Análisis histopatológico en árboles de limón mexicano ...
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA Análisis histopatológico en árboles de limón mexicano infectados con Candidatus Liberibacter asiaticus posterior a la aplicación de formulaciones biotecnológicas. TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN RECURSOS Y MEDIO AMBIENTE PRESENTA PAULINA GÁMEZ ROSAS GUASAVE, SINALOA; MÉXICO DICIEMBRE DEL 2014
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN
PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL
UNIDAD SINALOA
Análisis histopatológico en árboles de limón
mexicano infectados con Candidatus Liberibacter
asiaticus posterior a la aplicación de formulaciones
biotecnológicas.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN
RECURSOS Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA
PAULINA GÁMEZ ROSAS
GUASAVE, SINALOA; MÉXICO DICIEMBRE DEL 2014
El presente trabajo de investigación se desarrolló en las instalaciones del
Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo integral Regional (CIIDIR)
Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN), en el departamento de
Biotecnología Agrícola (BIOTECSIN), en el laboratorio de Virología bajo la dirección
del Dr. Jesús Méndez Lozano y en el Centro de Nanociencias y Micro y
Nanotecnologías (CNMN) del Instituto Politécnico Nacional, en el laboratorio de
Microscopía confocal de Barrido Laser bajo la dirección de la Dra. María de Jesús
Perea Flores. Para la realización de este proyecto se recibió financiamiento de la
Secretaria de Investigación y Posgrado (SIP 20120507) y del Consejo Nacional de
Ciencia y Tecnología (CONACyT) (FINNOVA-173465). El autor agradece al
CONACyT e IPN por las becas otorgadas (Beca BEIFI y Beca Institucional).
DEDICATORIA
A mis padres por apoyarme
incondicionalmente y ser mi pilar principal.
A Elodia por ser mi segunda madre
adoptarme y cuidar de mí durante todo este
tiempo
Alberto, tú sabes lo que ha sido esto para
mí…gracias por no dejarme flaquear.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco al Dr. Jesús Méndez por haberme dado la oportunidad de desarrollarme en su laboratorio, por
su paciencia, apoyo, consejos y sobre todo su confianza durante todo este tiempo. A la Dra. María de Jesús
por su amistad y dedicación en este proyecto y por haberme dado seguridad en momentos de duda. A la
Dra. Norma Leyva y al Dr. Antonio Luna por sus aportaciones en el desarrollo de este trabajo.
También quiero agradecer a los chicos de Virología a Erika, por sus risas, amistad y no dejarme morir sola
en nuestras diversas aventuras. A Juanjo por su ayuda en todo momento, recomendaciones y frases
motivacionales. Cindy muchas gracias por tu gran apoyo y esfuerzo en este trabajo que sin ti no estaría
completo y sobre todo por brindarme tu cariño. A Betty, Marielos y Ángela Paulina les agradezco su
tiempo, confianza y el que me hayan aceptado como su amiga. A Gustavo y Marco por los momentos de
alegría que me brindaron en el laboratorio así como sus consejos y apoyo. También quiero agradecer a
Lucy, Emanuel y Roger por su ayuda al inicio de esta aventura.
.
i
I. ÍNDICE GENERAL
I. ÍNDICE GENERAL.................................................................................................. i
INDÍCE DE CUADROS ................................................................................................ v
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................. vi
GLOSARIO ................................................................................................................ viii
RESUMEN ................................................................................................................... x
ABSTRACT ................................................................................................................ xii
I. INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 1
II. ANTECEDENTES ................................................................................................. 3
CITRÍCOS ...................................................................................................... 3 A.
1. Aspectos generales del limón mexicano ........................................................ 3
2. Importancia económica internacional y nacional ............................................ 3
3. Enfermedades de los cítricos ......................................................................... 4
Huanglongbing ............................................................................................... 5 B.
1. Agentes causales de Huanglongbing ............................................................. 5
2. Transmisión del HLB. ..................................................................................... 6
3. Síntomas del HLB en cítricos. ........................................................................ 7
4. Cambios fisiológicos en cítricos inducidos por CLas ...................................... 8
5. Cambios histológicos y estructurales. ............................................................ 9
6. Distribución de HLB en México .................................................................... 11
7. Alternativas para contrarrestar la enfermedad del HLB de cítricos ............. 12
Defensa en plantas ...................................................................................... 13 C.
1. Inducción de defensa en plantas .................................................................. 14
ii
2. Resistencia sistémica adquirida (SAR) ........................................................ 15
3. Resistencia sistémica inducida (ISR) .......................................................... 15
Herramientas disponibles para el análisis de la microestructura de tejidos D.
vegetales ............................................................................................................... 16
1. Técnicas de microscopía .............................................................................. 16
2. Microscopio óptico ........................................................................................ 17
3. Microscopía confocal de barrido laser. ......................................................... 17
4. Microscopía electrónica de barrido (MEB) ................................................... 17
5. Análisis de imágenes ................................................................................... 18
III. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................. 20
IV. HIPÓTESIS ..................................................................................................... 21
V. OBJETIVOS .................................................................................................... 21
OBJETIVO GENERAL ................................................................................. 21 A.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................ 21 B.
VI. MATERIALES y MÉTODOS ............................................................................ 22
Diseño experimental en huerto malla sombra .............................................. 22 A.
Diseño experimental en campo .................................................................... 24 B.
Extracción de DNA mediante el método CTAB ............................................ 25 C.
Cuantificación de DNA ................................................................................. 26 D.
Electroforesis en gel de agarosa .................................................................. 26 E.
Detección de Candidatus Liberibacter asiaticus por PCR convencional ...... 26 F.
Cuantificación absoluta de la concentración de Candidatus Liberibacter G.
asiaticus por P CR en tiempo real ....................................................................... 27
Preparación de muestra para análisis microscópico .................................... 28 H.
1. Fijación de muestras .................................................................................... 28
2. Deshidratación ............................................................................................. 29
iii
3. Transparentación e inclusión........................................................................ 29
Análisis visual de almidón en follaje fresco de limón mexicano....................... 29 I.
Microscopía óptica para analizar cambios en la microestructura celular de J.
limón mexicano ...................................................................................................... 30
Microscopia electrónica de barrido para observar la presencia de almidón . 30 K.
Detección de almidón mediante microscopía confocal de barrido láser ....... 31 L.
Evaluación del cambio microestructural del tejido foliar por MCBL .............. 31 M.
Detección de calosa por microscopia confocal............................................. 32 N.
Análisis de imagen (AI) para obtención de parámetros morfométricos del O.
tejido foliar ............................................................................................................. 32
Análisis estadístico ....................................................................................... 33 P.
VII. RESULTADOS Y DISCUSIONES ................................................................... 34
Acumulación de almidón en follaje de limón mexicano infectado por HLB .... 34 A.
Detección y cuantificación de Candidatus Liberibacter asiaticus en limón B.
mexicano ............................................................................................................... 37
Análisis de la acumulación de almidón en follaje de limón mexicano bajo C.
tratamiento en malla sombra ................................................................................. 40
Análisis de densidad y aspectos morfométricos de almidón en hoja de limón D.
mexicano 240 DPA ................................................................................................ 42
Acumulación de almidón en tejido foliar de árboles de limón mexicano 60 E.
DPA ..................................................................................................................... 46
Acumulación de calosa en árboles de limón mexicano en malla sombra. .... 49 F.
Acumulación de calosa en árboles de limón mexicano en campo ............... 51 G.
Cambios microestructurales en el sistema vascular de follaje en limón H.
mexicano infectado por CLas 240 DPA. ................................................................ 53
Cambios microestructurales en sistema vascular de follaje y raíz de árboles de I.
limón mexicano infectados por CLas 60 DPA ........................................................ 60
iv
VIII. CONCLUSIONES ............................................................................................ 65
IX. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................ 66
v
INDÍCE DE CUADROS
Cuadro 1 Concentración de Candidatus Liberibacter asiaticus en árboles
seleccionados 240 DPA. ........................................................................................... 23
Cuadro 2. Contenido de las formulaciones biotecnológicas ..................................... 24
Cuadro 3. Secuencia de amplificación de los primers internos y externos, sonda
TaqMan®................................................................................................................... 28
Cuadro 4. Cuantificación de CLas mediante PCR en tiempo real ............................ 38
Cuadro 5. Promedio del tamaño, número y densidad de gránulos de almidón
presentes en el tejido foliar 240 DPA. ....................................................................... 45
vi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Síntomas ocasionados por enfermedades de importancia nacional en
cítricos.. ....................................................................................................................... 4
Figura 2. Transmisión en la naturaleza del HLB a través de insectos vectores. ......... 7
Figura 3. Síntomas de HLB en follaje y fruto en naranja dulce. ................................... 8
Figura 4. Cambios histopatológicos en cítricos dulces afectados por el HLB............ 11
Figura 5. Mapa de distribución del HLB en México ................................................... 12
Figura 6. Esquema del huerto experimental en malla sombra.. ................................ 23
Figura 7. Huerto experimental en campo. ................................................................. 25
Figura 8. Acumulación de almidón en follaje de limón mexicano de invernadero. ….35
Figura 9. Acumulación de almidón en follaje de limón mexicano tratado con manejo
nutricional en malla sombra. ...................................................................................... 36
Figura 10. Acumulación de almidón en follaje de limón mexicano tratado con la
formulación FB-3 en malla sombra. ........................................................................... 36
Figura 11. Detección de CLas en tejido foliar sintomático y asintomático de limón
mexicano mediante PCR punto final. ........................................................................ 38
Figura 12. Estructura del sistema vascular en hoja de limón mexicano. ................... 41
Figura 1. Presencia de almidón en follaje de limón mexicano después de 240 días de aplicación de tratamiento y formulaciones biotecnológicas……………………… 41
Figura 14. Acumulación de almidón en xilema observado por MEB.......................... 42
Figura 15. Depuración de imagen confocal para la extracción de datos numéricos. 43
Figura 16. Presencia de almidón en tejido foliar de limón mexicano en malla sombra
240 DPA de las formulaciones biotecnológicas observados a través de una
reconstrucción tridimensional en MCBL. .................................................................. 44
Figura 17. Efecto de distintos tratamientos sobre el tamaño de los gránulos de
almidón de árboles de limón mexicano CLas+.. ......................................................... 45
Figura 18. Efecto de distintos tratamientos sobre el tamaño de los gránulos de
almidón de árboles de limón mexicano CLas+. .......................................................... 46
Figura 19. Presencia de almidón en tejido foliar de limón mexicano en campo 60 DPA
observados a través de una reconstrucción tridimensional en MCBL. ...................... 47
vii
Figura 20. Depuración de micrográficas en MCBL y cuantificación de Calosa en tejido
foliar de árboles de limón mexicano en malla sombra 240 DPA. .............................. 50
Figura 21. Presencia de calosa en hojas de limón mexicano en malla sombra 240
DPA. .......................................................................................................................... 50
Figura 22. Efecto de distintos tratamientos sobre el número de depósitos de calosa
detectados. ................................................................................................................ 51
Figura 23. Presencia de calosa en hojas de limón mexicano en campo 60 DPA. ..... 52
Figura 24. Microestructura de follaje sano (CLas-) y follaje infectado (CLas+). ........ 54
Figura 25. Segmentación de imágenes de MCBL para obtener datos cuantitativos de
cambios morfométricos en el cilindro vascular. ......................................................... 55
Figura 26. Efecto de las formulaciones biotecnológicas 240 DPA en el tamaño del
floema en follaje de limón mexicano afectado por CLas. .......................................... 57
Figura 27. Efecto de las formulaciones biotecnológicas 240 DPA en el tamaño de
cilindro vascular en follaje de limón mexicano afectado por CLas.. .......................... 58
Figura 28 Efecto de las formulaciones biotecnológicas 240 DPA en el tamaño de
xilema en follaje de limón mexicano afectado por CLas.. .......................................... 59
Figura 29 Efecto de las formulaciones biotecnológicas 240 DPA en el tamaño de
floema en follaje de limón mexicano afectado por CLas. .......................................... 60
Figura 30. Microestructura de raíz de limón mexicano.. ............................................ 61
Figura 31 Aspecto del tejido vascular de floema de limón mexicano 60 DPA.. ......... 62
viii
GLOSARIO
Â. Angstroms. Unidad de longitud empleada para expresar longitudes de onda,
distancias moleculares y atómicas
Almidón. Polisacárido formado por unidades de glucosa que sirven como reserva
energética, está formado por amilosa y amilopectina.
Calosa. Polisacárido de origen vegetal formado por enlaces β-1,3-glucano. Es un
constituyente común en las paredes celulares de los haces vasculares de los
elementos cribosos, también se desarrolla rápidamente en reacción a daño en
elementos cribosos y células del parénquima.
DNA. (Ácido desoxirribonucleico). Polímero compuesto de cuatro unidades
moleculares diferentes, denominadas desoxirribonucleótidos (abreviados A, G, C, y
T). El DNA es una hélice doble compuesta por dos hebras antiparalelas unidas por
enlaces de hidrógeno entre bases puricas y pirimidínicas complementarias.
DPA. Días Post Aplicación
Enfermedad. Alteración en el funcionamiento de las células y tejido del hospedante
causado por un agente patogénico o determinadas condiciones ambientales. Esta
alteración resulta de la continua irritación por un agente patógeno o factor ambiental
y lleva al desarrollo de síntomas.
Fisiología vegetal. Rama de la biología que estudia el funcionamiento de los tejidos
y órganos vegetales así como su relación con el ambiente.
Histología vegetal. Disciplina derivada de la botánica que estudia los tejidos
orgánicos desde su estructura, desarrollo hasta su función.
Inductor. Molécula capaz de activar la respuesta de defensa de las plantas.
Patógeno. Entidad que causa enfermedad.
ix
PCR. Reacción en cadena de la polimerasa. Sistema de amplificación genética que
permite obtener millones de copias de un determinado fragmento de DNA del que
solamente se conozcan las secuencias que lo flaqueen.
x
RESUMEN
La enfermedad del Huanglongbing (HLB) representa una amenaza para la citricultura
nacional. Como agentes causales del HLB se han reportado tres especies de
bacterias, siendo Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) la reportada en México.
Se sabe que el empleo de elementos nutricionales y agentes inductores de
resistencia incita la expresión de mecanismos de defensa y estimulan cambios en la
microestructura celular de los tejidos afectados. El objetivo del presente trabajo fue
analizar histopatológicamente árboles de limón mexicano infectados por CLas
posterior a la aplicación de formulaciones biotecnológicas. Los ensayos consistieron
en aplicar cinco tratamientos en árboles de limón Mexicano en huertos de malla
sombra y campo en Tecomán, Colima. Se utilizó tres formulaciones biotecnológicas
(FB-1, FB-2 y FB-3) en malla sombra, más elementos nutricionales y los restantes
fueron la aplicación alternada de las tres formulaciones y un manejo nutricional.
Posteriormente, se realizó una colecta de varetas sintomáticas de 15 árboles
representativos de limón mexicano cultivados en malla sombra 240 días post
aplicación (DPA). Así mismo, se realizó una colecta de nueve varetas sintomáticas y
tejido radicular de árboles de limón mexicano tratados con FB-1 y FB-3 en campo 60
DPA. Los resultados de acumulación de almidón en árboles en malla sombra
mediante la técnica de la reacción almidón/yodo y PCR en tiempo real indican una
asociación entre la concentración de la CLas y presencia de almidón. Posteriormente
se analizó mediante microscopia confocal de barrido laser, la acumulación de
almidón y los datos muestran que FB-1 presentó el mejor efecto en la disminución
del tamaño de los gránulos de almidón con 3260 µm2 y una densidad 0.0397617
gránulos de almidón/µm2 a los 240 DPA. Así mismo, se observó una tendencia
similar a los 60 DPA en campo abierto, encontrando una mayor reducción en tamaño
de los gránulos de almidón, tras la aplicación de FB-1. Por otro lado, los análisis
microestructurales indican que en las fórmulas FB-1, FB-2 y FB-3 a los 240 DPA
propiciaron un acomodo de la estructura celular. Adicionalmente, posterior a la
aplicación FB-1 se observó una estimulación en el crecimiento del cilindro vascular
con 199,446 µm2 y xilema con 140,303 µm2. Así mismo, en árboles de limón
Mexicano de campo abierto a los 60 DPA posterior a la aplicación de las
xi
formulaciones se observó un mayor arreglo en el tejido vascular de raíz y la
expansión del cilindro vascular en hoja. Los datos muestran que la FB-1 mostró
mejor efecto en la disminución del tamaño de los gránulos de almidón; así mismo, se
observó el haz vascular con menor saturación y una tendencia a mejorar la
estructura vascular con respecto a las otras formulaciones y el manejo nutricional.
xii
ABSTRACT
The Huanglongbing (HLB) is a destructive disease that represents a major threat to
the national citriculture. Three species of bacteria belongs to the genus Candidatus
Liberibacter and have been associated to HLB. Candidatus Liberibacter asiaticus
(CLas) is reported as a causative agent of HLB in Mexico. It is known that use of
nutritional elements and resistance inductors agents produce the expression of
defense mechanisms and stimulate changes in cellular microstructure of the affected
tissues. The aim of this study was to analyze histologically Mexican lime trees
infected with Candidatus Liberibacter asiaticus after the application of biotechnology
formulations. The assays consisted in the application of five treatments in Mexican
lime trees in mesh shade and field in Tecomán, Colima, three biotechnological
formulations were used (BF-1, BF-2 and BF-3) with nutritional elements, the another
two treatments were the alternate application of the three formulations and nutritional
management in Mexican lime trees in mesh shade. Fifteen representative samples of
symptomatic Mexican lime tree in mesh shade were collected at 240 days after
application (DAP). Additionally, root and leaves tissue of nine symptomatic trees in
field treated with FB-1and FB-3 were collected 60 days after application. The results
showed an association between concentration of the CLas and starch accumulation
using the technique of starch analysis by iodine and real-time PCR. In addition
analysis by confocal laser microscopy showed that BF-1 exhibit the best effect at
starch granule size diminution (3260 µm2) and density decrease with starch granules
0.03976 starch grains /µm2 at 240 DAP while a similar trend was observed at 60 DAP
in decreasing the size and density of the starch granules, after application of BF-1.
Furthermore a microstructural analysis revealed that biotechnological formulations
BF-1, BF-2 and BF-3 propitiate a better cell structure at 240 DAP. After the
application of BF-1 were observed a vascular cylinder growth 199,446 µm2 and
increase xylem thickness 140,303 µm2. A similar trend was observed in Mexican lime
trees at 60, were the root tissue showed a modification on cell microstructure and the
growth of vascular tissue in leaves. The results show that BF-1 had the better effect
over the size of starch grains and show a tendency to recovery the vascular structure
comparing with the others biotechnologies formulations and nutritional management.
1
I. INTRODUCCIÓN
La citricultura es una de las actividades más importantes dentro de la fruticultura en
México; para la cual, se han destinado más de 550 mil hectáreas distribuidas en 24
estados de la república (SAGARPA, 2014). Entre los cítricos de importancia nacional
se encuentran: la naranja, la cual ocupa el 67% de la superficie sembrada, seguido
por el limón mexicano con 20% de la superficie citrícola, limón persa 7%, toronja 3%
y mandarina 3% (SAGARPA, 2012). Siendo el cultivo del limón mexicano uno de los
más significativos por su importancia económica, con una producción de 1,
007,037.21 t sembradas en 22 estados (81,221.90 Ha) (SIAP, 2013).
El cultivo de los cítricos representa un beneficio para más de 67 mil familias, genera
un aproximado de 70 mil empleos directos y 250 mil indirectos (DOF-SEGOB, 2009)
en el campo, empacadoras, industria, transporte y comercializacion de frutos o
subproductos. No obstante, al igual que otros cultivos, los cítricos tienen una
población de microorganismos que se le asocian produciendo diversas
enfermedades, cuya incidencia afecta tanto la cantidad como la calidad del producto
(Rivera-German, 2000). Entre los agentes etiológicos más comunes se encuentran
virus, hongos y bacterias, siendo este último el de mayor relevancia en los últimos
años. Durante el 2009, en Yucatán se detectó por primera vez la presencia de la
enfermad Huanglongbing, considerada como la enfermedad más grave y
devastadora de los cítricos en el mundo (da Graça, et al., 2004; Gottwald, 2010),
incluso mayor a la tristeza de los cítricos (Halbert, 1999).
El Huanglongbing es causado por bacterias relacionadas con el género Candidatus
Liberibacter. A la fecha se conocen tres especies: Candidatus Liberibacter africanus,
considerada la menos severa, restringida en cuanto al espacio geográfico y sensible
al calor (27°), Candidatus Liberibacter asiaticus, considerada como severa, resistente
a climas cálidos (30°-35°) y con mayor extensión geográfica (da Graça, et al., 2004) y
Candidatus Liberibacter americanus, la cual es cercana al tipo asiático en cuanto a la
expresión de síntomas y severidad, pero menos tolerante al calor (Gottwald et al.,
2007).
2
Actualmente no se conoce cura para la enfermedad, por lo que los árboles infectados
disminuyen su producción y mueren. No obstante, se ha reportado que el empleo de
agentes nutricionales y agentes biológicos inducen la expresión de sistemas de
defensa SAR e ISR (por sus siglas en ingles), ayudando a disminuir la concentración
de CLas, severidad de síntomas y mantener la producción en cítricos dulces (Ahmad
et al., 2011; Xia et al., 2011; Shen et al., 2013;).
El empleo de agentes nutricionales, hormonas de origen vegetal e inductores bióticos
(microrganismos), desencadenan respuestas microestructurales en la formación de
nuevo tejido que suponen un mejoramiento en la arquitectura del sistema vascular,
desarrollo del fruto y respuesta contra el ataque de patógenos (Guardiola, et al.,
1992; Narayanasamy, 2008; McKenzie, et al., 2011).
El presente trabajo de investigación tuvo como objetivo analizar histopatológicamente
árboles de limón mexicano infectados por Candidatus Liberibacter asiaticus posterior
a la aplicación de formulaciones biotecnológicas, mediante el análisis de la
microestructura.
3
II. ANTECEDENTES
CITRÍCOS A.
1. Aspectos generales del limón mexicano
El limón mexicano (Citrus aurantifolia Swingle), también conocido como west indian o
key lime, pertenece a la familia de las rutáceas y al género Citrus; cuyo término
común cítrico, es designado a las especies de grandes arbustos o arbolillos perennes
(entre 5 y 15 m). Los frutos procedentes de este género poseen un alto contenido en
vitamina C y ácido cítrico, el cual proporciona un sabor característico (Sandoval-
Rincón et al., 2011).
El limón mexicano requiere temperaturas entre 22° y 28° para su desarrollo. En las
zonas cálidas, el tiempo que va de la floración a la maduración del fruto es más corto
que en las zonas frescas y frías. Requiere lluvias moderadas, entre mil doscientos y
dos mil milímetros al año. Los mejores resultados se obtienen en suelos francos,
arenosos y profundos, con buena humedad (SIAP, 2014).
Su origen se remonta a la India, de donde se dispersó a otras regiones del mundo.
Se cultiva en las regiones tropicales, subtropicales y semitropicales del planeta. Los
principales países productores son la India, México, Egipto y los países caribeños.
Se ha adaptado muy bien y convertido en silvestre en el sur de Florida (en zonas
costeras, áreas boscosas) y en la América tropical (Canche Mis, 2007).
2. Importancia económica internacional y nacional
La agroindustria de los cítricos ha colocado a México en un lugar privilegiado en el
mundo; a la fecha, es el quinto productor de cítricos en general de mayor importancia
y el segundo lugar como productor de limas y limones en el mundo con una
producción anual de 2, 147,740 t anuales (FAO, 2013), contribuyendo con el 14.5%
de la producción de este cultivo en el mundo (Rivera-Cabrera, et al., 2010). Los
principales estados productores de limón mexicano son Michoacán (516,540.62 t),
Colima (262,730.24 t), Guerrero (73662.61 t) y Oaxaca (82339.86 t) (SIAP, 2013 t).
4
3. Enfermedades de los cítricos
Al igual que otros cultivos, los cítricos son afectados por diferentes enfermedades.
En México, algunas de las enfermedades más importantes son el virus de la tristeza
de los cítricos (VTC) (Figura 1 A), ocasionado por un virus de la familia
Closteroviridae, el cual provoca el declinamiento de los árboles, por lo que es
considerada una importante enfermedad económica en cítricos (Nappo, 2013); otros
ejemplos son; la antracnosis, causada por hongos del género Colletotrichum, que
propician la caída del fruto sin madurar (Figura 1 B), (Orozco, 2013); la clorosis
variegada de los cítricos, ocasionada por la bacteria limitada al floema, Xylella
fastidosa, que causa manchas cloróticos en hojas, desarrollo de pústulas gomosas,
reduce el tamaño de frutos y la calidad del jugo (Figura 1 C), (Hernández-Macías,
2013); la leprosis, causado por rhabdovirus, ocasiona la caída prematura de fruto y
manchas en los mismos que disminuyen su valor comercial (Figura 1 D); y el cancro
bacteriano de los cítricos causada por la bacteria Xanthomonas citri, que afecta
hojas, ramas, tallo y fruto, en estos últimos se reduce calidad y valor comercial
(Figura 1 E); (SAGARPA-SENASICA, 2013).
Actualmente, una de las enfermedades más desbastadoras y con mayor prevalencia
en los huertos de cítricos en el mundo es el Huanglongbing (HLB), para la cual se
han reportado pérdidas de un 30 hasta el 100% de las cosechas en un periodo entre
2 y 5 años (Iftikhar, 2014).
A B C
D E
Figura 2. Síntomas ocasionados por enfermedades de importancia nacional en
cítricos. (Fuente: SENASICA, 2013).
5
Huanglongbing B.
Huanglongbing (HLB), conocido como greening o dragón amarillo, es una de las
enfermedades más antiguas, su origen es desconocido, pero se especula que el
movimiento global y la expansión de cultivos probablemente contribuyó a la rápida
diseminación e introducción de esta enfermedad en nuevas regiones (Johnson, et al.,
2013). El primer reporte relacionado con síntomas de la enfermedad data de la India
en el siglo XVIII, posteriormente su presencia se registró en China a finales del siglo
XIX y para 1920 ya se había extendido a África del sur (da Graça, 2008). Sin
embargo, en el continente americano, se detectó por primera vez durante el 2004,
en Sȃo Paulo, Brasil (Coletta Filho, et al., 2005), posteriormente se detectó en
Florida durante el 2005 y finalmente en México durante el 2009 donde ha significado
un fuerte impacto en la citricultura nacional.
El HLB supera los daños ocasionados por el virus de la tristeza de los cítricos, una
enfermedad de importancia económica, que se ha logrado controlar principalmente
mediante programas de remplazo de árboles infectados por especies de cítricos
tolerantes. Sin embargo, para el HLB, no existe control alguno, excepto estrategias
de prevención de la enfermedad mediante la reducción de la población del insecto
vector y la eliminación de los árboles infectados para evitar nuevas fuentes de
inóculo (Albrecht y Bowman, 2008), lo cual convierte al HLB en una de las
enfermedades más peligrosas de los cítricos (Bové, 2006). El HLB afecta todas las
especies de cítricos comerciales; entre los más susceptibles se han reportado, las
naranjas dulces (Citrus sinensis), mandarinas (Citrus reticulata) y tangelos (Citrus
tangelo), mientras que, naranja amarga (Citrus arantium), toronja (Citrus paradisi),
limón volkamariana (Citrus limonia) y lima mexicana (Citrus aurantifolia) han sido
reportadas como especies moderadamente tolerantes (Miyakawa, 1980; Folimonova,
et al., 2009).
1. Agentes causales de Huanglongbing
La enfermedad de HLB se ha asociado a microrganismos del género ‘Candidatus
Liberibacter spp’, bacterias Gram negativas con doble membrana celular,
pertenecientes al grupo de α-proteobacterium, no cultivables, que limitan su
A B
C D
6
crecimiento al floema (Garnier et al., 1984; Jagoueix et al., 1994). Mediante análisis
con la reacción en cadenas polimerasa (PCR), de su región 16s rDNA, han sido
identificadas tres especies de bacterias consideradas agentes causales del HLB;
Candidatus Liberibacter africanus (CLaf) presente en África; Candidatus Liberibacter
asiaticus (CLas) en Asia y América, y Candidatus Liberibacter americanus (CLam)
presente en Brasil y Unión Americana (Bové, 2008). Además de las bacterias del
género Liberibacter, diversos estudios han señalado la presencia de fitoplasmas,
microrganismo que carecen de pared celular y que se restringen al floema (Bertaccini
y Duduk, 2009), en árboles afectados por el HLB Candidatus Phytoplasma asteris se
ha encontrado en coinfección con CLas en campos citrícolas en China (Chen et al.,
2009) y en México (Arratia-Castro et al., 2014) y Candidatus Phytoplasma
phoenicium en Brasil (Teixeira et al., 2008 b).
2. Transmisión del HLB.
El HLB puede ser transmitido por dos insectos vectores: los psilidos Diaphorina citri
Kuwayama (Figura 2 A-B) y Trioza eritrae (Figura 2 C-D); el primero es responsable
de la transmisión de CLas en Asia y América, y CLam en Brasil, mientras que, Trioza
eritrae es responsable de la transmisión de CLaf en África (Wang y Triverdi, 2013).
De forma experimental, se ha comprobado la transmisión de CLas y CLam a través
de la planta parasita Cuscuta indecora a Citrus jambhiri (limón rugoso) (Hartung, et
al., 2010). En México la presencia de Diaphorina Citri se reportó por primera vez
durante el 2002 (López-Arrollo et al., 2005), en el 2008, el insecto se encontró en
todos los estados productores de cítricos en el país (SAGARPA-INIFAP, 2011). De
forma natural, Diaphorina citri es considerada una plaga, debido a los problemas
causados al alimentarse de brotes tiernos cítricos, en los cuales, inyecta toxinas que
anulan el crecimiento de los brotes (Michaud, 2004); sin embargo, al ser un
hospedante natural de CLas, el cual puede adquirirlo durante su estado de ninfa y
albergarlo en el sistema reproductivo, músculos, glándulas salivales y hemolinfa
(Ammar et al., 2011), se le ha considerado como un fuerte riesgo en la dispersión del
HLB.
7
3. Síntomas del HLB en cítricos.
Los árboles responden contra la bacteria a través de un amplio espectro de
reacciones fisiológicas que resultan en diversos síntomas, entre los más particulares
se encuentran el alargamiento y acorchamiento de las nervaduras centrales o
laterales de las hojas y un moteado clorótico irregular (Figura 3 B) (Teixeira et al.,
2008a), estos síntomas se caracterizan por tener un comportamiento sectorial
(Figura 3 A) (Gottwald, et al., 2007). Conforme la severidad de los síntomas
incrementa, la producción se reduce desde un 30% hasta el 100% en las ramas
sintomáticas, debido al aborto de fruto (Gottwald, 2010), por otro lado, se ha
reportado la reducción de la calidad del fruto en cítricos dulces que permanece en los
árboles, los cuales presentan menor tamaño, aborto de semilla (Figura 3 C-D),
cambios en acidez y ºBrix (Bassanezi, et al., 2009). Así mismo, se ha comprobado,
que el periodo de producción de fruto es afectado; mientras que en árboles jóvenes,
la producción se ve reducida en un periodo máximo de cuatro años, los árboles más
grandes llegan a sobrevivir hasta diez años después de la aparición de los primeros
síntomas (Bassanezi y Bassanezi, 2008). CLas puede alojarse en la zona radicular
de los árboles infectados, provocando la disminución tanto de raíces secundarias
Figura 3. Transmisión en la naturaleza del HLB a través de insectos
vectores A y B -Estado ninfa y adulto de Diaphorina citri, respectivamente. C
y D- Estado ninfa y adulto de Trioza eritrae.
.
A B
C D
8
A B
C D E
como del almidón de reserva (Johnson, et al., 2013). En árboles de limón mexicano
afectados por el HLB se ha reportado la disminución del rendimiento y una elevada
expresión de los síntomas desde un 50% hasta el 100% en follaje de la copa, así
mismo, se han observado cambios en los frutos provenientes de ramas sintomáticas,
como, disminución en peso, aborto de semilla y aumento en el contenido de ácido
ascórbico (Robles -Gonzáles, et al., 2013).
4. Cambios fisiológicos en cítricos inducidos por CLas
Una de las características de los cítricos dulces afectados por el HLB, es el profundo
cambio en el metabolismo de la planta, como la biosíntesis de carbohidratos, entre
ellos el almidón, una molécula de reserva de energía en plantas, que se encuentra
presente en hojas y en raíz en donde se almacena hasta su empleo (Preiss, 2007).
Análisis realizados en árboles de naranja dulce (Citrus sinensis) infectados por CLas,
mostraron la ausencia de almidón en raíz y la acumulación en exceso del
carbohidrato en todas las células del follaje sintomático (Etxeberria, et al., 2009); este
comportamiento ha sido atribuido a cambios en la regulación transcripcional de
Figura 4. Síntomas de HLB en follaje y fruto en naranja dulce. A,
Comportamiento sectorial de la enfermedad; B, moteado clorótico irregular. C,
Cambio en el tamaño de fruto; D y E, aborto de semillas y deformación de
fruto. (Fuentes: Gottwald et al., 2007; Wang & Triverdi, 2013).
9
genes involucrados en la producción de enzimas de síntesis de almidón, tales como,
ADP glucosa fosforilasa, la cual, regula la degradación de glucosa fosfato a glucosa,
principal sustrato para la formación de almidón; almidón sintasa y almidón sintasa
unida al gránulo, enzimas que transforman la glucosa y forman los gránulos de
almidón; enzimas ramificadoras de almidón; α- amilasa y α-glucano (Albrecht y
Bowman, 2008; Kim, et al., 2009; Martinelli, et al., 2013). Así mismo, se ha reportado
el incremento de sacarosa y glucosa en naranja dulce (Fan, et al., 2010); ambos
carbohidratos al aumentar su concentración, actúan como señalizadores que
intervienen en la expresión de genes involucrados en fotosíntesis y desarrollo de las
plantas (Albrecht y Bowman, 2008), este incremento se ha relacionado con la
disminución de genes que codifican proteínas claves en el proceso de fotosíntesis;
tales como, proteínas del fotosistema II-5-kDa, fotosistema I-sub unidad O y Clorofila
AB (Martinelli et al., 2013). De igual manera, se han reportado amplias variaciones en
la expresión de genes relacionados con otros procesos metabólicos, por ejemplo,
aumento de genes involucrados en la biogénesis y organización celular, el
incremento de 1-4-β-glucanasa, una enzima clave en la extensión de la pared celular
(Albrecht y Bowman, 2012); así como variaciones en la expresión de genes
asociados a la respuesta de defensa, disminución de transcriptomas asociados a la
regulación de rutas metabólicas de jasmonatos y etileno (Albrecht y Bowman, 2008;
Aritua, et al., 2013), incremento en precursores de peroxidasas, disminución de
quitinasas e incremento de proteínas de defensa PR1 (Kim, et al., 2009), e
incremento de transcriptomas de proteínas propias del floema, como lectinas
especificas del floema PP2 (Albrecht y Bowman, 2008) y de genes relacionados con
la síntesis de calosa (CALS), un polisacárido que en condiciones de estrés en la
planta actúa como barrera (Chen y Kim, 2009), ambos elementos han sido
reportados como causa principal del bloqueo de fotoasimilados del floema, en cítricos
infectados además de estar ligados al desarrollo de síntomas (Achor, et al., 2010) .
5. Cambios histológicos y estructurales.
Los cítricos afectados por el HLB muestran importantes modificaciones en la
organización y estructura celular durante las etapas avanzadas de la enfermedad
10
(Folimonova y Achor, 2010). La excesiva acumulación de gránulos de almidón en
células en empalizada y células del mesófilo parenquimatoso del follaje (Figura 4 F y
G) destruye las estructuras de cloroplastos, orgánulos que desarrollan el proceso de
fotosíntesis (Yelle, et al., 1989), mientras que las estructuras del sistema vascular en
la nervadura central, se han visto afectadas por la presencia de gránulos de almidón
en parénquima del floema, parénquima del xilema y células pith (Figura 4 H). Así
mismo, se ha registrado el incremento de las capas de floema (hiperplasia) (Figura 4
H) (Folimonova y Achor 2010; Fan, et al., 2013), colapso de células de floema
cercano al xilema, incremento en el contenido de citoplasma, deformación y
desorganización de las células de fibras del floema (cambium) (Figura 4 I)
(Brodersen et al., 2014). De igual manera, los análisis de ultraestructura han
señalado el colapso de las células de acompañamiento y acumulación de callosa en
los haces vasculares, placas cribosas y plasmodesmos del floema, engrosamiento de
paredes celulares y lamela media (Figura 4 J, O) (Kim, et al., 2009; Folimonova y
Achor, 2010; Koh, et al., 2011). Por otro lado, en raíz se ha registrado la ausencia de
almidón (Figura 4 n-ñ); así como la presencia de calosa, lectinas (pp2) y la
deformación de las células (Figura 4 O). En limón mexicano, se ha observado la
presencia de almidón en grandes cantidades en parénquima del mesófilo y
esporádicamente en células del floema, así como el crecimiento de las capas del
floema (Esquivel-Chávez, et al., 2012) no obstante, el colapso del floema no es tan
evidente como en naranja dulce, este mismo comportamiento ha sido documentado
en limón rugoso (Citrus jambhiri) el cual es considerado una especie tolerante al HLB
(Fan, et al., 2012; Fan, et al., 2013).
11
Las imágenes de la primera fila señalan la estructura normal de un árbol no infectado, (A), hoja sana
de limón mexicano; (B) zona laminar formado por parénquima y mesófilo (flechas rojas); (C) cilindro
vascular sano, formado por células del esclerénquima (Primer anillo celular), Floema (flecha roja),
Xilema (células centrales); (D-E) células del floema. Las imágenes de la segunda fila muestran
cambios en los tejidos de follaje afectado por HLB (F-J), (F) hoja con moteado clorótico irregular
síntoma característico del HLB; (G) Exceso de almidón (flechas rojas) en las células del mesófilo y
parénquima; (H) Incremento de la zona del floema (flecha roja); (I), Colapso del floema y la posible
presencia de calosa (zonas oscuras); (J) Deformación de las células del floema y las células
acompañantes. La última fila presenta las diferencias entre una raíz sana (K-M) y una raíz enferma (N-
O), (K) Muestra el oscurecimiento de la zona de corteza, floema y médula, debido a la reacción del
yodo ante la presencia de almidón, lo cual se confirma en las imágenes L y M, así mismo se observa
en las imágenes de la raíz N y Ñ, la ausencia de almidón en las células del floema, mientras que en la
imagen O, señala la presencia de calosa y la deformación de la estructura celular.
6. Distribución de HLB en México
La primer detección del HLB en México fue en julio del 2009, al confirmarse por
primera vez la presencia de CLas en la localidad de El cuyo en el municipio de
Tizimín, en el estado de Yucatán. En este mismo año la enfermedad se dispersó
A B C D E
F G H I J
K L M N Ñ O
Figura 5. Cambios histopatológicos en cítricos dulces afectados por el HLB.
12
rápidamente a los estados de Quintana Roo, Jalisco, Nayarit. En el 2010 los estados
de Campeche, Sinaloa, Colima y Michoacán resultaron positivos a la presencia de la
bacteria, de igual manera en el 2011 se sumaron los estados de Baja california Sur,
San Luis Potosí, Hidalgo y Chiapas, en el 2012 en Tabasco, en Zacatecas, Puebla y
Guerrero en el 2013, durante el 2014 Oaxaca resultó positivo al HLB (Figura 5),
(SENASICA, 2014)
7. Alternativas para contrarrestar la enfermedad del HLB de cítricos
Debido a las cuantiosas pérdidas económicas que han generado los daños
ocasionados por CLas, el gobierno mexicano ha implementado la campaña
fitosanitaria “Todos contra el HLB de los cítricos”, en la que ha invertido 86 millones
de pesos (Huerta, 2013), principalmente en la compra y aplicación de insecticidas,
con la finalidad de disminuir la población del insecto vector Diaphorina citri; sin
embargo el efecto de estos productos ha sido reducido debido al desarrollo de
resistencia por parte de Diaphorina Citri (Tiwari, et al, 2011). Otra alternativa es la
liberación en campo de insectos depredadores como Tamarixia radiata,
Figura 6. Mapa de distribución del HLB en México. El color verde señala los
estados con ausencia del HLB, el color rojo indica la presencia del HLB en
cítricos y psilidos; el color rosa señala la presencia de HLB solo en psilidos
(SAGARPA-SENASICA, 2014).
13
Chrysopperla y Anagyrus kamali (Arredondo-Bernal, et al., 2011). Pocos son los
estudios dirigidos hacia el control de la bacteria mediante la aplicación de
antibióticos, fitohormonas, agentes inductores de resistencia y programas de
mejoramiento nutricional de manera individual o en forma conjunta. Shokrollah y
colaboradores en 2010 reportaron el incremento del grosor de la pared celular y el
aumento de compuestos fenólicos con la aplicación tratamientos químicos y ácido
giberélico, de igual manera, se ha reportado que la aplicación foliar de nutrientes
como Mn, ZN, Boro y ácido salicílico durante un tiempo prolongado tienen un efecto
atenuador en los síntomas del HLB, además de mantener la productividad del árbol
por un periodo mayor e inducir la respuesta de los sistemas de resistencia (Shen, et
al., 2013), asimismo, se ha señalado que elevadas concentraciones de Zn mejoran
el desarrollo de las plantas infectadas e incrementan el desarrollo del xilema y el
sistema de transporte, lo cual reduce la concentración de gránulos de almidón y
polifenoles en la hoja, repercutiendo en la mejora del transporte de foto-asimilados;
sin embargo, estudios similares con manejo de micronutrientes como N, P, K,
durante un corto tiempo, señalan que no hay diferencias significativas entre la
concentración de la bacteria, producción de fruto y mejoramiento de síntomas,
variando únicamente el tamaño de la fruta entre los tratamientos (Gottwald, 2012).
Por otro lado, existe un amplio rango de plantas que producen una variedad de
metabolitos secundarios tóxicos que actúan como antagonistas de patógenos y
plagas los cuales han sido empleados para el control de diversas enfermedades en
numerosos cultivos (Zavaleta-Mejía, 1999; Lauzardo, et al., 2007). Entre los
compuestos más abundantes y con mayor espectro se encuentran los fenoles,
terpenos, alcaloides, lectinas y polipéptidos siendo diversos sus mecanismos de
acción ya sea por inhibición enzimática o competitiva, rompimiento de membranas y
formando canales iónicos sobre las membranas celulares de las bacteria (Cowan,
1999).
Defensa en plantas C.
En la naturaleza las plantas están rodeadas de una amplia variedad de enemigos
que incluyen bacterias, virus, nematodos, insectos, entre otros. Debido a esto, las
14
que les permite protegerse a sí mismas. Para esto, es necesaria la producción de
compuestos orgánicos, conocidos como metabolitos secundarios, los cuales se
dividen en tres grandes grupos químicos: terpenos, compuestos fenólicos y
compuestos nitrogenados. Algunos compuestos antimicrobianos son sintetizados
antes del ataque del patógeno, mientras que otros, son formados una vez que el
patógeno ha iniciado la infección dentro de la planta, en estos últimos, se activan
complejas redes de señalización, en las cuales interviene el ácido jasmónico y el
ácido salicílico. Una de las primeras respuestas ante el ataque de un patógeno es la
respuesta de hipersensibilidad, en la cual, la células rodean rápidamente el sitio de
infección, privando al patógeno de los nutrientes y previniendo su dispersión, a esta
respuesta le precede la producción de especies reactivas al oxigeno (ROS, por sus
siglas en inglés), que básicamente son compuestos tóxicos formados por la
reducción de oxígeno, incluye el anión súper oxido (O2-), peróxido de hidrógeno
(H2O2) y el radical hidroxilo OH. Los radicales hidroxilos son fuertes oxidantes que
inician una cadena de reacciones con una amplio rango de moléculas y enzimas.
Otra respuesta de defensa es la formación de enzimas hidrolíticas como
glucanasas, quitinasas conocidas como proteínas de defensa PR, estas moléculas
forman parte de los mecanismos de resistencia constitutiva, los cuales operan de
forma constante y de los mecanismos de resistencia inducida, que son expresados
frente a una alteración externa (Taiz y Zeiger, 2002).
1. Inducción de defensa en plantas
Las plantas reconocen y responden a moléculas de varios tipos de microrganismos,
incluyendo a factores de virulencia patogénicos y no patogénicos. Esta resistencia
es expresada localmente en el sitio de ataque y posteriormente en las partes no
infectadas de la planta (Mauch y Métraux, 1998); y puede ser activada por una
variedad de compuestos orgánicos e inorgánicos, químicos, bacterias, virus,
nemátodos y herbívoros (conocidos como elicitores). La actividad de los agentes
inductores no se debe a una respuesta antimicrobiana en sí o por su capacidad para
transformarse en agentes antimicrobianos (Mauch y Métraux, 1998), si no en la
capacidad que poseen para desencadenar un sinnúmero de respuestas asociadas a
15
cambios fisiológicos y morfológicos en la célula, por esta razón, la inducción de
resistencia es una estrategia atractiva para la protección de plantas contra un amplio
espectro de patógenos. Los tipos de resistencia en plantas usualmente se divide en
dos: resistencia sistemática adquirida (SAR por sus siglas en inglés), y resistencia
sistemática inducida (ISR por sus siglas en inglés), la diferencia entre ambos tipos de
resistencia radica en la naturaleza del inductor y las vías de señalización que sigue
cada uno (Gómez y Reis, 2011). El sistema SAR es activado en respuesta a la
infección por patógenos o por aplicación de compuestos químicos, esta respuesta va
desde la respuesta hipersensible de una sola célula hasta lesiones necróticas en
la plantas causando la muerte célula, por otro lado, la colonización por
rizobacterias promotoras del crecimiento activan el sistema ISR. SAR es regulado
por procesos dependientes de ácido salicílico (AS) (Gaffney, et al., 1993), mientras
que, ISR es regulado por rutas metabólicas dependientes de jasmonatos y etileno
(Pieterse, et al., 2003).
2. Resistencia sistémica adquirida (SAR)
El SAR se caracteriza por ser una respuesta de resistencia de amplio espectro y
duración, la activación de SAR está acompañada de un incremento de SA (ácido
salicílico) local y sistémico. Un requerimiento necesario para la activación de la SAR
es el estímulo de una respuesta hipersensitiva (RH) o de la muerte celular causada
por la acción del patógeno (Camarena-Gutiérrez y Torre-Almaraz, 2007). El
engrosamiento de las paredes celulares en las células cercanas a la zona de RH, por
la incorporación de proteínas estructurales o lignina, deposición de calosa y la
inducción de síntesis de fitoalexinas son las principales respuestas de SAR mientras
que en zonas distantes (no infectadas) toma lugar la síntesis de las proteínas de
defensa (PR) (Sha, et al., 1999).
3. Resistencia sistémica inducida (ISR)
La ISR es activada por la presencia de moléculas sintéticas en los órganos de las
plantas o por la imitación de la presencia de fitopatógenos, Van Loon y
colaboradores (1999), observaron que la colonización de raíces de plantas por
16
bacterias promotoras del crecimiento (PGPR por sus siglas en inglés) inducían la
activación de un mecanismo de defensa fenotípicamente similar al sistema SAR;
sin embargo, a diferencia de esta última, la ISR no depende de un incremento
endógeno local y sistémico del ácido salicílico por el contrario sus rutas
metabólicas dependen de señalizaciones lideradas por etileno (ET) y ácido
jasmónico (JA).
Herramientas disponibles para el análisis de la microestructura de D.
tejidos vegetales
Las características morfométricas de las células como forma, tamaño y arreglos
espaciales juegan un papel importante en las propiedades mecánicas del tejido
(estructura, protección, transporte, turgencia) (Zdunek y Umeda, 2006), debido a esto
la modificación de las estructuras impactan en gran medida en el funcionamiento del
organismo, por lo cual el estudio de estas características tiene gran relevancia. En la
actualidad, la histología es utilizada en muchas áreas de la investigación
relacionadas con las funciones celulares, a partir de estas técnicas es posible
obtener información acerca de la estructura interna de las plantas, lo cual, permite el
entendimiento de la organización celular y de procesos fisiológicos (Yeung, 1999).
1. Técnicas de microscopía
En estudios fitopatológicos, una de las herramientas más importantes son las
técnicas de microscopía, las cuales permiten observar modificaciones en las células
y clasificar al agente causal de una enfermedad en las plantas (Anderson, 2013).
Existen diversas técnicas como la microscopía óptica, microscopía electrónica y
microscopía confocal; las cuales permiten realizar observaciones micro y
nanométricas de las estructuras de los tejidos vegetales. Esto puede ser
complementado con el uso de programas computacionales para realizar numerosas
mediciones entorno a la microestructura que permite obtener una apropiada
interpretación de la información contenida en la imagen (Konstankiewicz y Zdunek,
2005).
17
2. Microscopio óptico
Tiene un limitado poder resolutivo (capacidad de percibir dos puntos pequeños por
separado) y está compuesto por objetivos de 4x, 10x, 40x, que son objetivos secos
hasta 100x que es un objetivo de inmersión. La manipulación de estos objetivos
permite aumentar la capacidad de observar muestras de menor tamaño como un
objeto más grande. Este microscopio funciona a base de luz visible, y su poder de
resolución teóricamente no supera los 200 nm. Las técnicas de preparación son
rápidas y no originan variaciones en la muestra (Anderson, 2013), es utilizado
principalmente para observar estructura de células, tejidos, hongos y bacterias.
3. Microscopía confocal de barrido laser.
El uso de herramientas como la microscopía confocal de barrido laser (CLSM),
permite obtener parámetros geométricos de la estructura celular y la localización e
identificación de compuestos específicos, a partir de las imágenes obtenidas
(Pieczywek, et al., 2011). Esta herramienta se basa en el comportamiento de
absorbancia y emisión de florescencia, ya sea intrínseca o lograda por el empleo de
cromoforos específicos (Hutzler, et al., 1998). La ventaja de la microscopía confocal
es la capacidad para reproducir secciones ópticas a través de tres dimensiones 3D.
Una sección óptica contiene información de un plano focal solamente; sin embargo,
el movimiento del instrumento en distancia definidas (rango en micrómetros) a través
de la muestra permite obtener un conjunto de imágenes, esta capacidad hace posible
obtener información acerca de regiones distantes del plano focal (Dürrenberger, et
al., 2001).
4. Microscopía electrónica de barrido (MEB)
La microscopía electrónica es una herramienta importante en el estudio de la
morfología externa de tejidos, estructuras, células y órganos de las plantas (Fowke,
1995). En los últimos años se ha popularizado su empleo para el análisis de
respuestas al estrés, lo cual ha permitido observar cambios en la estructura de las
membranas celulares, que están relacionados directamente con la adaptación o
degeneración inducidos por el estrés (Vartapetian, et al., 2003). Funciona mediante
18
el uso de electrones generados a partir de una fuente emisora, en lugar de utilizar luz
visible; sin embargo, puede obtener imágenes tridimensionales, utilizando la emisión
de electrones secundarios emitidos por el espécimen. Su poder de resolución es de 3
a 5 nm (30 a 50 Â) (Facultad de ciencias agropecuarias-Cordoba, 2013). Esta técnica
en especial constituye un reto durante la preparación de las muestras biológicas,
puesto que se someten a altas presiones y temperatura ambiente razón por la cual
las muestras deben de someterse a un proceso de deshidratación y posteriormente
deben ser cubiertos con un material conductivo (Ensikat, et al., 2010).
5. Análisis de imágenes
Actualmente existen diversas técnicas para evaluar cuantitativamente la estructura
celular obtenidas por microscopía, como lo es el análisis de imágenes, el cual
permite describir y obtener datos numéricos acerca del tamaño, forma, color y textura
de tejidos vegetales. Esta herramienta tiene la ventaja de ser precisa, capaz de
generar datos cuantitativos de las formas y los cambios estructurales que ocurren en
los tejidos por efecto de un tratamiento (Erasmus, 2004). El análisis de imagen
involucra cuatro pasos esenciales: A) Adquisición de imagen. Es la captura de una
imagen de manera digital, una buena imagen ayuda a reducir el tiempo y esfuerzo
durante el proceso de análisis, siendo la iluminación un factor importante. Otro factor
importante es el tipo de sensor utilizado para convertir imágenes a su forma digital,
siendo las cámaras con dispositivo de carga (CCD por sus siglas en inglés) los más
utilizados para estimar propiedades y características físicas de los materiales
biológicos. B) Pre-tratamiento: Generalmente las imágenes capturadas tienen alguna
clase de ruido que disminuye la calidad de la imagen y estropea la información a lo
largo del proceso, por lo que deben someterse a un proceso de depuración. El
propósito del pre-tratamiento es mejorar la información de la imagen y adecuarla
para una aplicación en específico. C) Segmentación de imágenes. La separación de
información en una imagen es un reto debido a la riqueza visual de la imagen, esto
puede lograrse con la herramienta threshold, la cual, permite separar los elementos
de una imagen, siempre y cuando la información de fondo se distinga de la sección
de interés en la imagen. D) Extracción de parámetros. Una vez que la imagen ha sido
19
segmentada, es posible obtener información descriptiva mediante la medición de
algunas de sus propiedades como forma, tamaño, color y textura (Du y Sun 2004).
20
III. JUSTIFICACIÓN
Para México, la citricultura es una actividad de gran importancia, siendo una fuente
de empleos e ingresos económicos razón por la cual representa un segmento
económico fundamental en la agricultura. Actualmente, más de 530 mil ha de
cítricos distribuidas en el país enfrentan a una de las enfermedades más
destructivas de este cultivo en todo el mundo, el Huanglongbing (HLB), hasta el
momento no se ha reportado un tratamiento capaz de inhibir totalmente el progreso
de la enfermedad. En México, el plan de manejo del Huanglongbing contempla
como principal estrategia la aplicación de insecticidas para controlar la dispersión del
insecto vector y la eliminación de árboles enfermos, no obstante estas estrategias
han sido poco efectivas para el control del HLB; por otro lado, algunos trabajos en
diferentes países han abordado estrategias de aplicación de tratamientos
nutricionales e inductores de resistencia en cultivos enfermos, logrando obtener
resultados l imi tados en cítricos dulces, una estrategia similar se ha
implementado en cítricos de importancia nacional de manera conjunta por CIIDIR-
IPN Unidad Sinaloa y las compañías mexicanas Greencorp y Frutech Innternational.
De dicha acción nace el proyecto general que tiene como objetivo generar una
estrategia para el control de Candidatus Liberibacter asiaticus; no obstante, poco ha
sido documentado sobre la progresión de la patología bajo este esquema de trabajo
en cítricos agrios, como el limón mexicano. Con base en los antecedentes, se
considera importante conocer el comportamiento de la enfermedad desde el punto
de vista histopatológico en limón mexicano después de la aplicación de
formulaciones biotecnológicas.
21
IV. HIPÓTESIS
Existe un cambio histológico favorable en árboles de limón Mexicano infectados con
Candidatus Liberibacter asiaticus posterior a la aplicación de formulaciones
biotecnológicas.
V. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL A.
Analizar histopatológicamente árboles de limón Mexicano infectados por Candidatus
Liberibacter asiaticus posterior a la aplicación de formulaciones biotecnológicas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS B.
1. Determinar la relación entre la concentración de Candidatus Liberibacter
asiaticus y la acumulación de almidón en hoja, posterior a la aplicación de
formulaciones biotecnológicas.
2. Analizar cambios histológicos en follaje de árboles de limón mexicano en
malla sombra posterior a la aplicación de formulaciones biotecnológicas.
3. Determinar cambios histológicos en follaje y raíz de árboles de limón
mexicano en campo durante la aplicación de formulaciones biotecnológicas.
22
VI. MATERIALES y MÉTODOS
El presente trabajo forma parte del proyecto integral “Desarrollo de un paquete
biotecnológico para el manejo efectivo del Huanglongbing (HLB) y su transferencia al
sector citrícola nacional”, cuya finalidad es la evaluación de formulaciones basadas
en microorganismos y extractos vegetales para el control de la enfermedad del HLB
en cítricos. El proyecto general, se desarrolló a través de tres módulos: A) Detección
y cuantificación del agente causal del HLB; B) Análisis bioquímicos y C) Análisis de
cambios estructurales; mediante los cuales se evaluó la efectividad de las
formulaciones biotecnológicas en cítricos de limón mexicano afectados por el HLB en
malla sombra y posteriormente en campo.
Diseño experimental en huerto malla sombra A.
La etapa de evaluación en cítricos de malla sombra se realizó en una parcela de
7,580 m2, protegida con una estructura de malla antiafidos tipo casa sombra, en la
localidad de Tecomán, Colima. El estudio se realizó en árboles de cuatro años de
edad establecidos en un sistema rectangular de 7 x 8 m, con un diseño
experimental de bloques completos al azar, que consto de cinco tratamientos con
tres repeticiones (Figura 6) aplicados mediante aspersión foliar. Los tratamientos
constaron de tres formulaciones biotecnológicas (F-B1, FB-2 y FB-3), un manejo
nutricional (MN) y la aplicación alternada de todos los tratamientos (alternancia).
Con base en los resultados obtenidos en el módulo de cuantificación de bacterias,
se seleccionó un total de quince árboles representativos (Cuadro 1). Por cada
tratamiento se analizaron tres árboles después de 8 meses (240 días) de aplicación
de las formulaciones biotecnológicas.
23
Cuadro 1 Concentración de Candidatus Liberibacter asiaticus en árboles seleccionados 240 DPA.
Tratamientos Número asignado al árbol en campo
Células CLas/100ng de DNA 240 DPA
Manejo nutricional
75 3,117.02
14 1,419.92
68 3,435.90
BF1
124 734.24
59 1,756.68
91 74.58
BF2
56 2,914.78
135 3,359.20
42 2,337.51
BF3
97 1,127.18
38 8,843.04
138 1,797.70
Alternancia
6 3,939.67
88 4,318.67
119 7,295.98
Figura 7. Esquema del huerto experimental en malla sombra. El experimento
se dividió en tres bloques al azar. Cada color representa un tratamiento. Manejo
nutricional (anaranjado); formulación biotecnológica uno (FB-1) color verde;
formulación biotecnológica dos (FB-2) color amarillo, formulación biotecnológica
tres (FB-3) color rojo, alternancia color lila y manejo convencional en color azul.,
cabe señalar que el tratamiento convencional no se tomó en cuenta el presente
estudio.
24
Cuadro 2. Contenido de las formulaciones biotecnológicas
Diseño experimental en campo B.
La segunda etapa del experimento se desarrolló en una plantación de cítricos de
10,000 m2 con cuatro años de edad en campo abierto, en un sistema rectangular con
5.0 m entre árboles y 7.0 m entre hileras (Figura 7). El experimento consistió de
cuatro tratamientos en un diseño de bloques al azar, cabe señalar que las
formulaciones seleccionadas fueron aquellas que mostraron mejores resultados en
los tres módulos del proyecto general durante la fase de malla-sombra. Por cada
tratamiento se eligieron tres árboles, siendo seleccionados un total de 9, los cuales
se analizaron antes de la aplicación los productos (T0) y 60 días después (T1).
Tratamientos Inductor de resistencia Agentes
antimicrobianos Agentes de crecimiento
Manejo nutricional
K, Ca, Cu, S, B, Silicatos y poli fenoles entre otros)
FB-1 Aromáticos jasmonicos, y complejos multienzimaticos.
Inhibidores de α-amilasas, terpenos, ácido linoleico (omega 3).
Complejos multivitamínicos y sales minerales.
FB-2
Esporas de Bacillus spp, extractos de plantas; Equinacea angustifolia, flores de hibisco, Mimosa tenuiflora.
Aceite de Lippia graveolens, extracto de semillas de Citrus paradisiaca y quitosano hidrolizado.
FB-3
Silicato de potasio (análogo de ácido salicílico), polifenoles, taninos, metabolitos secundarios de fermentación, extractos de algas marinas.
Terpenoides, alcaloides, ácido carboxílico, citosinas, Polisacaridos totales.
Vitaminas, aminoácidos esenciales y Auxinas.
Alternancia Aplicación alternada de cada uno de los tratamientos.
25
Extracción de DNA mediante el método CTAB C.
Se escindió la nervadura central de las hojas en pequeños trozos, posteriormente
el tejido se liofilizó a una temperatura de -80°C durante 24 h, y se colocó en tubos
de microcentrífuga de 1.5 ml con dos balines de acero inoxidables y se maceró en
el equipo TissueLyser II de Qiagen con una frecuencia de 30 GHz durante 1.5
min, dos veces. Se pesó 0.02 g del polvo liofilizado, en tubos de 1.5 ml,
posteriormente se adicionaron 800 µl de buffer CTAB al 3% (previamente
calentado a 60 °C), a continuación, las muestras se incubaron a 60 °C durante 30
min, agitando por inmersión cada 5 min, una vez concluida la incubación se
añadieron 600 µl cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), se agitó vigorosamente y
se centrifugó. Posteriormente el sobrenadante se colocó en un nuevo tubo de
micro centrifuga con 20 µl de RNAsa (20 mg/ml) e inmediatamente después las
muestras se incubaron a 37 °C durante 10 min, al terminar el periodo de
incubación, se adicionaron 600 µl de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) a una
temperatura de -20 °C. Posteriormente las muestras se agitaron vigorosamente y
se centrifugaron nuevamente a 15.6 g durante 10 min, posteriormente, se
recuperaron 500μL de sobrenadante en un tubo de microcentrifuga nuevo y se
Figura 8. Huerto experimental en campo. FB-1 color lila; FB-3 color amarillo;
GC-Frutech (manejo nutricional) color naranja, manejo convencional color azul.
Cabe señalar que en el presente estudio solo se tomaron en cuenta las dos
formulaciones biotecnológicas anteriores y el manejo nutricional.
26
agregó un volumen igual al recuperado de isopropanol al 100% a una temperatura
de -20 °C para precipitar el DNA. Las muestras se centrifugaron a 15.6 g durante 8
min, se eliminó la fase acuosa por decantación y se realizó el lavado de la pastilla
formada en el paso previo (la cual contiene el DNA), agregando 1000 µl de etanol
al 70% y centrifugando durante 4 minutos a 15.6 g. El sobrenadante fue
decantado y la pastilla se dejó secar. Finalmente el DNA se resuspendió en
100 µl de agua ultrapura y se almacenó una temperatura de -20 °C.
Cuantificación de DNA D.
La cuantificación se realizó en un espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000, que
además de valores de concentración, también expone los valores 260/280
(DNA/proteínas) y (260/230) los cuales aportan información sobre la pureza del
DNA.
Electroforesis en gel de agarosa E.
Se analizó la integridad del DNA total, en un gel de agarosa al 0.8%, disolviendo 0.8
g de agarosa en 250 mL de TAE 0.5X por calentamiento en microondas durante 2
min, posteriormente se dejó enfriar y se vertió en la cámara de electroforesis. Para
la visualización de la muestra de DNA, se cubrió el gel con TAE 0.5X y cada pozo
se cargó con 2 µl de la muestra de DNA más 8 µl de colorante GelRed (GelRedTM
Nucleic Acid Gel Stain) para teñir el DNA. Posteriormente se aplicó corriente de
75 voltios de 30 a 40 min. El DNA se visualizó en un trans iluminador de luz
ultravioleta (Chemidoc, Biorad).
Detección de Candidatus Liberibacter asiaticus por PCR convencional F.
Para la detección de Candidatus Liberibacter asiaticus, se realizó un ensayo de PCR
convencional basado en la amplificación del operon B utilizando primers específicos
A2 (5 ’-TATAAAGGTTGACCCTTTTCGAGTTT- 3’) y J5 (5’ACAAAAGCAGA-
AATAGCACGAACAA-3’) que amplifica un fragmento de 703pb (Hocquellet, 1999).
La reacción de PCR se realizó en tubos de microcentrifuga de 0.2ml, con un volumen
final de mezcla de 25 µl, formado por 1x de buffer de reacción, 2mM de MgCl2,
0.2mM de nucleótidos trifosfatados (dNTP´s), 0.2mM de oligonucleótidos (A2,J5), 1
27
unidad de Taq DNA polimerasa (INVITROGEN) y 100 ng de DNA molde. Para la
amplificación de los ácidos nucleicos, los tubos eppendorf con las muestras se
colocaron en un termociclador automático bajo las siguientes condiciones de
amplificación: 94 °C durante 2 min en la etapa de desnaturalización inicial y 35 ciclos
de 94 °C por 30 s, 62 °C por 30 s, 72 °C por 1 min, un ciclo final de extensión 72 °C
por 10 minutos y 13 °C por tiempo indefinido. El producto final de PCR se visualizó
mediante geles de agarosa al 1%.
Cuantificación absoluta de la concentración de Candidatus G.
Liberibacter asiaticus por P CR en tiempo real
La detección y cuantificación de CLas se realizó conforme lo descrito previamente
(Lin, et al., 2010), mediante un sistema de diagnóstico ultra-sensible a través de la
combinación de PCR anidado y PCR Taqman®. Se empleó dos juegos de primers
específicos para CLas, un par de primers externos para la amplificación de 470 pb
y un par de primers in ternos para la ampli ficación de 170 pb, ambos
diseñados en el factor de elongación TS. La amplificación de PCR se llevó a
cabo en un volumen total de reacción de 25µL, formándose de 100 ng del DNA de
interés, 0.5 pmol del par de primer exterior, 20 pmol del par de primer interno, 10
pmol de sonda Las-P Taq Man® y Taq Man® master mixture. Las condiciones de
amplificación se conformaron por un ciclo de 50 °C x 2 min y otro de 95 °C x 10 min,
seguido por 20 ciclos a 95 °C x 30 s, 67 °C x 45 s, 72 °C x 45 s, seguido de 35
ciclos de 95 °C x 30 s, 57 °C x 45 s y 72 °C x 45 s. Las curvas de las
concentraciones bacterianas se calcularon por el programa 7500 Fast real Time
PCR System de Applied Biosystem
28
Cuadro 3. Secuencia de amplificación de los primers internos y externos, sonda TaqMan®
Primers internos
Amplicon 470 pb
Las-I-F
(5'-CGATTGGTGTTCTTGTAGCG-3') Las-I-R (5'AACAATAGAAGGATCAAGCATCT3')
Primers externos
Amplicon 170 pb
Las-O-F
(5' CGGTGAATGTATTAAGCTGAGGCGTTCC-3')
Las-O-R
(5'-TACCCACAACAAAATGAGATACACCAACAACTTC-3')
Sonda TaqMan Las-P
(5'-AATCACCGAAGGAGAAGCCAGCATTACA-3').
Preparación de muestra para análisis microscópico H.
Para determinar los cambios microestructurales en limón mexicano mediante
microscopia óptica y de fluorescencia las muestras se trataron de acuerdo al
procedimiento descrito por Peña (2010). El manejo de muestras incluyó la fijación,
deshidratación, transparentación, inclusión en parafina, desparafinación y tinción de
las muestras.
1. Fijación de muestras
La fijación tiene como propósito preservar la estructura original del tejido mediante
la reacción de las soluciones usadas con las macromoléculas que componen a los
tejidos. En el presente trabajo se empleó la solución formaldehido-ácido acético-
alcohol (FAA). El formaldehido y el alcohol contraen los tejidos, mientras que el
ácido acético los dilata preservando de esta manera la estructura celular de la
célula. El tejido foliar se sumergió en solución FAA (50 mL de etanol al 100%, ácido
acético glacial 5 mL, 10 mL formaldehido al 40% y 35 mL agua destilada) para su
fijación durante un máximo de 48 h a 72 h, a continuación, el tejido fue lavado en
agua corriente durante una hora para eliminar el fijador, y posteriormente
enjuagado en PBS (solución buffer de fosfatos pH 7). Se realizaron cortes
transversales de las secciones de interés y se colocaron dentro de casetes de
inclusión.
29
2. Deshidratación
La deshidratación de los tejidos permite que éstos sean embebidos en una matriz
de soporte (por ejemplo parafina) para su manipulación, debido a que la mayoría
de los medios para embeber son hidrofóbicos, por lo que el agua debe ser
removida de las muestras. En el presente trabajo se empleó la deshidratación
seriada en alcohol. El tejido dentro del “casete” de inclusión se deshidrató
sumergiéndolo en diluciones seriadas de etanol desde el 25% hasta el 100%
durante 30 min en cada solución, a excepción de la última, en la que se sumergió
durante 60 min.
3. Transparentación e inclusión
La transparentación de los tejidos permite obtener un mayor contraste de las
estructuras y una correcta tinción de ellas, en el caso de las muestras vegetales es
importante la eliminación de la clorofila, razón por la cual los “casete” se introdujeron
en series de etanol-xilol 3:1, 1:1, 1:3 y xilol absoluto durante 20 min en cada
solución. Al terminar el proceso de transparentación los “casetes” se colocaron en
una solución de parafina – xilol (3:1) durante toda la noche a 60 °C (máximo de 12
h), posteriormente la solución de parafina-xilol se remplazó por parafina pura y se
incubó a 60°C durante 2 h. Los bloques de parafina se realizaron en el equipo de
inclusión KD-BM II Tissue embedding system. Posteriormente los bloques se
enfriaron en un plato frio KD-BL cooling plate. A continuación se realizaron los
cortes de parafina en un micrótomo rotatorio, con un grosor de 5-10 µm, los cortes
obtenidos se colocaron en un baño de flotación a 20 °C durante 15 min (o hasta su
extensión completa) con agar bacteriológico. Posteriormente se recuperaron con un
portaobjetos limpio y se dejaron secar a 60 °C toda la noche. Los portaobjetos se
desparafinaron en una solución de xilol absoluto, y posteriormente en etanol- xilol
(1:1), EtOH 96%, EtOH 70% y EtOH 25% respectivamente, durante 20 min por
cada solución. Finalmente el tejido se dejó secar a temperatura ambiente.
Análisis visual de almidón en follaje fresco de limón mexicano I.
Para definir de manera visual la extensión del daño causado por CLas en limón
30
mexicano, se colectó tejido sano de invernadero (CLas -) y tejido infectado de una
vareta sintomática y una vareta asintomática. Cada vareta se dividió en tres zonas,
basal, media y apical. Las hojas fueron teñidas con yodo al 0.2% durante dos
minutos posteriormente el tejido se lavó con agua destilada (Salazar, 2010). La
prueba de reacción almidón/yodo es una técnica basada en la reacción del yodo
ante la presencia de almidón mediante la formación un complejo con las micelas del
almidón que permite visualizar de manera rápida la presencia de almidón en los
tejidos (Rivera-Vejar, 2005).
Microscopía óptica para analizar cambios en la microestructura celular J.
de limón mexicano
Con la finalidad de evaluar la recuperación de la microestructura en el cilindro
vascular de árboles de limón mexicano afectados por el HLB posterior a la aplicación
de las formulaciones se realizó un estudio histopatológico mediante microscopia
óptica y tinción con los colorantes azul de metileno y fucsina básica. El azul de
metileno se une a las ligninas de la pared celular confiriéndoles una tonalidad azul-
purpura y fucsina básica tiñe los gránulos de almidón de color rojo. Para la
preparación de 25 mL de azul de metileno se pesó 0.130 g de azul de metileno y se
diluyó en una mezcla de glicerol (2.5 mL), etanol (2.5 mL), buffer de fosfato 0.1M,
pH7 (7.5 mL) y agua destilada (12.5 mL). En el caso del colorante fucsina básica se
realizó una solución madre compuesta de 0.1 g de fucsina básica en 10 mL de
EtOH, 50%, posteriormente se elaboró una solución de trabajo con 3 mL de fucsina
básica (solución madre) en 57 mL de agua destilada Ruzin, 1999.
Microscopia electrónica de barrido para observar la presencia de K.
almidón
Para determinar la presencia de almidón en el xilema, se fijó en solución FAA la
nervadura central de una hoja durante 12 h, se realizaron cortes longitudinales que
fueron cubiertos con oro en una cámara de vacío sputter durante 2 min, finalmente
las muestras se observaron en un microscopio electrónico de barrido JSM 7800f
(JEOL, Japón).
31
Detección de almidón mediante microscopía confocal de barrido láser L.
Para la detección de los gránulos de almidón en follaje se sumergió el corte de hoja
en rodamina B al 0.2% en PBS y se dejó reposar en oscuridad durante 15 min,
posteriormente el corte se enjuagó en agua destilada para eliminar el excedente del
cromóforo durante 10 s, finalmente se dejó secar a temperatura ambiente y en
oscuridad. Los cortes se observaron en un microscopio confocal de barrido laser
LSM 710 NLO (Carl Zeiss, Alemania) con los objetivos 10x/0.3; 20x/0.8, para las
imágenes en 3D se capturaron 40 cortes ópticos. Las imágenes se tomaron a una
velocidad de barrido de 5 s y promedias, el láser de excitación fue de 514 nm y 2%
de transmitancia. Las imágenes se adquirieron con el programa ZEN 2010 (Carl
Zeiss). Se capturaron alrededor de cuatro campos en color RGB y se almacenaron
en formato TIFF a 512 x 512 pixeles. Las imágenes se depuraron con el programa
ImageJ hasta solamente tener gránulos de almidón, por último, a través de la
herramienta analize particles se calculó el promedio de número de gránulos de
almidón. De las cuantificaciones obtenidas correspondiente a cada corte, se calculó
el promedio de granulo de almidón presente por µm2 (densidad) y tamaño del
gránulo.
Evaluación del cambio microestructural del tejido foliar por MCBL M.
Para determinar la estructura celular de los tejidos foliares se empleó el cromóforo
calcofluor, el cual tiene afinidad por la celulosa (enlaces β- glucano) de las paredes
celulares. Se colocó una gota del fluoróforo directamente sobre el corte y se dejó
reposar en oscuridad durante 5 minutos (SIGMA ALDRICH-Hoja de datos),
posteriormente el corte se sumergió en agua destilada durante 10 s, finalmente se
secó a temperatura ambiente y en oscuridad antes de analizarse en microscopio
confocal de barrido laser LSM 710 NLO (Carl Zeiss, Alemania) con los objetivos
10x/0.3 y 20x/0.8, un láser de 405nm de excitación para un fluorescencia en azul.
Las imágenes se adquirieron con el programa ZEN 2010. Se capturaron alrededor de
cuatro campos en color RGB y se almacenaron en formato TIFF a 512 x 512 pixeles.
32
Detección de calosa por microscopia confocal N.
Para la detección de calosa mediante microscopia confocal se empleó el cromóforo
azul de anilina debido a su afinidad por la celulosa de las paredes celulares y los
depósitos de calosa en floema, los cortes de hoja realizados se sumergieron en una
solución de azul de anilina al 1%y se dejaron reposar en oscuridad durante 5 min,
posteriormente se lavaron con agua destilada durante 10 s (Ruzin., 1999),
finalmente se dejó secar a temperatura ambiente y en oscuridad antes de analizarse
en microscopio confocal a una excitación 405 nm. Las imágenes se adquirieron con
el programa ZEN 2010. Se capturaron alrededor de cuatro campos en color RGB y
se almacenaron en formato TIFF a 512 x 512 pixeles. Para determinar la cantidad de
depósitos de calosa presentes en cada muestra, se realizó una estrategia similar a la
empleada en el análisis de cuantificación de almidón.
Análisis de imagen (AI) para obtención de parámetros morfométricos del O.
tejido foliar
Con la finalidad de detectar y evaluar cambios morfométricos en el follaje después de
la aplicación de las formulaciones se realizó el AI a las diferentes imágenes
obtenidas por microscopia confocal mediante el programa Image J. Todas la
imágenes se convirtieron del formato RGB a 8 bits y posteriormente se binarizaron y
segmentaron con la herramienta Trheshold (Tapia, et al., 2011). Para determinar el
número y el tamaño de los gránulos de almidón observados en las microgafías se
aplicó el algoritmo watershade para separar los conglomerados de almidón y
posteriormente se usó el algoritmo análisis de partículas (analize particles) para
obtener información cuantitativa de forma, tamaño y número de gránulos. De forma
similar, para obtener la cuantificación de calosa, se realizó mediante el conteo de
unidades o depósitos de calosa detectados a través del mismo algoritmo. Por otro
lado para determinar el tamaño del cilindro vascular, del xilema y del floema se
empleó el algoritmo measure para obtener el área de los respectivos tejidos.
33
Se analizaron 3 cortes por cada árbol bajo tratamiento, y de cada corte se
analizaron cuatro campos ópticos, resultando en un total de 36 imágenes
observadas por cada una de las pruebas.
Análisis estadístico P.
El análisis estadístico se realizó a partir de los datos numéricos obtenidos del análisis
de imágenes. Los datos se analizaron mediante la aplicación de análisis de varianza
(ANOVA) para detectar diferencias entre tratamientos y una prueba Tukey con una
p≤ 0.05 en el programa Statgraphics centurión XV.
34
VII. RESULTADOS Y DISCUSIONES
Acumulación de almidón en follaje de limón mexicano infectado por HLB A.
Para determinar de manera rápida la presencia de CLas y la acumulación de almidón
en el follaje, se realizó un análisis de tinción de yodo en tejido foliar no infectado de
invernadero (Figura 8) y en follaje de árboles en malla sombra infectados con CLas a
los 150 DPA, en éstos últimos se analizó una vareta sintomática y una asintomática
examinándose la parte apical, media y basal (Figuras 9 y 10). La tinción de yodo en
tejido no infectado de invernadero mostró la presencia del almidón específicamente
en el área laminar así como en las zonas cercanas a la epidermis en donde se
observó un oscurecimiento (Figura 8B-I, 8B-II), mientras que en la nervadura central
se observó de forma general un oscurecimiento ligero en floema (Figura 8C-I, C-II).
Con la finalidad de realizar un análisis previo en árboles de malla sombra infectados
con CLas se analizaron sólo dos tratamientos, manejo nutricional (Figura 9) y la
formulación FB-3 (Figura 10). Se observó que las hojas media y basal de la vareta
sintomática de manejo nutricional (Figura 9 A-C), presentaron una elevada
acumulación de almidón en la zona del mesófilo además de un oscurecimiento
moderado de las nervaduras centrales, mientras que la hoja apical se observó una
ligera acumulación de almidón, un comportamiento similar al de las varetas
asintomáticas (Figura 9 C). El análisis del tejido asintomático (Figura 9 B-D), solo
presentó un ligero oscurecimiento en la zona cercana a la epidermis de las hojas
apical y media, mientras que la hoja basal mostro un leve oscurecimiento en la zona
del mesófilo laminar (Figura 9 D). De manera similar, la vareta sintomática de la
formulación FB-3 (Figura 10 A-C), reveló una alta acumulación de almidón en la
zona del mesófilo y floema de la hoja apical, media y basal (Figura 10 C) a
diferencia del tejido asintomático el cual mostro en la zona laminar, la presencia
basal de almidón solamente en las hojas media y apical (Figura 10 D).
35
Apic
al
Me
dia
B
asa
l A
pic
al
Me
dia
B
asa
l
Ms
Ms
Ms
Ms
Ms
Ms
Ep
Ep
Ep
Ep
Ep
Xi
Fl
Xi
Fl
Xi
Fl
Fl
Xi
Xi
Fl
Xi
Fl
AI BI CI
AII BII CII
Figura 9. Acumulación de almidón en follaje de limón mexicano de
invernadero. A, Apariencia general de árboles de invernadero no infectados con
CLas (A-I y A-II). B – C, cortes transversales de hojas de la parte basal, media y
apical (la columna B representa la zona laminar, la columna C presenta la zona de
la nervadura central). Ep, epidermis; Ms, mesófilo; Fl, floema; Xi, xilema
36
Figura 11. Acumulación de almidón en follaje de limón mexicano tratado con la formulación
FB-3 en malla sombra. A, vareta sintomática. B, varetas asintomáticas. C, corte transversal de
hojas de follaje sintomático, mostrando la parte laminar (izquierda) y nervadura central (derecha). D,
corte transversal de follaje asintomático, mostrando la parte laminar (izquierda) y nervadura central
(derecha). Ms, mesófilo; Fl, floema; Xi, Xilema. La flecha blanca señala la presencia de almidón en el
tejido y los puntos azules señalan el tejido que fue seleccionado para el ensayo.
Figura 10. Acumulación de almidón en follaje de limón mexicano tratado con manejo
nutricional en malla sombra. A, vareta sintomática. B, varetas asintomáticas. C, corte
transversal de hojas de follaje sintomático, mostrando la parte laminar (izquierda) y
nervadura central (derecha). D, corte transversal de follaje asintomático, mostrando la
parte laminar (izquierda) y nervadura central (derecha). Ms, mesófilo; Fl, floema; Xi,
Xilema. La flecha blanca señala la presencia de almidón en el tejido y los puntos
azules señalan el tejido que fue seleccionado para el ensayo.
37
Detección y cuantificación de Candidatus Liberibacter asiaticus en limón B.
mexicano
Para corroborar la presencia de CLas en follaje de árboles en malla sombra
seleccionados para el análisis de acumulación de almidón se realizó la detección de
la bacteria mediante PCR convencional, la prueba se efectuó en la hoja contraria del
tejido seleccionado para la prueba de yodo. La bacteria se detectó en el tejido
sintomático en las hojas media y basal tratado con manejo nutricional y en las hojas
apical, media y basal de tejido tratado con BF-3. Sin embargo no se detectó la
presencia de la bacteria en el tejido asintomático de ninguno de los dos tratamientos
(Figura 11).
Al realizar el análisis de PCR en tiempo real, se detectó la presencia de CLas tanto
en tejido sintomático como asintomático (Cuadro 4) de ambos tratamientos. El
número de copias de CLas en las varetas sintomáticas fue elevado en ambos
tratamientos, lo cual se reflejó en valores tempranos de Ct de entre 18 y 20. En el
tejido sintomático tratado con manejo nutricional se observó una mayor
concentración de la bacteria en las hojas basal (3,163.605 células/100 ng de DNA) y
media (5,648.159 células/100 ng de DNA) mientras que el tejido apical presentó una
baja concentración de CLas (40.691 células/100 ng de DNA). De manera similar, la
formulación FB-3, presentó un elevado número de copias de CLas en tejido
sintomático en la hoja basal (9,992.702 células/100 ng de DNA), media (5,964.336
células/100 ng de DNA) y apical (10,886.746 células/100 ng de DNA).
En ambos casos se observó una relación entre las elevadas concentraciones de
CLas y los resultados de análisis de yodo donde el grado de oscurecimiento del
tejido sintomático fue evidente (Figura 9 A-C y 10 A-C). Respecto a los resultados
de las varetas asintomáticas de ambos tratamientos, se observó que solamente la
parte basal del tejido tratado con manejo nutricional resultó positiva a la presencia de
la bacteria presentando una limitada concentración de CLas (8.732 células/100 ng de
DNA), cabe señalar que el análisis visual de yodo en esta zona en particular de la
vareta presento una elevada acumulación de el almidón en comparación con el resto
del tejido (Figura 9 D basal).
38
1kb
Cuadro 4. Cuantificación de CLas mediante PCR en tiempo real
Manejo nutricional
BF-3
Estado Muestra Valor de
Ct
Células de CLas/ 100
ng de DNA
Valor de
Ct
Células de CLas/
100 ng de DNA
Sintomática Basal 20.232 3,163.605 18.521 9,992.702
Sintomática Media 19.353 5,648.159 19.279 5,964.336
Sintomática Apical 26.622 40.691 18.435 10,886.746
Asintomática Basal 28.885 8.732 ND ND
Asintomática Media ND - ND ND
Asintomática Apical ND ND ND
Figura 12. Detección de CLas en tejido foliar sintomático y asintomático de limón
mexicano mediante PCR punto final. (-): Control negativo, (1 kb): Marcado de peso
molecular, (+): Control positivo para CLas, A: Apical, M: Media, B: basal
La curva estándar presentó una pendiente del 3.39, una R2= 0.99 y una eficiencia del 97%. Los
valores de Ct obtenidos en las varetas sintomáticas de entre 18 y 20 presentaron un elevado
número de células de CLas, mientras que los valores tardíos de Ct de entre 26 y 28
presentaron bajas concentración de células de CLas. ND: No detectado.
(-) 1kb
39
Los ensayos de tinción de yodo, PCR convencional y PCR en tiempo real permitieron
detectar la presencia de la bacteria y observar su distribución en el follaje. En el
presente estudio se observó el comportamiento no homogéneo en la distribución de
CLas en limón mexicano tal como se ha reportado para cítricos dulces (Triverdi, et
al., 2009; Coletta, et al., 2010); en donde también se ha señalado la presencia de
CLas tanto en tejido sintomático de hojas maduras como en follaje joven
asintomático. Las concentraciones más elevadas de CLas se encontraron en el tejido
sintomático, Triverdi y colaboradores (2009), sugieren que los síntomas
característicos del HLB, se desarrollan una vez que CLas ha alcanzado un umbral de
concentración en el tejido de 9.17 x105 a 6.60 x 106 DNA total/equivalentes de
genoma en µg. Lo cual puede asociarse con lo observado en el presente estudio. Así
mismo los resultados sugieren que elevadas concentraciones de CLas pueden
asociarse con un alto contenido de almidón (Cuadro 4 y Figuras 9 C y 10 C),
mientras que bajas concentraciones de la bacteria, se asocian a una baja
acumulación de almidón (Cuadro 4 Figuras 9 D y 10 D). CLas es una bacteria
limitada a los tubos cribosos del floema en el sistema vascular de la planta, el cual
forma una extensa red de “conexiones” entre celulas, desde la parte foliar hasta la
zona radicular y cuya principal tarea es el transporte de fotoasimilados, por lo que la
bacteria se moviliza junto con el flujo de los fotoasimilados haciendo posible su
distribución en diferentes zonas de los árboles (Shokrollah et al., 2009).
40
Análisis de la acumulación de almidón en follaje de limón mexicano bajo C.
tratamiento en malla sombra
Con la finalidad de evaluar la efectividad de las formulaciones biotecnológicas en
árboles de limón mexicano afectados por el HLB, se determinó la concentración de
almidón 240 días después de la aplicación de los tratamientos mediante un análisis
cualitativo y cuantitativo a través de las imágenes de microscopía confocal, lo que
permitió obtener información acerca de la densidad de gránulos de almidón en un
área determinada y evaluar características morfométricas (tamaño).
Los haces vasculares del floema y xilema (Figura 12) cuyas funciones son
almacenamiento de carbohidratos y regulación del flujo hídrico (Zwieniecki y
Holbrook, 2009) son algunos de los tejidos que presentan mayor deterioro a causa
del HLB. En ellos los cambios estructurales y bioquímicos afectan la distribución de
los fotoasimilados razón por la cual el análisis de almidón se realizó en esta zona).
Para evaluar la presencia de almidón en los árboles infectados con HLB con
aplicación de los tratamientos manejo nutricional, alternancia y las formulaciones BF-
1, BF-2 y BF-3, se realizaron cortes transversales del follaje. En todos los caso se
observó la presencia de almidón en la células en empalizada (EM) y mesófilo (Ms)
(Figura 13) además en el tejido vascular (xilema/floema) se observó la presencia de
Figura 13. Estructura del sistema vascular en hoja de limón mexicano. A, Selección de la zona
basal para el análisis microscópico. B, estructura de la nervadura central. C, Diferenciación entre
células del xilema y las células pith. D, Presencia de placas cribosas en la parte central del xilema
(flecha azul) y la presencia basal de gránulos de almidón (flecha amarilla). Es, Esclerénquima; Fl,
Floema; M, medula; Xi, Xilema.
41
almidón en las células centrales del xilema, conocidas como células pith (Figura 13).
Para corrobar la presencia de los gránulos de almidón en el xilema de limón
mexicano se realizarón obsevaciones longitudinales que mostraron estructuras
helicoidales de la pared celular del xilema, traqueidas y células mediante un análisis
por microscopio electrónico de barrido (MEB) en el parenquima del xilema (Figura 14
A); asi mismo, se observó la presencia de gránulos de almidón entre las helices del
xilema secundario y dentro de las células del parénquima del xilema (Figura 14 B-C),
cabe señalar que en esta ultima sección se observó la agrupación de gránulos de
almidón bloqueando completamente la placa cribosa de la celula (Figura 14 D).
Figura 14. Presencia de almidón en follaje de limón mexicano después de 240 días de
aplicación de tratamiento y formulaciones biotecnológicas. A, Follaje sano, la presencia de
almidón (puntos rojos) no se acentuó como en tejido afectado por HLB. B, follaje tratado con
manejo nutricional. C, tejido tratado con FB-1. D, tejido tratado con FB-2. E, tejido tratado con
FB-3. F, tejido tratado con la alternancia. .Em, empalizada; Ms, Mesófilo; Es, Esclerénquima;
Fl, Floema; M, medula; Xi, Xilema.
42
Análisis de densidad y aspectos morfométricos de almidón en hoja de D.
limón mexicano 240 DPA
Una vez determinada el área de estudio para evaluar la acumulación de almidón en
el sistema vascular, se realizó la toma de imágenes del área central del xilema, por
cada tratamiento se analizó un mínimo de seis imágenes, las cuales fueron
segmentadas en el programa image J para depurar la información concerniente a la
estructura celular (Figura 15).
Figura 16. Obstrucción por acumulación de almidón en el Xilema.
Figura 15. Acumulación de almidón en xilema observado por MEB. A. Estructura
general del xilema, formado por paredes secundarias en forma de hélice, elementos de
la traqueida (Tr) y parénquima del xilema (PX). B y C, presencia de gránulos de almidón
(flecha blanca) dentro de la estructura elíptica del xilema y parénquima respectivamente.
D, obstrucción de una célula por la excesiva acumulación de gránulos de almidón.
A B
C D
Xi
PX
Xi
Tr
Tr
PX
43
Se realizó la comparación entre follaje de un árbol CLas + no tratado y arboles CLas
+ tratados con formulaciones biotecnológicas. En el follaje CLas+ sin tratamiento se
observó la obstrucción total de las placas cribosas y aglomeraciones de gránulos de
almidón con un tamaño promedio de 10,428 µm2 y una densidad de 0.00496739
gránulos de almidón/ µm2 (Figura 16 A). En comparación, los árboles tratados con
manejo nutricional presentaron un notable descenso en el tamaño del gránulo de
almidón 3296 µm2 mientras que la presencia de los gránulos se mantuvo en
0.004444 gránulos de almidón/µm2 (Figura 16 B y Cuadro 5). Así mismo la
formulación FB-1 presentó una disminución en el tamaño de los gránulos de almidón
con un área de 3,260 µm2 así como un descenso en la presencia de almidón con una
densidad de 0.0397617 gránulos de almidón/µm2 (Cuadro 5), lo cual se reflejó en
haces cribosos sin obstrucciones (Figura 16 C) respecto a lo observado en el follaje
sin tratamiento. Por otro lado las formulaciones biotecnológicas FB-2 y FB-F3 y el
tratamiento alternancia aunque mostraron un descenso en el tamaño de los gránulos
de almidón en comparación con el follaje no tratado se observó una tendencia a
conservar un tamaño superior respecto a manejo nutricional y FB-1 (6390.23 µm2,
6578.64 µm2, 6901.49 µm2 respectivamente) lo cual se reflejó en la obstrucción total
de la estructura de las placas cribosas y células de la médula (Figura 16 D -F) de
manera similar la variable de densidad se observó alta respecto a FB-1 (Cuadro 5).
Figura 15. Depuración de imagen confocal para la extracción de datos numéricos. A,
Micrografía en confocal mostrando la presencia de almidón. B, Imagen en campo claro que permite
distinguir entre secciones del tejido y los gránulos. C y D, Depuración de la imagen y cuantificación de
las partículas.
44
Los análisis estadísticos realizados sugieren que al menos una formulación
biotecnológica mostro un efecto significativo en la disminución en el tamaño del
gránulo de almidón. La comparación de medias mediante el análisis de Tukey
(P≤0.05) indica que FB-1 seguido de manejo nutricional, resultaron más adecuados
para la disminución del tamaño del gránulo (Figura 17). Sin embargo
estadísticamente se sugiere que no hay una diferencia significativa en la disminución
de la densidad del almidón (Figura 18) a pesar de la diferencia cualitativa observada
en FB-1 con respecto al follaje del árbol no tratado (Figura 16 C y A
respectivamente).
Figura 16. Presencia de almidón en tejido foliar de limón mexicano en malla sombra 240 DPA
de las formulaciones biotecnológicas observados a través de una reconstrucción
tridimensional en MCBL. A, tejido CLas+ sin tratamiento en él se observó la el comportamiento
normal de la enfermedad respecto a la obstrucción del tejido por acumulación de almidón. B, tejido
foliar tratado con manejo nutricional. C, tejido foliar tratado con FB-1. D, Tejido foliar tratado con FB-2.
E, tejido foliar tratado con FB-3. F, tejido foliar tratado con Alternancia. Pc: placa cribosa; Xi: Xilema;
Flecha amarilla: granulo de almidón; Flechas verdes: obstrucción parcial de células; Flechas blancas:
obstrucción total de las células
PC
XI
PC
PC
PC
PC
PCPC
PC
pc
pc
pc
pc
pc pc pc
A B
D E F
C
45
Cuadro 5. Promedio del tamaño, número y densidad de gránulos de almidón presentes en el tejido foliar 240 DPA.
Tratamientos Tamaño de gránulo µm2
Densidad en µm
2
gránulos/área
CLas+ no tratado (NT)
10428.2 0.00496739
Manejo nutricional 3296.26 0.00444363
FB-1 3260.36 0.00397617
FB-2 6390.23 0.00576971
FB-3 6578.64 0.00503728
Alternancia 6901.49 0.00453088
Figura 17. Efecto de distintos tratamientos sobre el tamaño de los gránulos de
almidón de árboles de limón mexicano CLas+. Letras distintas indican diferencias
significativas según la prueba de Tukey (P≤0.05). A, Las barras en cada rectángulo
son ± el error estándar. B, gráfico de medias indicando la formación de grupos
homogéneos (letras superiores).
C
A A
BB
B
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Nt Nutrición FB-1 FB-2 FB-3 Alternancia
Ta
ma
ño
de
grá
nu
lo d
e a
lmid
ón
Tratamientos
A
B
46
Acumulación de almidón en tejido foliar de árboles de limón mexicano 60 E.
DPA
El análisis en cítricos en campo abierto con la aplicación de las formulaciones
biotecnológicas FB-1, FB-3 y el tratamiento de manejo nutricional, consistió de un
análisis microscópico cualitativo 60 días después de la primera aplicación de las
Figura 18. Efecto de distintos tratamientos sobre el tamaño de los gránulos
de almidón de árboles de limón mexicano CLas+. Letras distintas indican
diferencias significativas según la prueba de Tukey (P≤0.05). Las barras en cada
rectángulo son ± el error estándar. A, Las barras en cada rectángulo son ± el error
estándar. B, gráfico de medias indicando la formación de grupos homogéneos
(letras superiores
AA
A
A
AA
0
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.007
Nt Nutrición FB-1 FB-2 FB-3 Alternancia
Den
sida
d de
grá
nulo
s de
alm
idón
/µm
2
Tratamientos
A
B
47
formulaciones. Se observó que antes de iniciar la aplicación de las formulaciones
(tiempo 0), el tejido foliar de los árboles seleccionados presentó elevadas
acumulaciones de almidón obstruyendo las placas cribosas de las células (Figura 19
A, B, C), sin embargo, 60 días DPA al realizar el ensayo microscópico en los mismos
árboles se observó la disminución del tamaño del gránulo. Tanto el tratamiento de
manejo nutricional como ambas formulaciones (BF-1 y BF-3) presentaron la
tendencia a disminuir tamaño de gránulo de almidón (Figura 19 D-F)
El almidón es un producto de la fijación del CO2 durante el proceso de fotosíntesis y
es la forma de reserva de carbono más importante en las plantas, está formado por
un arreglo semi-cristalino de amilosa- cadenas de α 1,4- glucosa- y amilopectinas - α
1,4 y α 1,6- glucosa (Martin y Smith, 1995). En Cítricos, la exportación de este
Figura 19. Presencia de almidón en tejido foliar de limón mexicano en campo 60 DPA
observados a través de una reconstrucción tridimensional en MCBL. A-C, micrografías de
follaje de limón mexicano en campo antes de la aplicación de las formulaciones biotecnológicas. En
todos los cítricos seleccionados se observó un exceso de gránulos de almidón y la obstrucción de
las placas cribosas. D-E corte transversal de follaje de limón mexicano en campo 60 DPA. D,
aplicación de manejo nutricional; F, aplicación de BF-1; F, aplicación de BF-3. Flechas azules:
presencia de placas cribosas no obstruidas; Flechas amarillas: gránulos de almidón.
BA
Pc
Pc
Pc
Pc
Pc
ED
C
Pc
Pc
Pc
F
48
fotosintato es extremadamente lenta, por lo que la mayoría permanece en las hojas
(Roy y Goldschmidt, 1996; Zamski y Schaffer, 1996). En los diversos análisis
microscópicos se observó la presencia de almidón en las células en empalizada y
mesófilo lo cual coincide con lo reportado para naranja Valencia (Citrus Sinensis)
(Etxeberria et al., 2009) asi mismo se observó la presencia de almidón en xilema,
células pith y en limitadas ocasiones en floema lo que corresponde con los reportado
en diversas investigaciones respecto a la acumulación de almidón en estas mismas
estructuras en pecíolo de limón rugoso (Citrus jambhiri Lush) y naranja valencia
(Citrus sinensis L.Osbeck) (Fan et al., 2013; Brodersen, et al., 2014).
La acumulación de almidón en una planta y sus características físicas, bioquímicas y
fisiológicas están influenciadas por alteraciones genéticas e infecciones por
patógenos (Gonzalez et al., 2012). Los gránulos de almidón están formados por dos
polímeros de glucosa, 30% amilosa y 70% de amilopectina; sin embargo, esta
relación se afecta por la presencia de patógenos. En naranja valencia CLas+ (Citrus
sinensis L.) se ha reportado que los gránulos de almidón presentan un incremento en
la cadena de amilopectinas (Gonzalez et al., 2012), esta alteración en la ramificación
afecta la relación amilosa / amilopectina que provoca desórdenes en el tamaño
(Smith, 2001), no obstante la aplicación de formulaciones elaboradas con base en
reguladores de crecimiento como fitohormonas y sustancias que pueden actuar
como moléculas señalizadores, tienen la capacidad de modificar el progreso normal
de una enfermedad (Kim et al. 2009; Li et al. 2010). Ensayos relacionados con la
aplicación de nutrientes como zinc, magnesio, nitrógeno entre otros, en naranja
valencia y toronja reportan la disminución de síntomas y el mejoramiento estructural
de tejidos fotosintéticos y de transporte de fotoasimilados (Li et al., 2013; Weishou et
al., 2013), lo cual influye en la reducción de gránulos de almidón. Esta respuesta
puede asociarse a lo observado en el tratamiento de manejo nutricional respecto a la
disminución de gránulos de almidón en comparación con el árbol infectado no
tratado.
49
Así mismo la aplicación de fitohormonas como ácido giberélico AG3 y ácido
indolacetico IAA, incrementan la actividad de α y β-amilasa y reduce el contenido de
almidón en arroz (Kim et al., 2006), lo cual sugiere que el empleo de fitohormonas
reguladores de crecimiento en FB-1 tiene un efecto en la reducción del contenido de
almidón.
A pesar de la disminución del tamaño del gránulo en FB-2, FB-3 y alternancia con
respecto al tejido foliar no tratado se observó la tendencia de mantener gránulos con
el tamaño suficiente para obstruir las placas cribosas y otras estructuras celulares.
Se ha reportado que la aplicación exógena de ácido acetilsalicílico (como en FB-3)
en follaje de pepino (Cucumis Sativus) incrementa la actividad tanto de sacarosa
fosfato sintasa (enzima relacionada con la síntesis de sacarosa para la formación de
almidón) como de α y β-amilasa (enzimas encargadas de la hidrolisis de almidón)
(Dong et al., 2011) así mismo se ha observado que la aplicación exógena de ácido
salicílico incrementa la concentración de especies reactivas como H2O2 que influyen
en la biosíntesis y el tamaño de los gránulos de almidón (López-Delgado, et al, 2005;
Sánchez-Rojo, et al., 2011).
Acumulación de calosa en árboles de limón mexicano en malla sombra. F.
La calosa es un polisacárido que juega numerosos papeles en las plantas
superiores, entre ellos, la defensa ante el ataque de patógenos mediante la
formación de barreras físicas alrededor de las membrana plasmáticas, pared celular
y elementos cribosos del floema (Chen y Kim, 2009), cerca del tejido invadido por el
patógeno. En el presente estudio se analizó la acumulación de calosa en el sistema
vascular de hojas CLas+ 240 DPA mediante la cuantificación de los depósitos de
este polisacárido en floema (Figura 20).
Para el análisis de calosa se utilizó como referencia el follaje de un cítrico de limón
mexicano afectado por el HLB sin tratamiento (CLas+), en él se observó la presencia
de depósitos de calosa distribuidos en diversas zonas del floema (Figura 21 A). A
pesar de cambios observados en la intensidad de los depósitos de calosa en el
tratamiento nutricional y la formulación FB-1 (Figuras 21) no se observó una
50
disminución en la presencia de esté polisacárido en ninguna de las muestras bajo
tratamiento (Figura 22). Por su parte el análisis estadístico realizado no presentó
diferencias significativas al comparar las medias de los tratamientos mediante el
análisis de Tukey (P≤0.05)
Figura 20. Depuración de micrográficas en MCBL y cuantificación de Calosa en tejido foliar
de árboles de limón mexicano en malla sombra 240 DPA. A-C, micrografías de follaje de limón
mexicano en campo antes de la aplicación de las formulaciones biotecnológicas.
Figura 21. Presencia de calosa en hojas de limón mexicano en malla sombra 240 DPA. A,
Clas+ sin tratamiento, B, presencia de calosa en árboles tratados con manejo nutricional. C,
Presencia de calosa en árboles tratados con FB-1. D, presencia de calosa en árboles tratados con
FB-2. E, presencia de calosa en árboles tratados con FB-3. F, calosa en árboles tratados con
Alternancia. Fl: Floema; M: medula: Xi: Xilema, las flechas blancas señalan la presencia de
depósitos de calosa.
51
Acumulación de calosa en árboles de limón mexicano en campo G.
Antes de la aplicación de los tratamientos manejo nutricional, FB-1 y FB-3 se realizó
un análisis preliminar cualitativo de los árboles infectados en campo (Figura 23 A-C).
En las imágenes obtenidas se observó la presencia de intensos depósitos de calosa
(flechas blancas) alrededor de todo el tejido de floema. 60 DPA los cítricos tratados
con manejo nutricional y FB-3 (Figura 23 D) presentaron depósitos de calosa muy
similares en intensidad a los observados en los mismo árboles antes de la aplicación
Figura 22. Efecto de distintos tratamientos sobre el número de depósitos de
calosa detectados. Letras distintas indican diferencias significativas según la prueba
de Tukey (P≤0.05). Las barras en cada rectángulo son ± el error estándar. A, Las
barras en cada rectángulo son ± el error estándar. B, gráfico de medias indicando la
formación de grupos homogéneos (letras superiores).
A
A
A
AA
A
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Nt Nutrición BF-1 BF-2 BF-3 Alternancia
A A A A A A
Alternancia NT FB-1 FB-3 FB-2
Dep
ós
ito
s d
e c
alo
sa
Nutrición
Dep
ós
ito
s d
e c
alo
sa
Tratamientos
A
B
52
de los tratamientos, no obstante se observó una disminución en la cantidad de
depósitos de calosa del tejido tratado con FB-1 (Figura B,E) .
La respuesta de calosa observada después de la aplicación de los tratamientos
estadísticamente presentó un comportamiento similar al del árbol CLas+ no tratado,
no obstante cualitativamente se observó ligeros cambios en la intensidad y número
de depósitos en el tejido tratado con FB-1 en ambos ensayos. La respuesta de
calosa en cítricos infectados con CLas ha sido reportada anteriormente como una
formación excesiva alrededor de las plasmodesmos del floema (estructuras que
conectan a las células), lo cual llega afectar el transporte de fotoasimilados (Koh et
al., 2011).
Figura 23. Presencia de calosa en hojas de limón mexicano en campo 60 DPA. A-C, Presencia
de calosa antes de la aplicación de los tratamientos. D-F, 60 DPA, la presencia de almidón sigue
siendo evidente en las células del floema. D, tejido tratado con manejo nutricional. E, tejido tratado
con FB-1. F, tejido tratado con FB-3. Fl, Floema; M, medula: Xi, Xilema.
53
Se conoce que especies de cítricos tolerantes al HLB como limón rugoso (Citrus
jambhiri), presentan un incremento en genes relaciones con la degradación de
calosa bajo la influencia de CLas, mientras que en las especies susceptibles los
genes relacionados con la síntesis de calosa incrementan su expresión y aquellos
genes relacionados con la degradación son reprimidos (Fan J. et al., 2012), lo cual
se aprecia en estructuras del floema sin alteraciones tan evidentes como en naranja
y limitados cuerpos de calosa presentes en el floema de limón rugoso (Fan J. et al.,
2013). El limón mexicano es un cítrico moderadamente tolerante a CLas (Folimonova
et al., 2009), lo cual puede sugerir un comportamiento distinto a lo reportado en otras
especies. Los resultados respecto a la respuesta de calosa en ésta etapa
proporcionan información limitada para sugerir algún efecto por parte de las
formulaciones respecto a la acumulación de calosa, por lo que se sugiere continuar
con un análisis de mayor profundidad respecto a esta variable de respuesta en limón
mexicano.
Cambios microestructurales en el sistema vascular de follaje en limón H.
mexicano infectado por CLas 240 DPA.
Con la finalidad de observar si existen o no diferencias microestructurales inducidos
por la aplicación de formulaciones biotecnológicas, se realizó una comparación en el
sistema vascular de follaje CLas+ y CLas+ con formulaciones biotecnológicas.
En primera instancia se realizó un análisis óptico entre follaje sano (CLas-) y follaje
afectado por el HLB. El tejido sano (Figura 24 A) no presentó síntomas y su
microestructura presentó un anillo vascular delimitado perfectamente por células del
cambium (Figura 24 B y C, flecha blanca), largas células del xilema en el centro y por
paredes fibrosas del esclerénquima en la periferia exterior, en medio de ambos
tejidos se observó la presencia de largas células del parénquima del floema de forma
organizada (Figura 24 C, flecha negra). En cambio, el cilindro vascular del follaje
CLas+ (Figura 24 D), mostró un crecimiento prominente en la zona del floema (Figura
24 E), las células del parénquima del floema presentaron una completa
desorganización (Figura 24 F, flecha negra), mientras que, el floema cercano al
xilema exhibió un oscurecimiento debido al alto contenido citoplasmático de
54
presumiblemente calosa y proteínas P, así mismo, se observó el colapso de las
células de floema localizadas hacia el interior (corchete) y de las células de cambium
(Figura 24 F, flecha blanca).
Las observaciones realizadas en tejido CLas+ con aplicación de formulaciones
presentaron un arreglo y distribución del floema similar al tejido sano CLas- (Figura
24 C), lo cual sugiere una recuperación celular (Figura 26). El follaje con la aplicación
de manejo nutricional (Figura 26 A-C), presentó una mejora en la distribución celular,
sin embargo, el parénquima del floema presentó alteraciones en su forma (Figura 26
B, flecha negra). Por otro lado, los follajes bajo la aplicación de las formulaciones FB-
1, FB-2 y FB-3 presentaron una notable mejora en el arreglo celular, de forma
general se observó el parénquima del floema con forma regular (Figura 26 E, H, K,
flecha blanca), similar al follaje CLas-; además, no se observó la presencia de
Figura 24. Microestructura de follaje sano (CLas-) y follaje infectado (CLas
+). A, Hoja sana
de limón mexicano. B, corte transversal de nervadura central. C, organización de las células del
parénquima del floema y del cambium. D, Hoja de limón mexicano con síntomas de HLB. E,
corte transversal de la nervadura central, la microestructura se observó diferente, siendo más
amplia la zona del floema. F, Falta de organización y colapso en las células del floema y del
cambium. Es, esclerénquima, Fl, floema; Xi, xilema.
55
almidón o colapso celular. Por otro lado el follaje con la aplicación de alternancia
presentó gránulos de almidón en floema (flecha blanca) y colapso cercano a las
células del esclerénquima (Figura 26 N, flecha negra).
El análisis estructural se complementó con microscopia confocal (Figura 25 C-Ñ),
mediante la cual se calculó el promedio del área del cilindro vascular, el área del
xilema y el área del floema a partir de las mediciones realizadas en el programa
image J posterior a la limpieza de las imágenes obtenidas por microscopia confocal
(Figura 25).
Los datos obtenidos indicaron diferencias en el tamaño del cilindro vascular. Se
observó que manejo nutricional presentó un tamaño promedio de cilindro de
159,285µm2 mientras que la formula FB-1 presentó un incremento de tamaño
promedio de cilindro con 199,446 µm2 respecto a manejo nutricional, por el contrario
FB-2 y FB-3 con un tamaño promedio de 151,451 µm2 y 157,513 µm2 presentaron
una menor expansión de su cilindro vascular con respecto a manejo nutricional, así
mismo alternancia presento un tamaño promedio de 214,076 µm2. Cabe señalar que
cualitativamente los cilindros vasculares de manejo nutricional, FB-2 y FB-3 se
Figura 25. Segmentación de imágenes de MCBL para obtener datos cuantitativos de cambios
morfométricos en el cilindro vascular. A, imagen confocal del cilindro vascular completo. B,
depuración de imagen original, para obtener el contorno del cilindro vascular. C, contorno del xilema.
Los cálculos de floema se realizaron a partir de la resta de los valores del cilindro vascular completo
y xilema. Este análisis se realizó en cada uno de los árboles seleccionados en malla sombra bajo
tratamiento
56
observaron similares entre sí (Figura 26 C, I, M), mientras que los cilindros de FB-3 y
alternancia se observaron de mayor tamaño (Figura 26 F,O).
Respecto a los datos obtenidos en el grosor de floema se observó que manejo
nutricional presentó un tamaño de floema de 55,916.4 µm2, mientras que FB-1
presento un ligero incremento con 59,143.1 µm2 respecto a manejo nutricional, por
su parte FB-2 y FB-3 presentaron tamaños de 61,073 µm2 y 45,400 µm2 por último
Alternancia presentó el mayor incremento en el grosor de floema respecto a las
formulaciones biotecnológicas con 66,568.1 µm2.
Por último, las mediciones en el xilema del follaje mostraron diferencia en el tamaño
observado respecto a cada tratamiento. En manejo nutricional se obtuvo un tamaño
promedio de 103,369 µm2, mientras que en FB-1, FB-2 y FB-3 se obtuvieron
tamaños de 140,303 µm2, 90,377.5 µm2 y 112,113 µm2 respectivamente, mientras
que alternancia registró un tamaño de 147,508 µm2. Se observó una tendencia
similar a cilindro vascular en cuanto a los comportamientos de los tamaños
observado en las micrografías.
57
Figura 26. Efecto de las formulaciones biotecnológicas 240 DPA en el tamaño del floema en
follaje de limón mexicano afectado por CLas. Imágenes representativas de los cambios observados
en follaje de cada uno de las formulaciones. Los cortes transversales permitieron observar cambios en
el acomodo celular de los arboles tratados con diferentes formulaciones. A-C, manejo nutricional. D-F
fórmula FB-1. G-I fórmula FB-2. J-L fórmula FB-3. M-Ñ, alternancia. Xi: xilema; Fl: floema
A B C
Fl
Xi
Xi Fl
Fl
Xi
D E F
Xi
Fl
Fl
Es
Xi
Fl
Xi
G H I
Xi
FlXi Fl
Fl
Xi
K L
Xi
Fl
Fl
Es
Fl
Xi
M
N
Xi
Fl
Fl
Es
XiFl
Xi
Ñ O
58
Los análisis estadísticos respecto a las variables de tamaño de cilindro vascular
señalaron que al menos un tratamiento mostro diferencia significativa en el
incremento del tamaño. La comparación de medias mediante el análisis de Tukey
(P≤0.05) indican que alternancia seguido de FB-1 y manejo nutricional, presentaron
mayores variaciones en el área del cilindro vascular (Figura 27). Así mismo en xilema
el análisis de comparación de medias con Tukey (P≤0.05) señaló que al menos un
tratamiento presentó diferencia significativa, se observó que alternancia seguida por
FB-1 y FB-3 presentaron mayores variaciones en el tamaño del xilema (Figura 28).
Por otro lado el análisis estadístico de medias Tukey (P≤0.05) sugiere que no hay
diferencia significativa en el tamaño del floema (Figura 29).
Figura 27. Efecto de las formulaciones biotecnológicas 240 DPA en el tamaño de
cilindro vascular en follaje de limón mexicano afectado por CLas. A, Letras
distintas indican diferencias significativas según la prueba de Tukey (P≤0.05). Las
barras en cada rectángulo indican ± el error estándar. B, gráfico de medias indicando
la formación de grupos homogéneos (letras superiores).
AB
AB
A A
B
0.00
50,000.00
100,000.00
150,000.00
200,000.00
250,000.00
Nutrición FB-1 FB-2 FB-3 Alternancia
X1000
A
B
Alternancia FB-2 FB-1 Nutrición FB-3
Ta
ma
ño
de
cilin
dro
va
sc
ula
r e
n µ
m2
Tratamientos
A AB AB AB
59
A
AB
A
AB
B
0.00
20,000.00
40,000.00
60,000.00
80,000.00
100,000.00
120,000.00
140,000.00
160,000.00
180,000.00
Nutrición FB-1 FB-2 FB-3 Alternancia
Tam
año
de X
ilem
a en
µm
2
A AB AB AB
FB-2 FB-1 Nutrición FB-3Alternancia
X10000
Tratamiento
A
B
Figura 28. Efecto de las formulaciones biotecnológicas 240 DPA en el tamaño
de xilema en follaje de limón mexicano afectado por CLas. A, Letras distintas
indican diferencias significativas según la prueba de Tukey (P≤0.05). Las barras en
cada rectángulo indican ± el error estándar. B, gráfico de medias indicando la
formación de grupos homogéneos (letras superiores).
60
Cambios microestructurales en sistema vascular de follaje y raíz de I.
árboles de limón mexicano infectados por CLas 60 DPA
De manera similar al ensayo en cítricos en malla sombra, se realizó un análisis
cualitativo de la microestructura foliar de árboles afectados por HLB en campo
tratados con las formulaciones FB-1, FB-3 y manejo nutricional a 60 DPA,
adicionalmente se examinó el tejido radicular, bajo el conocimiento de que CLas
puede resguardarse en la raíz, tejido en el cual se almacena almidón principalmente,
donde induce cambios en la microestructura de las células y el metabolismo del
almidón (Johnson, et al., 2013). El estudio óptico de la microestructura del follaje se
complementó con un análisis cualitativo de micrografías en MCBL, mientras que las
observaciones de la estructura de raíz solo fueron realizadas de manera
microestructural. Las micrografías del tejido foliar y radicular de un árbol de limón
mexicano sano presenta estructuras celulares integras tanto en hoja (Figura 24 B-C)
AA
A
A
A
0.00
10,000.00
20,000.00
30,000.00
40,000.00
50,000.00
60,000.00
70,000.00
80,000.00
Nutrición FB-1 FB-2 FB-3 Alternancia
X1000
Tam
año
de fl
oem
a en
µm
2
Alternancia FB-2 FB-1 Nutrición FB-3
Tratamientos
A A A AA
A
B
Figura 29 Efecto de las formulaciones biotecnológicas 240 DPA en el tamaño
de floema en follaje de limón mexicano afectado por CLas. A, Letras distintas
indican diferencias significativas según la prueba de Tukey (P≤0.05). Las barras en
cada rectángulo indican ± el error estándar. B, gráfico de medias indicando la
formación de grupos homogéneos (letras superiores).
61
Figura 30. Microestructura de raíz de limón mexicano. A, corte transversal de raíz sana. B,
Floema con presencia de gránulos de almidón (flechas blancas). C, raíz afectada por HLB. D,
colapso de células del floema. Cor, corteza; Fl, floema; Xi, xilema.
como raíz (Figura 30 A-B), en donde la presencia de almidón fue baja en tejido foliar
y elevada en tejido radicular (Figura 30 B). De manera contraria, el tejido radicular de
un árbol enfermo presentó colapso de floema y nula presencia de almidón (figura 30
C-D).
A diferencia de lo observado en follaje a los 240 DPA en malla sombra, los
resultados de la aplicación de los tratamientos manejo nutricional, FB-1 y FB-3 a los
60 DPA presentaron un escaso progreso en la recuperación de la estructura celular
del floema en follaje, observándose un colapso total (Figura 31 A, D, G), no obstante,
raíz, si presentó una estructura definida del floema en la mayoría de las muestras
analizadas (Figura 31 B, H). El análisis confocal realizado en follaje exhibió
diferentes comportamientos en el arreglo del floema. La estructura del floema en
follaje tratado con nutrición, presentó una apariencia compacta y delimitada (Figura
31 C) a diferencia del follaje tratado con FB-3 y FB-1 en los cuales se observó una
estructura menos uniforme (Figura 31 F,I) no obstante en los tres tratamientos se
XI
10 x 40 x
Xi
A B
XI
FL
Es
XI
FL
Cor
10 x 40 x
C DCor
FL
Cor
62
observó el incremento del xilema tal como en el primer ensayo (Figura 26). Estos
resultados sugieren que a pesar del corto tiempo al que han estado expuestos los
cítricos a la aplicación de las formulaciones biotecnológicas hay un efecto inicial en la
mejora de la estructura celular del sistema vascular.
XI
XI
A B
FL
ES
FL
ES
FL
XI
ES
D F
ME
H
XI
FL
ES
I
XI
FL
C
Fl
XI
G
Fl
XI
E
FL
FlXI
XI
40 x 40 x
40 x
40 x
40 x
40 x
Figura 31 Aspecto del tejido vascular de floema en raíz y follaje de limón mexicano 60
DPA. A-C, manejo nutricional. D-F, aplicación de FB-1. G-I aplicación de FB-3. La primera
columna muestra cortes transversales de follaje. La segunda columna muestra cortes
transversales de raíz. La tercer columna muestra el cilindro vascular de follaje observado por
MCBL. Cor, corteza; Fl, floema; Xi, xilema.
63
Los resultados de ambos ensayos sugieren que la aplicación de formulaciones
biotecnológicas desarrollan el sistema vascular foliar y radicular en los árboles
tratados, lo cual ayuda a estabilizar el transporte de fotoasimilados.
El Huanglongbing afecta la concentración de Zn, Mn y Ca además de repercutir en la
distribución de Fe, Cu, K, en follaje (Tian, et al., 2014). Se ha reportado que las
deficiencias de K se relacionan con desequilibrios en la síntesis de celulosa mientras
que bajas concentraciones de Boro se asocian al colapso de floema (Spann y
Schumann., 2009). Diversos estudios han señalado que la aplicación de Ca, Zn, Cu,
B y otros agentes nutricionales en cítricos como naranja dulce y mandarina
disminuyen los síntomas del HLB, mantienen la producción del fruto e incrementan el
área, largo y ancho de las hojas e intervienen en el desarrollo e integridad de
membranas y paredes celular (Spann y Schumann., 2009; Khairulmazmi, et al.,
2011; Weishou, et al., 2013), estos resultados coinciden con lo observado en el
presente estudio en el cual durante el desarrollo de ambos experimentos se aplicó un
manejo nutricional con micro y macro nutrientes además de que la aplicación de
cada formulación biotecnológica fue acompañada por la aplicación del manejo
nutricional.
Tanto en manejo nutricional como en FB-2 cuyos ingredientes principales son
esporas de Bacillus y extractos vegetales, se observó una estructura celular similar a
las células de follaje sano, no obstante el efecto positivo observado en follaje tratado
con formulaciones a base de hormonas fue mayor. La formulación FB-3, constituida
por hormonas promotoras del crecimiento y salicilato de potasio y FB-1 en la cual se
incluyen reguladores de crecimiento y complejos multienzimaticos, presentaron un
floema de apariencia sana y un incremento en el grosor del cilindro vascular, siendo
el tejido del xilema el de mayor expansión en ambos tratamientos. Por su parte
alternancia, el cual es una combinación en la aplicación de todas los tratamientos
mostro resultados similares a F-B1 y FB-3.
64
Estudios relacionados con la aplicación de GA3 y Ba (una citoquinina) en naranja
clementina y en mandarina satsuna señalaron el incremento en el número de haces
vasculares del xilema y el aumento en la formación de elementos vasculares y la
división en células parénquima (Guardiola, et al., 1991; Mesejo, et al., 2003). De
igual modo, se ha mostrado que la aplicación de jasmonatos induce la respuesta
acído salicilico, el cual desencadena la activación de elementos polifenólicos en
parénquima y de células del cambium (Franceschi, et al., 2002). En diversos estudios
se ha señalado que la aplicación de giberelinas (GA3) y ácido indolacetico (IAA)
estimula cambios en la estructura de las ligninas (uno de los principales
componentes de las paredes celulares), específicamente en los monómeros guacilo
y siringilo (precursores de lignina) y dependiendo de las concentraciones de estos
precursores se forman paredes celulares propias del xilema o del floema (Romano,
et al 1991; Aloni, 1995; McKenzie y Deyholos, 2011). Esto se relaciona con los
resultados en el incremento del floema y xilema, el cual se sugiere proceden de la
diferenciación y crecimiento célular regulado por la aplicación de fitohormonas.
65
VIII. CONCLUSIONES
Existe una asociación entre la concentración de Candidatus Liberibacter
asiaticus y la acumulación de almidón en follaje de limón mexicano.
La formulación FB-1 presentó el mejor efecto en la disminución del tamaño de
los gránulos de almidón (3260.36 µm²) en árboles de limón Mexicano en el
ensayo de malla sombra a los 240 DPA y la menor tendencia en densidad de
gránulos de almidón (0.00397617 gránulos de almidón/µm²).
Las formulaciones biotecnológica FB-1 y FB-3 en campo presentaron una
tendencia a disminuir la acumulación y el tamaño de los gránulos de almidón
en árboles de limón Mexicano en el ensayo de campo abierto a los 60 DPA,
sugiriendo un efecto positivo en la respuesta de los árboles a la enfermedad
en un periodo corto de tiempo.
La formulación FB-1 y el tratamiento alternancia presentaron el mejor
comportamiento en formación de células propias del cilindro vascular,
principalmente en xilema a los 240 DPA en cítricos de malla sombra.
El tratamiento manejo nutricional y las formulaciones biotecnológica FB-1 y
FB-3 en campo presentaron una tendencia a incrementar el tamaño del xilema
y mejorar la estructura celular de floema en raíz 60DPA
Se observó la presencia de calosa en el área del floema de cítricos infectados
por CLas; sin embargo, no se logró elucidar un comportamiento relacionado
con la aplicación de los tratamientos respecto a su acumulación a los 240
DPA en cítricos en malla sombra y tampoco a los 60 DPA en cítricos de
campo.
66
IX. BIBLIOGRAFÍA
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