução da queda do pH para 5,0. Os autores concluíram que a

quitosana de baixo PM não pode influenciar a atividade glicolítica do S. mutans e que o efeito

sobre a inibição da queda do pH da cavidade oral pode ser advindo da capacidade tampão da

quitosana devido a sua alta permeabilidade no biofilme. O PM e o GD também podem influenciar

nesta permeabilidade e na capacidade de inibir a queda do pH do biofilme in vivo48.

2.6. Ação antimicrobiana da quitosana e dos derivados da quitina sobre as bactérias orais

No que diz respeito à ação antimicrobiana oral da quitosana e dos derivados de quitina

fez-se oportuno à realização de uma revisão sistemática.

Para tanto, foram analisados trabalhos que contemplassem o tema em estudo. As

estratégias de busca para a identificação desses trabalhos incluíram pesquisas eletrônicas nas

bases de dados MEDLINE (Literatura Internacional em Ciências da Saúde), LILACS (Literatura

Latino-Americana e do Caribe em Ciências da Saúde) e BBO (Biblioteca Brasileira de

Odontologia), além das buscas manuais nas referências bibliográficas dos artigos selecionados.

Os artigos selecionados enquadraram-se nos seguintes critérios de inclusão: 1) estudos in

vivo e in vitro; 2) publicados em inglês, português e espanhol; 3) cujo desfecho fosse presença ou

ausência de halo de inibição, contagem de unidades formadoras de colônias e presença ou

ausência de diferenças morfológicas analisados mediante microscópio eletrônico de varredura

(MEV) e microscópio de transmissão (MET).

31

Já os critérios de exclusão da revisão sistemática foram: 1) artigos não relacionados à ação

antimicrobiana; 2) ação sobre bactérias de outros habitats que não a cavidade oral; 3) artigos do

tipo revisão bibliográfica.

As estratégias de busca realizadas foram as seguintes:

No MEDLINE, nos anos de 1966 a 2005:

1ª busca: (“chitin” or “chitosan”) and (“antimicrobial” or “antimicrobian” or

“antimicrobiana” or “antimicrobianas” or “antimicrobiano” or “antimicrobianos”) como

palavras; and (“espanhol or inglês or português”) como idiomas;

2ª busca: (“chitin” or “chitosan”) and (“antimicrobial” or “antimicrobian” or

“antimicrobiana” or “antimicrobianas” or “antimicrobiano” or “antimicrobianos”) and

(“oral”) como palavras; and (“espanhol or inglês or português”) como idiomas;

Na base LILACS e BBO, foi feita a seguinte estratégia de busca:

(“chitin”) and (“antimicrobial” or “antimicrobials” or “antimicrobian” or

“antimicrobiana” or “antimicrobianas” or “antimicrobiano” or “antimicrobianos”) como

palavras; and (“espanhol or inglês or português”) como idiomas;

Na base LILACs, não foi encontrada nenhuma referência bibliográfica sobre o tema em

questão. Nas buscas manuais, foram selecionados artigos pertinentes mencionados na bibliografia

dos outros artigos já selecionados no MEDLINE e no BBO.

Assim, na base de dados MEDLINE, foram encontrados 65 artigos na 1ª busca e

selecionados 2; 5 artigos na 2ª busca, selecionando-se 2 que já estavam incluídos dentre os

artigos selecionados na primeira busca. Na base BBO, foi selecionado um artigo. Nas buscas

manuais, foram selecionados dois artigos, totalizando cinco artigos que se encontram

apresentados no quadro 1.

32

Quadro 1: Referências bibliográficas, objetivos, metodologia e resultados dos trabalhos selecionados para a revisão sistemática da ação antimicrobiana da quitosana e dos derivados da quitina sobre bactérias orais. Natal/RN, 2005.

BIBLIOGRAFIA OBJETIVOS METODOLOGIA RESULTADOS

Choi BK, Kim KY, Yoo YJ, Oh SJ, Choi JH, Kim CY. In vitro antimicrobial activity of a chitooligosaccharide mixture against Actinobacillus actinomycetemcomitans and Streptococcus mutans. Int J of Antimicrob Agents 2001; 18: 553-57.

Avaliar in vitro a atividade antimicrobiana do quitooligossacarídeo sobre o Actinobacillus actinomycetemcomitans (A.a.) e S. mutans.

Preparou-se uma solução de quitooligosacarídeo a partir da despolimerização da quitosana em 0,3% de ácido acético. O S. mutans e A.a. foram cultivados em BHI caldo e, em seguida, foi adicionada a solução de quitooligosacarídeo. Esta mistura foi inoculada em BHI ágar a 37°C por 24-48h para posterior contagem das UFCs. As mudanças morfológicas nas células bacterianas foram analisadas pelo microscópio eletrônico de varredura (MEV) e pelo microscópio de transmissão (MET).

A capacidade mínima inibitória (CIM) de quitooligossacarídeo que obteve ação antimicrobiana foi de 0,001%, inibindo maior quantidade de A.a. do que S. mutans em 120 minutos de exposição. As células de A.a. examinadas pelo MEV e MET apresentaram mudanças intra e extracelularmente, incluindo separação da membrana citoplasmática do envoltório celular.

Ikinci G, Senel S, Akincibay H, Kas S, Ercis S, Wilson CG et al. Effect of chitosan on a periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis. Int J Pharm 2002; 235: 121-27.

Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro dos géis e filmes de quitosana com diferentes pesos moleculares e graus de desacetilação sobre Porphyromonas gingivalis.

Géis de quitosana de 1e 2% com alto PM, adicionados de clorexidina, e de 3% com baixo PM foram diluídos em ácido lático. A amostra testada de P. gingivalis foi isolada do biofilme subgengival de pacientes com doença periodontal. A P. gingivalis foi adicionada aos géis de quitosana e incubados em anaerobiose a 37°C por 48h. Para os filmes, foi feito o teste de difusão em ágar e medido o diâmetro dos halos de inibição.

Os géis de quitosana com diferentes PM e GD inibiram o crescimento bacteriano e os filmes apresentaram halos de inibição superior a oito milímetros de diâmetro. O aumento da ação antimicrobiana foi obtido com o aumento do PM da quitosana.

33

Teixeira JA. Ação antimicrobiana in vitro de derivados da quitina sobre bactérias orais organizadas em biofilme [dissertação]. Natal (RN): UFRN; 2002.

Determinar a concentração bactericida mínima (CBM) e avaliar in vitro a ação antimicrobiana da quitosana com diferentes PM e GD sobre S. mutans, S. sanguinis e S. sobrinus organizados em biofilme.

Para determinar a CBM, as soluções de quitosana foram diluídas 6 vezes e embebidas em discos de papéis. Em seguida, uma membrana de nitrocelulose com bactérias organizadas em biofilme foi colocada por sobre estes discos e incubados em anaerobiose a 37°C por 48h. A CBM foi a menor diluição onde não ocorreu a presença de bactérias viáveis. A partir da CBM, as bactérias organizadas em biofilme foram colocadas em tubos de ensaio contendo as soluções de quitosana por 5 min para verificação do efeito antibacteriano sobre os biofilmes.

A quitosana a 0,4% com alto PM e GD apresentou ação antimicrobiana sobre S. mutans e S. sanguinis e a 0,8% inibiu o crescimento de S. sobrinus e L. casei. Quanto maior o PM e o GD, maior a ação antimicrobiana da quitosana. A quitosana com baixo PM e GD não foi capaz de inibir nenhuma cepa bacteriana testada. A quitosana com alto PM, GD e baixa viscosidade apresentou efeito bactericida sobre bactérias orais organizadas em biofilme de forma similar à clorexidina.

Decker EM, Weiger R, Wiech I, Heide PE, Brecx M. Comparison of antiadhesive and antibacterial effects of antiseptics on Streptococcus sanguinis. Eur J Oral Sci 2003; 111: 144-148.

Comparar in vitro o efeito de três antisépticos bactericidas e uma substância antiadesiva (quitosana) sobre a viabilidade e a densidade das células de S.sanguinis planctônicos ou fixados.

Antisépticos testados: clorexidina a 0,12%, Olaflur® (Ola 0,13%), Octenisept® (Oct 0,1%); e a quitosana como antiadesiva. As bactérias foram expostas a cada substância por 2 min. Em seguida, suspensas em saliva humana e fixadas em esmalte por 60 min, submetidas a um sistema de câmara de fluxo, em que foram novamente expostas às substâncias testadas. Foi feita a contagem das UFCs fixadas ao esmalte e

A quitosana não inibiu o crescimento bacteriano, apresentando apenas uma ligeira redução das UFCs dos S.sanguinis planctônicos.

34

suspensas em solução. Sano H, Shibasaki KI, Matsukubo T, Takaesu Y. Effect of chitosan rinsing on reduction of dental plaque formation. Bull Tokyo Dent Coll 2003; 44: 9-16.

Analisar o efeito in vivo do bochecho de quitosana a 0,5% com PM de 6 KDa e GD de 60% sobre os níveis de S. mutans salivares.

Duzentos gramas de quitosana foram diluídas em 10 litros de água deionizada e, posteriormente, a solução foi neutralizada. Composição do bochecho de quitosana: quitosana a 0,5%, etanol a 15%, glicerina a 10%, sacarina sódica a 0,008%, polioxietilenohidrogenada a 1% e 0,3% de flavorizante. O ensaio foi controlado, randomizado, duplo-cego, crossover. Os 24 indivíduos bochecharam 20 mL da solução por 30 segundos, duas vezes ao dia após a escovação, durante 14 dias. Os bochechos não foram supervisionados e foi usado um dentifrício comercial sem flúor. As amostras de saliva não estimulada foram coletadas no início e no fim de cada período dos bochechos e 0,1mL desta foi colocado em tubo estéril contendo MSB caldo e incubadas a 37°C por 24 horas.

No grupo do bochecho de quitosana, dezesseis indivíduos apresentaram redução na contagem de S. mutans, enquanto no grupo placebo, apenas cinco indivíduos apresentaram redução das UFCs desta espécie bacteriana.

35

A ação antimicrobiana da quitosana e dos derivados da quitina sobre as bactérias orais

vem sendo testada em alguns estudos que também correlacionam-na com o PM, GD e

concentração desse biopolímero. Alguns trabalhos observaram essa ação antimicrobiana sobre o

S. mutans.

Choi e colaboradores5 observaram in vitro que o quitooligossacarídeo apresentou

capacidade mínima inibitória (CIM) na concentração a 0,001%, inibindo o S. mutans em 120

minutos de exposição. Teixeira53 afirmou que a quitosana a 0,4% com alto PM e alto GD

apresentou ação antimicrobiana in vitro sobre o S. mutans. Confirmando esse fato, um trabalho in

vivo realizado por Sano e colaboradores43 verificou que o bochecho de quitosana a 0,5% com

baixo PM e alto GD reduziu as unidades formadoras de colônias do S. mutans salivares de

dezesseis indivíduos participantes da pesquisa. Portanto, esse bochecho usado diariamente reduz

significativamente o número desta espécie bacteriana na saliva43.

Outros estudos abordaram a ação antimicrobiana da quitosana sobre Streptococcus

sanguinis, Streptococcus sobrinus e Lactobacillus casei. Nesse sentido, Decker e colaboradores10

verificaram que a quitosana apresentou uma ligeira redução das UFCs dos S. sanguinis

planctônicos. Corroborando esse estudo, Teixeira53 observou que a quitosana a 0,4% com alto

PM e alto GD inibiu o crescimento desta espécie bacteriana. Esse mesmo autor também verificou

que esse biopolímero a 0,8% inibiu o crescimento do S. sobrinus e do L. casei. Dessa forma, foi

observado também que quanto maior o PM e o GD maior a ação antimicrobiana da quitosana. A

quitosana com baixo PM e baixo GD não foi capaz de inibir nenhuma cepa bacteriana testada.

Logo, esse autor verificou que a quitosana com alto PM, alto GD e baixa viscosidade

apresentaram efeito bactericida sobre bactérias orais organizadas em biofilme de forma similar a

clorexidina53.

Alguns trabalhos testaram o efeito bactericida da quitosana sobre as bactérias orais

patogênicas do periodonto. Choi e colaborabores5 afirmaram que a quitosana a 0,001% inibiu

Actinobacillus actinomycetemcomitans. em 120 minutos de exposição. As células de A.a.

examinadas pelo SEM e TEM apresentaram mudanças intra e extracelularmente incluindo

separação da membrana citoplasmática do envoltório celular. Ikinci e colaboradores15 observaram

que géis e filmes de quitosana com diferentes PM e GD inibiram o crescimento da P. gingivalis

com halo de inibição superior a oito milímetros de diâmetro. Foi constatado também que a

36

quitosana com alto PM aumentou a capacidade bactericida e que o GD do biopolímero não afetou

a atividade antimicrobiana do mesmo15.

Nessa revisão sistemática, sobre a ação antimicrobiana da quitosana e dos derivados da

quitina sobre as bactérias orais, foi constatado que apenas cinco trabalhos abordaram o tema em

questão e, desses, apenas um foi realizado in vivo. Assim, torna-se importante a realização de

novos estudos contemplando essa temática.

2.7. Ação da quitosana e dos derivados da quitina sobre a inibição da adsorção bacteriana à superfície dentária

Uma das propriedades muito discutidas da quitosana é sua capacidade de inibir a adsorção

de células bacterianas à superfície dentária. Isso impede a colonização bacteriana e,

conseqüentemente, previne a possível ocorrência das doenças biofilmes dependentes.

Dessa forma, alguns mecanismos de ação antiadesiva da quitosana são sugeridos, tais

como: modificação na superfície bacteriana através da ligação das cargas positivas da quitosana

com as negativas das bactérias e alterações na expressão dos níveis de receptores celulares da

superfície bacteriana; adsorção da quitosana às superfícies do hospedeiro alterando as

propriedades iônicas da hidroxiapatita51.

Partindo dessa premissa, realizou-se uma revisão sistemática acerca da capacidade de

inibição bacteriana da quitosana e dos derivados da quitina.

Para tanto, foram avaliados trabalhos que avaliassem tal propriedade. As estratégias de

busca para a identificação destes trabalhos incluíram pesquisas eletrônicas nas bases de dados

MEDLINE, LILACS e BBO, além das buscas manuais nas referências bibliográficas dos artigos

selecionados.

Os artigos selecionados enquadraram-se nos seguintes critérios de inclusão: 1) estudos in

vivo e in vitro; 2) publicados em inglês, português e espanhol; 3) e cujo desfecho fosse contagem

de unidades formadoras de colônias, medição da porcentagem de bactérias presentes na

suspensão e medição da radioatividade dos sobrenadantes.

37

Já os critérios de exclusão da revisão sistemática foram: 1) artigos não relacionados à ação

antiadesiva da quitosana; 2) ação sobre bactérias de outros habitats que não a superfície dentária;

3) artigos do tipo revisão bibliográfica.

As estratégias de busca realizadas foram as seguintes:

No MEDLINE, nos anos de 1966 a 2005, foram feitas duas buscas:

1° busca: (“chitin” or “chitosan”) and (“adsorption”) and (“bacterial” or “bacterials” or

“bacterian” or “bacteriana” or “bacterianas” or “bacteriano” or ”bacterianos” or

”bacterias” ) como palavras; and (“espanhol or inglês or português”) como idiomas;

2° busca: (“chitin” or “chitosan”) and (“adsorption”) and (“bacterial” or “bacterials” or

“bacterian” or “bacteriana” or “bacterianas” or “bacteriano” or ”bacterianos” or

”bacterias” ) como palavras; and (“espanhol or inglês or português”) como idiomas.

Nas bases LILACS e BBO, foi feita a seguinte estratégia de busca:

("chitin" or "chitosan") and ("adsorption") and ("bacteria") como palavras and ("espanhol"

or "ingles" or "portugues") como idiomas.

Não foi encontrado nenhum artigo nas bases eletrônicas LILACS e BBO. No MEDLINE,

na primeira busca foram localizadas dez artigos e somente um foi selecionado; na segunda busca,

foram localizadas nove artigos e três foram selecionados. Nas buscas manuais foram selecionados

dois artigos, portanto totalizando 6 artigos que se enquadravam nos critérios de inclusão do

estudo. Estes artigos estão sumarizados no quadro 2.

38

Quadro 2: Referências bibliográficas, objetivos, metodologia e resultados dos trabalhos selecionados para a revisão sistemática da ação da quitosana e dos derivados da quitina sobre a inibição da adsorção bacteriana à superfície dentária. Natal/RN, 2005.

Bibliografia Objetivos Metodologia Resultados

Sano H, Matsukubo T, Shibasaki KI, Itoi H, Takaesu Y. Inhibition of adsorption of oral Streptococci to saliva treated hydroxyapatite by chitin derivatives. Bull Tokyo Dent Coll 1991; 32: 9-17.

Avaliar in vitro a capacidade de inibição da adsorção bacteriana de cinco derivados da quitina sobre S. mutans, S. sanguinis e S. mitis à hidroxiapatita mergulhada em saliva.

Cristais de hidroxiapatita foram incubados com suspensão de células bacterianas por 30 min. Os sobrenadantes foram removidos e a hidroxiapatita com as células aderidas foi incubada com 2mL de derivado de quitina. A suspensão das células bacterianas foi medida para determinar a porcentagem de perda de adesão.

A quitinafosforilada, sulfato de quitosana e carboximetilquitina apresentaram maior inibição da adsorção bacteriana do que a etileneglicolquitina e do que quitosana de baixo peso molecular, promovendo a perda de adesão de 82% de S. mutans, 70% de S. sanguinis e 61% de S. mitis.

Tarsi R, Muzzarelli RAA, Guzmàn CA, Pruzzo C. Inhibition of Streptococcus mutans adsorption to hydroxyapatite by low-molecular-weight chitosans. J Dent Res 1997; 76: 665-72.

Avaliar in vitro a eficácia da quitosana de baixo PM e seus derivados, carboximetilquitosana e imidazolilquitosana, na prevenção da fixação do S. mutans à hidroxiapatita, dependente e independente de sacarose.

A hidroxiapatita foi tratada com quitosana e, em seguida, foram adicionadas células bacterianas. A capacidade da quitosana de inibir a fixação das bactérias, na presença ou ausência de sacarose, foi determinado pela medida da radioatividade dos sobrenadantes.

A quitosana, na presença de saliva e na ausência de sacarose, reduziu, em torno de 53 a 59%, a fixação do S. mutans à hidroxiapatita e na presença de sacarose, de 47 a 67%. Na ausência de saliva e de sacarose, houve inibição da fixação de 47 a 53% e de 55 a 66% na presença de sacarose. Quando os cristais de hidroxiapatitas, na presença ou ausência de sacarose, foram revestidos de saliva depois do tratamento com quitosana, não houve redução estatisticamente significativa sobre a

39

adsorção de S. mutans. A capacidade de inibição da adsorção bacteriana da quitosana foi maior para as bactérias já fixadas a hidroxiapatita revestida de saliva e na presença de sacarose.

Tarsi R, Corbin B, Pruzzo C, Muzzarelli RAA. Effect of low-molecular-weight chitosans on the adhesive properties of oral streptococci. Oral Microbiol Immunol 1998; 13: 217-224.

Avaliar in vitro o efeito da quitosana de baixo peso molecular, imidazolilquitosana e carboximetilquitosana sobre as propriedades adesivas dos estreptococos comumente isolados da cavidade.

A hidroxiapatita foi tratada com quitosana, na presença ou ausência de saliva e, em seguida, foram adicionados os estreptococos orais. A capacidade da quitosana de inibir a fixação das bactérias, na presença ou ausência de sacarose, foi determinado pela medida da radioatividade dos sobrenadantes.

A carboximetilquitosana inibiu a adsorção das bactérias aos prismas de hidroxiapatita mergulhados ou não na saliva (p<0,05). A quitosana de baixo PM e a imidazolilquitosana só tiveram efeito estatisticamente significativo sobre a fixação do S. mutans aos prismas de hidroxiapatitas.

Sano H, Shibasaki KI, Matsukubo T, Takaesu Y. Comparison of the activity of four chitosans derivatives in reducing initial adherence of oral bacteria onto tooth surfaces. Bull Tokyo Dent Coll 2001; 42: 243-49.

Avaliar in situ o efeito de quatro derivados da quitosana sobre a aderência das bactérias orais à superfície dentária.

A superfície vestibular dos dentes anteriores de 29 indivíduos saudáveis foram lavadas com 2mL das soluções de derivado de quitosana por 30 segundos. Em seguida, foi passado um swab estéril sobre essas superfícies. Esse foi colocado em um tubo de ensaio com solução salina, agitado e 0,1mL foi semeado em MS ágar. As placas foram incubadas em anaerobiose por 78 h

A quitosana a 0,5% com baixo PM apresentou forte inibição sobre a aderência dos estreptococos orais à superfície dos dentes durante três horas.

40

para posterior contagem das UFCs.

Sano H, Shibasaki KI, Matsukubo T, Takaesu Y. Effect of molecular mass and degree of deacetylation of chitosa on adsorption of Streptococcus Sobrinus 6715 to saliva treated hydroxyapatite. Bull Tokyo Dent Coll 2002; 43: 75-82.

Avaliar in vitro o efeito do PM e do GD da quitosana sobre a inibição da adsorção de S. sobrinus à hidroxiapatita e sobre a hidrofobicidade dos estreptococos orais.

A hidroxiapatita foi incubada com 2 mL de S. sobrinus por 30 min. Após desincubação, os cristais foram lavados com cloreto de potássio e incubados com solução de quitosana por 30min. Após a desincubação, os sobrenadantes foram removidos, os cristais foram lavados com cloreto de potássio e, então, 2 mL de ácido clorídrico foi adicionado para solubilizar os cristais de hidroxaiapatitas. O grupo controle foi incubado sem quitosana e com cloreto de potássio. Em seguida, o número de células bacterianas foi determinado.

Houve uma correlação linear (r= 0,876) entre o PM da quitosana e a porcentagem de inibição da adsorção bacteriana. A quitosana com baixo PM inibiu mais de 70% da adsorção bacteriana. Houve baixa correlação (r=0,351) entre o PM da quitosana e a porcentagem inibição da adesão das células bacterianas já fixadas a hidroxiapatita. A quitosana com alto GD inibiu 90% da adsorção de S. sobrinus e 70% dos já fixados. A hidrofobicidade da superfície das células bacterianas diminui com o aumento da concentração da quitosana.

Decker EM, Weiger R, Wiech I, Heide PE, Brecx M. Comparison of antiadhesive and antibacterial effects of antiseptics on Streptococcus sanguinis. Eur J Oral Sci 2003; 111: 144-148.

Comparar in vitro o efeito de três antisépticos bactericidas e uma substância antiadesiva (quitosana) sobre a viabilidade e a densidade das células de S.sanguinis planctônicos ou fixados.

Antisépticos testados: clorexidina a 0,12%, Olaflur® (Ola 0,13%), Octenisept® (Oct 0,1%); e a quitosana como antiadesiva. As bactérias foram expostas a cada substância por 2 min; em seguida, suspensas em saliva humana e fixadas em esmalte por 60 min,

A quitosana apresentou redução na aderência dos S. sanguinis fixados ao esmalte.

41

submetidas a um sistema de fluxo de câmara, em que foram novamente expostas as substâncias testadas. Foi feita a contagem das UFCs fixadas ao esmalte e suspensas em solução.

42

Conforme os critérios acima relatados da revisão sistemática, alguns estudos que

abordaram a capacidade da quitosana e dos derivados da quitina de inibir a adsorção bacteriana à

superfície dentária serão discorridos a seguir.

Alguns autores observaram essa ação sobre S. sanguinis. Sano e colaboradores41

verificaram que os derivados da quitina inibiram a adsorção de 70% dessa espécie bacteriana. A

capacidade de inibição da adesão dos derivados de quitina pode mudar a natureza iônica da

hidroxiapatita e da superfície das células bacterianas resultando em interações menos favoráveis

entre a bactéria e a hidroxiapatita. Corroborando esse assunto, Decker e colaboradores10

afirmaram que a quitosana reduziu a aderência dos S. sanguinis fixados ao esmalte e, Tarsi e

colaboradores52 observaram que a carboximetilquitosana inibiu a adsorção desta espécie

bacteriana na presença ou ausência de saliva.

Outra espécie bacteriana avaliada isoladamente nos estudos foi o S. mutans. Sano e

colaboradores41 constataram que os derivados de quitina inibiram a adsorção de 82% dessa

espécie bacteriana. Consubstanciando esse fato, Tarsi e colaboradores51 observaram que este

biopolímero reduziu a fixação de S. mutans, em torno de 47-67%, na presença de sacarose e de

saliva. Esse trabalho também mostrou que a saliva restaura as propriedades adesivas da

hidroxiapatita e que a capacidade de inibição da adsorção bacteriana da quitosana foi maior para

as bactérias já fixadas a hidroxiapatita revestida de saliva e na presença de sacarose51.

Reforçando a ação antiadesiva da quitosana e dos derivados de quitina sobre as bactérias

orais, Tarsi e colaboradores52 verificaram que esse biopolímero inibiu a adsorção do S. mutans. A

quitosana de baixo PM e a imidazolilquitosana só tiveram efeito estatisticamente significativo

sobre a fixação do S. mutans aos prismas de hidroxiapatitas. A capacidade do S. mutans interagir

com a hidroxiapatita é fortemente impedida devido a uma modificação na hidrofobicidade

superficial das bactérias52.

Estudando a capacidade de inibir a fixação bacteriana, Sano e colaboradores44 verificaram

que a quitosana com alto GD inibiu a adsorção de 90% dos S. sobrinus e 70% dos já fixados.

Dessa maneira, quando a bactéria já se encontrava fixada à hidroxiapatita houve uma diminuição

da capacidade de adsorção. A hidrofobicidade da superfície das células bacterianas diminui com o

aumento da concentração de quitosana44. Em outro estudo, Sano e colaboradores41 observaram

inibição da adsorção de 61% do S. mitis à superfície dentária.

43

Em relação aos demais estreptococos orais, Tarsi e colaboradores52 observaram que a

carboximetilquitosana inibiu a adsorção de Streptococcus gordonii, Streptococcus constellatus,

Streptococcus anginosus, Streptococcus intermedius, Streptococcus oralis, Streptococcus

salivarius e Streptococcus vestibularis. Confirmando esse achado, Sano e colaboradores42

verificaram que a quitosana a 0,5% com baixo PM inibiu fortemente a aderência dos

estreptococos à superfície dentária durante três horas e que esta inibição depende da concentração

da quitosana e do tipo de derivado de quitina utilizado. Assim, a inibição da adsorção das

bactérias orais pelos derivados da quitosana depende da concentração da amostra e do tipo de

derivado de quitosana utilizado.

Portanto, apenas trabalhos in vitro e um in situ avaliaram essa capacidade da quitosana e

dos derivados da quitina de inibir a adsorção bacteriana à superfície dentária. Dessa forma, faz-se

necessários mais estudos sobre essa característica da quitosana.

2.8. Ação da quitosana sobre variáveis clínicas

Conforme demonstra a literatura, a quitosana desempenha uma importante ação

antibiofilme. Esse efeito sobre o biofilme dentário, através da avaliação do índice de placa, foi

avaliado através de uma revisão sistemática.

Dessa forma, foram selecionados estudos que abordassem o assunto. As estratégias de

busca incluíram pesquisas eletrônicas nas bases de dados MEDLINE, LILACS e BBO, além das

buscas manuais.

Os artigos selecionados enquadraram-se nos seguintes critérios de inclusão: 1) estudos in

vivo; 2) publicados em inglês, português e espanhol; 3) cujo desfecho fosse presença ou ausência

de ação antibiofilme da quitosana e dos derivados da quitina sobre as bactérias orais.

Os critérios de exclusão foram: 1) artigos não relacionados à ação antibiofilme; 2) ação

sobre o biofilme de outros habitats que não a cavidade oral; 3) estudos in vitro; 4) artigos do tipo

revisão bibliográfica.

As estratégias de busca realizadas foram as seguintes:

No MEDLINE, nos anos de 1966 a 2005, foram feitas duas buscas:

44

1° busca: (“Chitosan”) and (“rising”) como palavras; and (“espanhol or inglês or

português”) como idiomas;

2° busca: (“chitin” or “chitosan”) and (“dental”) and (“plaque”) como palavras; and

(“espanhol or inglês or português”) como idiomas.

Nas bases de dados LILACS e BBO não foram encontradas nenhuma referência

bibliográfica, assim como nas buscas manuais.

Na base MEDLINE foram encontrados 4 artigos na primeira busca e selecionados 2 e na

segunda busca foram encontrados 4 artigos e selecionados apenas 1 que já estava incluído dentre

os artigos selecionados na primeira busca. Portanto, apenas dois artigos foram selecionados e que

se encontram resumidos no quadro 3.

45

Quadro 3: Referências bibliográficas, objetivos, metodologia e resultados dos trabalhos selecionados para a revisão sistemática da ação antibiofilme da quitosana e dos derivados da quitina sobre bactérias orais. Natal/RN, 2005. BIBLIOGRAFIA OBJETIVOS METODOLOGIA RESULTADOS

Sano H, Shibasaki KI, Matsukubo T, Takaesu Y. Effect of chitosan rinsing on reduction of dental plaque formation. Bull Tokyo Dent Coll 2003; 44: 9-16.

Avaliar o efeito in vivo do bochecho de quitosana a 0,5% com PM de 6 KDa e GD de 60% sobre a formação do biofilme dentário.

Duzentos gramas de quitosana foram diluídas em 10 litros de água deionizada e, posteriormente, a solução foi neutralizada. Composição do bochecho: quitosana a 0,5%, etanol a 15%, glicerina a 10%, sacarina sódica a 0,008%, polioxietilenohidrogenada a 1% e 0,3% de flavorizante. O ensaio foi controlado, randomizado, duplo-cego, crossover. Os 24 indivíduos bochecharam 20 mL da solução por 30 segundos, duas vezes ao dia após a escovação, durante 14 dias. Os bochechos não foram supervisionados e foi usado um dentifrício comercial sem flúor. O índice de placa gengival foi registrado segundo índice de Quigley & Hein (QHI) com escores de 0 a 5 e o índice de severidade de placa (ISP) também foi medido.

O bochecho de quitosana reduziu significativamente a média dos escores do QHI em torno de 11,1% e do ISP em torno de 25,8%.

Sano H, Shibasaki KI, Matsukubo T, Takaesu Y. Effect of rising with phosphorylated chitosan on four-day plaque regrowth. Bull Tokyo Dent Coll 2001; 42: 251-256.

Avaliar o efeito do bochecho de quitosana fosforilada a 0,5% com PM de 20Kda e GD de 70% sobre o desenvolvimento do biofilme dentário.

Ensaio clínico, simples-cego, controlado, crossover. Composição do bochecho: quitosana fosforilada a 0,5%, 10% de etanol, 10% de glicerina e água deionnizada. Os três indivíduos bochecharam 20 mL da solução por 1 minuto durante 4 dias. Evidenciação da placa e coleta do biofilme supragengival no final do período de bochechos.

O bochecho de quitosana fosforilada reduziu 26% do biofilme novo e 61% do biofilme envelhecido em comparação com o placebo.

46

Uma dessas pesquisas clínicas observou que o bochecho de quitosana fosforilada a 0,5%,

com baixo PM e alto GD reduziu 26% do biofilme novo e 61% do biofilme envelhecido, em

comparação com o placebo. Os autores sugeriram que o bochecho de quitosana fosforilada pode

ser usado na redução da formação do biofilme dentário e, conseqüentemente, na prevenção da

cárie45.

Outro estudo in vivo investigou o efeito do bochecho de quitosana a 0,5%, com baixo PM

e alto GD, sobre a formação do biofilme dentário. Essa investigação foi feita através da análise do

índice de placa supragengival registrado segundo o critério de Quigley & Hein (QHI), em que as

superfícies bucal e lingual de todos os dentes, exceto os terceiros molares, receberam escores de

zero a cinco e, também, através do índice de severidade de placa (ISP) registrado através da soma

das superfícies que receberam escores 3, 4 ou 5, ainda de acordo com o critério de QHI, e dividido

pelo total de superfícies examinadas43.

Dessa forma, observou-se que bochecho de quitosana reduziu significativamente a média

dos escores do QHI em torno de 11,1% e do ISP em torno de 25,8%. Os autores concluíram que o

bochecho de quitosana foi efetivo na redução da formação do biofilme dentário, sendo essa ação

antibiofilme efetiva para seu uso nos produtos de higiene oral43.

47

3. Objetivos

3.1. Objetivo Geral:

Avaliar a eficácia in vivo da solução para bochecho contendo quitosana a 0,4% com

alto peso molecular e alto grau de desacetilação sobre a redução do biofilme e

bactérias orais.

3.2. Objetivos Específicos:

Avaliar o efeito da solução de quitosana a 0,4%, incorporada em uma solução para

bochecho sobre a redução do total de estreptococos orais, Streptococcus mutans e total

de lactobacilos orais.

Avaliar o efeito da solução de quitosana a 0,4% sobre a redução dos biofilmes

dentários, através dos índices de placa visível (IPV) e índice de sangramento gengival

(ISG).

Avaliar a proporção de S. mutans em relação ao total de estreptococos após o uso da

solução, a fim de verificar possíveis alterações na microbiota oral.

Verificar após o uso da solução a repopulação ao longo do tempo por tais bactérias.

Verificar se as variáveis independentes: sexo, idade, severidade de cárie inicial e final

(representada através do índice de superfícies cariadas, perdidas e obturadas – CPO-s),

freqüência de escovação inicial e final, atividade de cárie, experiência de cárie, uso dos

bochechos, dentifrício com antimicrobiano, consulta ao dentista, componente cariado

inicial e final, períodos do estudo (representado pelos tempos: linha base, tempo zero e

tempo quinze) e grupos de bochechos (representados pelos grupos teste -bochecho de

quitosana- e controle) têm interferência sobre o desfecho das variáveis dependentes

após a utilização do bochecho de quitosana a 0,4%.

48

4. Procedimentos Metodológicos

4.1. Tipo de estudo

O estudo consistiu em um ensaio clínico, controlado (em paralelo), randomizado e duplo-

cego.

4.2. Amostra 4.2.1. Caracterização da amostra

A amostra envolvida na pesquisa foi composta por 72 indivíduos entre 11 e 13 anos,

estudantes da Escola Estadual Nestor Lima situada à rua São José, bairro de Lagoa Nova, na

cidade do Natal-RN. A escola foi intencionalmente selecionada por ser de grande porte, podendo

assim ser recrutada toda a amostra que cumprisse os critérios de inclusão da pesquisa.

De acordo com o censo demográfico realizado em 2000 pelo Instituto Brasileiro de

Geografia e Estatística (IBGE)14, o bairro Lagoa Nova se localiza na região administrativa sul da

cidade do Natal/RN, tendo população de 35.569 habitantes e densidade populacional de 4.643,5

hab/ Km2 (habitantes por quilômetro quadrado).

Com o intuito da melhor caracterização da amostra deste estudo, pesquisaram-se as

condições econômicas dessa região administrativa. Segundo o IBGE14, o valor do rendimento

mensal do responsável pelo domicílio, em salários mínimos, da região administrativa sul em

comparação com as demais regiões administrativas da cidade, mostrou que esta região apresenta a

menor quantidade de responsáveis pelo domicílio sem rendimento (5.465 hab) e a maior

quantidade de responsáveis ganhando mais de 30 salários mínimos (12.027 hab).

Contudo, vale salientar que os alunos matriculados na escola Nestor Lima pertenciam a

diferentes bairros de Natal. Dos alunos selecionados para o estudo, 38,88% moravam no bairro

Lagoa Nova (região sul), 45,83% moravam em bairros da região norte, 8,83% moravam em

bairros da região oeste e 6,46% em bairros da região leste.

49

4.2.2. Critérios de inclusão

Alguns requisitos foram determinados como critérios de inclusão da pesquisa, tais quais:

indivíduos que apresentassem boa saúde geral, com idade entre 11 e 13 anos completos, tivessem

no mínimo 24 dentes, que os responsáveis tivessem autorizado a participação do aluno na

pesquisa e que concordassem em seguir rigorosamente o esquema terapêutico adotado.

4.2.3. Critérios de exclusão

Da mesma forma, determinaram-se alguns requisitos como critérios de exclusão, quais

sejam: indivíduos que fizeram uso de qualquer antibiótico ou antimicrobiano nos últimos três

meses ou durante o tratamento, que fizeram uso de flúor tópico na semana anterior ao tratamento

ou durante o período de tratamento, com alguma doença crônico-degenerativa, que usassem

aparelho ortodôntico ou protético, que tivessem algum tipo de alergia a crustáceos (camarão,

caranguejo e lagosta), que possuíssem tratamentos restauradores extensos (coroas ou múltiplas

restaurações).

4.2.4. Cálculo do tamanho da amostra

Para determinação do tamanho da amostra, partiu-se do consenso existente na literatura

que preconiza um mínimo de trinta unidades amostrais para um ensaio clinico, em cada grupo de

estudo, permitindo assim uma boa dispersão dos dados em torno da média.

Corroborando tal fato, Siew50, em um guideline sobre clareamento, afirma que para esse

fim, o ensaio clínico deve conter pelo menos 25 indivíduos em cada grupo (experimental e

controle).

Definiu-se utilizar o mínimo de trinta indivíduos mais vinte por cento para compensar

eventuais perdas em cada grupo amostral. Assim, cada grupo foi representado por 36 indivíduos,

tendo a pesquisa um total de 72 indivíduos selecionados, de acordo com os critérios de inclusão e

exclusão já citados.

50

4.3. Fase Experimental 4.3.1. Randomização

A alocação dos indivíduos em cada um dos grupos se deu de forma aleatória. De posse do

número de indivíduos por grupo, previamente selecionados por satisfazerem os critérios de

inclusão no estudo, realizou-se uma reunião com os responsáveis pelos mesmos com o intuito de

explicar o objetivo da pesquisa e esclarecer possíveis dúvidas.

Após os responsáveis autorizarem a participação do aluno na pesquisa, bem como o

próprio aluno concordar de livre e espontânea vontade com sua participação, estes preencheram

um termo de consentimento livre e esclarecido, constante do projeto aprovado pelo Comitê de

Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (ANEXO A e B). E cada um

deles sorteou uma letra, A ou B, correspondente ao grupo a que pertenceria. Essas letras eram as

mesmas contidas nos frascos dos bochechos que representaram o teste e o controle.

O bochecho teste apresentava cor levemente amarelada e consistência um pouco viscosa

enquanto o bochecho controle era transparente e fluido. Devido a esse fato, os dois bochechos

testados foram acondicionados em frascos branco leitosos para evitar identificação do líquido

contido dentro neles pela pesquisadora.

4.3.2. Coleta de dados

Dando continuidade, os indivíduos selecionados preencheram um questionário com dados

sobre idade, sexo, freqüência de escovação (um, duas, três vezes ao dia), tipo de dentifrício que

utiliza (com ou sem antimicrobiano), uso ou não de flúor antes e durante a pesquisa e quantas

visitas ao dentista realizou durante o período do experimento (ANEXO C).

Em seqüência, foi realizado um exame clínico antes do período dos bochechos, após o

término e após 15 dias desses, a fim de se obter dados sobre índice de placa visível (IPV), índice

de sangramento gengival (ISG) e índice de superfícies cariadas, perdidas e obturadas (CPO-s).

51

O Índice de Placa Visível é oriundo do Índice de Placa de Silness & Löe, sendo utilizado

de forma simplificada, visto que somente se considera a presença ou não de biofilme visível à

secagem em todas as superfícies dos dentes. Esse índice foi calculado através da soma de todas as

superfícies com biofilme visível e dividido pelo total de superfícies examinadas36 (figura 3).

Já para o Índice de Sangramento Gengival, uma sonda periodontal com secção circular foi

inserida levemente (em torno de 0,5 mm) na entrada do sulco gengival e percorrida por toda sua

extensão delicadamente. Após esse procedimento, aguardaram-se alguns minutos para verificar se

houve ou não sangramento marginal. Esse índice foi calculado através da soma de todas as

superfícies que apresentaram sangramento à sondagem dividida pelo total de faces sondadas36

(figura 4).

52

Figura 3: Índice de Placa Visível. Natal/RN, 2005.

Figura 4: Índice de Sangramento gengival. Natal/RN,2005.

53

O índice de superfícies cariadas, perdidas e obturadas (CPO-s) se refere à severidade de

cárie na dentição permanente. Esse índice foi originalmente formulado por Klein e Palmer, em

1937, e citado por Pinto em 199238. Nesse sentido, os 32 dentes permanentes foram divididos em

148 superfícies da seguinte maneira: molares e pré-molares com cinco superfícies cada (oclusal,

mesial, distal, vestibular e lingual), incisivos e caninos com quatro (mesial, distal, vestibular e

lingual). A superfície foi considerada presente no arco quando qualquer parte da coroa clínica já

tinha rompido a mucosa gengival, podendo ser tocada pela sonda exploradora. A cariada foi

diagnosticada por: esmalte socavado podendo ser penetrado pela sonda, presença de tecido

cariado amolecido, opacidade de esmalte ou manchas de cárie. A obturada se apresentou

perfeitamente obturada com material definitivo ou quando existiu uma falha na restauração,

porém não se conseguiu inserir o explorador entre o dente e ela38.

A superfície extraída foi representada pelo número de faces do elemento dentário perdido

devido à cárie dentária. A extração indicada correspondeu ao número de faces do elemento

dentário que apresentou uma lesão atingindo a câmara pulpar. A superfície foi considerada hígida

quando inexistiu cárie ou restauração. A excluída ou ausente foi caracterizada pelo número de

faces do elemento dentário extraído por outras causas que não a cárie dentária, como, por

exemplo, fraturas, correções ortodônticas, doenças periodontais ou necessidades protéticas. Esse

índice foi calculado pela soma de cada um dos componentes separadamente38.

No que se refere à atividade de cárie, neste estudo, foi considerada a presença de lesão

branca ativa na superfície dentária, com presença de biofilme acumulado e sangramento

localizado, podendo apresentar cavitação com tecido amolecido no seu interior.

Todos esses índices foram realizados por apenas um examinador previamente calibrado

através do coeficiente de correlação intraclasse (CCI). Para o ISG o CCI foi 0,9678 com intervalo

de confiança de 95% variando entre 0,9425 – 0,9820. Para o IPV o CCI foi 0,9042 com intervalo

de confiança de 95% variando entre 0,8333 – 0,9458. E para o CPOS o CCI foi 1,0, logo o

intervalo de confiança de 95% não apresentou variação.

Para avaliar a eficácia antimicrobiana das soluções teste e controle, foi feita a contagem

das unidades formadoras de colônias (UFCs) do total de estreptococos, S. mutans e total de

lactobacilos através da coleta de saliva de linha base, feita antes do período experimental, no dia

imediatamente após o último bochecho (tempo zero – T0) e aos 15 (tempo quinze – T15) dias

54

após o término da série de bochechos, intervalo de tempo estimado, segundo alguns autores, para

a observação da repopulação bacteriana33.

Para tanto, a saliva foi estimulada, mediante mastigação de um pedaço de 1 g de goma-

base, sempre em um mesmo horário (entre 08:00h e 09:00h), com intervalo de, no mínimo, uma

hora após a última ingestão de alimento, a fim de evitar possíveis interferências sobre os níveis

bacterianos. Os pacientes mastigaram a goma-base por um minuto, deglutiram o excesso de saliva

e, em seguida, coletaram a saliva produzida em uma proveta estéril.

As amostras de saliva foram coletadas na própria escola em provetas estéreis e estas foram

armazenadas em uma caixa de isopor com gelo para garantir a viabilidade das bactérias até o seu

processamento. Imediatamente após a coleta de saliva, esse isopor contendo as provetas foi

transportado para o laboratório de Odontologia Preventiva e Social da UFRN onde a saliva foi

processada para análise microbiológica.

A saliva coletada foi imediatamente processada, de modo que o tempo decorrido entre a

coleta do material e a semeadura nos meios de cultura fosse mínimo. Para tanto, as amostras de

saliva foram colocadas em banho-maria por dois minutos a 55°C e, em seguida, agitadas em um

vibrador vortex® por trinta segundos, com o objetivo de dispersar os grumos bacterianos. Diluiu-

se, então, a saliva até 10-6 com solução salina redutora estéril25.

Para a análise microbiológica do total de lactobacilos, foi inoculado 0,1 mL da diluição 10-

1 numa placa de petri estéril; em seguida, verteu-se Rogosa SL ágar (Laboratórios Difco®,

Detroit/MI, USA), previamente fundido e fizeram-se movimentos rotatórios vinte e cinco vezes na

placa com a finalidade de homogeneizar a saliva e permitir a saída do oxigênio entre esta e o meio

de cultura (técnica pour plate)39. As placas foram colocadas em uma estufa de cultura a 37°C por

72 horas em aerobiose.

Para a avaliação do número de UFCs de S.mutans, inoculou-se 0,1 mL da diluição 10-4 no

meio de cultura ágar Mitis Salivarius (Laboratórios Difco®, Detroit/MI, USA) com bacitracina

(Purex®, Brasil) (MSB) e semeou-se com a alça drigalsky por toda a extensão da placa

(semeadura de superfície)25. O MSB é um meio de cultura seletivo para S. mutans por conter 20%

de sacarose e 0,2 UI (unidades internacionais) de bacitracina por mL de meio12.

Para a análise do total de estreptococos, inoculou-se 0,1 mL da diluição 10-6 no meio de

cultura ágar Mitis Salivarius (MS) (Laboratórios Difco®, Detroit/MI, USA) e semeou-se com a

alça drigalsky por toda a extensão da placa (semeadura de superfície).

Ambas as placas de cultura para semeadura de S. mutans e do total de estreptococos foram

incubadas em jarras Gaspak a 37°C por 48 horas, sob condições de anaerobiose.

O ensaio foi feito em duplicata para cada diluição em teste e a média das unidades

formadoras de colônias (UFCs) foram transformadas em LOG10 para cada grupo bacteriano

analisado.

4.3.3. Preparação das soluções para bochechos teste e controle e esquema terapêutico adotado

Consoante os resultados achados no trabalho de Teixeira53, a quitosana a 0,4% com alto

PM (51KDa) e alto GD (85%) foi incorporada em uma solução para bochecho.

Essa quitosana a 0,4% com alto PM e alto GD foi adquirida na Polymar® Indústria

Comércio Importação e Exportação LTDA (ANEXO D) situada na cidade de Fortaleza/CE

(Figura 5).

Figura 5: Quitosana da Polymar®. Natal/RN, 2005. .

56

Inicialmente, quatro gramas de pó de quitosana foi diluída em um litro de solução de água

destilada e acido acético a 0,3%, uma vez que a quitosana é solúvel em ácido acético23.

Em relação à concentração do ácido acético, durante os testes laboratoriais para

formulação do bochecho, constatou-se que a menor concentração de ácido que permitiu a total

dissolução do biopolimero foi a 0,3%. Portanto, quanto menor a concentração do ácido no

bochecho, menor a possibilidade de interferência no equilíbrio do ecossistema oral. Em seguida, o

pH da solução foi medido por um pHmetro manual (pHtek®, Natal/RN, Brasil), obtendo-se valor

aproximadamente de 4,5.

Para neutralização desse pH, foi utilizada uma solução de hidróxido de sódio a 6 N

(Normal). Em torno de 7,5 mL desta solução básica foi adicionada lentamente à solução de

quitosana, elevando o pH final para aproximadamente 6,5, pH este ideal para a solução de

bochecho teste.

Por fim, adicionou-se essência de menta (flavorizante) com o objetivo de melhorar o sabor

do bochecho de quitosana e, em seguida, mediu-se novamente o pH da solução.

No que se refere ao bochecho controle, esse seguiu os mesmos passos da formulação do

bochecho teste, com exceção da incorporação do pó de quitosana. O pH final deste bochecho

controle também foi de 6,5.

Sendo assim, a única diferença entre os dois bochechos foi a presença ou ausência de

quitosana, que representa a substância utilizada na intervenção do ensaio clinico.

Portanto, esse ensaio clínico foi duplo-cego, pois a pesquisadora, que realizou a aplicação

dos bochechos e, posteriormente, a avaliação dos resultados, e os indivíduos participantes do

estudo não tiveram conhecimento dos grupos de bochechos teste e controle.

4.3.4. Intervenção

Os bochechos teste e controle foram então distribuídos em frascos semelhantes de plástico

branco leitosos, de 250 mL e com tampa rosqueável para evitar qualquer possibilidade de

identificação por parte da pesquisadora do líquido contido neles (figura 6). Estes foram

identificados com os nomes dos alunos e as instruções para o uso dos mesmos.

57

Figura 6: Soluções teste e controle. Natal/RN, 2005.

Nesse sentido, 36 indivíduos fizeram uso do bochecho com quitosana e 36 fizeram uso do

placebo. Foram feitos dois bochechos diários, por um minuto, com 10 mL da solução (o que

corresponde a uma tampa do frasco cheia de líquido), sendo um pela manhã (supervisionado) e

outro no fim da tarde (não-supervisionado), durante aproximadamente 15 dias, pelo menos 30

minutos após a escovação, a fim de evitar a interferência da ação da quitosana pelo lauril sulfato

de sódio presente nos dentifrícios. O esquema terapêutico seguido foi idêntico para ambos os

grupos.

4.3.5. Teste de estabilidade do bochecho de quitosana

A estabilidade do bochecho de quitosana, assim como as condições de armazenamento e

acondicionamento do mesmo, após o período do estudo, foram testadas paralelamente à execução

da fase clínica, através do teste de atividade antimicrobiana por difusão em ágar.

Dessa maneira, as soluções testadas foram as seguintes: 1) solução de quitosana feita no

mesmo dia do experimento; 2) solução controle feita no mesmo dia do experimento; 3) solução de

quitosana após o período de bochecho e armazenada no banheiro com a tampa aberta; 4) solução

controle após o período de bochecho e armazenada no banheiro com a tampa aberta; 5) solução de

quitosana após o período de bochecho e armazenada no laboratório com a tampa fechada; 6)

solução controle após o período de bochecho e armazenada no laboratório com a tampa fechada.

58

A forma de armazenamento dos bochechos no banheiro foi simulada com o objetivo de

aproximar-se da real condição de uso e armazenamento dos frascos dos bochechos pelos alunos.

Para o teste de difusão em ágar, foram utilizadas três cepas bacterianas: S. mutans ATCC

25175, S. sanguinis ATCC 10556 e Streptococcus sobrinus ATCC 27609, cultivadas em meio

brain heart infusion (BHI, Becton Dickinson and Co., Cockeyville, MD, USA) caldo a 37°C de

um dia para o outro.

Cada cepa bacteriana foi semeada no meio de cultura BHI ágar (Difco®, Michigan, USA)

com auxílio de um swab estéril. Em seguida, discos de antibiograma estéreis com seis milímetros

de diâmetro foram embebidos com 25 µL de cada solução testada e foram colocados nos meios de

cultura com o auxílio de uma pinça estéril. As placas foram incubadas em condições de

anaerobiose, em jarras Gaspak®, a 37°C por 48 horas em estufa de cultura bacteriológica, para

posterior verificação dos halos de inibição em milímetros (mm). O ensaio foi feito em duplicata

para cada cepa bacteriana testada.

Após o período de incubação, o diâmetro dos halos de inibição foi medido em milímetros

com o auxílio de uma régua milimetrada.

Portanto, os resultados mostraram que todas as soluções de quitosana apresentaram halo de

inibição igual ou superior a oito milímetros para S. mutans e S. sanguinis. As demais soluções

testadas apresentaram halos de inibição inferior a oito milímetros.

4.3.6. Teste de esterilidade das soluções para bochecho teste e controle.

Um outro ponto que poderia ser questionado trata-se da esterilidade dessas soluções

preparadas artesanalmente, sem adição de conservantes. Para esclarecer tal fato, realizou-se o

teste de esterilidade.

Dessa forma, para avaliar a esterilidade das soluções para bochecho teste e controle, 0,1 mL

de cada solução foi colocado em tubos de ensaio com 10 mL de tioglicolato caldo (Difco®,

Michigan, USA) e, em seguida, os tubos foram incubados em aerobiose a 37°C por 24 horas em

estufa de cultura bacteriológica.

59

Portanto, verificou-se que, em 24 horas, todas as soluções testadas apresentavam-se

contaminadas.

Cumpre salientar, que os bochechos teste e controle não foram esterilizados, visto que este

procedimento poderia influenciar a ação antimicrobiana e antiadesiva da quitosana. Constatou-se

também que os bochechos acondicionados em frascos brancos leitosos usados pelos alunos da

pesquisa durante quinze dias não apresentaram nenhum tipo de turvação ou indícios de

contaminação visual. No entanto, a contaminação foi de baixo nível, sem apresentar riscos a saúde

dos indivíduos.

60

5. Elenco de variáveis

As variáveis dependentes e independentes envolvidas no estudo e suas respectivas

classificações, encontram-se descritas nos quadros 3 e 4.

Quadro 4: Variáveis dependentes analisadas no estudo. Natal/RN, 2005

VARIÁVEIS DEPENDENTES

Nome da variável Definição Classificação

Total de estreptococos Quantidade de unidades formadoras de

colônias do total de estreptococos

Média UFCs/mL

Total de S. mutans Quantidade de unidades formadoras de

colônias do total de S. mutans

Média UFCs/ml

Total de lactobacilos Quantidade de unidades formadoras de

colônias do total de lactobacilos

Média UFCs/mL

Higiene oral (índice de placa

visível)

Percentual de superfícies dentárias com

presença de biofilme no momento do

exame, caracterizando acúmulo de

biofilme jovem por má higienização

0 a 100%

Higiene oral (índice de

sangramento gengival)

Percentual de sangramento gengival

caracterizando inflamação gengival

devido ao biofilme envelhecido

acumulado por má higienização

0 a 100%

61

Quadro 5: Variáveis independentes analisadas no estudo. Natal/RN, 2005.

VARIÁVEIS INDEPENDENTES

Nome da variável Definição Classificação

Grupos dos bochechos Grupo ao qual o aluno pertencia segundo

a solução de bochecho.

Teste e controle

Períodos de coleta do estudo Períodos de tempo em que o exame

clínico e a coleta de saliva foi realizada.

Linha base, tempo zero

e tempo quinze.

Severidade de cárie inicial Número de superfícies cariadas, perdidas

e obturadas (CPO-S) na linha base.

0 a 148

Severidade de cárie final Número de superfícies cariadas, perdidas

e obturadas (CPO-S) no final do estudo.

0 a 148

Idade Número de anos desde o nascimento. 11; 12 e 13

Sexo Masculino ou feminino

Freqüência de escovação

inicial

Número de escovações realizadas

durante o dia na linha base.

1 a 4 vezes ao dia

Freqüência de escovação

final

Número de escovações realizadas

durante o dia no final do estudo.

1 a 4 vezes ao dia

Dentifrício com

antimicrobiano

Uso de dentifrício que contém agente

antimicrobiano.

Sim ou não

Atividade de cárie Presença de lesão branca ativa na

superfície dentária, associada à presença

de biofilme dentário acumulado e

sangramento gengival localizado.

Sim ou não

Componente cariado inicial Número de superfícies cariadas iniciais. 0 a 148

Experiência de cárie Experiência que os indivíduos tiveram

em relação à doença.

Sim ou não

Número de bochechos Número de bochechos realizados

durante a pesquisa.

0 a 42

62

6. Análise Estatística

Os resultados foram analisados mediante testes paramétricos para as variáveis com

distribuição normal, que são: teste “t” de Student (emparelhado e não-emparelhado) e

correlacionados através da correlação de Pearson; e testes não paramétricos para variáveis sem

distribuição normal, como o teste de Wilcoxon (para amostras emparelhadas), teste de Mann-

Whitney (para amostras não emparelhadas) e correlacionados através da correlação de Spearman.

Para as variáveis qualitativas foi usado o teste do Qui-quadrado. Foi considerada a significância

de 5% para todos os testes usados.

Para a comparação entre os grupos teste e controle das três espécies bacterianas avaliadas

e do IPV, nos tempos linha base, tempo zero e tempo quinze, foi utilizado o teste “t” de Student

não-emparelhado. Nesse mesmo sentido, para a comparação do ISG entre os dois grupos testados,

nos períodos de tempos avaliados, foi utilizado o teste de Mann-Whitney, por esta variável não

apresentar distribuição normal.

Em relação à comparação entre os tempos linha base, zero e quinze, dentro de um mesmo

grupo (quitosana ou controle), para os três grupos bacterianos testados e para o IPV, foi utilizada a

Análise de Variância (ANOVA). Já para a comparação do ISG nos três tempos analisados dentro

de um mesmo grupo, foi utilizado o teste de Friedman pela falta de distribuição normal desta

variável.

As correlações entre o número de bochechos supervisionados e feitos em casa e a

freqüência de escovação e as três espécies bacterianas testadas, assim como o IPV foram

realizadas através do coeficiente de correlação de Pearson. Já as correlações entre o número de

bochechos supervisionados e feitos em casa e o ISG foram realizados através da correlação de

Spearman.

No que concerne à comparação entre os grupos (teste e controle) e as variáveis

independentes quantitativas (idade, severidade de cárie, freqüência de escovação e componente

cariado) foi utilizado o teste “t” de Student não-emparelhado. Já a comparação entre os dois

grupos do estudo e as variáveis independentes qualitativas (sexo, dentifrício com antimicrobiano,

63

consulta ao dentista, atividade de cárie e experiência de cárie) foram utilizados o teste do Qui-

quadrado. Os dados foram analisados pelo software SPSS versão 10.0 for Windows.

64

7. Considerações éticas

O projeto de pesquisa foi submetido ao Comitê de Ética em pesquisa da UFRN para

devida análise, recebendo parecer favorável à sua execução sob número 14/04, estando de acordo

com a Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde, a qual trata de pesquisas em seres

humanos (ANEXO A).

Realizou-se, também, consulta aos pais ou responsáveis pelos alunos, no sentido de se

obter autorização para a participação destes na pesquisa. Foram fornecidas informações verbais e

através do termo de consentimento livre e esclarecido (ANEXO B) sobre todos os esclarecimentos

necessários a respeito do estudo.

65

8. RESULTADOS

Para melhor compreensão dos resultados, estes foram divididos didaticamente em quatro

partes. A primeira delas trata de pontos que poderiam interferir diretamente nos resultados do

estudo, conhecidos como vieses metodológicos, quais sejam, a perda de unidades amostrais. A

segunda versa sobre os resultados relacionados aos períodos do estudo, linha base, tempo zero e

tempo quinze, onde se comparou ambos os grupos. Na terceira parte foi feita a comparação entre

os três tempos simultaneamente, primeiro para o grupo teste e, seqüencialmente, para o grupo

controle. Finalizando este capítulo, na sua quarta parte, uma avaliação através de gráficos que

demonstram a tendência dos grupos teste e controle, em conjunto, também foi realizada.

Dos 72 indivíduos selecionados, somente 68 permaneceram até o final do experimento,

totalizando uma perda de 5,55%. Todas as perdas foram de indivíduos do grupo teste. Dois

participantes (2,77%) apresentaram alergia ao bochecho de quitosana, apesar de terem respondido

ao questionário não serem alérgicos a crustáceos. Um indivíduo (1,38%) teve pneumonia durante

o período do estudo e um indivíduo (1,38%) não seguiu rigorosamente o esquema terapêutico

adotado para os bochechos, sendo estes quatro pacientes excluídos da amostra.

Assim, ao final do período do experimento, o grupo teste contou com 32 participantes,

enquanto o grupo controle, visto que não houve perda, foi constituído por 36 indivíduos.

Tendo sido destacado o controle de possíveis vieses metodológicos, a comparação entre os

grupos nos diferentes tempos do estudo será detalhada a seguir.

Em relação à linha base, quando se comparou os grupos teste e controle em relação às

variáveis dependentes (total de estreptococos, total de lactobacilos, S. mutans e IPV), observou-se

que não houve diferença significativa entre eles, demonstrando que quanto a estas variáveis os

dois grupos eram semelhantes no início da pesquisa. Em relação ao ISG, observou-se diferença

estatisticamente significativa entre os grupos teste e controle, porém como as médias dos dois

grupos foram muito baixas e sem significado clínico, é possível que isso não tenha prejudicado a

similaridade dos grupos quanto ao conjunto de variáveis dependentes, não comprometendo,

portanto, a comparação entre os grupos nos períodos pós-bochechos (tabela 1).

66

Tabela 1: Tamanho da amostra, médias, desvios-padrões, intervalos de confiança de 95% e valor de p das unidades formadoras de colônias (UFCs) em LOG10 para o total de lactobacilos, S. mutans, total de estreptococos e dos IPV E ISG em relação aos grupos teste e controle na linha base. Natal/RN, 2005.

Variáveis Dependentes

Grupos n Média ± dp IC 95% P

Teste 32 2,44 ± 1,69 1,833 – 3,058 Total de lactobacilos Controle 36 1,76 ± 1,85 1,143 – 2,396

p=0,123

Teste 32 7,31 ± 0,62 7,087 – 7,540 S. mutans Controle 36 7,23 ± 0,78 6,973 – 7,504

p=0,668

Teste 32 9,44 ± 0,65 9,208 – 9,683 Total de estreptococos Controle 36 9,46 ± 0,55 9,273 – 9,648

p=0,919

Teste 32 14,24 ± 10,61 10,415 – 18,071 IPV Controle 36 11,54 ± 9,40 8,363 – 14,734

p=0,271

Teste 32 1,68 ± 2,27 0,86 – 2,50 ISG Controle 36 0,60 ± 1,43 0,12 – 1,09

p=0,009

No que se refere às variáveis independentes quantitativas (idade, severidade de cárie

inicial, freqüência de escovação inicial e componente cariado inicial), em relação aos grupos teste

e controle na linha base, observou-se não haver diferença estatisticamente significativa entre os

dois grupos, demonstrando que quanto a estas variáveis, os grupos também eram semelhantes no

início do experimento (tabela 2).

Tabela 2: Tamanho da amostra, médias, desvios-padrões, intervalo de confiança de 95% e valor de p para as variáveis independentes quantitativas idade, severidade de cárie inicial, freqüência de escovação inicial, componente cariado inicial na linha base em relação aos grupos teste e controle. Natal/RN, 2005.

Variáveis Independentes

Grupos n Média ± dp IC 95% P

Teste 32 11,81 ± 0,59 11,60 – 12,03 Idade Controle 36 11,81 ± 0,86 11,52 – 12,10

p=0,969

Teste 32 4,88 ± 6,22 2,63 – 7,12 Severidade de cárie inicial Controle 36 3,31 ± 3,93 1,98 – 4,63

p=0,213

Teste 32 2,63 ± 0,71 2,37 – 2,88 Freqüência de escovação inicial Controle 36 2,81 ± 3,14 2,57 – 3,05

p=0,298

Teste 32 1,16 ± 3,14 0,02 – 2,29 Componente cariado inicial Controle 36 0,53 ± 1,18 0,13 – 0,93

p=0,269

Para as variáveis independentes categóricas (sexo, dentifrício com antimicrobiano,

atividade de cárie e experiência de cárie), os grupos teste e controle na linha base apresentaram-

se semelhantes (tabela 3).

67

Tabela 3: Número absoluto e relativo, valor de p das variáveis independentes categóricas sexo, dentifrício com antimicrobiano, atividade de cárie, experiência de cárie na linha base entre os grupos teste e controle. Natal/RN, 2005.

Grupos Teste Controle

Variáveis Independentes

Categóricas

Categorias

n (%) n (%)

P

Masculino 11 (34,37) 13 (36,11) Sexo Feminino 21 (65,62) 23 (63,88)

p=1,00

Sim 17 (53,12) 21 (58,33) Dentifrício com antimicrobiano Não 15 (46,87) 15 (41,66)

p=0,852

Sim 1 (3,12) 3 (8,33) Atividade de Cárie Não 31 (96,87) 33 (91,66)

p=0,693

Sim 9 (28,12) 8 (22,22) Experiência de Cárie Não 23 (71,87) 28 (77,77)

p=0,779

Após o período de bochechos, a comparação entre os grupos teste e controle para as

variáveis S. mutans, total de lactobacilos, IPV e ISG não apresentou diferença estatisticamente

significativa. Porém, em relação às UFCs do total de estreptococos, houve diferença

estatisticamente significativa, demonstrando que após a intervenção para essa variável, os grupos

apresentaram-se diferentes entre si, existindo um maior número de UFCs dos estreptococos no

grupo controle do que no teste (tabela 4).

TABELA 4: Médias, desvios-padrões e intervalo de confiança de 95% das unidades formadoras de colônias (UFCs) em LOG10 do total de estreptococos, S. mutans e total de lactobacilos e dos IPV e ISG no tempo zero para os bochechos teste e controle. Natal/RN, 2005.

Variáveis dependentes Grupos Média ± dp IC 95% P Teste 9,25 ± 0,58 9,04 –9,47 Total de estreptococos

Controle 9,58 ± 0,70 9,35 –9,82 p=0,041

Teste 7,89 ± 0,36 7,76 –8,02 S. mutans Controle 8,04 ± 0,31 7,93 – 8,14

p=0,086

Teste 2,54 ± 1,65 1,95 – 3,14 Total de lactobacilos Controle 2,91 ± 1,55 2,38 – 3,43

p=0,352

Teste 11,23 ± 9,66 7,754 – 14,722 IPV Controle 8,54 ± 8,93 5,518 – 11,570 p=0,237

Teste 1,08±1,62 0,49 – 1,67 ISG Controle 0,71±1,41 0,23 – 1,18 p=0,117

68

Ao final do período de bochechos, a comparação entre os dois grupos testados para as

variáveis freqüência de escovação final e uso dos bochechos não apresentou diferença

estatisticamente significativa (tabela 5). Do mesmo modo, a variável consulta ao dentista também

não apresentou diferença significativa (p = 0,427) entre os grupos. Nesse sentido, pode-se afirmar

que estas variáveis também não influenciaram os desfechos deste estudo.

Quanto às variáveis idade e severidade de cárie final, como estas não sofreram nenhuma

modificação no curto tempo de bochechos (15 dias), a diferença entre os grupos para as mesmas

não foi realizada no tempo zero.

Tabela 5: Tamanho da amostra, médias, desvios-padrões, intervalo de confiança de 95% e valor de p para as variáveis independentes quantitativas freqüência de escovação final e uso dos bochechos entre os grupos teste e controle no tempo zero. Natal/RN, 2005.

Variáveis Independentes

Grupos n Média ± dp IC 95% P

Teste 32 2,69 ± 0,59 2,47 – 2,90 Freqüência de escovação final Controle 36 2,86 ± 0,68 2,63 – 3,09

p=0,270

Teste 32 25,94 ± 7,09 23,38 – 28,49 Uso dos bochechos Controle 36 27,81 ± 5,48 25,95 – 29,66

p=0,233

A fim de se eliminar possíveis interferências, independente do grupo a que o indivíduo

pertencia, do número de bochechos e da freqüência de escovação sobre as variáveis dependentes e

independentes estudadas, fez-se a correlação entre ambas. Foi verificado não haver correlação

significativa entre o número total de bochechos e a freqüência de escovação realizados durante o

período do experimento e as variáveis dependentes e independentes do estudo.

Quinze dias após o período de bochechos, as UFCs para os três grupos bacterianos

analisadas entre os dois grupos do estudo (bochecho teste e controle) não apresentaram diferença

estatisticamente significativa (tabela 6).

Para o IPV e ISG entre os grupos teste e controle, não houve diferença estatisticamente

significativa. Logo, quinze dias após o término dos bochechos os valores desses índices

permaneceram semelhantes (tabela 6).

69

TABELA 6: Média, desvio-padrão, intervalo de confiança de 95% e valor de p das unidades formadoras de colônias (UFCs) em LOG10 do total de estreptococos, S. mutans e total de lactobacilos e do IPV e ISG no tempo quinze para os bochechos teste e controle. Natal/RN, 2005.

Variáveis Dependentes Grupos Média ± dp IC 95% P Teste 9,38 ± 0,57 9,17 – 9,59 Total de estreptococos

Controle 9,47 ± 0,44 9,32 – 9,62 p=0,453

Teste 7,89 ± 0,27 7,79 – 7,99 S. mutans Controle 7,83 ± 0,39 7,70 – 7,96

p=0,479

Teste 2,61 ± 1,79 1,96 – 3,26 Total de lactobacilos Controle 2,39 ± 1,77 1,78 – 2,99

p=0,604

Teste 7,72 ± 6,59 5,344 – 10,100 IPV Controle 6,65 ± 5,89 4,659 – 8,650 p=0,483

Teste 1,02 ± 1,15 0,60 – 1,44 ISG Controle 0,66 ± 0,84 0,37 – 0,94 p=0,278

Uma análise intragrupo, tomando a variável tempo como variável independente em relação

aos desfechos também foi realizada.

Para o grupo teste (bochecho de quitosana), em relação ao total de estreptococos e o total

de lactobacilos, não houve diferença estatisticamente significativa entre os tempos. Dessa forma,

observa-se que o bochecho de quitosana não apresentou nenhuma ação antimicrobiana sobre

estes dois grupos bacterianos avaliadas. Para o ISG, entre os três tempos analisados, também não

houve diferença significativa, demonstrando igualmente uma ausência de efeito do bochecho

teste sobre o índice de sangramento gengival ao longo do estudo, continuando este com valores

semelhantes ao período anterior à intervenção (tabela 7).

Já para a variável número de UFCs de S. mutans, houve diferença estatisticamente

significativa entre os três tempos analisados, havendo uma maior recuperação de unidades

formadoras de colônias da linha base para os tempos zero e quinze. O contrário pode ser visto

para o IPV, onde observou-se diferença estatisticamente significativa, determinada pela

diminuição deste índice da linha base para o tempo zero e deste para o tempo quinze (tabela 7).

70

Tabela 7: Médias, desvios-padrões, intervalo de confiança de 95% e valor de p das unidades formadoras de colônias (UFCs) em LOG10 do total de estreptococos, S. mutans e total de lactobacilos e do IPV e ISG nos tempos linha base, tempo zero e tempo quinze para o bochecho teste. Natal/RN, 2005.

Variáveis Dependentes Tempos Média ± dp IC 95% P LB 9,44 ± 0,65 9,208 – 9,683 T0 9,25 ± 0,58 9,047 – 9,471

Total de estreptococos

T15 9,38 ± 0,57 9,175 – 9,590

p=0,473

LB 7,31 ± 0,62 7,087 – 7,540 T0 7,89 ± 0,36 7,762 – 8,028

S. mutans

T15 7,89 ± 0,27 7,795 –7,992

p<0,0001

LB 2,44 ± 1,69 1,833 – 3,058 T0 2,54 ± 1,65 1,951 – 3,144

Total de lactobacilos

T15 2,61 ± 1,79 1,968 – 3,263

p=0,757

LB 14,24 ± 10,61 10,415 – 18,071 T0 11,23 ± 9,66 7,754 – 14,722 IPV

T15 7,72 ± 6,59 5,344 – 10,100 p<0,0001

LB 1,68 ± 2,27 0,86 – 2,50 T0 1,08 ± 1,62 0,49 – 1,67 ISG T15 1,02 ± 1,15 0,60 – 1,44

p=0,187

Em relação às mesmas considerações para o grupo controle, observou-se que para o total

de estreptococos entre os três tempos analisados não houve diferença significativa. Porém, em

relação ao S. mutans e ao total de lactobacilos, imediatamente após o uso do bochecho controle,

houve um aumento significativo das UFCs para estes dois grupos bacterianos, seguido de um

decréscimo após 15 dias (tabela 8).

Quando se analisou o IPV entre os três tempos, observou-se uma diferença bastante

significativa, havendo uma diminuição da média dos valores de IPV após o uso do bochecho e

quinze dias após a interrupção do mesmo, que não foi acompanhada pelo mesmo comportamento

em relação ao ISG, onde não houve diferença significativa entre os tempos, demonstrando que o

bochecho controle não alterou o ISG ao longo do tempo (tabela 8).

71

Tabela 8: Médias, desvios-padrões, intervalo de confiança de 95% e valor de p das unidades formadoras de colônias (UFCs) em LOG10 do total de estreptococos, S. mutans e total de lactobacilos e dos IPV e ISG nos tempos linha base, tempo zero e tempo quinze para o bochecho controle. Natal/RN, 2005.

Variáveis Dependentes Tempos Média ± dp IC 95% P LB 9,46 ± 0,55 9,273 – 9,648 T0 9,58 ± 0,70 9,352 – 9,827

Total de estreptococos

T15 9,47 ± 0,44 9,327 – 9,625

p=0,588

LB 7,23 ± 0,78 6,973 – 7,504 T0 8,04 ± 0,31 7,933 – 8,148

S. mutans

T15 7,83 ± 0,39 7,701 – 7,967

p<0,0001

LB 1,77 ± 1,85 1,143 – 2,396 T0 2,91 ± 1,55 2,386 – 3,438

Total de lactobacilos

T15 2,39 ± 1,77 1,788 – 2,991

p<0,0001

LB 11,54 ± 9,40 8,363 – 14,734 T0 8,54 ± 8,93 5,518 – 11,570 IPV T15 6,65 ± 5,89 4,659 – 8,650

p=0,0008

LB 0,60 ± 1,43 0,86 – 2,50 T0 0,71 ± 1,41 0,23 – 1,18 ISG T15 0,66 ± 0,84 0,37 – 0,94

p=0,189

72

Para uma melhor compreensão da tendência conjunta de ambos os grupos (teste e controle)

em relação ao comportamento das variáveis dependentes ao longo do tempo do experimento, fez-

se oportuna à construção de gráficos em linhas que a elucidam de forma mais clara.

No que diz respeito ao total de estreptococos, a figura mostra que na linha base e no tempo

quinze os dois grupos apresentaram a mesma condição, enquanto no tempo zero houve um

comportamento divergente, aumentando o número de UFCs dos estreptococos no grupo controle e

diminuindo no grupo teste (tabela 1, 4 e 6). Contudo, a comparação intragrupo mostrou que ao

longo do tempo não houve diferença significativa em nenhum dos dois grupos testados (tabela 7,

8 e figura 7).

8,9

9

9,1

9,2

9,3

9,4

9,5

9,6

9,7

Linha Base Tempo Zero Tempo Quinze

Tempos

Méd

ias Grupo Teste

Grupo Controle

0,55

0,70

0,44

0,65

0,58

0,57

Figura 7: Média e Desvio Padrão das Unidades Formadoras de Colônias do Total de Estreptococos nos Tempos Linha Base, Tempo Zero e Tempo Quinze para os Grupos Teste e Controle. Natal/RN, 2005.

73

Em relação ao número de UFCs de S. mutans, verificou-se que o comportamento entre os

grupos foi semelhante (figura 8), havendo uma tendência significativa de aumento da linha base

para o tempo zero e uma estabilização nos valores destas até o tempo quinze (tabelas 7 e 8).

Entretanto, quando da comparação entre os grupos tempo a tempo eles se mostraram semelhantes

(tabelas 1, 4 e 6).

6

6,5

7

7,5

8

8,5

Linha Base Tempo Zero Tempo Quinze

Tempos

Méd

ias

Grupo TesteGrupo Controle

0,62

0,360,27

0,78

0,310,39

Figura 8: Média e Desvio Padrão das Unidades Formadoras de Colônias de S. mutans nos Tempos Linha Base, Tempo Zero e Tempo Quinze para os Grupos Teste e Controle. Natal/RN, 2005.

74

Para o total de lactobacilos, em nenhum dos tempos do estudo houve diferença

significativa entre o comportamento dos dois grupos (tabelas 1, 4 e 6). Todavia, a figura revela

uma tendência estatisticamente significativa de aumento das UFCs do total de lactobacilos da

linha base para o tempo zero e uma redução destas do tempo zero para o tempo quinze em se

tratando do grupo controle (tabela 8 e figura 9). No grupo teste, ao longo do tempo, observou-se

um comportamento linear, não havendo mudanças estatisticamente significativas das UFCs neste

grupo bacteriano ao longo do tempos (Tabela 7 e figura 9).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Linha Base Tempo Zero Tempo QuinzeTempos

Méd

ias Grupo Teste

Grupo Controle

1,69

1,65

1,79

1,85

1,55

1,77

Figura 9: Média e Desvio Padrão das Unidades Formadoras de Colônias do Total de Lactobacilos nos Tempos Linha Base, Tempo Zero e Tempo Quinze para os Grupos Teste e Controle. Natal/RN, 2005.

75

No que concerne ao IPV, os grupos teste e controle ao longo do tempo mostraram um

comportamento semelhante, não havendo diferença significativa (tabelas 1, 4 e 6) entre nenhum

dos tempo do estudo. A observação do comportamento dessa variável para os grupos revela que,

tanto teste quanto controle, apresentam uma tendência de diminuição do IPV ao longo do tempo

(tabelas 7, 8 e figura 10).

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Linha Base Tempo Zero Tempo QuinzeTempos

Méd

ias Grupo Teste

Grupo Controle

10,61

9,66

6,59

9,40

8,93

5,89

Figura 10: Média e Desvio Padrão do Índice de Placa Visível dos Tempos Linha Base, Tempo Zero e Tempo Quinze para os Grupos Teste e Controle. Natal/RN, 2005.

76

O ISG apresentou uma tendência semelhante ao IPV apenas para o grupo teste (figura 11).

Em relação ao grupo controle, observa-se um discreto aumento da linha base para o tempo zero e

um tênue decréscimo deste para o tempo quinze, caracterizando uma quase linearidade para esta

variável ao longo dos tempos do estudo (figura 11). Apesar de ter sido encontrada diferença entre

os grupos na linha base (tabela 1), quanto aos demais tempos de avaliação os grupos foram

semelhantes (tabelas 4 e 6).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

Linha Base Tempo Zero Tempo Quinze

Tempos

Méd

ias Grupo Teste

Grupo Controle

1,15

0,84

1,62

1,41

2,27

1,43

Figura 11: Média e Desvio Padrão do Índice de Sangramento Gengival dos Tempos Linha Base, Tempo Zero e Tempo Quinze para os Grupos Teste e Controle. Natal/RN, 2005.

77

9. DISCUSSÃO

A cárie e as doenças periodontais, doenças bucais mais prevalentes, são decorrentes de um

desequilíbrio da microbiota oral residente, devido ao acúmulo de biofilme nas superfícies

dentárias. Tais biofilmes se constituem num agregado de microrganismos embebidos em uma

matriz polimérica e fixados às superfícies dentárias através de mecanismos de adesão

irreversíveis, caracterizando então, a colonização microbiana nas superfícies dentárias e sua

perpetuação no meio ambiente bucal.

O controle freqüente do biofilme dentário, de modo que ele não se torne patogênico, é a

medida mais simples e menos onerosa de se controlar ambas as doenças. É uma estratégia

preventiva primordial, voltada diretamente ao controle do agente etiológico primário dessas

doenças.

Este controle pode ser realizado de forma mecânica ou química. O objetivo do controle

mecânico do biofilme é a obtenção de níveis de limpeza capazes de prevenir o início e/ou o

desenvolvimento das doenças orais, cárie e doenças periodontais3.

Em alguns casos onde o controle mecânico não está sendo eficaz, lança-se mão do

controle químico, que deve ser usado como um coadjuvante aos métodos mecânicos. O controle

químico pode ser indicado em algumas situações tais como em pacientes que façam uso de

aparelhos ortodônticos fixos que dificultam a remoção mecânica do biofilme; em pós-operatórios

de cirurgias orais; em pacientes especiais não habilitados para controle mecânico do biofilme; e

em alguns casos de pacientes desmotivados ao adequado controle do mesmo8.

Muitas substâncias têm sido utilizadas no controle químico do biofilme, sejam elas anti-

sépticas, antiadesivas e substâncias que promovem a desorganização do biofilme.

Em se tratando de agentes antimicrobianos utilizados no controle químico do biofilme,

destacam-se algumas substâncias naturais, dentre as quais, a quitosana. O mecanismo de ação

antibacteriano da quitosana está baseado em algumas propostas tais como: interação da quitosana

com a membrana das células, alterando a permeabilidade celular; a natureza policatiônica da

quitosana, o qual interfere com os resíduos de cargas negativas das macromoléculas de superfície;

união da quitosana com o DNA da célula, inibindo a síntese de RNA26; inativação enzimática;

78

quelação de íons metálicos essenciais e formação de complexos de polieletrólitos nas superfícies

bacterianas51.

Tomando como base tais características, este trabalho buscou avaliar a eficácia da

quitosana a 0,4% com alto peso molecular e alto grau de desacetilação, incorporada a uma

solução para bochecho, sobre a redução de algumas bactérias orais e variáveis clínicas

relacionadas ao acúmulo bacteriano, o biofilme visível e o sangramento gengival.

Para tanto, os indivíduos selecionados para a pesquisa fizeram uso do bochecho de

quitosana e de um bochecho controle por um período de quinze dias. Anteriormente ao período

de bochechos, as unidades formadoras de colônias dos três grupos bacterianos, bem como os

índices de placa visível e de sangramento gengival foram avaliados e os resultados demonstraram

não haver diferença significativa entre os grupos de bochechos, excetuando-se aqueles obtidos

para o ISG (tabela 1 e figuras 7, 8, 9, 10 e 11).

Essa falta de homogeneidade estatística dos grupos em relação ao ISG pode não ter

prejudicado a comparação dos grupos nos demais tempos pelo fato dos valores correspondentes a

este índice terem sido muito baixo, sem expressão clínica. Como pode ser visto na tabela 1, as

médias obtidas em ambos os grupos foram de 1,68 e 0,6% de faces que apresentaram

sangramento.

Do mesmo modo que para as variáveis dependentes, quanto às variáveis independentes

quantitativas e categóricas os grupos se apresentaram semelhantes (tabelas 2 e 3) antes do início

dos bochechos. Esse fato reforça a assertiva de que, caso tivesse havido uma diferença entre os

grupos imediatamente após os bochechos e com quinze dias do seu término, esta se devia ao

efeito da intervenção e não a estas possíveis diferenças entre os grupos amostrais.

Partindo da premissa que os grupos eram semelhantes antes do início do período dos

bochechos no que diz respeito às variáveis dependentes e independentes, serão discutidos a seguir

os resultados obtidos a partir do término dos bochechos (tempos zero e quinze).

Do mesmo modo, algumas variáveis relacionadas ao período em que foram feitos os

bochechos poderiam ter influenciado os resultados e a atribuição de possíveis efeitos poderia ter

sido dada a elas e não ao efeito do bochecho em si. Como evidenciado na tabela 5, não houve

diferença significativa entre os grupos para o número total de bochechos e a freqüência de

79

escovação durante o período em que os bochechos foram realizados, o mesmo sendo observado

para as visitas ao dentista neste período. Bem como, as correlações entre o número total de

bochechos e a freqüência de escovação nos dois grupos para as variáveis dependentes e

independentes não apresentaram correlações significativas. Isso deixa claro que tais variáveis não

influenciaram os efeitos dos bochechos sobre nenhuma das variáveis dependentes e

independentes analisadas.

Em relação ao número de UFCs do total de estreptococos, os resultados do estudo

mostraram que o bochecho de quitosana a 0,4% reduziu significativamente tais valores em

relação ao placebo (tabela 4 e figura 7). A princípio poderia se imaginar que a quitosana em

solução para bochecho na concentração utilizada neste estudo seria eficaz na redução do total de

estreptococos. No entanto, quando se analisou o grupo teste isoladamente (tabela e figura 7),

constatou-se que não houve diferença entre os tempos, o que denota uma falta de ação da

quitosana sobre esse grupo bacteriano. Caso essa ação fosse real, haveria uma redução

imediatamente pós-bochecho que poderia perdurar pelo tempo de observação do estudo (15 dias).

Este resultado vai de encontro à maioria dos trabalhos in vitro pesquisados na literatura,

os quais afirmam que a quitosana e seus derivados apresentam ação antimicrobiana sobre

estreptococos orais5, 10, 53.

O estudo de Teixeira53 observou in vitro que a quitosana a 0,4% com alto PM e GD

obteve ação antimicrobiana sobre S. sanguinis e S. mutans e a quitosana a 0,8% com alto PM e

GD apresentou ação antimicrobiana sobre S. sobrinus. Segundo ele, observa-se que para

desempenhar ação antimicrobiana sobre algumas espécies de estreptococos, necessário se faz

elevar sua concentração, o que in vitro ele conseguiu dobrando-a.

Os demais estudos in vitro apontam para uma redução significativa de espécies de

estreptococos orais proporcionada pela quitosana, sejam elas S. sanguinis 10, 53 e S. sobrinus 53.

A ação antimicrobiana da quitosana também foi observada em relação a outras bactérias

não orais, dentre elas E. coli 17, 23, 34, Helminthosporium 23, P. aeruginosa 19, B. megaterium, B.

cereus, S. aureus, L. plantarum, L. brevis, L. bulgaricus, P. fluorescens, S. typhimurium, V.

parahaemolyticus 34.

80

Vale ressaltar que a maioria dos trabalhos sobre a ação antimicrobiana da quitosana foi

realizada in vitro e, dessa forma, não consegue reproduzir com verossimilhança a dinâmica do

ecossistema oral, não devendo ser utilizado para comparação com o estudo ora desenvolvido.

Ademais, os estudos in vitro verificaram que a quitosana reduziu algumas espécies

bacterianas isoladas, como por exemplo, S. sanguinis e S. sobrinus, enquanto, neste estudo a ação

antimicrobiana da quitosana foi testada sobre o total de estreptococos orais, o qual representa um

gênero que contém várias espécies para as quais os estudos não apresentam resultados.

De todos os estudos que avaliaram o efeito da quitosana sobre bactérias orais, apenas o de

Sano e colaboradores43 foi realizado in vivo. Este observou que o bochecho de quitosana a 0,5%

com baixo PM e alto GD reduziu as UFCs de S. mutans de dezesseis dos vinte e quatro

indivíduos participantes do estudo. Contudo, este estudo utilizou uma metodologia diferente, pois

os bochechos de quitosana não foram supervisionados e a contagem das UFCs se deu através do

número de bactérias aderidas em tubos de ensaio contendo MSB caldo, transformados em

escores.

Do mesmo modo que os estudos in vitro supracitados, esse estudo analisou apenas uma

espécie bacteriana e utilizou uma solução de quitosana numa concentração um pouco superior.

Ainda em relação à ação da quitosana sobre as bactérias orais, muitos trabalhos destacam

a capacidade de inibição da adsorção bacteriana sobre os estreptococos orais.

De acordo com Sano e colaboradores41, os derivados de quitina inibiram in vitro 70% da

adsorção de S. sanguinis e 61% de S. mitis. Tarsi e colaboradores52 observaram que os derivados

da quitosana inibiram in vitro a adsorção S. mutans, S. sanguinis, S.gordonii, S.constellatus, S.

anginosus, S.intermedius, S. oralis, S. salivarius e S. vestibularis. Os mesmos resultados em

relação aos S. sanguinis foram observados por Decker e colaboradores10.

Sano e colaboradores42 verificaram que a quitosana a 0,5% com baixo PM inibiu in vitro a

aderência dos estreptococos orais durante três horas. Reforçando essa ação antiadesiva, Sano e

colaboradores44 afirmaram que a quitosana de baixo PM inibiu 70% da adsorção bacteriana e

aquela com alto GD inibiu 90% da adsorção de S. sobrinus e 70% dos já aderidos.

Apesar da ação antiadesiva da quitosana ter sido testada sempre in vitro, o fato dela existir

poderia suscitar o fato de que a mesma poderia impedir a colonização das superfícies dentárias in

81

vivo ou mesmo desalojar bactérias já aderidas, contribuindo para redução nos níveis dessas

bactérias na boca e, conseqüentemente, a redução do biofilme e sangramento gengival.

Ainda se tratando de estreptococos, este estudo também avaliou a ação antibacteriana da

quitosana sobre uma espécie isolada, S. mutans. Após o uso do bochecho de quitosana a 0,4%,

não foi observada diferença entre este grupo e o que bochechou a substância placebo (tabela 4 e

figura 8). Quando da comparação entre os tempos para o grupo teste, observou-se um aumento

estatisticamente significativo das UFCs para esta bactéria (tabela 7 e figura 8). O aumento no

número das UFCs desta bactéria pode ser devido ao consumo de uma dieta cariogênica a base de

sacarose, o que não pode ser confirmado, uma vez que a variável dieta não foi avaliada neste

estudo. Diante destes dados, pode-se afirmar que o bochecho de quitosana a 0,4% não apresentou

ação antimicrobiana sobre o S. mutans, o que contrasta com os estudos in vitro5, 53 e com o estudo

de Sano e colaboradores43.

A relação da capacidade antiadesiva in vitro da quitosana sobre o S. mutans é relatada em

alguns trabalhos41, 51, 52. Sano e colaboradores41 verificaram que o derivado da quitina inibiu a

adsorção de 82% dos S. mutans. Corroborando esse achado, Tarsi e colaboradores51, observaram

que, na presença de saliva e sacarose, a quitosana reduziu, em torno de 47 a 67%, da fixação do

S. mutans a hidroxiapatita, destacando que a saliva restaura as propriedades adesivas do esmalte.

E Tarsi e colaboradores52 afirmaram que a quitosana com baixo PM apresentou inibição

estatisticamente significativa da fixação dos S. mutans a superfície dentária e que este

biopolímero reduziu de 30 a 90% da aderência dessa espécie bacteriana às células epiteliais da

bochecha.

Como não foi observado efeito antibacteriano da quitosana utilizada neste estudo em

relação ao total de estreptococos e ao número de UFCs de S. mutans, a repopulação por estas

bactérias não pode ser observada. Nesse sentido, os resultados desse estudo confirmam esse

achado. Conforme observado na tabela 6, quinze dias após os bochechos os grupos não diferiram

em relação a estas bactérias, o mesmo tendo sido observado quando se comparou os grupos em

relação a ambas bactérias após o término dos bochechos e quinze dias após (tabelas e figuras 7 e

8).

Poderia ser questionado então o porquê do uso de uma concentração de 0,4% de

quitosana, uma vez que o efeito obtido no outro estudo in vivo foi por uma concentração de

82

0,5%43 e que alguns estudos in vitro53 apontam para concentrações também maiores como

inibidoras da adsorção e bactericidas. Como a concentração de 0,4% era muito próxima àquela

utilizada no único estudo in vivo e pelo fato da concentração bactericida mínima sobre biofilmes

para duas espécies representativas de estreptococos orais obtida por Teixeira53 ter sido de 0,4%,

optou-se pela verificação de sua eficácia clínica.

Outro gênero bacteriano analisado neste estudo foram os lactobacilos orais. Os resultados

mostraram que o bochecho de quitosana a 0,4% não apresentou eficácia antimicrobiana sobre

esse grupo bacteriano quando comparado ao grupo controle (tabela 4, figura 9), nem quando o

grupo teste foi analisado sozinho nos diferentes tempos (tabela 7 e figura 9).

As pequenas flutuações observadas nos níveis de lactobacilos nesse estudo podem ter sido

oriundas do elevado consumo de carboidratos fermentáveis pela população aqui acompanhada ou

por variações comuns no grau de recuperação dessas bactérias. Ainda, os níveis de lactobacilos

orais estão bastante sujeitos a variações a depender de áreas de aprisionamento físico presentes na

boca27, que nem sempre são passíveis de controle em uma pesquisa clínica. Esse fato pode ser

ilustrado pelo que aconteceu com o grupo controle, cujos números de UFCs aumentaram após os

bochechos e quinze dias após voltaram a cair (tabela 8 e figura 9).

A falta de ação sobre os lactobacilos orais também pode ter sido fruto da inacessibilidade

dos bochechos às áreas retentivas onde essas bactérias costumam se localizar, cicatrículas e

fissuras e áreas lisas não livres como as interproximais27. Como não houve ação da quitosana

sobre os lactobacilos, sua repopulação que seria verificada quinze dias após o término dos

bochechos não pode ser observada (tabelas 7 e 8 e figura 9).

Este resultado diverge do trabalho de Teixeira53 que observou que a quitosana com alto

PM e alto GD a 0,8% reduziu as UFCs do L. casei. Contudo, cumpre salientar que este estudo foi

realizado in vitro e que a quitosana reduziu as UFCs do L. casei numa concentração maior do que

0,4%, a utilizada neste estudo. Provavelmente, então, uma concentração mais elevada seria

necessária para ter efeito sobre os lactobacilos orais.

Uma outra abordagem realizada nesse estudo foi a eficácia dos bochechos sobre as

variáveis clínicas índice de placa visível e sangramento gengival.

83

No que se refere aos resultados encontrados nesta pesquisa para o IPV, constatou-se que

houve uma redução da média deste índice da LB para o T0 e deste para o T15 (tabela 7, figura

10), muito embora uma redução de 11,54% para 6,65% não tenha significado clínico algum. Este

fato pode ser justificado pelo efeito mecânico do bochecho e pelo efeito Hawthorne que os

autores definem como uma melhora na higiene oral devido à participação do aluno na pesquisa25,

o que pode também ser constatado em relação ao grupo controle que apresentou uma mesma

tendência de declínio no acúmulo do biofilme (tabela 8 e figura 10).

Entretanto, as freqüências de escovação iniciais e finais entre os dois grupos testados não

apresentaram diferença significativa (tabelas 2 e 5), o que poderia nos levar a crer que tal efeito

não estava associado a uma melhoria na escovação. Há que se pontuar que esta é uma variável

referida pelo aluno, estando sujeita ao viés da informação. Nesse sentido, outro aspecto que se

deve levar em consideração é o fato da qualidade da escovação ter melhorado, apesar de não ter

havido nenhuma orientação de escovação.

Não pode ser deixado de lado, ainda, o fato dos alunos apresentarem uma boa condição de

higiene oral, visto que o IPV antes do experimento (11,54%) foi considerado baixo. Assim, pode-

se concluir que o bochecho de quitosana a 0,4% não alterou o biofilme visível e, portanto, seu

efeito após quinze dias também não foi influenciado pelos bochechos em si (tabelas 7 e 8 e figura

10).

Os resultados deste estudo em relação ao IPV divergem do trabalho de Sano e

colaboradores45, onde o bochecho de quitosana fosforilada a 0,5% com baixo PM e alto GD,

reduziu 26% do biofilme novo e 61% do biofilme envelhecido. Porém, além da quitosana ter sido

fosforilada, algumas críticas podem ser feitas a esse estudo. Este trabalho in vivo utilizou uma

amostra bastante pequena, visto que apenas três indivíduos participaram do experimento; o

bochecho formulado continha 10% de etanol, podendo a redução do biofilme observada ter

sofrido influência do álcool; e, além disso, o uso dos bochechos não foi supervisionado, não se

tendo a certeza se os bochechos foram realizados apenas uma vez ou realizada sobretratamento.

Dentro desta mesma perspectiva, outro estudo clínico realizado por Sano e

colaboradores43, também diverge dos resultados encontrados nesta pesquisa em questão, na

medida em que o bochecho de quitosana a 0,5% com baixo PM e alto GD, reduziu

significativamente os escores do índice de Quigley & Hein em 11,1% e do ISP em torno de

84

25,8%. Todavia, esse bochecho foi formulado com 15% de etanol e essa redução dos índices QHI

e ISP pode ter sido devido a concentração do álcool e não da quitosana presente no bochecho.

No que se refere à ação do bochecho de quitosana a 0,4% sobre o ISG, pode-se observar

que houve uma redução deste índice ao longo do tempo (tabela 7, figura 11), porém considerada

não significativa. Logo, o bochecho de quitosana não alterou o ISG. Um discreto aumento foi

observado no ISG após o período de bochechos no grupo controle, acompanhado de uma similar

redução após quinze dias (tabela 8 e figura 11).

Os efeitos observados sobre o ISG podem ser atribuídos aos mesmos motivos já relatados

para o IPV. Poderia ser levantada, ainda, a hipótese de que essa redução não foi efetiva, uma vez

que os valores do ISG para ambos os grupos já eram muito baixos. Sem dúvida, uma redução de

médias de 1,68% para 1,08% no grupo teste e incremento de 0,6% para 0,71% no grupo controle

não expressam elevação e redução efetivas.

Não foram encontrados trabalhos na literatura pesquisada que contemplassem a ação da

quitosana sobre o ISG. Dessa forma, bases comparativas não são oferecidas para os resultados

aqui encontrados.

Outro aspecto que deve ser discutido diz respeito às características da quitosana, PM, GD

e concentração do biopolímero. Neste estudo, foi constatado que o bochecho de quitosana a 0,4%

com alto PM e alto GD não apresentou redução sobre os três grupos bacterianos avaliados, bem

como, sobre o IPV e ISG.

Divergindo deste aspecto, Teixeira53 observou in vitro que a quitosana a 0,4% com alto

PM e alto GD apresentou ação antibacteriana sobre S. mutans e S. sanguinis e a 0,8% sobre S.

sobrinus e L. casei. Liu e colaboradores26 verificaram que quanto maior o PM e o GD maior a

ação antimicrobiana deste biopolímero. No e colaboradores34 e Zheng e Zhu54 afirmaram que

quanto maior o PM maior a ação bactericida sobre bactérias gram positivas.

Nos dois estudos in vivo, Sano e colaboradores45 e Sano e colaboradores43, verificaram

que a quitosana a 0,5% com baixo PM e alto GD reduziu 26% do biofilme novo, 61% do

biofilme envelhecido e 11,1% dos escores do QHI e 25,8% do ISP, respectivamente, portanto,

sendo efetivo na redução do biofilme divergindo dos resultados aqui relatados.

85

Outro aspecto abordado sobre a quitosana, é sua capacidade de neutralizar o pH do

biofilme através da ligação deste biopolímero, carregado positivamente, aos ácidos, carregados

negativamente, provenientes do metabolismo bacteriano. A quitosana restabelece o pH a valores

normais, mantendo o pH do biofilme neutro.

Neste sentido, Shibasaki e colaboradores48, 49 realizaram dois estudos que corroboram essa

ação antiácida da quitosana. Um destes estudos observou, in vitro, que uma goma de quitosana a

1 e 3% com baixo PM foi eficaz na neutralização do pH do biofilme na presença de carboidratos

fermentáveis49.

No outro trabalho, constatou-se que a quitosana de baixo PM reduziu a queda do pH do

biofilme na presença de sacarose para 5,0. Foi observado também que este biopolímero não

influencia a atividade glicolítica de S. mutans, pois seu efeito sobre a inibição da queda do pH é

devido a capacidade tampão da quitosana de neutralizar os ácidos e penetrar no biofilme48.

Outro aspecto analisado nesta pesquisa é a relação entre a atividade antimicrobiana da

quitosana e o pH da solução. Muitos trabalhos afirmam que a solução de quitosana com baixo pH

apresenta maior ação antibacteriana17, 19, 26, 34.

Nesta pesquisa, o pH final da solução de quitosana foi 6,5. Isto pode ter diminuído a ação

antimicrobiana da quitosana devido a sua pobre solubilidade, assim como mostra alguns estudos

discutidos a seguir.

Consoante Jia, Shen e Xu17, a solução de quitosana com baixo pH apresenta grupo NH2

protonado favorecendo a interação com a superfície negativa bacteriana, dessa forma,

aumentando a capacidade bactericida da mesma. Este autor também afirmou que o ácido acético

exerceu ação antibacteriana e quanto menor o pH da solução de quitosana menor a CIM.

Liu e colaboradores26 observaram que quanto maior o pH da solução de quitosana, menor

a solubilidade do biopolímero e menor ação antibacteriana deste. Confirmando esse aspecto,

Jumaa, Furkert e Müller19 verificaram que a solução de quitosana com valores de pH maior do

que 5,5 causaram precipitação da quitosana dissolvida. NO e colaboradores34 afirmaram que

quanto menor o pH da solução, maior a atividade bactericida da quitosana.

Outro aspecto relatado sobre a ação antimicrobiana da solução de quitosana pode também

ser devido à concentração do ácido na solução.

86

Nesse estudo foi usada uma concentração de ácido acético em que a quitosana fosse

completamente diluída. Dessa forma, foi usado ácido acético a 0,3%, e essa baixa concentração

também pode ter diminuído a solubilidade do biopolímero e conseqüentemente a ação

antimicrobiana da quitosana contida no bochecho.

Nesse aspecto, No e colaboradores34 mostraram que o ácido acético foi efetivo na inibição

do crescimento da maioria das bactérias. Segundo Avadi e colaboradores1 a ação bactericida da

quitosana e seus derivados é pH dependente, ou seja, o aumento da concentração do ácido acético

resultou numa maior ação antimicrobiana da quitosana e na diminuição dos valores de CIM e

CBM.

No que se refere ao teste de estabilidade realizado no bochecho de quitosana a 0,4%,

constatou-se que após o período do experimento, o bochecho de quitosana ainda apresentou ação

antimicrobiana sobre pelo menos duas cepas testadas, o que confirma a estabilidade do

biopolímero após quinze dias de uso.

Este resultado corroborou Kaya e Picard20 que observaram que os géis de quitosana

utilizados no biotratamento de água contaminada apresentaram estabilidade química durante o

período de um mês.

Ainda nesse sentido, Jumaa e Müller18 verificaram que a combinação quitosana-lipídio

resistiu ao choque térmico após a esterilização em autoclave, sem mudanças no tamanho das

partículas e sem fase de separação, dessa forma mostrando uma boa estabilidade físico-química.

Nesse contexto, Cervera e colaboradores4 verificaram que a estabilidade da quitosana

depende das condições de armazenamento. Diante disso, vale ressaltar que os bochechos teste e

controle foram armazenados em frascos branco leitosos com tampa rosqueável e, em ambiente

natural para não prejudicar a estabilidade do biopolímero.

Em relação ao teste de esterilidade feito no bochecho de quitosana, verificou-se que,

provavelmente, a água destilada não estéril utilizada na formulação do bochecho, pode ter

contribuído para a contaminação dos mesmos no teste de esterilidade realizado.

Outro ponto importante a ser discutido é a questão da substantividade do bochecho. Não

foi realizado nenhum teste de substantividade no bochecho de quitosana testado. Entretanto, essa

propriedade depende do grau de ligação ou adsorção dos bochechos às superfícies orais e da

87

interferência na aderência bacteriana às superfícies orais55. Sendo assim, alguns estudos 41, 42, 44, 51, 52 relatam a capacidade de inibição da adsorção de células bacterianas as superfícies dentárias

e a liberação prolongada de medicamentos na cavidade oral como a clorexidina, sendo bastante

promissor nas terapias periodontais47.

Portanto, o bochecho de quitosana a 0,4% com alto peso molecular e alto grau de

desacetilação não apresentou eficácia sobre a redução dos três grupos bacterianos testados, assim

como sobre o IPV e ISG. Alguns fatores podem justificar este fato tais como: a concentração de

quitosana utilizada no bochecho foi considerada baixa para um estudo in vivo; o pH 6,5 da

solução pode ter causado precipitação da quitosana e ter diminuído a ação antimicrobiana do

biopolímero; a concentração de ácido utilizada para diluir a quitosana foi pequena, visto que a

maioria dos estudos utiliza concentração ácida a 0,5%, e este fato pode ter diminuído a

solubilidade e reduzido a ação bactericida da quitosana.

Portanto, calcado nos resultados encontrados neste estudo, algumas recomendações

devem ser levadas em consideração com vistas à realização de trabalhos futuros nessa mesma

linha de pesquisa: o aumento da concentração da quitosana em solução, assim podendo obter

também melhor ação antibacteriana deste biopolímero; a adição de conservantes à solução para

bochecho, dessa forma, garantindo melhor estabilidade à solução; a diminuição do pH da solução

e o aumento da concentração do ácido acético para melhor solubilização da quitosana e melhor

ação bactericida desta; a esterilização da água destilada usada na solução para bochecho com o

intuito de minimizar a contaminação do mesmo.

Em síntese, a maioria dos trabalhos que fundamentaram esse estudo utilizou metodologias

in vitro, as quais deixam muito a desejar em termos de fidedignidade da ação antimicrobiana da

quitosana sobre as variáveis aferidas. Faz-se necessária a realização de mais estudos in vivo

acerca da ação antimicrobiana da quitosana sobre as bactérias orais e biofilme, visto que somente

dois utilizaram este tipo de metodologia, não apresentando evidência científica para o uso desta

substância como coadjuvante aos métodos mecânicos de controle dos biofilmes dentários.

88

10. CONCLUSÕES

Diante dos resultados analisados nesta pesquisa, pode-se concluir que:

A solução para bochecho contendo quitosana a 0,4%, com alto peso molecular e alto grau

de desacetilação, não apresentou eficácia antimicrobiana sobre a redução do total de

estreptococos, S. mutans e total de lactobacilos, bem como sobre o IPV e ISG.

Como o bochecho com solução de quitosana a 0,4% não apresentou ação antimicrobiana

sobre nenhum dos três grupos bacterianos testados, não houve desequilíbrio no

ecossistema oral e, consequentemente, não houve possibilidade de se caracterizar

qualquer tipo de repopulação bacteriana após o uso do mesmo;

As variáveis independentes sexo, idade, severidade de cárie, freqüência de escovação

inicial e final, atividade de cárie, freqüência do uso dos bochechos, uso de dentifrício com

antimicrobiano, consulta ao dentista e componente cariado não interferiram no desfecho

das variáveis dependentes (total de estreptococos, S. mutans, total de lactobacilos, IPV e

ISG);

89

11. REFERÊNCIAS

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