ANTECEDENTES Implicaciones Biológicas del Zinc Intracelular
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ANTECEDENTES
Implicaciones Biológicas del Zinc Intracelular
El zinc es uno de los elementos esenciales más abundantes en el cuerpo humano, y a
nivel intracelular, se le encuentra principalmente en el citosol. Las concentraciones más
elevadas de zinc aparecen en el hígado, páncreas, riñones, huesos y músculos, aunque
existen también concentraciones importantes en el ojo, próstata, espermatozoides, piel, pelo
y uñas. Este metal juega un papel central en procesos biológicos tales como la expresión de
genes, la apoptosis, la regulación enzimática y la neurotransmisión. Por tal motivo, todas
las células, incluyendo las neuronas, disponen de mecanismos de transporte y
almacenamiento de zinc que les permiten mantener la concentración intracelular de este ion
regulada fuertemente, puesto que alteraciones tanto por arriba como por debajo de los
requerimientos fisiológicos resultan fatales para la supervivencia celular.14
Concentraciones intracelulares de zinc anormales se han relacionado con el
desarrollo de ciertas enfermedades como la diabetes tipo 2, cáncer de próstata y algunas de
tipo neurodegenerativo, como el mal de Parkinson y el Alzheimer. A continuación se
describen de manera general las características de estos padecimientos y las implicaciones
del zinc en cada uno de ellos.
Enfermedad de Alzheimer
La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad cerebral progresiva, caracterizada
por los trastornos de la memoria y de diversos campos cognitivos como las funciones
lingüísticas, de praxis y de ejecución. Los rasgos neuropatológicos característicos son:
placas seniles extracelulares (compuestas de depósitos insolubles de fibrillas amiloides),
ovillos neurofibrilares intracelulares, persistente degeneración granulovacuolar y pérdida de
neuronas corticales.5, 15
5
La teoría amiloide sugiere que los oligómeros solubles intracelulares de
betaamiloide (Aß) desencadenan una cascada de eventos que provoca estrés oxidativo y
condiciones metabólicas desfavorables dentro de las neuronas. Posteriormente se produce
el depósito de placas de Aß en la neocorteza, un hallazgo patológico fundamental en esta
enfermedad. Los metales (cobre, hierro y zinc) se concentran dentro y alrededor de las
placas amiloides del cerebro que padece de Alzheimer. Existen pruebas de que estos
metales interactúan con el Aß, catalizando la producción del peróxido de hidrógeno. Esto
contribuye al estrés oxidativo y a la generación de fibrillas de Aß que poseen una gran
tendencia a acumularse, las cuales son tóxicas y resistentes a la depuración.4, 5, 15
Enfermedad de Parkinson
La Enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno del movimiento
neurodegenerativo caracterizado por la pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicas en
la sustancia nigra y la disminución de la dopamina en el cuerpo estriado que se cree es
causada por el estrés oxidativo resultante de la excesiva actividad de los radicales libres, lo
cual conducen a anomalías patológicas y clínicas.16
La enzima cuprozinc superóxido
dismutasa (SODCuZn), cataliza la dismutación del anión superóxido en peróxido de
hidrógeno más oxígeno, y normalmente se encuentra en concentraciones altas en la
sustancia nigra donde protege a las neuronas por los radicales libres.17
Por tal motivo, se
han realizado diversas investigaciones sobre la EP, entre las que sugieren la ingesta de
suplementos de zinc, ya que estudios in vitro demostraron que aumentan significativamente
a la enzima SODCuZn.17
Enfermedad del Diabetes Mellitus
La diabetes mellitus, es una enfermedad caracterizada por altas concentraciones de
glucosa en sangre como una consecuencia de disminución de la secreción o la acción de la
insulina. El zinc parece ejercer efectos similares a la insulina mediante el apoyo de la
transducción de la señal de la insulina y reduciendo la producción de citoquinas, que
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conducen a la muerte de células beta durante el proceso inflamatorio en el páncreas en el
curso de la enfermedad. Además, se ha demostrado que el zinc desempeña un papel en el
desarrollo de la diabetes tipo 1, ya que esta involucrado en los polimorfismos genéticos en
el gen transportador del zinc (ZnT)-8 y en la codificación de los genes de la metalotioneína
(MT), en los cuales, anticuerpos dirigidos contra estos transportadores de zinc
se han detectado en este tipo de pacientes diabéticos.1
Enfermedad del Cáncer de Próstata
El cáncer de próstata es la segunda causa de muerte por cáncer en hombres
estadounidenses, y la mayoría de los hombres de edad avanzada tienen algunas células de la
próstata anormales. Aun así, la causa de este tipo de cáncer no se ha aclarado del todo. La
próstata humana normal, acumula el mayor nivel de zinc que cualquier tejido blando del
cuerpo, pero aún se desconoce el motivo. Sin embargo, la próstata cancerosa tiene menor
cantidad de zinc que la normal y varios estudios han demostrado la alteración del estado de
zinc en el desarrollo y progresión de tumores malignos de próstata. Por otro lado, hay
evidencia de que el aumento de zinc en la dieta está asociado con una disminución en la
incidencia de cáncer de próstata. Estudios recientes han confirmado que en varios tipos de
células los cambios en la concentración de zinc intracelular afecta dramáticamente el daño
y reparación del ADN, y por lo tanto, aumentan el riesgo de cáncer.18
Quimiosensores Fluorescentes
Una de las líneas de investigación más novedosas dentro del área de la química
supramolecular, en la cual se aplica el concepto de reconocimiento molecular, es el diseño
de quimiosensores, los cuales actualmente tienen aplicaciones importantes y favorables
para el ser humano y la investigación. Estas moléculas tienen la capacidad de unirse
selectivamente a algún analito de interés (molécula, catión o anión) y de manera
simultánea, mostrar un cambio detectable y medible en alguna de sus propiedades físicas
como pueden ser sus espectros de absorción y/o emisión, potencial redox, etc.19
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En cuanto al diseño de quimiosensores, la elección de la fluorescencia como señal
de transducción representa ventajas sobre otras propiedades por su alta sensibilidad y
porque permite efectuar análisis altamente selectivos in situ, es decir en el mismo sitio
donde ocurre el fenómeno. Adicionalmente, los equipos analíticos de luminiscencia son
económicos y las metodologías que se aplican son sencillas.20
Por otra parte, el enfoque a la
detección de cationes intracelulares como analitos de estudio es de gran importancia en la
investigación debido al interés biológico. Por tal motivo en esta sección nos enfocaremos al
diseño de quimiosensores fluorescentes para el reconocimiento de cationes.
Los quimiosensores fluorescentes de diseño clásico están constituidos por un centro
de reconocimiento (ionóforo) y una unidad generadora de señal o indicadora (fluoróforo).
Estas dos unidades pueden o no estar unidas a través de un espaciador (ver Figura 1).
Algunas de las unidades de reconocimiento que se utilizan son EDTA y DTPA, como
espaciador se suele utilizar a un grupo metileno y como unidades indicadoras fluorescentes
se han empleado hidrocarburos aromáticos policíclicos como naftaleno, antraceno y
pireno.12, 13,21,22
Figura 1. Representación esquemática del diseño de quimiosensores fluorescentes.
Fuente: [21, 23]
8
Los quimiosensores fluorescentes pueden ser cíclicos o acíclicos (ver Figura 1),
siendo los de tipo acíclico los que presentan flexibilidad mayor al no depender de una
cavidad que limite la interacción. Desde el diseño de los primeros quimiosensores
fluorescentes se han desarrollado estrategias diversas para mejorar la respuesta de
señalización tales como el hecho de colocar un espaciador (por lo común un grupo
metileno) que facilita la flexibilidad para interaccionar con el analito, otra estrategia es la
de diseñar quimiosensores que contengan grupos amino, amida y carboxílico los cuales le
confieren solubilidad mayor en agua, además se han tenido un gran auge en el novedoso
diseño del tipo biscromofórico, los cuales están constituidos por dos unidades fluoróforas
idénticas a través de una cadena de interconexión con propiedades quelantes, ya que tienen
la ventaja de formar excímeros al unirse al catión y de este modo se espera una respuesta
radiométrica por la interconversión excímero-monómero (ver Figura 1).21
Algunos de los modo de respuesta que se pueden obtener por fluorescencia para
medir cualitativa o cuantitativamente un ion metálico se pueden expresar en un cambio
espectral los cuales se describen a continuación (ver Figura 2)23
:
a) Aumento de la intensidad de la fluorescencia (efecto apagado-encendido). Esta
característica comprende al uso de una molécula que presenta nula o muy poca
intensidad de fluorescencia por sí misma, pero cuando interactúa con el ion metálico
la fluorescencia aumenta significativamente. Esto se puede deber a que cuando se
protona el grupo receptor (o interactúa fuertemente con un catión), la transferencia de
electrones se ve obstaculizada y se observa un aumento de fluorescencia muy
grande.23-25
b) Apagamiento de la fluorescencia (efecto encendido-apagado). Este efecto implica un
fluoróforo que presenta por sí sólo una intensidad de fluorescencia alta, pero al estar
en contacto con el ion metálico, la fluorescencia disminuye significativamente o la
apaga por completo. Muchos metales de transición se caracterizan por apagar la
fluorescencia por si mismos al activar el mecanismo de transferencia de energía.23-25
c) Respuesta radiométrica. Esta característica se presenta cuando dos unidades
fluoróforas interaccionan entre sí antes (preasociación) o después de interaccionar
con el ion (formación de excímero) y espectralmente se expresa en un aumento de la
9
banda monomérica y una disminución de la banda de excímero o viceversa.26
Este
comportamiento solo se presenta en quimiosensores de tipo biscromofórico y dicha
respuesta es favorable al reducir al mínimo los errores experimentales, por factores
instrumentales o en la estabilidad de iluminación. Con este tipo de respuesta, la
relación de las señales ópticas se puede utilizar para controlar el equilibrio de
asociación y para calcular la concentración de iones.21-23, 27
d) Desplazamiento en la banda de emisión. Esta característica se refiere al
desplazamiento de la banda espectral hacia una mayor o menor longitud de onda
dependiendo de la presencia o ausencia del ion metálico.23, 24
Figura 2. Representación gráfica de los diversos modos de respuesta espectral de los quimiosensores
fluorescentes al unirse al catión.
Fuente: [24]
Inte
nsi
dad
de
Flu
ore
scen
cia
λ(nm) λ(nm)
Inte
nsi
dad
de
Flu
ore
scen
cia
350 400 450 500 550 600 350 400 450 500 550 600
M2+
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M2+
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Uno de los principales retos en el desarrollo de quimiosensores es obtener sistemas
moleculares con propiedades adecuadas y características mejores para la detección y
cuantificación de cationes que presenten algún interés en específico, como puede ser
analítico, medioambiental y biológico principalmente.
Entre las propiedades que constantemente se busca mejorar en estos dispositivos se
encuentran algunas tales como el obtener moléculas más pequeñas, de baja toxicidad,
mayor solubilidad en agua y altamente sensibles y selectivas para la detección en tiempo
real del catión, preferentemente a un pH fisiológico o intracelular que les confiera
compatibilidad con los sistemas biológicos.10
Algunos analitos de gran interés son los iones metálicos tales como: Na+, K
+, Ca
2+,
Mg2+
y Zn2+
, debido al importante papel que juega en muchos procesos biológicos, para
ello una opción novedosa y favorable para detectar dichos iones han sido el desarrollo de
quimiosensores basados en la emisión de fluorescencia.28,29
Quimiosensores Fluorescentes Solubles en Agua
Los quimiosensores solubles en agua son de interés especial para utilizarse en
sistemas biológicos, sin embargo son muy pocos los que presentan dicha característica y
éstos se han generado en los últimos años. El primer quimiosensor soluble en agua se
reportó en 1990, por Czarnik y col. el cual es un macrociclo que posee una poliamina unido
a un grupo antraceno, el cual responde a los iones H+, Zn
2+ y Cd
2+, que encienden la
fluorescencia del sensor (ver Figura 3).21, 30, 31
Figura 3. Estructura del primer quimiosensor antrilazamacrociclo soluble en agua.
Fuente: [20,31]20, 31
11
La complejidad estructural de los sensores fluorescentes basados en poliaminas
solubles en agua hacen necesario el uso de un conjunto de técnicas analíticas
complementarias a la fluorescencia para caracterizar de manera completa las diferentes
especies del sensor y su comportamiento con respecto al pH del medio y la presencia del
analito..
En 1995, García-España y col. introdujeron por primera vez la superposición
sistemática de curvas de titulación por técnicas potenciométricas, de absorción molecular,
RMN 1H y fluorescencia, para estudiar la interacción de los receptores macrocíclicos
poliazaciclofano con el anión hexacianocobaltato(III). La combinación de estas cuatro
técnicas en función del pH, demostró ser una herramienta poderosa para investigar el
comportamiento en medio acuso de quimiosensores fluorescentes poliamina.30, 32
Recientemente, en el DIPM se han sintetizado diversos ligantes acíclicos
poliaminocarboxílicos solubles en agua y se ha aprovechado la herramienta antes descrita
para su evaluación en el reconocimiento de cationes a diferentes valores de pH. Los
resultados encontrados han conducido a nuestro grupo de investigación a plantear la
posibilidad de generar sensores fluorescentes con capacidad de ser aplicados en sistemas
biológicos.12, 13, 27
Avances Recientes en el Desarrollo de Quimiosensores Fluorescentes Para Detectar
Zn Intracelular
Actualmente, el desarrollo de sensores químicos tiene un gran futuro en
aplicaciones clínicas, especialmente la detección selectiva de zinc intracelular, ya que este
catión participa en múltiples implicaciones biológicas y patológicas en el organismo por lo
cual es muy importante evaluarlo y monitorearlo.33
Por otra parte, no ha sido una tarea fácil el obtener sensores sensibles y selectivos,
ya que deben de cumplir con propiedades estrictas para ser aplicables biológicamente. Lo
ideal es que los sensores fluorescentes sean biocompatibles para detectar iones metálicos de
12
zinc intracelular es decir, que mantengan solubilidad en agua suficiente, permeabilidad
membranal y toxicidad baja; además se requiere que sean altamente sensibles y selectivos
al zinc para que otros cationes involucrados biológicamente como potasio, magnesio y/o
calcio no interfieran en la señal. Adicionalmente, en cuanto a la respuesta, preferentemente
deben ser capaces de generar una detección radiométrica.
El primer sensor fluorescente utilizado para obtener imágenes biológicas de zinc
intracelular fue la sulfonamida derivada del 8-aminoquinolina denominado TSQ (ver
Figura 4). Surgida de los trabajos de Frederickson y col. en 1987,34
este sensor mostró un
gran aumento en la fluorescencia con la formación del complejo TSQ-Zn y además resultó
ser permeable a la membrana, otra ventaja fue la de ser el primer sensor químico con
selectividad suficiente para medir zinc en presencia de concentraciones altas de calcio y
magnesio. Sin embargo, la pobre solubilidad en agua, la partición en la membrana celular y
la estequiometría de unión a zinc indefinida han complicado el uso de TSQ en la
determinación cuantitativa de zinc intracelular libre.
35-37
Figura 4. Estructura del quimiosensor TSQ.
Fuente: [22,36]
Para mejorar la solubilidad en agua y la permeabilidad a la membrana celular se
desarrollaron los quimiosensores análogos al TSQ denominados Zinquin A y Zinquin E
(ver Figura 5) introduciendo un ácido carboxílico o un grupo éster, los cuales encienden la
fluorescencia, sin embargo en presencia de hierro y cobre apaga la fluorescencia.36
La
problemática de estas quinolinas es el hecho de que estos sensores requieren excitación
ultravioleta, lo que puede provocar autofluorescencia de las células o bien dañarlas; además
muestran relativamente poca fluorescencia. Otro compuesto basado en 8-quinolina y
13
rodamina responde con un aumento de la fluorescencia con la adición de zinc, sin embargo
lo hace en una mezcla de solución de acetonitrilo:agua, además de competir con cadmio.7, 11
Figura 5. Estructuras de los receptores Zinquin A y Zinquin E, respectivamente.
Fuente: [22,36]
Para lograr afinidad alta para los iones de zinc, sean modificado este tipo de
sensores integrándoles, con ellos sitios de unión adicionales, la constante de unión y
solubilidad en agua de los receptores de quinolina aumentó notablemente. Un ejemplo es el
sensor reportado por Jiang y col. que incorporaron DPA en 8-hidroxi-2-metilquinolina en la
posición 2 y un grupo carboxílico en la posición 8 (ver Figura 6).38
Figura 6. Estructura del quimiosensor fluorescente derivado de DPA en 8-hidroxi-2-metilquinolina.
Fuente: [35,38]
El compuesto reportado por Burdette y col. Zinpyr-1 (ver Figura 7), el cual está
basado en bis(2-piridilmetil)amina como sitio de reconocimiento y fluoresceína como
fluoróforo, ha sido diseñado para detectar zinc en células vivas, este compuesto es
permeable a las células y no tiene afinidad esencialmente mensurable para calcio o
14
magnesio. Tras la adición de zinc en condiciones fisiológicas, la fluorescencia aumenta, sin
embargo, carece de una respuesta radiométrica.7
Figura 1. Estructura del sensor Zinpyr-1 para detectar zinc intracelular.
Fuente: [39]
Por otra parte, recientemente se ha reportado un sensor fluorescente simple y eficaz
(Figura 8) basado en hidrazona-pireno. Este sensor muestra un aumento en la fluorescencia
al unirse selectivamente con zinc y se demostró con éxito la aplicación de este sensor para
detectar iones de zinc intrínseco presentes en células pancreáticas, aunque por otra parte no
muestra comportamiento radiométrico y opera en buffer Heppes:acetonitrilo.40
Figura 8. Estructura del sensor derivado de hidrazona-pireno selectivo a zinc en células pancreáticas.
Fuente: [40]
Además, también se han reportado sensores fluorescentes para zinc que incluyen a
aquéllos basados en polipéptidos y proteínas, así como macrociclos unidos a fluoróforos,
aunque cada uno tiene ventajas potenciales sobre las sondas de quinolina, ninguno de ellos
15
ha sido aplicado con éxito para medir zinc dentro de células vivas, ya sea por la baja
afinidad de unión, propiedades ópticas, o la necesidad de realizar microinyecciones para su
uso.7, 9
Por tal motivo, es de gran interés el disponer continuamente de mejores sensores de
zinc intracelular específicos, debido a que proporcionan información adicional sobre la
biología celular de este catión.3, 6, 41