AnticuerposAnticuerpos

Prof. Manzur Hassanhi

Plan de las clasesPlan de las clases• AnticuerposAnticuerpos

1.1. Estructura Estructura 2.2. Función Función 3.3. Complejo receptor, correceptores y coestimuladores de Complejo receptor, correceptores y coestimuladores de

la célula B madurala célula B madura4.4. Uso de los anticuerpos en el laboratorio: Uso de los anticuerpos en el laboratorio:

inmunodiagnósticoinmunodiagnóstico5.5. Uso clínico de los anticuerpos: inmunoterapiaUso clínico de los anticuerpos: inmunoterapia6.6. Producción de anticuerpos para uso clínico y Producción de anticuerpos para uso clínico y

diagnósticodiagnóstico

Forma secretadaForma secretada

Forma de membrana (BCR)Forma de membrana (BCR)

Ag.I. Anticuerpos

Ag.

Ig Ab

Célula plasmática

Anticuerpos y PatologíaAnticuerpos y Patología

1.1. Su falta provoca inmunodeficiencia.Su falta provoca inmunodeficiencia.– Incluso deficiencias de algun isotipo (IgA) o Incluso deficiencias de algun isotipo (IgA) o

deficits cuantitativos pueden comprometer la deficits cuantitativos pueden comprometer la inmunocompetencia.inmunocompetencia.

2.2. La presencia de autoanticuerpos de isotipo IgG La presencia de autoanticuerpos de isotipo IgG contribuye a la autoinmunidad.contribuye a la autoinmunidad.

3.3. La presencia de IgE alergenoespecífica La presencia de IgE alergenoespecífica contribuye a las enfermedades alérgicas.contribuye a las enfermedades alérgicas.

1. Estructura de los anticuerpos1. Estructura de los anticuerposCaracterísticas estructurales comunesCaracterísticas estructurales comunes

– 2H2H + + 2L2L– Dominios inmunoglobulinaDominios inmunoglobulina– Dominios variables y constantesDominios variables y constantes

• Características diferenciales Características diferenciales • Variación continua (clonal):Variación continua (clonal):

– Regiones variablesRegiones variables• Combinación VDJCombinación VDJ

• Variación discreta :Variación discreta :• Cadena pesadaCadena pesada

– Clases Isotipos, subtipos o subclases: Clases Isotipos, subtipos o subclases: • Cadena ligera. Tipos: Cadena ligera. Tipos:

Cadenas pesadas

Cadenas ligeras

Sitios de unión al antígeno

Antígeno

Antígeno

RegiónVariable

Especificidad

RegiónConstanteFunción

Características estructurales Características estructurales comunes de los anticuerposcomunes de los anticuerpos

• Forma monoméricaForma monomérica: 2 cadenas : 2 cadenas ligeras (L) idénticas y 2 pesadas ligeras (L) idénticas y 2 pesadas (H) también idénticas(H) también idénticas

• Uniones disulfuro:Uniones disulfuro:• H-L: H-L: • H-H:H-H:• Cadenas están constituidas por Cadenas están constituidas por

dominios inmunoglobulinadominios inmunoglobulina

Dominio de inmunoglobulinaDominio de inmunoglobulina

110 aa

Nomenclatura de los dominios de Nomenclatura de los dominios de inmunoglobulinainmunoglobulina

DominiosDominiosvariablesvariables

DominiosDominiosconstantesconstantes

Variación de los anticuerposVariación de los anticuerpos

DiversidadDiversidad 10 109 9 moléculas de moléculas de anticuerpos diferentes en cada anticuerpos diferentes en cada individuo, individuo,

La diversidad en la secuencia esta La diversidad en la secuencia esta confinadaconfinada a los dominios a los dominios aminoterminales (dominios aminoterminales (dominios variables) de las cadenas pesadas y variables) de las cadenas pesadas y ligeras. ligeras.

Variación discreta (categorizable):Cadena pesada clases e Isotipos cadena ligera. Tipos: y . 4 isotipos

Variación continua (no categorizable):Número de clones muy elevadoDiversidad de la región variable 107 a 109

moléculas diferentes con secuencias únicas en sus sitios de unión al antígeno.

Características estructurales Características estructurales diferenciales:diferenciales:

Variación génica (en distintos loci)Variación génica (en distintos loci) En función de En función de cadena pesadacadena pesada, c, claseslases: : IgA, IgA, IgD, IgD, IgE, IgE, IgM, IgM, IgG. IgG. Isotipos, subtipos o subclasesIsotipos, subtipos o subclases: 95 % de identidad productos de : 95 % de identidad productos de segmentos génicos diferentes.segmentos génicos diferentes.Ig G1, Ig G2, Ig G3, Ig G4.por orden decreciente de concentración en Ig G1, Ig G2, Ig G3, Ig G4.por orden decreciente de concentración en suero.suero.Ig A1 suero, Ig A2 secrecionesIg A1 suero, Ig A2 secrecionesSubtipo determina función biológica Subtipo determina función biológica cadena ligeracadena ligera. . Tipos: Tipos: y y . 4. 4 isotipos isotipos

Variación discretaVariación discreta

Distribución de los isotiposDistribución de los isotipos

DistribuciónDistribución

1.1. Superficie de células Superficie de células productoras (todos)productoras (todos)

2.2. Plasma (IgG IgA IgMpent) y Plasma (IgG IgA IgMpent) y fluido intersticial (IgG) fluido intersticial (IgG)

3.3. Unidos a receptores de alta Unidos a receptores de alta afinidad en la superficie de afinidad en la superficie de otras células (IgE)otras células (IgE)

4.4. En líquidos secretadosEn líquidos secretados IgA IgA dimdim

Variación alélica (alelos alternativos)Variación alélica (alelos alternativos)

• Alotipos: Alotipos: Productos de Productos de alelos alternativosalelos alternativos• Alotipo A2m: A2m(1) A2m(2), locus A2mAlotipo A2m: A2m(1) A2m(2), locus A2m• AlotipoGm: locus G1m 11 alotipos, locus AlotipoGm: locus G1m 11 alotipos, locus

G2m 1 alotipo, locus G3m 11 alotipos G2m 1 alotipo, locus G3m 11 alotipos • AlotipoKm 3 alotipos AlotipoKm 3 alotipos

FR1 FR2 FR3 FR4

HVR1HVR2

HVR3

Var

iabi

lity

Inde

x

25 7550 100

Amino acid residue

150

100

50

0

Regiones variables (HVR) y regiones armazón

•Las HVR (high variable regions) también Las HVR (high variable regions) también se denominan regiones determinantes de se denominan regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) porque la complementariedad (CDRs) porque forman la superficie de unión al antígeno forman la superficie de unión al antígeno •Entre ellas se disponen regiones armazón Entre ellas se disponen regiones armazón de secuencia más conservada. de secuencia más conservada.

Segmentos hipervariablesSegmentos hipervariables

Cadena ligeraCadena ligera• Tipos Tipos y y • Proporciones 2/3 Proporciones 2/3 , 1/3 , 1/3 ,,• No existen diferencias funcionales,No existen diferencias funcionales,• Contienen un Contienen un dominio variable aminoterminal dominio variable aminoterminal y y otro constante otro constante

carboxiterminal.carboxiterminal.• 33 segmentos hipervariables segmentos hipervariables o CDRs. El más variable es el CDR3, o CDRs. El más variable es el CDR3, • Regiones armazón:Regiones armazón: Ciertos aminoácidos están altamente Ciertos aminoácidos están altamente

conservados, conservados, • Los dominios constantes son idénticos en las moléculas de cada Los dominios constantes son idénticos en las moléculas de cada

tipo y similares entre los dos tipos de cadena Ltipo y similares entre los dos tipos de cadena L• Se usan como indicadores clonalidad en tumoresSe usan como indicadores clonalidad en tumores

Cadena pesadaCadena pesada• Contienen un Contienen un dominio variable aminoterminal (región V)dominio variable aminoterminal (región V) y y

varios constantes (region C).varios constantes (region C).1.1. Región VRegión V formada por 3 segmentos hipervariables o CDRs. formada por 3 segmentos hipervariables o CDRs.

El más variable es el CDR3.El más variable es el CDR3.2.  2.  Región bisagra Región bisagra entre Centre CHH1 y C1 y CHH2 tamaño desde 10 aa ( 2 tamaño desde 10 aa ( 1, 1, 2, 2,

1, 1, 2, y 2, y 4) hasta 60 aa en ( 4) hasta 60 aa en (4 y 4 y ))– funcion: posibilidad de variar la disposición relativa y la distancia funcion: posibilidad de variar la disposición relativa y la distancia

entre los dos centros de unión al antigeno.entre los dos centros de unión al antigeno.3. 3. La La región constante región constante es distinta en cada tipo o isotipo, pero es es distinta en cada tipo o isotipo, pero es

invariante para las cadenas de un mismo isotipo.invariante para las cadenas de un mismo isotipo.– 4 dominios en las regiones constantes de Ig M e Ig E, 4 dominios en las regiones constantes de Ig M e Ig E, – 3 en Ig A, Ig D, Ig G. 3 en Ig A, Ig D, Ig G.

Formas de expresiónFormas de expresión

• Difieren en la secuencia de aminoácidos del último Difieren en la secuencia de aminoácidos del último dominio carboxiterminal de la cadena pesada. dominio carboxiterminal de la cadena pesada.

Forma secretadaForma secretada

Forma de membranaForma de membrana

Asociación de las cadenas. Asociación de las cadenas. • Asociación H-L Asociación H-L • Asociación H-H Asociación H-H

Piezas de colaPiezas de cola• Secuencias adicionales no globulares en el extremo Secuencias adicionales no globulares en el extremo

carboxiterminal del ultimo dominio de la cadena carboxiterminal del ultimo dominio de la cadena pesada. Se asocian a cadena J y participan en pesada. Se asocian a cadena J y participan en polimerización (IgM) y transporte (IgA)polimerización (IgM) y transporte (IgA)

J Chain

Secretory Piece

C4

J Chain

AntígenosAntígenos

• Antígeno:Antígeno: • Sustancia que se une específicamente a un Sustancia que se une específicamente a un

anticuerpo. anticuerpo. • Inmunógeno:Inmunógeno: • Sustancias capaces de generar respuestas inmunes.Sustancias capaces de generar respuestas inmunes.

Determinante antigénico o epítopoDeterminante antigénico o epítopo• Porción de una molécula que es reconocida por el anticuerpoPorción de una molécula que es reconocida por el anticuerpo

• Tipos:Tipos:• Determinantes conformacionales o discontinuosDeterminantes conformacionales o discontinuos: Formados por aa : Formados por aa

de porciones separadas en la secuencia primaria de la proteína pero de porciones separadas en la secuencia primaria de la proteína pero que están juntos yuxtapuestos en la estructura tridimensional.que están juntos yuxtapuestos en la estructura tridimensional.

• Determinantes lineales:Determinantes lineales: 6 aa de longitud, formados por aa 6 aa de longitud, formados por aa correlativos en la estructura primaria, la mayoría son inaccesibles en correlativos en la estructura primaria, la mayoría son inaccesibles en la conformación nativa y sólo aparecen cuando la proteína sufre la conformación nativa y sólo aparecen cuando la proteína sufre proteolisis o desnaturalización. proteolisis o desnaturalización. 

Sitios de Unión antígeno-anticuerpoSitios de Unión antígeno-anticuerpo• Unión no covalente, es reversible pero de alta afinidad.Unión no covalente, es reversible pero de alta afinidad.• LocalizaciónLocalización: Regiones hipervariables del fragmento Fab.: Regiones hipervariables del fragmento Fab.• 1.- Mayor variación entre distintos anticuerpos.1.- Mayor variación entre distintos anticuerpos.• 2.-Los cambios en su secuencia alteran la especificidad de unión.2.-Los cambios en su secuencia alteran la especificidad de unión.• 3.- Forman lazos extendidos expuestos en la superficie del 3.- Forman lazos extendidos expuestos en la superficie del

anticuerpo (estudios de difracción de rayos X).anticuerpo (estudios de difracción de rayos X).• 4.- Los residuos aminoácidos de las regiones hipervariables 4.- Los residuos aminoácidos de las regiones hipervariables

están en contacto con el antígeno unido, sobre todo la región están en contacto con el antígeno unido, sobre todo la región CDR3, (la más variable).CDR3, (la más variable).

Fuerzas que participan en interacción Fuerzas que participan en interacción Antígeno-AnticuerpoAntígeno-Anticuerpo

Caracterización de la unión al Caracterización de la unión al antígenoantígeno• SupuestosSupuestos: :

– Antígeno con un solo determinante por molécula,Antígeno con un solo determinante por molécula,– Todos los anticuerpos presentes específicos frente a él, temperatura y Todos los anticuerpos presentes específicos frente a él, temperatura y

condiciones de disolución controladas.condiciones de disolución controladas.

• Constante de disociación (KConstante de disociación (Kdd ): ): La concentración Molar de La concentración Molar de ag. a la que la mitad de las moléculas de Ab esten unidos a el y ag. a la que la mitad de las moléculas de Ab esten unidos a el y la otra mitad libre. para los Ab es de 10la otra mitad libre. para los Ab es de 10-7-7 a 10 a 10-11-11..

• Afinidad (Afinidad (inverso de la constante de disociación): Mide la inverso de la constante de disociación): Mide la intensidad de la unión de un ag monovalente a un Ab con un intensidad de la unión de un ag monovalente a un Ab con un solo lugar de unión.solo lugar de unión.

Caracterización de la unión al Caracterización de la unión al antigeno en condiciones realesantigeno en condiciones reales

• MultivalenciaMultivalencia, los antígenos suelen tener más de un , los antígenos suelen tener más de un determinante (antígenos multivalentes), los anticuerpos determinante (antígenos multivalentes), los anticuerpos tienen más de un sitio de unión (de 2 a 10). tienen más de un sitio de unión (de 2 a 10).

• La afinidad de una La afinidad de una unión multicéntricaunión multicéntrica es mucho es mucho mayor que la que resultaría de la suma de las afinidades mayor que la que resultaría de la suma de las afinidades de cada uno de los lugares de unión implicados. de cada uno de los lugares de unión implicados.

• Avidez:Avidez: Mide la intensidad global de la unión de un Mide la intensidad global de la unión de un anticuerpo a un antígeno. anticuerpo a un antígeno.

2. Funciones de las distintas regiones2. Funciones de las distintas regiones1.-El sitio de unión al antígeno 1.-El sitio de unión al antígeno

esta formado por segmentos de esta formado por segmentos de las regiones Vlas regiones VLL y V y VHH

2.-La porción Fc. activa las 2.-La porción Fc. activa las funciones efectoras que funciones efectoras que dependen principalmente del dependen principalmente del isotipo de la cadena pesada.isotipo de la cadena pesada.

Unión a FcR

Unión complemento

Transferencia placentaria

Unión al antígeno

Funciones de las distintas regionesFunciones de las distintas regiones

3.- La región bisagra determina como una 3.- La región bisagra determina como una molécula de anticuerpo puede interaccionar molécula de anticuerpo puede interaccionar simultáneamente con dos moléculas de antígeno.simultáneamente con dos moléculas de antígeno.

IgG1, IgG2 and IgG4IgG1, IgG2 and IgG4 IgG3IgG3

Flexibilidad de la región Flexibilidad de la región bisagrabisagra

Funciones de los anticuerposFunciones de los anticuerpos1.1. Son desencadenadas por la unión al antígeno.Son desencadenadas por la unión al antígeno.2.2. Son muy variadas desencadenan mecanismos Son muy variadas desencadenan mecanismos

efectores diversos.efectores diversos.3.3. Dependen del isotipo del anticuerpo.Dependen del isotipo del anticuerpo.

Neutralización del antígenoNeutralización del antígeno• Anticuerpos secretados de cualquier isotipo:Anticuerpos secretados de cualquier isotipo:

Impiden la acción toxica o infecciosa de las Impiden la acción toxica o infecciosa de las moléculas a las que se unen.  moléculas a las que se unen.  

Funciones isotipo específicasFunciones isotipo específicas1.1. Permiten distintos tipos de respuestas contra cada Permiten distintos tipos de respuestas contra cada

tipo de patógeno. tipo de patógeno. 2.2. Variedad de la región variable permite reconocer Variedad de la región variable permite reconocer

distintos antígenos. Los distintos isotipos, permiten distintos antígenos. Los distintos isotipos, permiten atacar a un patógeno por distintos mecanismos. atacar a un patógeno por distintos mecanismos. Distintos isotipos con una misma especificidad Distintos isotipos con una misma especificidad antigénica activan diferentes funciones efectoras.antigénica activan diferentes funciones efectoras.

3.3. La selección del mecanismo mas eficaz permite La selección del mecanismo mas eficaz permite adaptar la respuesta inmune se adapte al patógeno adaptar la respuesta inmune se adapte al patógeno portador del antígeno. portador del antígeno.

Diferentes isotipos y subtipos de Ig realizan funciones Diferentes isotipos y subtipos de Ig realizan funciones diferentesdiferentes

Funciones de los distintos isotiposFunciones de los distintos isotipos

+

Distribución isotiposDistribución isotipos

Ig A

2

1250mg/dlIg G1

Ig G2

Ig G3

Ig G4

250 mg/dlIgA1

110mg/dlIg M

Ig A2Ig G1

IgEIg E

Ig A2Ig E Ig G1

Ig G, IgA1, Ig M

AireLuz intestinal

Activación del complemento por Activación del complemento por Ig M e Ig G.Ig M e Ig G.

• C1q se une a la región Fc (CC1q se une a la región Fc (C2, C2, C3) de 3) de inmunoglobulinas unidas a antígenos.inmunoglobulinas unidas a antígenos.

• De las IgG humanas IgG3 activa eficientemente De las IgG humanas IgG3 activa eficientemente el complemento, IgG1 algo menos, IgG2 el complemento, IgG1 algo menos, IgG2 pobremente, IgG4 nada. pobremente, IgG4 nada.

C1rC1s

C1q C1r C1s

C1q

Aumento de la fagocitosis, Aumento de la fagocitosis, opsonización por IgG.opsonización por IgG.

• Las partículas antigénicas son recubiertas por Las partículas antigénicas son recubiertas por anticuerpos cuyas regiones Fc son a su vez anticuerpos cuyas regiones Fc son a su vez reconocidas por receptores específicos de los reconocidas por receptores específicos de los neutrófilos y los fagocitos mononucleares (Fcneutrófilos y los fagocitos mononucleares (FcRI; RI; FcFcRII, FcRIII) estimulando la fagocitosis de las RII, FcRIII) estimulando la fagocitosis de las partículas partículas

•   

Citotoxicidad dependiente de Citotoxicidad dependiente de anticuerpoanticuerpo (ADCC) (ADCC)

• Los linfocitos citotóxicos expresan receptores de Los linfocitos citotóxicos expresan receptores de baja afinidad para FcIgG (Fcbaja afinidad para FcIgG (FcRIII=CD16) que solo RIII=CD16) que solo se unen a IgG agregada en superficies reconocidas se unen a IgG agregada en superficies reconocidas por los anticuerpos.por los anticuerpos.

ADCC por los EosinófilosADCC por los Eosinófilos

•Tienen receptores para regiones Fc de IgA e IgE y Tienen receptores para regiones Fc de IgA e IgE y exocitan gránulos con contenido letal para parásitos y exocitan gránulos con contenido letal para parásitos y helmintos insensibles a otras células efectoras.helmintos insensibles a otras células efectoras.

Hipersensibilidad inmediata Hipersensibilidad inmediata desencadenada por Ig E desencadenada por Ig E

• Los mastocitos y los basófilos expresan receptores Los mastocitos y los basófilos expresan receptores para FcIgE (Fcpara FcIgE (FcRI) de alta afinidad ocupados por RI) de alta afinidad ocupados por monómeros en ausencia del antígenomonómeros en ausencia del antígeno  

Inmunidad en las mucosas mediada Inmunidad en las mucosas mediada por la Ig A.por la Ig A.

•   La IgA es transportada a través La IgA es transportada a través de las barreras mucosas y es de las barreras mucosas y es secretada a la luz intestinal secretada a la luz intestinal donde neutraliza posibles donde neutraliza posibles patógenos o toxinas derivadas patógenos o toxinas derivadas de ellos.de ellos.

Transferencia de inmunidad pasiva Transferencia de inmunidad pasiva al feto y al neonato por la IgG.al feto y al neonato por la IgG.

• Los mamíferos durante la vida fetal o recién nacidos Los mamíferos durante la vida fetal o recién nacidos no son capaces de responder eficazmente a los no son capaces de responder eficazmente a los microbios. microbios.

• Las IgG maternas son capaces de atravesar la Las IgG maternas son capaces de atravesar la placenta y pasar ala sangre del feto placenta y pasar ala sangre del feto

• Las madres en periodo de lactancia secretan IgA (e Las madres en periodo de lactancia secretan IgA (e IgG en algunas especies) al calostro y a la leche, que IgG en algunas especies) al calostro y a la leche, que el neonato es capaz captar mediante receptores el neonato es capaz captar mediante receptores específicos IgG de la luz intestinal y pasarla a la específicos IgG de la luz intestinal y pasarla a la sangre sangre

Supresión por la IgG de las respuestas Supresión por la IgG de las respuestas de anticuerpos de células B novatas de anticuerpos de células B novatas

3. Anticuerpos de membrana como 3. Anticuerpos de membrana como receptores de las células Breceptores de las células B

• Ontogenia de las células B: Ontogenia de las células B: Expresión de Expresión de distintos isotipos en función del grado de distintos isotipos en función del grado de diferenciación celular.diferenciación celular.

PreBCR IgM IgM IgD

IgEIgAIgM

IgG4IgG3IgG2IgG1

Complejo receptor para antígeno, y sus Complejo receptor para antígeno, y sus co-receptores, en linfocitos B madurosco-receptores, en linfocitos B maduros(Fearon 2000)(Fearon 2000) • Complejo receptorComplejo receptor

– BCRBCR IgM (u otro isotipo en B memoria) IgM (u otro isotipo en B memoria)– IgIge Ige Ig

• Co-receptores (co-ligan)Co-receptores (co-ligan)– ComplejoCD19/CD21/CD81(TAPA-1)ComplejoCD19/CD21/CD81(TAPA-1)

• CD21 une C3dCD21 une C3d• CD19 Lyn amplificación Tk de familia SrcCD19 Lyn amplificación Tk de familia Src

• Receptores coestimuladoresReceptores coestimuladores– CD22, FcIgCD22, FcIg antagonizan CD19 antagonizan CD19

reclutando PTP (Poe 2001)reclutando PTP (Poe 2001)– CD72CD72 antagoniza ITIM antagoniza ITIM– CD40 CD40 activa NFkBactiva NFkB

CD19/CD21

Ag-C3d

ITAM

CD40

Transducción de señal de Transducción de señal de reconocimiento antigénico en células B reconocimiento antigénico en células B

Ag-Costimuli (C3d)

SHP-1SHIP(PTP)

Costimuly-dependent inhibition of PTP

CD22 FcIgG

Stimuly dependentTirosine kinase

activation Activation of PTP by negative costimulators

CD21/CD19

Lyn

CD72

ITIM

CD40

NFB

ITAM

SyKproliferación

IgMIgIg

Slp65

ITAM-dependentITAM-dependent signal amplificationsignal amplification

Diferenciación

Costimuly-dependent activation of NFB

4. Usos diagnósticos y terapéuticos4. Usos diagnósticos y terapéuticos• Técnicas analíticas/diagnósticas:Técnicas analíticas/diagnósticas: miden generalmente fuera del miden generalmente fuera del

organismo por técnicas "organismo por técnicas "in vitroin vitro" algún parámetro, ej. nivel " algún parámetro, ej. nivel sérico de Ig A sérico de Ig A – ELISA enzima inmunoensayo mediadores, seropositividadELISA enzima inmunoensayo mediadores, seropositividad– WESTERN inmunoelectroforesis de proteínas,WESTERN inmunoelectroforesis de proteínas,– IMMUNOHISTOQUIMICA, biopsias, IMMUNOHISTOQUIMICA, biopsias, – NEFELOMETRIA turbidometría, Ig séricasNEFELOMETRIA turbidometría, Ig séricas– CITOMETRIA DE FLUJO Diagnostico leucemias CITOMETRIA DE FLUJO Diagnostico leucemias

• Técnicas terapéuticasTécnicas terapéuticas: diseñadas para curar. : diseñadas para curar. – Tratamiento antineoplásico destrucción células tumoralesTratamiento antineoplásico destrucción células tumorales– Tratamientos antiinflamatorios. Neutralización de mediadores Tratamientos antiinflamatorios. Neutralización de mediadores

proinflamatoriosproinflamatorios

4. Uso de anticuerpos en el laboratorio4. Uso de anticuerpos en el laboratorio • Fundamento:Fundamento: Pueden ser utilizados como herramientas Pueden ser utilizados como herramientas

capaces decapaces de reconocer específicamente reconocer específicamente y a las que nosotros y a las que nosotros podemos podemos sujetar, localizar o medir. sujetar, localizar o medir.

• EspecificidadEspecificidad en el reconocimiento aportada por la región en el reconocimiento aportada por la región Fab del anticuerpo.Fab del anticuerpo.

• Posibilidad de Posibilidad de marcajemarcaje: radioactivo, enzimatico, : radioactivo, enzimatico, fluorescente, con puente biotina-avidina. Detección y fluorescente, con puente biotina-avidina. Detección y medida. medida.

• Unión a soportes (Unión a soportes (magnéticos o de plástico) por región Fc. magnéticos o de plástico) por región Fc. Se paración y purificación molecular y celular. Se paración y purificación molecular y celular.

1. Ag.

2. *3.

Cuantificación de antígenoCuantificación de antígeno• Miden moléculas mediante anticuerpos indicadores unidos a otras Miden moléculas mediante anticuerpos indicadores unidos a otras

radioactivasradioactivas (RIA) o a (RIA) o a enzimasenzimas (ELISA), comparan con una curva (ELISA), comparan con una curva estándar con concentraciones conocidas de la sustancia problema. estándar con concentraciones conocidas de la sustancia problema.

• ELISA o RIA ELISA o RIA competitivocompetitivo. Antígeno pegado. El antigeno de la . Antígeno pegado. El antigeno de la muestra inhibe la unión de un anticuerpo indicador al antígeno muestra inhibe la unión de un anticuerpo indicador al antígeno pegado al pocillo.pegado al pocillo.

•   ELISA o RIA ELISA o RIA sandwichsandwich. 1. 1erer anticuerpo pegado captura antígeno anticuerpo pegado captura antígeno segundo anticuerpo indicador unido a enzima o radiomarcado segundo anticuerpo indicador unido a enzima o radiomarcado reconoce otro determinante del antígeno.reconoce otro determinante del antígeno.

Identificación, purificación y Identificación, purificación y caracterización de antígenos proteicoscaracterización de antígenos proteicos

• Inmunoprecipitación Inmunoprecipitación Para separar una proteína de Para separar una proteína de otras sustancias se usa un anticuerpo especifico para otras sustancias se usa un anticuerpo especifico para precipitarla. Se lava y se libera el antígeno por cambio precipitarla. Se lava y se libera el antígeno por cambio de pH que reduce la afinidad de la unión Ab-Ag.de pH que reduce la afinidad de la unión Ab-Ag.

• WWestern e inmunoblot estern e inmunoblot separación analítica por separación analítica por electroforesis en gel de (SDS)-poliacrilamida separa electroforesis en gel de (SDS)-poliacrilamida separa proteínas por a su peso molecular que son transferidas a proteínas por a su peso molecular que son transferidas a un filtro poroso por capilaridad. Las proteínas son un filtro poroso por capilaridad. Las proteínas son reconocidas por anticuerpos radiomarcados o unidos a reconocidas por anticuerpos radiomarcados o unidos a enzimas. enzimas.

Identificación, purificación y Identificación, purificación y caracterización de célulascaracterización de células

• Marcaje de superficie celularMarcaje de superficie celular

• Citometria de flujo La expresión de antígenos es Citometria de flujo La expresión de antígenos es medida en cada célula haciéndolas pasar de una medida en cada célula haciéndolas pasar de una en una por delante de un haz de luz, anticuerpos en una por delante de un haz de luz, anticuerpos marcados fluorescentes son utilizados como marcados fluorescentes son utilizados como moléculas indicadoras. moléculas indicadoras.

Localización del antígeno en tejidos o célulasLocalización del antígeno en tejidos o células

• InmunofluorescenciaInmunofluorescencia Anticuerpos fluoromarcados en Anticuerpos fluoromarcados en microscopia óptica. estructuras no marcadas no se ven, microscopia óptica. estructuras no marcadas no se ven, dificultando la localización precisa del marcaje fluorescente.dificultando la localización precisa del marcaje fluorescente.

• Inmunofluoescencia de barridoInmunofluoescencia de barrido ilumina con láser lee a varios ilumina con láser lee a varios colorescolores

• Inmunohistoquímica:Inmunohistoquímica: Utilización en microscopia óptica de Utilización en microscopia óptica de anticuerpos unidos a enzimas que a partir de sustratos anticuerpos unidos a enzimas que a partir de sustratos incoloros producen compuestos coloreados e insolubles que incoloros producen compuestos coloreados e insolubles que precipitan en la posición del ag .precipitan en la posición del ag .

• Microscopia inmunoelectrónica: Microscopia inmunoelectrónica: Utilización en microscopia Utilización en microscopia electrónica de anticuerpos unidos a compuestos electrodensos, electrónica de anticuerpos unidos a compuestos electrodensos, como el oro coloidal. como el oro coloidal.   

Uso de anticuerpos para separación Uso de anticuerpos para separación celularcelular..

•   Métodos de fase sólidaMétodos de fase sólida • PanningPanning fijación de anticuerpos por su región Fc a una fijación de anticuerpos por su región Fc a una

fase sólida. Células portadoras del antígeno se unen al fase sólida. Células portadoras del antígeno se unen al soporte. lavado y separación mecánica o química.soporte. lavado y separación mecánica o química.

• MACSMACS (Magnetic Activated Cell Sorting) anticuerpos (Magnetic Activated Cell Sorting) anticuerpos unidos a micropartículas magneticas por su región Fc unidos a micropartículas magneticas por su región Fc son retenidos en una matriz ferromagnética (fase sólida) son retenidos en una matriz ferromagnética (fase sólida) cuando se aplica un campo magnético. Células cuando se aplica un campo magnético. Células portadoras del antígeno se unen al soporte. lavado y portadoras del antígeno se unen al soporte. lavado y elución por eliminación del campo magnético.elución por eliminación del campo magnético.

Métodos fluorescentes inteligentes Métodos fluorescentes inteligentes • FACSFACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) (Fluorescence Activated Cell Sorting)

anticuerpos unidos a compuestos fluorescentes son anticuerpos unidos a compuestos fluorescentes son reconocidos en la superficie de cada célula. reconocidos en la superficie de cada célula.

• Células portadoras de las combinaciones de Células portadoras de las combinaciones de antígenos seleccionadas son reconocidas una a una y antígenos seleccionadas son reconocidas una a una y en función de las combinaciones de parámetros en función de las combinaciones de parámetros seleccionados el aparato toma decisionesseleccionados el aparato toma decisiones

• Aplica un campo eléctrico que desvía trayectoria de Aplica un campo eléctrico que desvía trayectoria de caída de la célula hacia el contenedor de fracción caída de la célula hacia el contenedor de fracción deseado.deseado.

5. Terapia con anticuerpos monoclonales5. Terapia con anticuerpos monoclonales“from magical bullets to smart bombs”“from magical bullets to smart bombs”

• Tecnología anticuerpos monoclonales 1975. Tecnología anticuerpos monoclonales 1975. • Limitaciones de anticuerpos murinos Limitaciones de anticuerpos murinos

– Vida media corta en humanos Vida media corta en humanos – No interaccionan óptimamente con sistemas efectores humanosNo interaccionan óptimamente con sistemas efectores humanos– Estimulan formación de antianticuerpos (reacciones anafilácticas)Estimulan formación de antianticuerpos (reacciones anafilácticas)

• Anticuerpos humanizadosAnticuerpos humanizados• 200 anticuerpos distintos en pruebas clínicas y a diferencia 200 anticuerpos distintos en pruebas clínicas y a diferencia

de antiangiogénicos están funcionando en terapia de antiangiogénicos están funcionando en terapia antitumoral. antitumoral.

• Estimulan activación complemento, ADCC, fagocitosis.Estimulan activación complemento, ADCC, fagocitosis.

5. Uso terapéutico de los anticuerpos5. Uso terapéutico de los anticuerpos• Radioconjugados Radioconjugados

– Fósforo, Estroncio Yodo YtrioFósforo, Estroncio Yodo Ytrio I-antiCD45 leucemias mieloides I-antiCD45 leucemias mieloides agudasagudas

– Zevalin antiCD20 de ratón vida corta Zevalin antiCD20 de ratón vida corta Itrio 90 Itrio 90 emisiónemisión– Bexxar antiCD20 de ratón Bexxar antiCD20 de ratón Iodo131Iodo131

• Quimioconjugados Quimioconjugados – AntiCD33 Mylotarg conjugado con chaleomicinna (CMA-676) AntiCD33 Mylotarg conjugado con chaleomicinna (CMA-676)

produce especies altamente reactivas que dañan el DNA e inducen produce especies altamente reactivas que dañan el DNA e inducen apoptosis.apoptosis.

– Se emplea en leucemias mieloides agudas. El antígeno CD33 se Se emplea en leucemias mieloides agudas. El antígeno CD33 se endocita al ser reconocido por el anticuerpo anti CD33.endocita al ser reconocido por el anticuerpo anti CD33.

– AntiCD22 Conjugados con AntiCD22 Conjugados con RNAsasRNAsas se experimentan en linfomas. se experimentan en linfomas.• Anticuerpos puros Anticuerpos puros

– AntiCD40 induce AICD en linfomas.AntiCD40 induce AICD en linfomas.– AntiCD20 mata células de linfomas y leucemias (depende de AntiCD20 mata células de linfomas y leucemias (depende de

polimorfimo Receptores Fc).polimorfimo Receptores Fc).

Anticuerpos sin conjugarAnticuerpos sin conjugar• Terapia selectivaTerapia selectiva• Anti CD52 Campath 1H 2001tumores de células B, Anti CD52 Campath 1H 2001tumores de células B,

enfermedad mínima residual, rechazo de órganos e enfermedad mínima residual, rechazo de órganos e injerto contra huésped, enfermedades autoinmunesinjerto contra huésped, enfermedades autoinmunes

• AntiCD20 Rituximab 1999 para linfomas y Leucemias AntiCD20 Rituximab 1999 para linfomas y Leucemias de células Bde células B

• Eliminación de células indeseables de inóculos Eliminación de células indeseables de inóculos para trasplante de médula ósea.para trasplante de médula ósea.

• AntiCD3 OKT-3 Purgado de linfocitos T de inóculos AntiCD3 OKT-3 Purgado de linfocitos T de inóculos alogénicos anti-CD3alogénicos anti-CD3

• Purgado de células tumorales de inóculos autólogos.Purgado de células tumorales de inóculos autólogos.

Conjugados con partículas magnéticasConjugados con partículas magnéticas

• AntiCD34 para purificación de células madre AntiCD34 para purificación de células madre hematopoiéticas (CD34+) por selección hematopoiéticas (CD34+) por selección inmunomagnética.inmunomagnética.

• Permite purificar células madre a partir de sangre Permite purificar células madre a partir de sangre periférica.periférica.

Antagonistas de citocinasAntagonistas de citocinas• Anticuerpos anticitocina Anticuerpos anticitocina Anti-TNFAnti-TNF • Neutralizan mediadores proinflamatorios Neutralizan mediadores proinflamatorios • Tienen un efecto drástico efecto antiinflamatorioTienen un efecto drástico efecto antiinflamatorio

• Enfermedad de Chron, Artritis reumatoide.Enfermedad de Chron, Artritis reumatoide.

• Receptores solubles de TNF Receptores solubles de TNF • También neutralizan TNF pero tienen vida más corta.También neutralizan TNF pero tienen vida más corta.• Quimeras con región Fc. IgG. Quimeras con región Fc. IgG. alargan vida media del alargan vida media del

receptor solublereceptor soluble

6. Producción de anticuerpos6. Producción de anticuerpos

1.1. Obtención de antisueros (anticuerpos policlonales)Obtención de antisueros (anticuerpos policlonales)

2.2. Síntesis de anticuerpos monoclonalesSíntesis de anticuerpos monoclonales

3.3. Reducción de su inmunogenicidad. Síntesis de Reducción de su inmunogenicidad. Síntesis de

anticuerpos quiméricosanticuerpos quiméricos

Obtención de antisuerosObtención de antisueros (anticuerpos policlonales) (anticuerpos policlonales)

• Uso diagnósticoUso diagnóstico

• VENTAJAS: rápido y de bajo coste

• INCONVENIENTES: Reproducibilidad limitada, cantidad limitada de Ab.

Síntesis de anticuerpos monoclonalesSíntesis de anticuerpos monoclonalesKohler G. Y Milstein C. (Nature, 1975).Kohler G. Y Milstein C. (Nature, 1975).

- PROTEÍNA- PLÁSMIDO- CÉLULAS

-VÍA: parenteral, intramuscular...-DOSIS: 3/4 inoculos-ADYUVANTES Y CARRIERS. CEPA: BALB/c, Y3

PROTEÍNAS VIRALESMÉTODOS ELECTRQUICOS

CEPAS: P3/x63.Ag8.653, NSI/0, NSI/1

ELISA, IFI, RIA, WESTERN,INMUNOCITOQUÍMICAS, FACS.......

- DILUCIÓN- AGAR

Problemas para el uso terapéuticoProblemas para el uso terapéuticoinmunogenicidad de los anticuerpos inmunogenicidad de los anticuerpos

xenogénicosxenogénicos

Disminución de la Inmunogenicidad Disminución de la Inmunogenicidad de los anticuerposde los anticuerpos

• Anticuerpos xenogénicos Anticuerpos xenogénicos – estimulan la formación de antianticuerposestimulan la formación de antianticuerpos

• Anticuerpos quiméricos Anticuerpos quiméricos – regiones constantes humanas funciones efectorasregiones constantes humanas funciones efectoras

• Anticuerpos humanizados Anticuerpos humanizados – reemplazo de regiones marco originales por otras reemplazo de regiones marco originales por otras

humanas para disminuir la inmunogenicidad.humanas para disminuir la inmunogenicidad.

Síntesis de anticuerpos quiméricosSíntesis de anticuerpos quiméricosMorrison et al.(PNAS, 1986 ) y Boulianne Morrison et al.(PNAS, 1986 ) y Boulianne

(Nature, 1984).(Nature, 1984).

Variantes biotecnológicasVariantes biotecnológicas

Quimeras con región Fc. Quimeras con región Fc. alargan vida media de la molécula alargan vida media de la molécula asociadaasociada

Anticuerpos biespecíficos.Anticuerpos biespecíficos.

Inmunoliposomas liposomas recubiertos de anticuerpos Inmunoliposomas liposomas recubiertos de anticuerpos monoclonalesmonoclonalesletales como transportadores de sustancias toxicas letales como transportadores de sustancias toxicas intracelulares ej. RNAasasintracelulares ej. RNAasas

El “toque humano” ha permitido el uso El “toque humano” ha permitido el uso clínicoclínico

• Anticuerpos quiméricos (1995-)Anticuerpos quiméricos (1995-)– Simulect rechazoSimulect rechazo– Remicade CrhonRemicade Crhon

• HumanizadosHumanizados– Herceptin (1998) cáncer de mama metastático que expresa EGF receptorHerceptin (1998) cáncer de mama metastático que expresa EGF receptor– Zenapax (1997) (CD25)Zenapax (1997) (CD25)– Campath antiCD52Campath antiCD52– Xolair anti IgE asma alérgicaXolair anti IgE asma alérgica– Efalizumab psoriasisEfalizumab psoriasis– 200 tipos más están actualmente utilizándose en ensayos clínicos en humanos.200 tipos más están actualmente utilizándose en ensayos clínicos en humanos.