Análisis metabolómico de especies forestales, la encina ... · distintos órganos de encina...

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

INSTITUTO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO

MÁSTER EN BIOTECNOLOGÍA

Trabajo Fin de Máster

Análisis metabolómico de especies forestales, la

encina (Quercus ilex)

Cristina López Hidalgo 20224320Y

Departamento Bioquímica y Biología Molecular

Director: Jesús Valentín Jorrín Novo

Codirector: Luis Valledor González

Córdoba, 06/2017

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA - INSTITUTO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO

Análisis metabolómico de especies forestales, la encina (Quercus ilex)

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PROPUESTA DE REVISORES

Jesús Valentín Jorrín Novo y Luis Valledor González, directores del trabajo fin de máster

titulado “Análisis metabolómico de especies forestales, la encina (Quercus ilex)”, proponen como

posibles revisores del mismo a:

o Elena Prats Pérez. Resistencia a estreses bióticos y abióticos. Instituto de Agricultura

Sostenible, Consejo Superior de Investigaciones Científicas.

o Feliciano Priego Capote. Departamento de Química Analítica. Universidad de Córdoba.

o Mónica Meijón Vidal. Biología de Organismos y Sistemas. Universidad de Oviedo.

Jesús Valentín Jorrín Novo

Fdo.

Luis Valledor González

Fdo.


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AGRADECIMIENTOS

Hace nada estaba en esta misma situación, escribiendo los agradecimientos para mi trabajo de

fin de grado. Y de la misma forma que en esa ocasión debo agradecer a muchísima gente su ayuda,

compañía y consejos. Espero no olvidarme de nadie. Este año se me ha pasado fugazmente y podría

afirmar que ha sido mi mejor año tanto profesionalmente como personalmente.

A Jesús, por su invalorable paciencia y disponibilidad absoluta. Gracias por tus ánimos y tus palabras

que me motivan a continuar trabajando. Y por supuesto gracias por seguir confiando en mí y

permitirme continuar en este grupo. Gracias a Luis y a Mónica y a la gente de su grupo, que hicieron

mi estancia en Oviedo muy agradable y en la que aprendí muchas cosas que me han permitido

desarrollar este trabajo. No me puedo olvidar de Macarena, responsable del área de metabolómica del

SCAI, por su amabilidad y su interés en escucharme y enseñarme multitud de cosas.

También gracias a Rosa, mi compañera de viaje y de laboratorio, y a quien ya considero una amiga.

Del mismo modo, debo agradecer a su hermana Silvia, Daniel, Leticia, Kamilla, Patricia, Víctor,

Isabel, y mucha gente más que han pasado por el laboratorio estos meses. También debo agradecer a

Ana Maldonado y Manolo Rodríguez que han sido profesores del máster, de los cuales he aprendido

mucho. Por supuesto, no me puedo olvidar de Maricarmen, por su paciencia y su máxima atención a

que nuestras condiciones de trabajo sean siempre las mejores.

A mi familia por apoyarme en todo momento. Y, por último, a mi mejor amigo y compañero del día a

día y que es la persona que más admiro. Me soporta (que es muy difícil hacerlo), me conoce, y

comprende que mi trabajo es una parte fundamental en mi vida y posee una enorme paciencia con lo

que todo esto conlleva.

Gracias a todos.



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ÍNDICE

PROPUESTA DE REVISORES............................................................................................................ 2

AGRADECIMIENTOS ......................................................................................................................... 4

ÍNDICE DE ILUSTRACIONES ........................................................................................................... 8

ÍNDICE DE TABLAS ......................................................................................................................... 10

RESUMEN .......................................................................................................................................... 12

OBJETIVOS ........................................................................................................................................ 14

1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 16

2. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................. 22

2.1. Material vegetal, condiciones de crecimiento y muestreo ................................................. 22

2.2. Extracción de metabolitos y derivatización ....................................................................... 24

2.3. Análisis por GC-MS .......................................................................................................... 26

2.4. Alineamiento de los cromatogramas y cuantificación de los metabolitos ......................... 27

2.5. Identificación de metabolitos ............................................................................................. 27

2.6. Análisis estadístico y bioinformático ................................................................................ 28

3. RESULTADOS......................................................................................................................... 28

4. DISCUSIÓN ............................................................................................................................. 36

5. CONCLUSIONES .................................................................................................................... 40

REFERENCIAS ................................................................................................................................... 41



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ÍNDICE DE ILUSTRACIONES

Ilustración 1 - Diversidad de metabolitos secundarios y rutas metabólicas principales de

biosíntesis………………………………………………………………………….……………..…..19

Ilustración 2 - Flujo de trabajo de un análisis metabolómico……………….………………......……20

Ilustración 3 - Esquema básico de un sistema GC-MS……………….………………....................…21

Ilustración 4 - Material vegetal……………...….………………......………………………......……23

Ilustración 5 - Protocolo de extracción de metabolitos……………….…………….........………..…25

Ilustración 6 - Protocolos de rampas de temperatura de la separación cromatográfica………....……26

Ilustración 7 - Cromatogramas de GC-MS de los tres órganos……………….……...…..…......……29

Ilustración 8 - Diagrama de Venn y diagrama de barras……………………………….……......……33

Ilustración 9 - Análisis de componentes principales (PCA) de los tres órganos………………...……34

Ilustración 10 - Heat maps de los metabolitos asignados en los tres órganos……………….…..……35


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ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 - Metabolitos asignados por las diferentes bases de datos correspondientes a la Fracción

Polar………………………………………………………………………….………………………30

Tabla 2 - Metabolitos asignados por las diferentes bases de datos correspondientes a la Fracción

Apolar...………………………………………………………………………………………………31

Tabla 3 - Metabolitos asignados por las diferentes bases de datos……………………………………32

Tabla 4 - Resumen de resultados de trabajos previos de metabolómica no dirigida sobre especies

vegetales……………………………………………………………………………………………...37


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RESUMEN

El presente trabajo fin de máster, titulado “Análisis metabolómico de especies forestales, la

encina (Quercus ilex)” ha constituido una primera aproximación al análisis del perfil metabolómico de

distintos órganos de encina (hojas y raíces de plantones de encina crecidos en invernadero y de semillas

recogidas en campo). Con el objetivo de relacionar las diferencias fenotípicas de los órganos con sus

fenotipos moleculares y metabólicos se ha comparado los perfiles de metabolitos. Se ha realizado la

extracción de los metabolitos mediante un procedimiento de dobles solventes, obteniéndose dos

extractos de metabolitos de distinta polaridad. A partir de los datos de obtenidos por cromatografía de

gases acoplado a espectrometría de masas (GC-MS) y el empleo de novedosas herramientas

bioinformáticas se han resuelto un total de 461 picos, 156 en semillas, 146 en hojas y 159 en raíces, y

se han identificado un total de 87 compuestos, 74 en semillas, 79 en hojas y 71 en raíces. La

identificación de los 87 compuestos permitió establecer distintas familias químicas (aminoácidos

proteicos y no proteicos, carbohidratos, ácidos orgánicos, ácidos grasos, y compuestos fenólicos) y su

cuantificación permitió la discriminación de los tres órganos analizados. Destacan diferencias

cualitativas y cuantitativas entre órganos, como mayor contenido de ácidos orgánicos y compuestos

fenólicos en hojas; un mayor contenido de aminoácidos proteicos, azúcares y carbohidratos en bellota

y la presencia única de ácido salicílico en raíz. La interpretación de las diferencias entre los perfiles

metabolómicos de los distintos órganos ha permitido establecer relaciones con las características o

propiedades biológicas de cada órgano.

Palabras clave: Metabolómica; Quercus ilex; hoja; bellota; raíz; GC-MS


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OBJETIVOS

Como continuación del trabajo recientemente iniciado (López Hidalgo, 2016) sobre análisis

metabolómico en encina (Quercus ilex subsp. ballota (Desf.) Samp), se planteó, como objetivo general,

el análisis del perfil metabólico en diferentes órganos de la planta (hoja, raíz y semillas), utilizando

cromatografía de gases acoplada a masas (GC-MS). Dicho objetivo general se dividió en los siguientes

objetivos específicos:

i. Optimizar protocolos de extracción y análisis metabolómico por GC-MS. Extracción

secuencial de metabolitos polares y apolares. Identificación y cuantificación mediante el

empleo de diferentes algoritmos.

ii. Análisis del perfil metabólico en hojas y raíces de plantones de encina crecidos en invernadero

y de semillas recogidas en campo.

iii. Análisis comparativo del perfil de metabolitos de los tres órganos analizados y relación con

sus características o propiedades biológicas.


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1. INTRODUCCIÓN

Tres son los elementos básicos que definen una investigación biológica, el sistema

experimental, la pregunta o hipótesis y la metodología. En la presente Tesis de Máster dichos

elementos quedan recogidos en el título de la misma, “Análisis metabolómico de especies forestales,

la encina (Quercus ilex)”: la encina, como sistema de estudio, su metaboloma, como pregunta, y el uso

de una aproximación holística de análisis de biomoléculas, la metabolómica.

El trabajo queda encuadrado dentro de la línea de investigación que sobre aproximaciones moleculares

al estudio de especies forestales (Sghaier-Hammami et al., 2013, Romero-Rodríguez et al., 2014)

lleva a cabo el Grupo de Investigación “Bioquímica, Proteómica y Biología de Sistemas Vegetal y

Agroforestal,” (AGR-164). En trabajos previos (López-Hidalgo, 2016) se planteó el uso de esta

aproximación holística (-ómicas) en la caracterización del perfil metabolómico en encina, teniendo un

carácter básicamente metodológico, empleando distintas técnicas y metodologías, desde técnicas

clásicas, determinaciones mediante bioquímica clásica, como más novedosas, espectroscopía de

infrarrojo cercano (NIRS), resonancia magnética nuclear (NMR) y cromatografía de gases acoplada a

espectrometría de masas (GC-MS). A partir de esta base de conocimiento, se plantea el uso de una

aproximación holística por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas para la

caracterización de los perfiles metabolómicos de tres órganos (semilla, hoja y raíz). Se pretende

implementar otras técnicas utilizadas previamente en el grupo (bioquímica clásica, proteómica y

transcriptómica), encaminando la investigación con esta especie forestal en la dirección de la definida

Biología de Sistemas.

La encina (Quercus ilex subsp. Ballota [Desf.] Samp) es la especie predominante del bosque

mediterráneo, en general, y del ecosistema agrosilvopastoral dehesa, en particular. Como podemos

afirmar para un gran número de especies forestales, catalogadas como huérfanas y recalcitrantes, la

encina, a pesar de su importancia medioambiental e interés económico, es una gran desconocida a

nivel biológico, en especial desde un punto de vista molecular. Los problemas históricos de

sobreexplotación, los actuales de pérdida de masa forestal por enfermedades y estreses ambientales (la

seca de la encina) y los asociados a un escenario de futuro cambio climático, hacen que el estudio de

su biología pase a ser una prioridad de cara a diseñar programas de manejo y conservación que

aseguren su valor medioambiental y agrosilvopastoral (Jorrín-Novo et al., 2014).

De todas las actuaciones biotecnológicas que se pueden utilizar en el ámbito agroforestal, mejora

clásica, transgénesis, mutación y explotación de la biodiversidad natural, es esta última, y la selección


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de genotipos “élite” o “plus” la más adecuada o única viable. Esto es debido a las características de las

especies forestales (ciclos de vida muy largos y no domesticadas), lo que dificulta los programas de

mejora clásica, o la posición europea frente a los transgénicos. En dicho marco, la selección de

individuos con determinadas características fenotípicas, como las de adaptación y tolerancia a

condiciones ambientales adversas (sequía y patógenos, fundamentalmente) (Simova-Stoilova et al.,

2015), sería un logro importante. Por otra parte, el estudio metabolómico puede llevarnos a la

identificación de compuestos que, por su actividad biológica y potencial uso aplicado, pueden darle

valor añadido a la especie de estudio.

Trabajos previos han mostrado la existencia de una elevada variabilidad poblacional y polimorfismo

en Quercus spp. Dicha conclusión se ha alcanzado gracias a estudios anatómicos y morfométricos

(Castro-Díez et al., 1997), bioquímicos (Valero et al., 2010), de marcadores de DNA (Jiménez et al.,

2004, Lumaret et al., 2009) y proteínas (Jorge et al., 2005, Valero et al., 2011). También se han

llevado a cabo análisis del contenido en fenólicos en Quercus ilex L., como componentes antioxidantes

útiles para la preservación de alimentos en la industria alimentaria (Cantos et al., 2003, Karioti et al.,

2011, Yarnes et al., 2006).

La pregunta que justifica este trabajo ha sido la siguiente, ¿las diferencias fenotípicas observadas entre

órganos estarían asociadas a una composición química diferencial a causa de un metabolismo

diferenciado? Para resolver dicha pregunta se necesita alcanzar un conocimiento del perfil de

metabolitos de los distintos órganos de encina. Con ello, pretendemos abordar los dos principales

objetivos anteriormente señalados, la caracterización del metaboloma y la búsqueda de compuestos

bioactivos.

Debido al importante papel del género Quercus en el sector agroalimentario, a causa de su elevado

potencial antioxidante y antibacteriano (Güllüce et al., 2004) de diversos extractos alcohólicos, o su

consideración como una fuente rica en fenólicos, como proantocianidinas y taninos, la identificación

de estos compuestos empleando técnicas metabolómicas, permiten alcanzar un mayor conocimiento

de éstos y, por último, asociarlos a dicha variabilidad fenotípica.

La aproximación experimental, la metabolómica, ha constituido el principal reto de este trabajo. Las

técnicas metabolómicas son una herramienta importante para el diagnóstico y estudio de las respuestas

fisiológicas de las especies vegetales a los cambios ambientales y ofrecen la oportunidad de obtener

conocimiento de los mecanismos implicados en la correcta relación biodiversidad-ecosistema

(Scherling et al., 2010).


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La metabolómica, término empleado por primera vez por Oliver Fiehn (Fiehn, 2002), entendida como

la disciplina científica o aproximación metodológica del área de la bioquímica, tiene por objeto el

análisis cualitativo y cuantitativo de forma exhaustiva de todos los metabolitos de un sistema biológico

dado, bajo un conjunto de condiciones ambientales determinadas (Sheth et al., 2014).

Analiza el metaboloma, término sugerido por Oliver et al. (1998) (Oliver et al., 1998). Este se define

como el conjunto completo de pequeñas moléculas, metabolitos, producidos por las diversas unidades

biológicas (desde organismos, órganos, tejidos, células y orgánulos o compartimentos celulares), en

un estado de desarrollo específico y bajo determinadas condiciones ambientales.

Los diversos metabolitos son pequeñas moléculas resultantes de las múltiples reacciones enzimáticas

durante el metabolismo que constituyen un grupo de compuestos de bajo peso molecular (normalmente

menores de 1500 Da) que incluyen: aminoácidos, péptidos, ácidos grasos, lípidos, purinas, pirimidinas,

azúcares y otras moléculas.

La gran diversidad de moléculas se refleja en una amplia gama de polaridades, pesos moleculares,

grupos funcionales, estabilidad y reactividad química, entre otras propiedades. Esto obliga

irremediablemente la utilización de múltiples plataformas y configuraciones analíticas que maximicen

la cobertura del metaboloma analizado.

Considerada como la más reciente de las grandes ómicas, la metabolómica permite la descripción,

identificación y cuantificación, desde una perspectiva holística de todos los metabolitos, considerados

como los productos finales de la expresión génica.

Al igual que el transcriptoma y el proteoma, el metaboloma es dinámico, experimenta cambios muy

rápidos que proporciona una visión del estado celular. Sin embargo, al contrario que los genes y las

proteínas, cuyas funciones están sujetas a la regulación epigenética y a las modificaciones

postraduccionales, respectivamente, los metabolitos actúan como indicadores directos de la actividad

bioquímica y son, por tanto, fácilmente correlacionados con el fenotipo (Sheth et al., 2014). Por dicho

motivo, la metabolómica está llamada a complementar la información bioquímica obtenida de los

genes y las proteínas, facilitando las reconstrucciones genómicas actuales del metabolismo y

mejorando nuestra comprensión de la biología celular y fisiología de diferentes sistemas biológicos.

La plasticidad vegetal que permite la adaptación de estos organismos sésiles al medio y a los cambios

ambientales origina una elevada diversidad físico-química en las estructuras moleculares y la

naturaleza química de los metabolitos, especialmente los denominados metabolitos secundarios.


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Se ha estimado que existen aproximadamente 200.000 metabolitos en plantas. Cada planta puede

producir entre 5.000-25.000 metabolitos diferentes (Trethewey, 2004). Además de los carbohidratos,

ácidos grasos y proteínas, se han identificado más de 100.000 metabolitos secundarios, como los

isoprenoides, fenilpropanoides y alcaloides (Ilustración 1). La biosíntesis y la acumulación de los

metabolitos secundarios muestran una gran especificidad espacio-temporal y son, en ocasiones,

compuestos únicos en ciertas especies vegetales (Sumner et al., 2003, Schawab, 2003, Kim et al.,

2015).

Ilustración 1. Diversidad de metabolitos secundarios y rutas metabólicas principales de biosíntesis. Se muestran

los metabolitos secundarios mayoritarios en el reino vegetal y las principales rutas metabólicas de origen (Glucolisis,

Ciclo de Krebs y Ciclo de Calvin). Esquema adaptado de Tissier et al, 2014.


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Al contrario que las proteínas, la estructura química no puede ser predicha basándonos en la secuencia

del genoma, haciendo incluso más difícil la determinación. Tal complejidad es un reto analítico

enorme, necesitándose poderosas herramientas para la separación y la caracterización de las muestras.

Son múltiples las metodologías que se emplean para la detección, cuantificación y elucidación de la

estructura de los metabolitos.

El flujo de trabajo de un análisis metabolómico (Ilustración 2) comprende al menos 5 etapas

fundamentales; (1) la preparación de la muestra, (2) el empleo de métodos analíticos para la

adquisición de los datos, (3) el análisis de los datos y (4) la identificación y cuantificación de los datos

empleando análisis estadísticos y bioinformáticos para alcanzar (5) una aproximación o interpretación

biológica de los resultados.

Ilustración 2. Flujo de trabajo de un análisis metabolómico. En un procedimiento de metabolómica no dirigida, los

metabolitos de las muestras biológicas son previamente aislados. Subsecuentemente, se obtienen los datos espectrales

a partir de técnicas de NMR, LC-MS y GC-MS. Una vez adquiridos los datos, estos son procesados empleando diversos

softwares bioinformáticos para alcanzar la identificación del mayor número posible de compuestos y finalmente

realizar una interpretación biológica adecuada. Esquema adaptado de Alonso et al, 2015.


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En el intento de identificar las diferencias fenotípicas observables de los órganos para su correlación

con el fenotipo molecular y metabolómico se ha realizado la identificación y cuantificación de los

metabolitos, empleando técnicas de GC-MS (Ilustración 3).

La espectrometría de masas es una técnica analítica que permite la adquisición de datos espectrales en

función de la relación masa/carga (m/z) y la intensidad relativa de los elementos analizados Para que

el espectrómetro pueda generar los picos de señal de cada metabolito, las muestras biológicas deben

ser previamente ionizadas. Los compuestos ionizados resultantes de cada molécula generarán

diferentes patrones de picos que definen la huella o el perfil de la molécula original. En metabolómica,

generalmente se requieren de un paso previo de separación. Este paso reduce la elevada complejidad

de la muestra biológica y permite dirigir el análisis a un conjunto determinado de compuestos. Las

columnas de cromatografía de líquidos y gases (LC y GC, respectivamente) son las técnicas de

separación más comúnmente empleadas (Theodoridis et al., 2011). Dicha técnica de separación

cromatográfica está basada en la interacción de los diferentes metabolitos contenidos en la muestra

con los materiales adsorbentes en la columna cromatográfica. De este modo, los metabolitos con

diferentes propiedades químicas poseerán distintos tiempos de retención (tiempo necesario para pasar

a través de la columna). El tiempo requerido por cada metabolito, se emplea junto a los valores de la

relación masa/carga que se obtendrán en el espectrómetro de masas generando la información

necesaria para la identificación de los metabolitos empleando las distintas bases de datos disponibles

(LipidBank, LIPID MAPS, Metlin Database, NIST, MetaCyc, Golm Metabolome Database, etc). Así,

se combinan ambas técnicas, denominándose LC-MS y GC-MS.

Ilustración 3. Esquema básico de un sistema GC-MS. Se muestran los elementos constituyentes básicos de un equipo

de GC-MS, consistente en un elemento inyector de la muestra, la fuente de ionización, el analizador de masas, el

sistema de detección de los iones y finalmente un elemento procesador de los datos.


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Para la realización de este trabajo de investigación, desde un punto de vista interdisciplinar, se ha

requerido de conceptos científicos y aproximaciones experimentales del campo de la biología y la

química (desde aspectos fisiológicos del organismo de estudio y propiedades físicas y químicas de los

componentes moleculares) para alcanzar la comprensión de los mecanismos moleculares en los

sistemas biológicos complejos.

Se debe destacar la naturaleza novedosa de esta aproximación al perfil metabolómico de los distintos

órganos de encina u otras especies forestales. Esto queda reflejado debido a la escasa bibliografía

reciente. De hecho, la mayoría de los trabajos que han enfrentado sus problemas con este tipo de

aproximación han sido referentes a la determinación del perfil metabolómico de respuesta a distintos

estreses. En ellos, han empleado 1H-NMR para la determinación del perfil en la respuesta a heridas en

el proceso de germinación de semillas de Quercus ilex (Sardans et al., 2014), GC-MS en respuesta a

estrés biótico (Adjami et al., 2016, Kersten et al., 2013) o espectroscopía FT-IR y GC en respuesta a

la desecación (Connor et al, 2003). En definitiva, no se ha realizado la determinación del perfil de

metabolitos para el estudio descriptivo del metaboloma de distintos tipos de órganos de encina como

se ha pretendido realizar en este trabajo.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Material vegetal, condiciones de crecimiento y muestreo

Las bellotas se recolectaron de una encina de una población de Quercus ilex procedente de la

localidad Aldea de Cuenca (Fuente Obejuna, Córdoba) (coordenadas UTM Huso 30 ETRS89 (x:

288570, y: 4238235.9)) en el año 2015 (Ilustración 4). Tras su transporte al laboratorio, se procedió

a la limpieza y selección de los frutos, siguiendo el protocolo previamente establecido por Bonner

(Bonner et al., 1987).

Los frutos se sumergieron en agua, eliminando aquellos que flotasen, y que correspondieron a frutos

dañados. Para su esterilización, las bellotas se transfirieron a una solución de agua: hipoclorito de sodio

al 2,5% (1:1; v:v) conteniendo unas gotas de Tween 20, dejándose en dicha solución durante 20

minutos. Finalmente, se lavaron abundantemente con agua, se secaron a temperatura ambiente y se

almacenaron a 4 oC en bolsas de polietileno herméticamente cerradas (Caliskan, 2014, Corbineau et

al., 2014).


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Las bellotas fueron germinadas. Para garantizar una germinación homogénea y evitar germinación

escalonada, se eliminó el pericarpo y la porción distal de las bellotas. Se dispusieron en macetas de 0.5

L conteniendo perlita y se llevaron, para su germinación y crecimiento, al invernadero.

El riego con agua corriente se llevó a cabo periódicamente, manteniendo condiciones altas de humedad

(capacidad de campo). A los tres meses se muestrearon las plantas, se lavaron abundantemente con

agua de grifo y agua destilada, se secaron, congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ±

1 oC hasta su análisis.

Ilustración 4. Material vegetal. a. Localización de muestreo, Aldea de Cuenca (Fuente Obejuna, Provincia de

Córdoba). b. Individuo de muestreo, encina con características de individuo élite. Se observa el tamaño diferencia con

respecto a los otros individuos de la población. c. Preparación de las bellotas para su germinación. Se observan los

múltiples cotiledones. d. Plántulas de tres meses de edad recolectadas.


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2.2. Extracción de metabolitos y derivatización

Se llevó a cabo la extracción de metabolitos mediante un procedimiento clásico de dobles

solventes y siguiendo la metodología descrita por el Dr. Luis Valledor (Universidad de Oviedo), con

algunas modificaciones (Valledor et al., 2014a), tal y como se detalla en la Ilustración 5.

Se ajustó la relación de peso seco con los volúmenes de solventes y se optimizaron los tiempos de

incubación en baño de ultrasonidos para maximizar el contenido de metabolitos en el extracto. Los

distintos órganos a analizar (bellota sin germinar, hoja y raíz) se homogenizaron con mortero y

nitrógeno líquido. El material molido se liofilizó (Liofilizador de mesa LABOTEC) durante 24 horas.

Los extractos de metabolitos resultantes (fracción soluble en metanol: agua (fracción polar) y la

fracción soluble en cloroformo (fracción apolar)) fueron secados mediante el empleo de un

concentrador SpeedVac (Concentrator plus, Eppendorf).

La derivatización de los compuestos de la fracción polar se llevó a cabo con una mezcla de 20 mg de

clorhidrato de metoxiamina en 500 µL de piridina. La mezcla se calentó o sonicó durante 30 segundos.

Se añadieron 20 µL de dicha mezcla a la muestra y se incubó durante 30 minutos a 37 oC en un agitador

térmico. Para la sililación de los metabolitos se añadió 70 µL de MSTFA (N-metil-N-(trimetilsilil)

trifluoroacetamida, Sigma-Aldrich) a las muestras y se incubaron durante 30 minutos a 37 oC en un

agitador térmico. Los compuestos de la fracción apolar fueron derivatizados con una mezcla de 295

µL de MTBE (éter metil tert-butílico, Sigma-Aldrich) y 5 µL de TMSH (trimetilsulfonio hidróxido,

Sigma-Aldrich) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras este tiempo, ambas fracciones

derivatizadas se centrifugaron durante 3 minutos a 20.000 g, transfiriendo el sobrenadante a los

microviales de GC.


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Ilustración 5. Protocolo de extracción de

metabolitos. Se obtuvieron dos fases claramente

diferenciadas que corresponden con la fracción más

polar de los metabolitos (fase superior) y la fracción

más apolar de los metabolitos (fase inferior). Ambas

fracciones fueron analizadas independientemente

mediante GC-MS.


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2.3. Análisis por GC-MS

Se siguió el procedimiento y la metodología empleada en el grupo del Dr. Luis Valledor

(Meijón et al., 2016, Furuhashi et al., 2012), con algunas modificaciones.

Las medidas de GC-MS se realizaron siguiendo el procedimiento (Furuhashi et al., 2012) en un

instrumento de triple cuadrupolo (TSQ Quantum GC, Thermo) disponible en el servicio de

metabolómica del Servicio Central de Apoyo a la Investigación (SCAI-UCO,

http://www.uco.es/probiveag/proyectos.html) y un instrumento de un cuadrupolo (Agilent 5975B

GC/MSD, Agilent) de los Servicios Científico-Técnicos de la Universidad de Oviedo

(http://www.sct.uniovi.es/).

Para ambas fracciones, se inyectó 1 µL de muestra y se realizó la separación por cromatografía de

gases mediante una columna capilar HP-5MS (30m x 0,25 mm x 0,25 mm, Agilent Technologies. El

caudal del proceso cromatográfico fue de 1.2 mL/ min. La temperatura del inyector fue 230 oC. Los

rangos de temperaturas del proceso y los parámetros de adquisición de datos del espectrómetro de

masas presentaron pequeñas diferencias (Ilustración 6).

Para la fracción polar, las temperaturas del horno fueron incrementando desde 70 oC a 310 oC. Las

rampas de temperatura fueron de 70 oC a 76 oC (0.75 oC/min), luego, fue incrementando desde 76 oC

a 180 oC (6 oC/min), de 180 oC a 200 oC (3.5 oC/min) y, por último, 200 oC hasta 310 oC (6 oC/min).

Ilustración 6. Protocolos de rampas de temperatura de la separación cromatográfica. Se emplearon distintas

rampas de temperatura para las fracciones polares y apolares de los extractos de metabolitos.

http://www.uco.es/probiveag/proyectos.html

http://www.sct.uniovi.es/


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Después de la separación, las condiciones de temperatura fueron 320 oC durante 10 minutos. El

intervalo de tiempo de detección fue de 6.10 a 50.4 minutos. El análisis de masas (m/z) se llevó a cabo

en un equipo de impacto electrónico (EI) a 70 eV en intervalos de escaneado de 40-800 m/z.

Para la fracción apolar, las temperaturas del horno fueron incrementando desde 80 oC a 270 oC. Las

rampas de temperatura fueron de 80 oC a 190 oC (8 oC/min), luego, fue incrementando desde 190 oC a

220 oC (5 oC/min) y, por último, 220 oC hasta 270 oC (5 oC/min). Después de la separación, las

condiciones de temperatura fueron 310 oC durante 10.25 minutos. El intervalo de tiempo de detección

fue de 7.00 a 34.00 minutos. El análisis de masas (m/z) se llevó a cabo en un equipo de impacto

electrónico (EI) a 70 eV en intervalos de escaneado de 40-600 m/z.

2.4. Alineamiento de los cromatogramas y cuantificación de los metabolitos

Se realizó el análisis y procesamiento de los datos obtenidos por GC-MS empleando el software

MZmine 2.24 (http://mzmine.github.io/) y AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and

Identification System; http://www.amdis.net/).

Los datos de masa fueron procesados y comparados empleando el software MZmine 2.24 (Pluskal et

al, 2010). Los espectros de masas fueron filtrados por establecimiento de un límite de intensidad de

4.5E03. Los picos fueron suavizados y deconvolucionados empleando el algoritmo de Local Minimun

Search. Los cromatogramas fueron alineados empleando el algoritmo de RANSAC con una tolerancia

de 3 ppm de m/z y 0.1 minutos de tiempo de retención. Las áreas de picos fueron normalizadas por el

área total y se emplearon para la cuantificación. Sus valores fueron transformados mediante logaritmo

en base 10 para disminuir el porcentaje del coeficiente de variación por reducción de la dependencia

media: desviación estándar.

2.5. Identificación de metabolitos

Para la identificación de los metabolitos se empleó el software AMDIS y NIST.MS Search

(versión 2.01, http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/). Los perfiles de espectros obtenidos se

compararon con los espectros teóricos de diversas bases de datos (Alkane, Fiehn library 1 y 2, Gölm

Metabolome Database, GC-TSQ, MoSys y NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library). Los compuestos

anotados se registraron junto a sus tiempos de retención, masas espectrales características y los valores

de área de pico.

http://mzmine.github.io/

http://www.amdis.net/

http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/


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ina2

8


2.6. Análisis estadístico y bioinformático

Se realizó la cuantificación de los metabolitos anotados mediante las áreas de pico

correspondientes. Se emplearon 3 réplicas técnicas para realizar el análisis metabolómico de los tres

órganos. Los valores de áreas de pico de cada metabolito se normalizaron con los valores de área total

en la muestra. Este paso fue seguido de la transformación por logaritmos.

Las áreas normalizadas fueron escaladas y se realizó un análisis de componentes principales (PCA) y

análisis de agrupamiento por mapa de calor siguiendo las recomendaciones dadas (Valledor & Jorrín-

Novo, 2011). Los procedimientos estadísticos fueron realizados con el software R versión 3.4.0 (R

Development Core Team, 2017) y RStudio (RStudio Team, 2016) con las funciones estadísticas

básicas y los paquetes estadísticos, ggfortify, corrplot, gcookbook, plyr, reshape, scales, entre otros.

El diagrama de Venn fue elaborado empleando el paquete VennDiagram (Chen & Boutros, 2011). Se

construyeron los “heat maps” empleando el método de distancias euclidianas agrupando los

metabolitos por distintas familias químicas y órganos. El análisis multivariante fue llevado a cabo por

un análisis de componentes principales (PCA). Para el análisis univariante se llevó a cabo un análisis

de Shaphiro-Wilk y de Levene, seguido de los test de ANOVA de una vía y test de Friedman (P<0.05)

(Valledor et al., 2014b). Las gráficas se elaboraron empleando el paquete ggplot2 (Wickham, 2009)

y el software online MetaboAnbalyst 3.0 (Xia &Wishart, 2016).

3. RESULTADOS

Se analizaron dos órganos diferentes de encinas (hoja y raíz) y semillas mediante la técnica

GC-MS. El material vegetal se extrajo con metanol: cloroformo: agua, lo que dio lugar a dos fases que

denominaremos polar y apolar, que fueron las que se inyectaron en los equipos de GC-MS (TSQ

Quantum GC, Thermo y Agilent 5975B GC/MSD, Agilent), tras la derivatización de ambas fracciones,

previamente secadas con SpeedVac (Concentrator plus, Eppendorf). Los cromatogramas obtenidos se

recogen en la Ilustración 7.

El número total de picos resueltos para cada órgano en la fracción polar, 137 (semilla), 136 (hoja) y

155 (raíz), mientras que en la fracción apolar fueron 19 (semillas), 10 (hoja) y 14 (raíz).



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ina2

9

A partir de los espectros m/z y los tiempos de retención y la posterior búsqueda en las bases de datos

(Alkane, Fiehn library 1 y 2, Gölm Metabolome Database, GC-TSQ, MoSys y NIST), utilizando los

algoritmos de búsqueda integrados en los programas AMDIS y NIST.MS Search 2.01, se asignaron

87 compuestos, algunos de ellos presentes en ambas fracciones (Tabla 1 y 2).

Ilustración 7. Cromatogramas (TIC, Total Ion Chromatogram) de GC-MS de los tres órganos. Se muestran los

valores de intensidad de señal de los cromatogramas. a. Cromatogramas superpuestos de la fracción soluble en metanol:

agua (Fracción polar). El rango de tiempo de retención (min) es de 6.1 a 50.4 minutos. b. Cromatogramas superpuestos

de la fracción soluble en cloroformo (Fracción apolar). El rango de tiempo de retención (min) es de 7.0 a 34.0 minutos.

Semilla, rojo; hoja, verde y raíz; azul.



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0

Tabla 1. Metabolitos asignados por las diferentes bases de datos correspondientes a la Fracción Polar. Metabolitos

asignados tras la comparación con las bases de datos (Alkane, Fiehn library 1 y 2, Gölm Metabolome Database, GC-

TSQ, MoSys y NIST). Se muestra fórmula y masa exacta de los compuestos depositados en la base de datos KEGG.

Nombre de compuesto (KEGG) RT (min) Fragmentos

principales (m/z) Fórmula Masa exacta (Da)

Ácido láctico (C00186) 10.69 147 117 191 C3H6O3 90.0317

Ácido glicólico (C00160) 11.21 147 205 177 C2H4O3 76.0160

Ácido pirúvico (C00022) 11.59 147 217 133 C3H4O3 88.0160

Alanina (C00041) 12.13 116 190 75 C3H7NO2 89.0477

Ácido oxálico (C00209) 13.35 147 133 220 C2H2O4 89.9953

Valina (C00183) 15.78 144 218 75 C5H11NO2 117.0790

Urea (C00086) 16.82 147 189 171 CH4N2O 60.0324

Ácido fosfórico (C00009) 17.22 299 314 211 H3PO4 97.9769

Leucina (C00123) 17.39 158 147 232 C6H13NO2 131.0946

Glicerol (C00093) 17.60 205 218 133 C3H9O6P 172.0137

Prolina (C00148) 17.87 142 147 75 C5H9NO2 115.0633

Isoleucina (C00407) 17.94 158 147 218 C6H13NO2 131.0946

Ácido maleico (C01384) 18.19 147 245 75 C4H4O4 116.0110

Ácido succínico (C00042) 18.40 147 247 75 C4H6O4 118.0266

Ácido glicérico (C00258) 19.03 292 147 189 C3H6O4 106.0266

Serina (C00065) 19.74 204 218 147 C3H7NO3 105.0426

Treonina (C00188) 20.38 218 291 117 C4H9NO3 119.0582

Eritrosa (C01796) 21.49 147 201 117 C4H8O4 120.0423

Ácido málico (C00149) 22.70 147 233 245 C4H6O5 134.0215

Ácido fumárico (C00122) 23.19 156 147 232 C4H4O4 116.0110

Ácido piroglutámico (C01879) 23.19 156 147 232 C5H7NO3 129.0426

Aspartato (C00049) 23.32 232 218 147 C4H7NO4 133.0375

GABA (C00334) 23.37 174 304 147 C4H9NO2 103.0633

Glutamato (C00025) 25.23 246 147 128 C5H9NO4 147.0532

Fenilalanina (C00079) 25.25 218 192 266 C9H11NO2 165.0790

Asparagina (C00152) 26.24 231 116 132 C4H8N2O3 132.0535

Arabinosa (C00259) 26.34 307 217 103 C5H10O5 150.0528

Xilulosa (C00310) 26.62 205 147 263 C5H10O5 150.0528

Ácido cis-aconítico (C00417) 27.69 147 229 375 C6H6O6 174.0164

Ácido salicílico (C00805) 27.97 267 370 193 C7H6O3 138.0317

Ácido ribónico (C01685) 28.39 292 217 147 C5H10O6 166.0477

Fructosa (C00095) 29.33 217 437 147 C6H12O6 180.0634

Ácido cítrico (C00158) 29.50 273 147 347 C6H8O7 192.0270

Ácido quínico (C00296) 30.37 345 255 147 C7H12O6 192.0634

Ácido galactónico (C0088) 30.89 205 275 147 C6H12O7 196.0583

Sorbosa (C00247) 31.08 217 307 103 C6H12O6 180.0634

Galactosa (C00124) 31.20 319 205 147 C6H12O6 180.0634

Glucosa (C00031) 31.35 319 205 147 C6H12O6 180.0634

Mio-inositol (C00137) 31.65 305 318 217 C6H12O6 180.0634

Manitol (C00392) 31.91 319 205 217 C6H14O6 182.1718

Sorbitol (C00794) 32.05 319 147 217 C6H14O6 182.079

Ácido ascórbico (C00072) 32.13 332 147 205 C6H8O6 176.0321



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1

Continuación de la Tabla 1

Ácido gálico (C01424) 32.17 458 281 443 C7H6O5 170.0215

Viburnitol (C08259) 32.50 217 191 204 C6H12O5 164.0685

Ácido glucónico (C00198) 33.3073 292 319 147 C6H10O6 178.0477

Ácido palmítico (C00249) 33.50 313 117 129 C16H32O2 256.2402

Ácido glucárico (C00818) 33.63 333 292 305 C6H10O8 210.0376

Ramnosa (C00507) 33.96 204 319 220 C6H12O5 164.0685

Ácido galactárico (C00879) 34.25 217 204 292 C6H10O8 210.0376

Ácido 3-deoxy-arabinohexárico 35.53 245 147 319 C14H8O2 208.0524

Ácido oleico (C00712) 36.60 339 129 117 C18H34O2 282.2559

Ácido esteárico (C01530) 37.03 341 117 129 C18H36O2 284.2715

Glucosa 6-P (C00092) 39.08 387 299 357 C6H13O9P 260.0297

Ácido galacturónico (C00333) 39.80 217 204 292 C6H10O7 194.0427

Sacarosa (C00089) 43.56 361 217 437 C12H22O11 342.1162

Maltotriosa (C01835) 44.19 361 204 217 C18H32O16 504.1690

Melibiosa (C05402) 44.27 204 217 147 C12H22O11 342.1162

Celobiosa (C00185) 44.79 204 361 217 C12H22O11 342.1162

Maltosa (C00208) 44.89 361 204 217 C12H22O11 342.1162

Catequina (C06562) 46.10 368 355 204 C15H14O6 290.0790

Antraquinona (C16207) 46.26 369 267 204 C14H8O2 208.0524

Epigalocatequina (C12136) 46.65 456 355 345 C15H14O7 306.0740

Tabla 2. Metabolitos asignados por las diferentes bases de datos correspondientes a la Fracción Apolar. Metabolitos

asignados tras la comparación con las bases de datos (Alkane, Fiehn library 1 y 2, Gölm Metabolome Database, GC-TSQ,

MoSys y NIST). Se muestra fórmula y masa exacta de los compuestos depositados en la base de datos KEGG.

Nombre de compuesto

(KEGG) RT (min)

Fragmentos

principales (m/z) Fórmula Masa exacta (Da)

Tridecano (C13834) 9.82 112 98 85 C13H28 184.2191

Ácido palmítico (C00249) 15.92 270 227 143 C16H32O2 256.2402

Ácido linoleico (C01595) 18.36 294 263 109 C18H32O2 280.2402

Ácido oleico (C00712) 18.48 264 222 180 C18H34O2 282.2559

Ácido esteárico (C01530) 18.89 298 255 199 C18H36O2 284.2715

El número de picos no asignados (eliminando artefactos) en ambas fracciones y para semilla, hoja y

raíz fue de 4 (semilla), 6 (hoja) y 5 (raíz), lo que globalmente representa un 93% de productos

asignados. La distribución de los metabolitos asignados en los diferentes órganos se representó

mediante diagrama de Venn (Ilustración 8.a). 65 compuestos fueron comunes a los tres órganos, y 2,

8 y 1 compuestos específicos de semillas, hoja y raíz, respectivamente. Los metabolitos asignados se

clasificaron en familias químicas, según: ácidos grasos, aminoácidos proteicos y no proteicos, ácidos

orgánicos, compuestos fenólicos, carbohidratos y no identificados. En la Tabla 3 e Ilustración 8.b se

muestra dicha clasificación y número de compuestos correspondientes a cada familia y detectados en

los distintos órganos.



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2

Tabla 3. Metabolitos asignados por las diferentes bases de datos. Se presenta los 87 metabolitos asignados y a las

distintas familias de compuestos que pertenecen.

Naturaleza de

los compuestos Compuestos (KEGG)

Aminoácidos

proteicos

Alanina (C00041) Valina (C00183)

Leucina (C00123) Glutamato (C00025)

Prolina (C00148) Isoleucina

(C00407) Serina (C00065)

Treonina (C00188) Aspartato (C00049)

Fenilalanina (C00079) Asparagina (C00152)

Ácidos grasos Ácido palmítico (C00249)

Hexadecanoilglicerol

Ácido esteárico (C01530)

Ácido oleico (C00712) Ácido linoleico (C01595)

Tridecano (C13834)

Ácidos

orgánicos

Ácido láctico (C00186) Ácido glicólico (C00160) Ácido pirúvico (C00022) Ácido oxálico (C00209)

Ácido fosfórico (C00009) Ácido maleico (C01384)

Ácido succínico (C00042) Ácido glicérico (C00258) Ácido glucárico (C00818) Ácido quínico (C00296)

Ácido galactónico (C0088) Ácido galactárico (C00879)

Ácido fumárico (C00122) Ácido málico (C00149)

Ácido piroglutámico (C01879) Ácido 2-oxo-glutárico

Ácido cis-aconítico (C00417) Ácido salicílico (C00805) Ácido ribónico (C01685) Ácido cítrico (C00158)

Ácido glucónico (C00198) Ácido ascórbico (C00072)

Ácido gálico (C01424) Ácido 3-deoxy-arabinohexárico

Compuestos

fenólicos Antraquinona (C16207) Catequina (C06562) Epigalocatequina (C12136)

Carbohidratos

Maltosa (C00208) Arabinosa (C00259)

Cellobiitol Ácido galacturónico (C00333)

Alofuranosa Celobiosa (C00185) Eritrosa (C01796) Fructosa (C00095) Galactosa (C00124) Glucosa (C00031)

Glucosa 6-P (C00092)

Ácido 1,4-lactona lixónico Maltotriosa (C01835)

Manitol (C00392) Melibiosa (C05402) Sorbitol (C00794) Sorbosa (C00247) Sacarosa (C00089)

Viburnitol (C08259) Xilulosa (C00310) Ramnosa (C00507)

Aminoácidos no

proteicos 3-ciano-alanina

Ornitina-1,5-lactámico Ácido 4-aminobutírico (GABA) (C00334)

Otros y no

asignados

Mio-inositol (C00137) Urea (C00086)

Glicerol (C00093) Butiro-1,4-lactámico

6 no presentes en la base de datos Hidroxilamina

Monometilfosfato



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3

Se llevó a cabo un análisis estadístico univariante y multivariante de los datos de las áreas de pico

normalizadas por el área total de cada muestra y transformadas por logaritmos en base 10. El análisis

de componentes principales (PCA) de los metabolitos de ambas fracciones (polar y apolar) nos permite

distinguir y agrupar las muestras pertenecientes a los tres órganos analizados (Ilustración 9.a.). El

modelo de dos componentes establecido explica el 99.4% de la variabilidad. Se muestra la

representación gráfica como cada uno de los metabolitos contribuye a la variabilidad y permite

discriminar muestras (Ilustración 9.b.).

Ilustración 8.a. Diagrama de Venn. Diagrama de

Venn comparando el número de metabolitos que se

detectan en los tres órganos. b. Diagrama de barras

de los grupos de metabolitos asignados en los

distintos órganos. Se indica el número de

compuestos de las distintas naturalezas químicas

(ácidos grasos, aminoácidos no proteicos, ácidos

orgánicos, compuestos fenólicos, aminoácidos

proteicos, carbohidratos, otros y desconocidos).

Semilla, rojo; hoja, verde y raíz; azul.



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4

Los valores de área de pico de los metabolitos asignados en los distintos tejidos mostraron tanto

diferencias cuantitativas, como en un número bajo de casos, diferencias cualitativas. Las diferencias

cuantitativas quedan de manifiesto cuando utilizamos un “heat map” (Ilustración 10). Se muestra la

similitud de las réplicas de los distintos órganos por agrupación por distancias euclidianas.

Ilustración 9. Análisis de componentes principales (PCA) de los tres órganos. PCA de los 87 compuestos

detectados en los distintos órganos de encina. a. Representación gráfica de las componentes. Los ejes corresponden

a las dos primeras componentes (PC1, 68% y PC2, 31.5%). Semilla (círculos rojos), hoja (triángulos verdes) y raíz

(cuadrados azules). b. Representación gráfica de las cargas (Loadings). Se muestran con flechas rojas los compuestos

empleados para la realización del modelo. La longitud de la flecha roja indica la relación entre las variables que

componen el modelo.



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5

Ilustración 10. Heat maps de los metabolitos asignados en los tres órganos. a. Ácidos orgánicos. b. Otros y no

identificados. c. Aminoácidos no proteicos. d. Carbohidratos. e. Aminoácidos proteicos. f. Ácidos grasos. g.

Compuestos fenólicos. Los valores de la escala van de 2 (rojo) a -2 (azul). Se representan los valores de las tres réplicas

técnicas por órgano. El color de la celda corresponde con el valor de área de pico normalizado. Semilla, rojo; hoja,

verde y raíz; azul.



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6

4. DISCUSIÓN

Este trabajo ha constituido una primera aproximación a la caracterización del metaboloma de

Quercus ilex mediante el empleo de cromatografía de gases acoplada a masas (GC-MS). Es una

continuación del Trabajo Fin de Grado (López-Hidalgo, 2016), en el que se evaluaron diferentes

técnicas de análisis, incluyendo técnicas colorimétricas, resonancia magnética nuclear de 13C de

muestras sólidas (1D 13C CP-MAS NMR sólida), espectroscopía de infrarrojo cercano (NIRS) y la

propia cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). Se ha establecido el

perfil de metabolitos de tres órganos, semilla, hojas y raíz. Se realizó la extracción de los metabolitos,

etapa clave en cualquier análisis -ómico, mediante un protocolo de extracción de dobles solventes

(metanol: cloroformo: agua) que nos permitió separar dos fases de distinta naturaleza con grupos de

metabolitos de distinta afinidad por dichos solventes (Valledor et al., 2014a). Los cromatogramas

obtenidos se mostraron en la Ilustración 7.

El número de picos resueltos (156 (semilla), 146 (hoja) y 159 (raíz)) y metabolitos anotados (74

(semilla), 79 (hoja) y 71 (raíz) está dentro del rango descrito para otras especies utilizando la misma

metodología (Tabla 4). Aún está lejos del potencial de, por ejemplo, LC-MS y representa sólo una

pequeña fracción del total de metabolitos presente en cualquier especie vegetal, cuyo número de

compuestos oscila entre 5.000 y 25.000, lo que es comparable al orden de magnitud del número de

genes (Trethewey, 2004). La necesitad de volatizar dichos compuestos mediante derivatización, es en

gran medida la causa de la elevada diferencia de picos resueltos y metabolitos anotados putativamente.

Dichos picos pertenecían a artefactos o a la derivatización diferencial de un mismo metabolito, debido

al grado de sililación con trimetilsilanol (TMS) de los grupos -OH, -COOH y NH2, afectando de este

modo a aminoácidos y carbohidratos con un elevado número de estos grupos funcionales (Rohloff,

2015).

El potencial de la metodología queda reflejado en numerosos trabajos previos sobre especies vegetales

(Tabla 4). Estos trabajos exponen el potencial de la combinación de múltiples plataformas aportando

una mayor cantidad de información. En nuestro trabajo, a pesar del empleo único de GC-MS y nuestra

especie de estudio, se obtienen resultados equiparables a los obtenidos por Safronov et al., 2017 y

Furuhashi et al., 2012. El empleo de distintos solventes para la extracción o incluso la extracción

secuencial de los permitiría abarcar un mayor número de metabolitos (Shu et al. 2008) y de familias

químicas distintas (Tablas 1, 2 y 3). Además, como nos muestra el PCA (Ilustración 9.a), la

cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) es una estrategia analítica



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ina3

7

robusta ya que los resultados fueron muy similares entre réplicas técnicas y eficientes para la

discriminación de los distintos órganos.

Tabla 4. Resumen de resultados de trabajos previos de metabolómica no dirigida sobre especies vegetales.

Referencia Organismo Instrumentos

empleados Resultados

Turner et al., 2016 10 líneas de Sorgo (Sorghum spp.) GC-MS y UPLC-MS 1181 metabolitos

Furuhashi et al., 2012 Cuscuta japonica GC-MS 31 metabolitos

Arbona et al., 2009 Citrus y Prunus GC-MS y HPLC-MS 1223 metabolitos

Moing et al., 2011 Tejidos diferentes del fruto de

melón (Cucumis melo)

1H-NMR, HPLC-PDA-

FL, GC-MS, LC-MS,

ICP-MS

2000 metabolitos

Safronov et al., 2017 Hoja y raíz de palmera (Phoenix

dactylifera) GC-MS 101 metabolitos

Kim et al., 2014 Hojas de 136 mutantes de

Arabidopsis (Arabidopsis thaliana)

11 plataformas de MS

distintas 4483 metabolitos

Los espectros de GC-MS obtenidos se compararon con los espectros teóricos disponibles en bases de

datos y se anotaron putativamente 87 compuestos. Como se ha mostrado en la Tabla 3, se detectaron

metabolitos de distintas familias químicas como, ácidos grasos, aminoácidos proteicos y no proteicos,

ácidos orgánicos, compuestos fenólicos, carbohidratos y otros. La distribución de dichas familias

químicas fue diferente en los distintos órganos, como se ha expuesto en la Ilustración 8.b. El perfil

de ácidos grasos fue cualitativamente el mismo en los tres órganos, existiendo diferencias cualitativas

entre ellos. Se observaron mayores diferencias en las otras familias químicas, destacando el mayor

perfil de ácidos orgánicos, compuestos fenólicos y carbohidratos en hojas y el mayor perfil de

aminoácidos proteicos en semillas.

Otras aproximaciones en trabajos previos han aportado información sobre la composición de semillas

y hojas. Resultados previos de análisis metabolómico de hojas de encina mediante resonancia

magnética nuclear (1H-NMR) identificaron aminoácidos proteicos, como valina, glutamato, alanina,

isoleucina y leucina. También, ácidos orgánicos como ácido fórmico, ácido málico, ácido cítrico, ácido

acético y ácido láctico (Sardans et al., 2013). Empleando espectroscopía de infrarrojo cercano (NIRS)

se analizó el perfil de compuestos mayoritarios en bellota, obteniéndose una valiosa información sobre

el perfil de ácidos grasos (ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico y ácido linoleico) y el

contenido en proteínas, almidón y azúcares (Valero et al., 2012). Los compuestos detectados coinciden

con los perfiles de metabolitos obtenidos en el presente trabajo (Tabla 1 y 2).

Los metabolitos más solubles en cloroformo fueron ácidos grasos (ácido palmítico, ácido oleico, ácido

esteárico y tridecano). Los metabolitos más solubles en metanol: agua fueron de una mayor diversidad



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ina3

8

de familias químicas, desde ácidos grasos y monoglicéridos (hexadecanoilglicerol), aminoácidos

proteicos y no proteicos, ácidos orgánicos, carbohidratos y compuestos fenólicos.

Los resultados obtenidos por GC-MS nos han permitido observar que las semillas, hojas y raíces de

encina poseen pequeñas diferencias en su perfil de metabolitos, fundamentalmente primarios. El perfil

de metabolitos dependió del órgano, aunque hay metabolitos comunes, siendo estos 65 compuestos

(Ilustración 8.a). Estos compuestos comunes, productos intermediarios del metabolismo, presentaron

diferencias cuantitativas en los distintos órganos. Eran fundamentalmente ácidos orgánicos

participantes en el ciclo de Krebs, aminoácidos constituyentes de proteínas, carbohidratos y ácidos

grasos. Las particularidades, tanto diferencias cualitativas como cuantitativas, se entienden teniendo

en cuenta las características biológicas de cada órgano y su metabolismo, siendo los cambios en el

metabolismo vegetal, la clave de los procesos de desarrollo de la planta. Además, los perfiles de

metabolitos aportan información funcional directa de los fenotipos metabólicos, tanto en condiciones

fisiológicas, estrés o patogenia (Meijón et al., 2016).

Como se ha expuesto en la Ilustración 10, las áreas de pico normalizadas de los 87 compuestos

permiten discriminar entre los tres órganos.

El contenido de ácidos orgánicos (Ilustración 10.a) es mayor en hojas y menor en raíces. Destaca el

contenido de ácido salicílico en raíces. El ácido salicílico juega un papel fundamental en el

crecimiento, regulador de la fotosíntesis, absorción de agua y defensa. También posee una función

esencial en la regulación de la toma de nutrientes, así como, la diferenciación vascular, el desarrollo

de hojas y la senescencia (Rubio et al, 2009). En estudios previos, se ha observado que el contenido

de ácido salicílico se ve incrementado en condiciones de estrés térmico, y éste se transporta por el

xilema desde la raíz a la parte aérea de la planta. (Liu et al. 2008). En hoja destaca el mayor contenido

de ácido ascórbico, donde principalmente es producido, para su transporte hacia otros órganos de la

planta por el floema. En la hoja se ha demostrado su participación en los procesos redox frente al estrés

oxidativo durante la fotosíntesis (Franceschi & Tarlyn, 2002). El contenido de ácidos orgánicos,

intermediarios del ciclo de Krebs, es mayor en hojas que en raíz. Estas observaciones coinciden con la

percepción clara de que ambos tejidos expresan vías regulatorias completamente diferentes, la función

principal de las hojas en la fijación de CO2 y síntesis de sacarosa y las raíces como órganos no

prototípicamente verdes como tejido de reserva y dependiente del transporte de sacarosa (Morgenthal

et al., 2006).

El contenido en aminoácidos proteicos (Ilustración 10.e) es mayor en semillas y raíz que en hoja. Los

aminoácidos libres juegan un papel primordial como molécula de almacenamiento de nitrógeno y en



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la síntesis de proteínas (Kimball & Jefferson, 2006). El contenido en ácido gamma-aminobutírico

(GABA), aminoácido no proteico, participante en funciones de transmisión de señales (Ilustración

10.c) es mayor en semilla. Se ha demostrado que el GABA se acumula rápidamente en los tejidos en

situaciones de estrés biótico y abiótico, además de regular el crecimiento de la planta. (Ramesh et al.,

2015). Su contenido en semillas se ha relacionado como señalizador del estado del contenido de

nitrógeno en la germinación de semillas, del mismo modo que los azúcares actúan como señal de la

situación de disponibilidad de carbono en la plántula (Roberts, 2006).

En semilla, también se encuentra un mayor contenido de mio-inositol. El mio-inositol juega un papel

importante en etapas tempranas del desarrollo de las semillas, siendo determinante para la distribución

de algunos componentes de almacenamiento en semillas (Dong et al., 2013). La mayoría de los

metabolitos no identificados en las bases de datos pertenecieron a las hojas (lustración 10.b).

El contenido en azúcares y carbohidratos (oligosacáridos y monosacáridos) (Ilustración 10.d) es

mayor en semillas. En el endospermo de semillas, el alto contenido de azúcares se ha visto relacionado

con el suministro de fuente de carbono para el desarrollo del embrión de la planta (Hill et al., 2003).

En hojas, el contenido es menor, exceptuando el contenido de carbohidratos relacionados con la

celulosa, como celobiosa. En especies de plantas leñosas se han determinado mediante NIRS el

contenido de celulosa en hojas, siendo este de valores de un 15 a 25% en las distintas especies de

Quercus (Petisco et al., 2005). Además, se destaca el mayor contenido de glucosa 6-fosfato en hoja,

relacionado con un mayor metabolismo del carbono en hojas (Morgenthal et al., 2006).

No se han obtenido resultados tan claros en el perfil de ácidos grasos entre los distintos órganos y

réplicas (Ilustración 10.f). Coincidiendo con estudios previos, en los cuales se ha determinado que el

ácido oleico constituía hasta un 64% del contenido de ácidos grasos en bellota, se ha determinado un

mayor contenido de ácido oleico en semilla (Valero et al., 2012).

En especies del género Quercus, estudios previos han determinado el contenido de compuestos

fenólicos en endospermo de semillas (Cantos et al., 2003) y en hojas jóvenes (Makkar et al., 1991),

en el cual se ha detectado un elevado contenido de taninos condensados y proantocianidinas. En

nuestro caso (Ilustración 10.g), se ha determinado que los compuestos fenólicos (catequina,

antraquinona y epigalocatequina) son más abundantes en hoja. El mayor contenido en hojas ha estado

relacionado con su papel fundamental en la defensa del estrés oxidativo ocasionado por estrés biótico

y abiótico (Barbehenn et al., 2005).



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5. CONCLUSIONES

Este trabajo ha constituido una primera aproximación al estudio del perfil metabólico de

diferentes órganos, semilla, raíz y hoja de Quercus ilex.

i. Mediante GC-MS se han resuelto un total de 461 picos, 156 en semillas, 146 en hojas y 159 en

raíces. Se han identificado un total de 87compuestos, 74en semillas, 79 en hojas y 71 en raíces.

ii. Se observaron diferencias cualitativas y cuantitativas entre órganos, representando éstas las

particularidades de cada uno de ellos. Los metabolitos comunes en los distintos órganos

correspondieron a intermediarios metabólicos del metabolismo celular, como ciclo de Krebs y

la glucolisis. Las diferencias más acusadas fueron: un mayor contenido de ácidos orgánicos y

compuestos fenólicos en hojas; un mayor contenido de aminoácidos proteicos, azúcares y

carbohidratos en bellota y la presencia única de ácido salicílico en raíz.

iii. La existencia de metabolitos únicos detectados en los órganos se ha relacionado con funciones

biológicas específicas


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Jesús Valentín Jorrín Novo

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Luis Valledor González

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Cristina López Hidalgo

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