“Inducción de respuesta morfogenética en Abies …última como en peligro de extinción según...
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i “Inducción de respuesta morfogenética en Abies religiosa (Kunth) Schltdl. & Cham. y A. hickelii Flous & Gausen de la región del Cofre de Perote, Veracruz.” TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE MAESTRO EN ECOLOGÍA FORESTAL PRESENTA Víctor Elías Luna Monterrojo DIRIGIDA POR MC. Virginia Rebolledo Camacho Dr. Martín Mata Rosas Xalapa, Veracruz, México Octubre de 2002
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“Inducción de respuesta morfogenética en Abies religiosa
(Kunth) Schltdl. & Cham. y A. hickelii Flous & Gausen de
la región del Cofre de Perote, Veracruz.”
T E S I S
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE
MAESTRO EN
ECOLOGÍA FORESTAL
PRESENTA
Víctor Elías Luna Monterrojo
DIRIGIDA POR
MC. Virginia Rebolledo Camacho
Dr. Martín Mata Rosas
Xalapa, Veracruz, México Octubre de 2002
i
CONTENIDO
CONTENIDO ............................................................................................................................... i
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS .......................................................................................... iii
RESUMEN ...................................................................................................................................v
SUMMARY ................................................................................................................................ vi
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 1
2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 3
2.1. Objetivo General ....................................................................................................... 3
2.2. Objetivos Específicos................................................................................................ 3
3. REVISIÓN DE LITERATURA ....................................................................................... 4
3.1. El género Abies ......................................................................................................... 5
3.1.1. Descripción botánica del género Abies ...........................................................5
3.1.2. Distribución del género Abies en México .......................................................6
3.1.3. Importancia del género Abies en México ........................................................7
3.1.4. Ecología del género Abies ...............................................................................8
3.2. Abies religiosa........................................................................................................... 9
3.2.1. Descripción botánica de Abies religiosa .........................................................9
3.2.2. Distribución de Abies religiosa ..................................................................... 11
3.3. Abies hickelii ........................................................................................................... 12
3.3.1 Descripción botánica de Abies hickelii .........................................................12
3.3.2. Distribución de Abies hickelii .......................................................................13
3.4. Métodos tradicionales de propagación en coníferas ............................................... 14
3.5. Cultivo de tejido vegetales (CTV) .......................................................................... 15
3.5.1 Formación de callo ........................................................................................18
3.5.2 Oxidación ......................................................................................................19
4. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................ 22
4.1. Localización ............................................................................................................ 22
4.2. Material biológico ................................................................................................... 22
4.3. Preparación de medios y condiciones de cultivo .................................................... 23
4.3.1. Medios de cultivo ..........................................................................................23
4.3.2. Condiciones de incubación ...........................................................................24
4.4. Desinfección de semillas......................................................................................... 24
ii
4.4.1 Desinfección de semillas de conos maduros abiertos ................................... 24
4.4.2. Desinfección de semillas de conos en diferentes estados de maduración ..... 26
4.5. Comparación de medios y reguladores de crecimiento en la inducción de respuestas
morfogenéticas en Abies religiosa .......................................................................... 27
4.6. Comparación de reguladores de crecimiento en la inducción de respuestas
morfogenéticas en Abies hickelii ............................................................................ 29
4.7. Comparación de antioxidantes en el control de la oxidación ................................. 30
5. RESULTADOS .............................................................................................................. 32
5.1. Desinfección de semillas ........................................................................................ 32
5.1.1. Desinfección de semillas de conos maduros abiertos ................................... 32
5.1.2. Desinfección de semillas de conos en diferentes estados de maduración ..... 33
5.2. Comparación de medios y reguladores de crecimiento en la inducción de respuestas
morfogenéticas en Abies religiosa .......................................................................... 35
5.2.1. Formación de callos por tipo de medio ......................................................... 37
5.2.2. Formación de callos con BA ......................................................................... 38
5.2.3. Formación de callos con auxinas .................................................................. 39
5.2.4. Formación de callos de los embriones de Abies religiosa en los
tratamientos completos (medio, BA y auxina) .............................................. 40
5.3. Comparación de reguladores de crecimiento en la inducción de respuestas
morfogenéticas en Abies hickelii ............................................................................ 41
5.3.1. Formación de callo con BA .......................................................................... 42
5.3.2. Formación de callo con Auxina .................................................................... 43
5.3.3. Formación de callos de los embriones cigóticos de Abies hickelii en las
combinaciones de BA con Auxinas ............................................................... 43
5.4. Comparación de antioxidantes en el control de la oxidación ................................. 44
6. DISCUSIÓN .................................................................................................................. 48
7. CONCLUSIONES ......................................................................................................... 51
8. RECOMENDACIONES ................................................................................................ 53
9. LITERATURA CITADA................................................................................................ 54
ANEXO 1 ................................................................................................................................... 62
ANEXO 2. Artículo publicado como requisito parcial............................................................... 64
iii
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
Figura 1. Distribución de los Abies mexicanos ...........................................................................7
Figura 2. Abies religiosa a) árbol adulto de A. religiosa en su hábitat, b) conos
femeninos de A. religiosa, c) semillas maduras de A. religiosa.. .....................................10
Figura 3. Distribución de Abies religiosa .................................................................................. 11
Figura 4. Abies hickeli a) árbol adulto de A. hickeli en su hábitat, b) conos femeninos de
A. heckeli, c) semillas maduras de A. hickeli. ...................................................................13
Figura 5. distribución de Abies hickeli. .....................................................................................14
Figura 6. Localización geográfica del Cofre de Perote. ............................................................23
Figura 7. a) Embrión cigótico inmaduro de A. hickeli, b) embrión cigótico inmaduro de
A. religiosa, c) embrión cigótico maduro de A.hickeli, d) embrión cigótico maduro
de A.religiosa. ...................................................................................................................34
Figura 8. Brotes adventicios en embriones cigóticos de Abies religiosa a los seis meses
de cultivados en medio MB. a) cultivado con BA (5 mg·L-1) y ANA (1 mg·L-1), b)
cultivado con cultivado con BA (5 mg·L-1) y ANA (0.5 mg·L-1)......................................37
Tabla 1. Diferencias entre Abies hickelii y Abies religiosa (Narave y Taylor, 1997). ............... 11
Tabla 2. Tratamientos aplicados en la etapa de desinfección de embriones. .............................26
Tabla 3. Concentraciones de BA, auxinas y medios evaluados en la inducción de
respuestas morfogenéticas de Abies religiosa. ..................................................................27
Tabla 4. Concentraciones de BA y auxinas evaluados en la inducción de respuestas
morfogenéticas de A. hickelii. ...........................................................................................30
Tabla 5. Porcentaje de contaminación obtenido después de aplicar diferentes
tratamientos de desinfección a las semillas maduras de A. religiosa y A. hickelii,
sembradas en medio de cultivo. ........................................................................................33
Tabla 6. Contaminación obtenida después de aplicar diferentes tratamientos de
desinfección a las semillas maduras de A. religiosa y sembradas en medio de
cultivo WP y MB. .............................................................................................................35
Tabla 7. Resultados del Análisis de varianza no paramétrico de las variables cualitativas
por tipo de medio en embriones de Abies religiosa. .........................................................38
Tabla 8. Resultados del Análisis de varianza no paramétrico de las variables cualitativas
por concentración de BA en embriones cigóticos de Abies religiosa. ..............................39
iv
Tabla 9. Efecto del tipos y concentración de auxinas empleadas para la formación de
callos a partir de embriones cigóticos maduros de A. religiosa. ...................................... 39
Tabla 10. Características cualitativas de las respuestas morfogenéticas de los embriones
maduros de A. religiosa; solo aparecen los 4 tratamientos (auxina/concentración)
con los callos más grandes (ver tabla 10). ........................................................................ 40
Tabla 11. Análisis de las variables cualitativas de los 10 tratamientos con los mejores
promedios en cuanto a tamaño del callo y diferentes (p<0.05) a los otros 54
tratamientos propuestos. ................................................................................................... 41
Tabla 12. Análisis de las variables cualitativas de Abies hickelii cultivado con 4
concentraciones diferentes de BA. ................................................................................... 42
Tabla 13. Análisis de las variables cualitativas en los tratamientos con los promedios
más altos del tamaño del callo. ......................................................................................... 43
Tabla 14. Análisis de las variables cualitativas en los tratamientos con los promedios
más altos del tamaño del callo. ......................................................................................... 44
Tabla 15. Efecto de los antioxidantes en el porcentaje de oxidación de los expantes de
A. religiosa a los dos meses de incubación. ...................................................................... 45
Tabla 16. Efecto de los antioxidantes en el porcentaje de oxidación de los expantes de
A. hickelii a los dos meses de incubación. ........................................................................ 45
Tabla 17. Efecto de los antioxidantes en el tamaño de los callos de A. religiosa a los dos
meses de incubación. ........................................................................................................ 46
Tabla 18. Efecto de los antioxidantes en el desarrollo de los callos de A. hickelii a los
dos meses de incubación. .................................................................................................. 47
v
RESUMEN
Se establecieron las bases para el cultivo in vitro de embriones cigóticos de Abies
religiosa y A. hickelii. Para establecer los cultivos se probaron diferentes tratamientos de
desinfección, así como diferentes estados de maduración de los conos; cuando se emplearon
semillas provenientes de conos maduros cerrados y desinfectaron con alcohol al 70% un minuto
e hipoclorito de sodio comercial al 30% 30 minutos, se obtuvo uno de los mayores porcentajes de
desinfección (14.8 %) y la mayor sobrevivencia. Para la inducción de respuestas morfogenéticas
en Abies religiosa se utilizaron dos diferentes medios de cultivo: Woody Plant y medio
Modificado de Blaydes, ambos adicionados con diferentes concentraciones de BA en
combinación con ácido 2,4-D o de ANA; el mayor porcentaje de explantes que formaron callo se
obtuvo en el medio modificado de Blaydes adicionado únicamente con BA (1, 3 y 5 mg.L
-1), por
otro lado, los callos de mayor tamaño se presentaron en nulas o bajas concentraciones de auxinas;
se logró la inducción y desarrollo de brotación a partir de embriones cigótico maduros cultivados
en medio modificado de Blaydes adicionado con 5 mg.L
-1 de BA en combinación con 1 o 0.5
mg.L
-1 de ANA. Para A. hickelii sólo se logró la formación de callo, los mayores porcentajes de
formación de callo y sobrevivencia, a los seis meses de cultivo, se obtuvieron en medio de cultivo
suplementado con bajas concentraciones de auxinas (0.5 a 1.0 mg.L
-1). La oxidación de los
explantes fue una limitante en el desarrollo de los cultivos de ambas especies, con el empleo del
carbón activado se obtuvo los menores porcentajes de oxidación. Dentro del cultivo in vitro de
coníferas el género Abies ha sido uno de los más difíciles, por lo que los resultados obtenidos son
altamente significativos.
vi
SUMMARY
The bases were established for the in vitro culture of zygotic embryos of Abies religiosa
and A. hickelii. To establish the culturing different treatments of disinfection were proved, as well
as different conditions of ripeness of the cones; when seeds were used obtained of mature closed
cones and disinfected with alcohol 70 % a minute and commercial hypochlorite sodium to 30 %
30 minutes, there was obtained one of the major percentages of disinfection (14.8 %) and the
major survive. For the induction of morphogenetic potential in A. religiosa two different media of
culture were in use: Woody Plant and a modified of Blaydes medium, both added with BA to
different concentrations in combination with 2,4-D or of ANA; the major percentage of explantes
that formed callus obtained in the modified of Blaydes medium added only with BA (1, 3 and 5
mgL-1
), on the other hand, the callus of major size appeared in void or low concentrations of
auxins; the induction and development of shoots was achieved from mature zygotic embryos
cultivated in modified of Blaydes medium added with 5 mgL-1
of BA in combination with 1 or
0.5 mgL-1
of ANA. For A. hickelii only there were achieved the formation of callus, the major
percentages of formation of callus and survive, to six months of culturing, they were obtained in
the culture medium added with low concentrations of auxins (0.5 to 1.0 mgL-1
). The oxidation of
the explantes was a limited in the development of the culturing of both species, with the
employment of the activated charcoal the minor percentages of oxidation were obtained. Inside
the in vitro culture of coniferous the genero Abies has been one of the most difficult, for what the
obtained results are highly significant.
1
1. INTRODUCCIÓN
En nuestro país al igual que en el resto del mundo existe un alto deterioro de los
ecosistemas, debido fundamentalmente a la tala inmoderada, incendios, desmontes, pastoreo,
plagas y enfermedades; se continúan explotando sus recursos sin que exista una planeación para
su manejo. El recurso forestal no es la excepción y principalmente las gimnospermas, que son las
especies más utilizadas en la industria maderera y de celulosa, han sido sobreexplotadas a tal
grado que muchas han visto reducida su área de distribución; tal es el caso de las especies del
género Abies. En Veracruz existen sólo dos especies de este género: Abies religiosa la cual se
distribuye desde el norte de la República Mexicana hasta Guatemala y A. hickelii que es
endémico de México, con una distribución limitada a pequeñas zonas de los estados de Veracruz,
Oaxaca y posiblemente en Chiapas (Narave y Taylor, 1997), el gobierno mexicano cataloga a esta
última como en peligro de extinción según la Norma Oficial Mexicana NOM-059-Ecol-2001
(Anónimo, 2002). Ambas especies se localizan en las partes altas del estado de Veracruz,
confinadas a pequeños rodales a causa de la explotación forestal, agrícola y ganadera (Sánchez-
Velásquez, 1991; Jardel 1986).
Dentro de las alternativas de rescate y conservación de germoplasma que se pueden
emplear para especies como A. religiosa y A. hickelii se encuentran los métodos de cultivo de
tejidos vegetales (Thorpe et al., 1990). Este tipo de cultivo presenta las ventajas de eliminar el
efecto de las estaciones del año, para algunas especies la propagación es más rápida que in vivo,
es factible obtener plantas libres de enfermedades, se utiliza muy poco material para establecer el
cultivo y existe ahorro de espacio y energía (López, 1989). En la propagación de especies con
poblaciones reducidas en la naturaleza, las técnicas de cultivo de tejidos pueden representar
grandes ventajas sobre los métodos convencionales, pues al aprovecharse la capacidad de
propagar vegetativamente árboles seleccionados se estarán clonando tales genotipos (Fay, 1994).
Esto debería ser de interés para las industrias, que podrían establecer en plantaciones los
ejemplares proveniente del cultivo de tejidos y reducir la necesidad de talar indiscriminadamente
poblaciones naturales (Mata, 2000).
2
A pesar de que el género Abies es un grupo de gran importancia económica, los reportes
sobre el cultivo in vitro para el género han sido muy limitados, esto se debe a que las
gimnospermas se consideran un grupo difícil de manipular in vitro (Bonga y von Aderkas 1992),
y dentro de este grupo, el género Abies ha presentado serias dificultades para su propagación con
estas técnicas, por lo que se considera como “recalcitrante” en el cultivo in vitro (Gajdosová and
Vooková, 1990; Bonga y von Aderkas,1992). Pese a lo anterior, se ha logrado inducir el proceso
de embriogénesis somática cultivando embriones cigóticos inmaduros de A. alba (Hristoforoglu
et al., 1995; Schuller et al., 1989) y embriones cigóticos maduros de A. fraseri (Guevin y Kirby,
1997).
El establecimiento de cultivos de tejidos vegetales, incluye desde la selección y
desinfección de los explantes, hasta la elaboración de la composición de los medios de cultivo
con el objeto de poder inducir una respuesta morfogenética (formación de callos, brotes, raíces y
embriones somáticos), es decir, modular la actividad de los genes para la inducción de los
procesos de organogénesis y/o embriogénesis somática. El presente trabajo aborda estas etapas
iniciales que permitirán sentar la bases para lograr el establecimiento del cultivo de tejidos
vegetales de estas especies y en un futuro, lograr la obtención de plantas completas que sirvan
para su conservación y propagación en masa, que puedan ser usados con fines comerciales o de
reintroducción; disminuyendo o aumentando la variación, según sea el caso.
3
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo General
Inducir respuestas morfogenéticas (callo, raíces, brotes, embriogénesis somática) a partir del
cultivo in vitro de explantes de Abies religiosa y A. hickelii del Cofre de Perote.
2.2. Objetivos Específicos
Establecer el cultivo aséptico de A. religiosa y A. hickelii, probando diferentes tratamientos de
desinfección y estados de maduración de las semillas.
Comparar la respuesta morfogenética de Abies religiosa y A. hickelii en dos medios de
cultivo.
Contrastar la inducción de respuestas morfogenéticas en Abies religiosa y A. hickelii en
cuatro diferentes concentraciones de N6-benciladenina (BA).
Confrontar la inducción de respuestas morfogenéticas en Abies religiosa y A. hickelii en
diferentes concentraciones de ácido-naftalen-acético (ANA) y 2,4-Diclorofenoxiacético (2,4-
D).
Determinar el medio y la combinación de reguladores del crecimiento (BA/2,4-D ó BA/ANA)
para el desarrollo de respuestas morfogenéticas.
Determinar el efecto antioxidante del carbón activado, ácido cítrico, ácido ascórbico y
polivinilpirrolidona sobre cultivos in vitro de Abies religiosa y A. hickelii.
4
3. REVISIÓN DE LITERATURA
Las coníferas son un grupo de gimnospermas con gran importancia biológica y
económica. Son la fuente de madera para usos que van desde la fabricación de muebles hasta la
construcción de casas y son el origen de sustancias como la brea o el aceite de inmersión usado
en microscopía; desde el punto de vista ecológico forman grandes bosques en las zonas
templadas tanto en el hemisferio norte como en el sur (Bismas y Johri, 1997); en México, los
bosques de coníferas se localizan sobre todas las sierras del país.
En el Orden coniferales se incluyen 6 familias de plantas: Araucariaceae,
Cephalotaxaceae, Cupressaceae, Pinaceae, Podocarpaceae y Taxodiaceae (Bismas y Johri, 1997).
Algunos autores como Kubitski (1990) aceptan la existencia de dos familias más:
Phyllocladaceae y Syacopitiaceae; así mismo Foster y Gifford (1974) incluyen sólo a la familia
Taxaceae.
La familia Pinaceae tiene casi 200 especies incluidas en 10 géneros (Bismas y Johri,
1997); en México se han reportado 67 especies incluidas en 4 géneros: Abies, Picea, Pseudotsuga
y Pinus (Fonseca, 1999).
Abies es un género boreal que incluye 50 especies distribuidas en las regiones templadas
de Europa, norte de África, Asia, Norte América, México y Guatemala. Para México se
reconocen 8 especies (Abies hickelii, A. religiosa, A. oaxacana, A. guatemalensis, A.
durangensis, A. mexicana, A. vejari, A. concolor) y 5 variedades (A. religiosa var. emarginata, A.
guatemalensis var. tacanensis, A. guatemalensis var. jaliscana, A. durangensis var. coahuilensis,
A. vejari var. macrocarpa), distribuidas principalmente en el centro y sur del País (Narave y
Taylor, 1997; Fonseca, 1999; Martínez, 1963). Los bosques de Abies ocupan áreas limitadas en el
país (0.16% del territorio nacional), se encuentran en lugares y condiciones muy particulares e
interesantes: cañadas profundas o laderas con neblinas constantes, suelos profundos, poca
insolación y alta cantidad de materia orgánica (Ávila, 1992).
5
En Veracruz se encuentran sólo dos especies de este género, A. religiosa y A. hickelii,
ésta última es un abeto endémico de México en peligro de extinción que presenta una distribución
limitada a ciertas zonas de los estados de Veracruz, Oaxaca y posiblemente en Chiapas (Narave y
Taylor, 1997).
3.1. El género Abies
Ubicación taxonómica, inicialmente Linneo, en el año de 1753, colocó a todos los
abetos en el género Pinus. Miller en el año 1754 los asignó a el género Abies (especie tipo: A.
alba). Hacia el año de 1820, Berchtold. y Presley consideraron que el grupo debía ser elevado a
familia (Abietaceae), circunstancia que no encontró apoyo y no fue aceptado (Farjon y Rushforth,
1989). Actualmente se sigue la clasificación vigente propuesta por Stewart (1985):
Reino: Plantae
División: Gymnospermae
Clase Gimnospermopsida
Orden Coniferales
Familia: Pinaceae
Género: Abies
3.1.1. Descripción botánica del género Abies
De acuerdo con Martínez (1963), el género Abies se caracteriza por que son árboles
corpulentos, siempre verdes, resinosos, de copa simétrica y aguda, su altura generalmente es de
30 a 40 m, ocasionalmente más de 60 m. Su corteza es oscura, gruesa y hendida, con placas
irregulares en los árboles adultos, grisácea y más o menos lisa en los jóvenes. Las ramillas son
opuestas y frecuentemente dísticas, de color moreno rojizo, a veces con tintes violáceos y la
superficie más o menos hirsuta, rara vez glabra. Sus hojas son lineares, sésiles, rectas o algo
falcadas; tiesas, algo coriáceas y frecuentemente aromáticas; sus dimensiones varían de 18 a 70
6
mm, su color va de verde claro a verde oscuro, en la cara superior son más o menos brillantes y
en la inferior opacas y glaucas.
Las características diagnóstica de Abies, por medio de las cuales podemos distinguirlo de
los demás géneros de la familia Pinaceae en el estado de Veracruz, de acuerdo con Narave y
Taylor (1997), son que presentan megastróbilos más o menos erectos en las ramillas, rojizos, de 7
a 15 cm de longitud; brácteas no divididas y escamas deciduas al madurar las semillas. Se
distingue fácilmente a distancia de otros árboles por su forma piramidal.
3.1.2. Distribución del género Abies en México
Los bosques de Abies de mayor extensión se presentan en las serranías que circundan a
la cuenca del estado México; le siguen en importancia otras montañas sobresalientes del propio
Eje Neovolcánico Transversal, como el Pico de Orizaba, Cofre de Perote, Nevado de Toluca y
Tancítaro (Rzedowski, 1978; Vela et al., 1976).
En la Sierra Madre del Sur los bosques de Abies de mayor importancia se conocen en la
zona del cerro de Teotepéc, Guerrero y al sur de Miahuatlán, Oaxaca. En el norte de Oaxaca, se
presentan en las partes más elevadas de sierra de Juárez, en la sierra de San Felipe y en la región
del cerro Zempoatépetl. Miranda (1952) los encontró en Chiapas, en la sierra del Tacaná, cerca de
San Cristóbal de las Casas, en los alrededores de Tapalapa y Coapilla. En la Sierra Madre
Occidental los encontramos en Durango y algunas localidades de Chihuahua. En la Sierra Madre
Oriental, sólo se conocen dos áreas de bosque de Abies de considerable extensión, en el Cerro
Potosí y el Cerro de San Antonio Peña Nevada, en Nuevo León y en Tamaulipas, respectivamente
(Rzedowski, 1978) (Figura 1).
7
Figura 1. Distribución de los Abies mexicanos
3.1.3. Importancia del género Abies en México
La madera de Abies tiene una gran demanda, debido a los múltiples usos que se le ha
dado. La carencia de olor y peso ligero de su madera, la hacen apropiada para la obtención de
pulpa para papel y madera aserrada. La pulpa puede usarse en la obtención de varias clases de
papel de imprenta y papel de estraza de alta calidad. La madera aserrada se utiliza en la
fabricación de cajas y camastros, además, por su color, ausencia de manchas y resina la hacen
apropiada para la fabricación de recipientes para alimentos como cajas para pescado, cajas para
sardinas, toneles para azúcar y otros. También se ha usado para la obtención de tablillas para
lápices; en construcciones toscas para puertas, marcos y techos interiores (Ortega, 1962).
8
Cerca de las zonas donde crecen las especies de Abies, la madera se emplea en trozos
delgados para techos de las casas (tejamanil) y es de las preferidas en la elaboración de muebles;
las ramas y árboles pequeños se emplean como árboles navideños (Narave y Taylor, 1997); en la
década de los 50´s llegó a ocupar el primer lugar como árbol de navidad en México.
3.1.4. Ecología del género Abies
Se han realizado diferentes estudios ecológicos en los bosques de Abies principalmente
en la parte central del país (Garduño, 1944; Madrigal, 1967; Bojorges, 1990; Avila, 1992). Para el
estado de Veracruz se han realizado pocos estudios ecológicos con las especies de este género,
Sánchez-Velásquez et al. (1991), trabajaron en el bosques de Abies religiosa en donde
determinaron las condiciones bajo las cuales habita. Jardel (1986), estudió el efecto de la
explotación forestal en la estructura y regeneración del bosque de coníferas en un área del Cofre
de Perote, en 2 de los 5 rodales que él estudió, encontró Abies hickelii.
De acuerdo con Narave (1985) en los bosques del Parque Nacional del Cofre de Perote,
Veracruz, las poblaciones de A. hickelii se localizan de los 2800 a 3100 msnm, preferentemente
en rodales donde predomina Pinus patula; aunque también es común su presencia en los rodales
de P. montezumae, P. pseudostrobus y P. ayacahuite. De los 3000 a los 3500 msnm en adelante se
encuentran bosques puros de Abies religiosa.
En lo que se refiere a la estructura de los bosques en la región del Cofre de Perote, están
formados por rodales puros de pinos coetáneos de Pinus patula y P. montezumae o de dos edades
y por rodales con una composición mezclada de múltiples edades. En estos últimos predominan
especies tolerantes, como Abies hickelii, o tolerantes intermedias como Pinus ayacahuite (Jardel,
1986).
La superficie que abarca el bosque de Abies religiosa, en la región del Cofre de Perote,
suma un total de 1145 hectáreas distribuidas en forma discontinua (Hernández-Martínez, 1984),
esta superficie se va reduciendo a pequeños manchones debido principalmente a presiones
antrópicas, talas y cultivos.
9
3.2. Abies religiosa
Dentro del género Abies, A. religiosa fue una de las primeras especies que se describió,
desde el siglo antepasado por el botánico Kunth (1817), basándose en las colectas enviadas por
Humbold y Bonpland. En un principio fue colocada en el género Pinus y posteriormente en el
género Picea (Martínez, 1963).
La publicación del nombre válido fue Abies religiosa (Kunth) Schtldl. & Cham.
(Linnaea V, 77. 1830) y Martínez (1963) le imputa los siguientes sinónimos:
Pinus religiosa H.B.K. Nov. Gen et Sp. Plant II. 4. 1817.
Pinus hirtella (H.B.K.) Nov. Gen et Sp. Plant. II, 4. 1817.
Picea religiosa Loudon. Arb. Brit. IV. 2349. 1838.
Picea hirtella Loudon Arb. Brit. IV. 2349. 1838.
Abies religiosa Lindley, ex Gordon. Pinetum. 153. 1858.
Abies hirtella Lindley Penny Cycl. 1. 31 . 1833.
Picea glaucescens Gordon Pinetum. 1858.
Picea religiosa glaucescens Gordon Pinetum. 1858.
Abies glaucescens Roezl. Cat Grains Conif. 1858-1859.
Abies galuca Roezl. ex De Candole, Prodromus, XVI, p. 420.
Abies tlapalcatuda Roezl. ex De Candole, Prodromus, XVI, p. 420.
3.2.1. Descripción botánica de Abies religiosa
Árboles de 10-35 m de alto, corteza obscura, grisáceo parda, ramillas opuestas, rojizo
pardas, glabras algunas veces glandular pubescentes o puberulentas, cicatrices foliares notorias,
yemas terminales ovoides, de 4-8 mm de ancho. Hojas densamente espiraladas, dísticas o
subdísticas, verde pálido cuando secas, lineares, de 11 a 30 mm de largo, 1-2 mm de ancho, haz
brillante, envés algunas veces ligeramente glauco, de 7-11 líneas estomáticas a cada lado de la
cresta, ápice agudo, obtuso o redondeado, la base frecuentemente torcida; dos canales resiníferos,
10
cerca de los márgenes. Microstróbilos rojizo-ocres o rojizo-amarillentos, ovoides a oblongo-
elipsoides, recurvados cuando maduros, de 0.5-2.4 cm de ancho. Megastróbilos sésiles o
subsésiles, púrpura negros a pardos rojizos cuando maduros, de 10 a 15 cm de largo, 4-7 cm de
ancho, escamas ovulíferas irregularmente obtriangulares, leñoso-coriáceas, de 0.8-3 cm de largo,
1-3.4 cm de ancho, brácteas oblanceoladas, de 1-3.2 cm de longitud, 0.5-0.7 cm de ancho,
ligeramente sobre-pasando a la escama, margen eroso a inciso, ápice acuminado recurvado
cuando maduro; semillas oblongo elípticas, de 6-10 mm de ancho, el ala abrazando a la semilla,
cuneada, de 1.5-2.8 cm de largo, 0.6-1 cm de ancho (Narave y Taylor, 1997) (figura 2).
Figura 2. Abies religiosa a) árbol adulto de A. religiosa en su hábitat, b) conos femeninos de A.
religiosa, c) semillas maduras de A. religiosa..
Las características diagnósticas de la especie con las cuales lo podemos distinguir
fácilmente de otras especies cercanas como A. hickelii se muestran en la tabla 1.
11
Tabla 1. Diferencias entre Abies hickelii y Abies religiosa (Narave y Taylor, 1997).
Característica Abies hickelii Abies religiosa
Ápice de la hoja
Comúnmente emarginado o más o
menos emarginado u obtuso,
raramente agudo
Agudo o redondeado
Color de la hoja cuando seca Verde olivo Verde pálido
Canales resiníferos en la hojas
(observados en corte transversal) 4-8 2
Brácteas del cono Sobresaliendo a la escama ovulífera Sobresaliendo ligeramente a la
escama ovulífera
3.2.2. Distribución de Abies religiosa
Se distribuye desde las montañas del centro y sur de México hasta el norte de
Guatemala. En México se localiza en los rangos de 17° 30´ a 21° 00´ de latitud Norte y 97° 104´
a 97° 96´ de Longitud W (Martínez, 1963). En altitudes que van desde 2600 hasta 3500 msnm,
comprendiendo los estados de Hidalgo, Michoacán, Jalisco, México, Morelos, Guerrero, Puebla,
Tlaxcala, Veracruz y el Distrito Federal (Narave y Taylor, 1997) (figura 3).
Figura 3. Distribución de Abies religiosa
12
3.3. Abies hickelii
Es una especie que se describió apenas en el siglo XX por Flous y Gaussen; al parecer
esta es una especie bien definida ya que no reporta sinónimos en la literatura, (Martínez, 1963)
La publicación del nombre fue A. hickelii Flous & Gaussen, (Bull. Soc. Hist. Nat.
Toulouse 64:24, 1932).
3.3.1 Descripción botánica de Abies hickelii
Árboles de 10-25 m de altura (ocasionalmente hasta 30), las ramas secundarias opuestas,
frecuentemente glandular-pubescentes, hirsutas, puberulentas o glabrescentes, cicatrices foliares
notorias, yemas terminales en verticilos de tres, resinosas, ligeramente ovoides, de 4-5 mm de
longitud, de 3-4 mm de ancho. Hojas más o menos espiraladas, de color verde olivo cuando
secas, lineares, de 12-30 mm de longitud, 1-2 mm de ancho, haz brillante, envés glauco, con 6-8
líneas estomáticas a cada lado de la cresta, ápice retuso, emarginado, obtuso u ocasionalmente
agudo, la base enroscada, canales resiníferos 4-8 (10) dispersos en la subepidermis o tejidos
internos o en el tejido lagunoso. Megastróbilos subsésiles, obongo-cilíndricos, de 5.5-10 cm de
longitud, 2-4.5 cm de ancho, el pedúnculo de 0.6-1 cm de largo, las escamas ovulíferas
anchamente obovadas o irregularmente obtriangulares, de 1.2-2.1 cm de largo, 1.5-2.5 cm de
ancho, la superficie adaxial algunas veces espiculado-ferrugínea, el margen redondeado, repando,
las brácteas de 0.5-0.7 de ancho, márgenes aserrados, el ápice ligeramente emarginado, obtuso o
frecuentemente cuneado; semillas irregularmente elípticas, de 4-9 mm de longitud, 1.5-3 mm de
ancho, ala rodeando la semilla cuneada, de 1.4-1.5 cm de longitud, 0.6-1 cm de ancho, con
márgenes enteros o repandos (Narave y Taylor, 1997) (figura 4).
13
Figura 4. Abies hickeli a) árbol adulto de A. hickeli en su hábitat, b) conos femeninos de A. heckeli, c) semillas maduras de A. hickeli.
3.3.2. Distribución de Abies hickelii
Los bosques de Abies hickelii, están confinados a las montañas centrales de Oaxaca
(Avila, 1992); en Veracruz se le puede encontrar en los ejidos de Carabinas e Ingenio del Rosario
en la región del Cofre de Perote (Narave y Taylor, 1997), en el Pico de Orizaba y en la Sierra de
Acultzingo; en Chiapas se localiza en Mezcalapa y Copainalá (Avila, 1992). Es importante
destacar que altitudinalmente presenta un rango estrecho, que va de 2800 a 3100 m (Narave y
Taylor, 1997). Además, es una especie endémica de México y catalogada como en peligro de
extinción por la Norma Oficial Mexicana NOM-059-Ecol-2001 (Anónimo, 2002) (figura 5).
14
Figura 5. distribución de Abies hickeli.
3.4. Métodos tradicionales de propagación en coníferas
Se reconoce que los bosques son talados a una taza más rápida que la que se pueden
regenerar, de manera natural o artificial. Por otro lado, existen enfermedades y plagas, así como,
incendios forestales que amenazan la existencia de algunas especies (Mata, 2000); por lo cual el
interés por el cultivo y propagación de las coníferas es muy grande.
La propagación sexual, se basa en el cruzamiento de gamétos; esta capacidad de
reproducción de los árboles ha sido manipulada por el hombre a través de la polinización
controlada, para realizar el mejoramiento genético tradicional; ésta se realiza mediante la cruza
de árboles elite o superiores para la producción de semillas mejoradas de alta calidad y así poder
15
obtener nuevos individuos de los que a su vez se seleccionan los mejores. Desgraciadamente para
muchas especies forestales, la producción de semillas mejoradas genéticamente requiere muchos
años, no se pueden producir en abundancia y a bajo costo (Bonga y von Aderkas, 1992).
Otro método de propagación en coníferas es la asexual o vegetativa, a través del
enraizamiento de esquejes o de fascículos, en el caso de los pinos, o mediante injertos (Thorpe y
Harry, 1991). Sin embargo, para la mayoría de las coníferas, este tipo de propagación es muy
limitada, debido a la pobre respuesta que tienen los esquejes para enraizar en forma masiva y
práctica (Bonga y von Aderkas, 1992; Thorpe et al., 1990), por lo que generalmente no es posible
usar estos métodos de propagación. Además los métodos de propagación vegetativa se han
practicado, en algunas especies de coníferas, desde hace mucho tiempo, pero estos tienen sus
limitaciones, especialmente cuando se requieren grandes cantidades de propágulos.
De manera particular, en las especies del género Abies se ven reflejados los problemas
de propagación antes mencionados; además, presentan porcentajes de germinación y
sobrevivencia bajos; por ejemplo, González (1985) reporta el 18% de germinación de A. religiosa
de la región de Zoquiapan del estado de México, y sólo el 7.7% de las plántulas obtenidas
sobrevivieron. Para especies como ésta existen otras alternativas de propagación, como la
propagación, a través del cultivo de tejidos.
3.5. Cultivo de tejido vegetales (CTV)
Los métodos de cultivo de tejidos vegetales (CTV) ofrecen una alternativa de
propagación y han sido exitosamente empleados para muchas especies de árboles (Ahuja, 1993).
En la década de los 30´s se inicio el CTV en las plantas leñosas; en los años 50´s se
logró mantener el primer callo de gimnosperma (Sequoia sempervirens) en continuo crecimiento
(Ball, 1950); en los 70´s se estableció el CTV de callos y órganos de varias especies de coníferas
(Ahuja,1993).
16
La propagación de muchas coníferas está limitada por los cambios fisiológicos que
ocurren durante la maduración, lo que hace que el tejido maduro no sea capaz de responder a la
estimulación morfogenética externa. Esto revela que los órganos y tejidos de las plantas adultas
tienen poca plasticidad de desarrollo (Bonga, 1983), muy evidente en el caso de las
gimnospermas, lo que ha conducido a que la mayoría de las especies que se han logrado propagar
vegetativamente por medio de los métodos de CTV hayan sido utilizando embriones y en algunos
casos tejidos de plántulas; aunque es altamente deseable llegar a desarrollar técnicas de
propagación vegetativa a partir de árboles maduros (Atree y Fowke, 1991).
De manera general los explantes juveniles como: embriones cigóticos, hojas
cotiledonares, hipocótilos, yemas y ápices de plántulas, son los que han respondido mejor a la
regeneración in vitro en comparación con los tejidos de plantas adultas; como por ejemplo, las
yemas laterales. Por esta razón, los explantes juveniles han sido extensamente empleados para la
propagación clonal de especies leñosas (Ahuja, 1993). Aunque el tejido juvenil es la fuente más
común de explantes en coníferas, su limitación radica en que éste también sufre maduración y
sólo puede ser capaz de responder a un estímulo organogénico o embriogénico dentro del primer
mes después de la germinación (Ellis y Bilderback, 1989).
En estudios sobre CTV de especies con poblaciones escasas en la naturaleza es necesario
explorar la regeneración a partir de los explantes disponibles; comúnmente en gimnospermas se
recurre a estructuras ligadas a la semilla (Atree y Fowke, 1991). La propagación a través del CTV
tiene un gran potencial como se ha demostrado en los últimos 20 años, en los que se han
propagado más de 50 especie de gimnospermas con estas técnicas (Thorpe y Harry, 1991).
El CTV de coníferas puede significativamente incrementar la producción forestal
mediante la producción de genotipos seleccionados para características como: tasa de
crecimiento, calidad de madera o resistencia a enfermedades. El CTV también podría introducir
nuevas variaciones genéticas y reducir las barreras para entrecruzar especies, asumiendo un papel
importante en el mejoramiento genético forestal (Mohammed y Vidaver, 1988).
17
Las respuestas morfogenéticas deseadas para la propagación masiva, en general, son de
tres tipos:
1) Elongación de brotes adventicios, ocurre cuando estos normalmente inactivos, por la
dominancia de la yema apical, son liberado por la adición de reguladores del
crecimiento, principalmente citocininas; esta técnica es utilizada en angiospermas más
que en las gimnospermas;. este tipo de respuesta es la que mantiene mayor estabilidad
genética (Bonga y von Aderkas,1992).
2) Organogénesis, en la cual hay que inducir primero la formación del órgano,
generalmente son brotes adventicios y posteriormente se induce el enraizamiento; en las
coníferas la formación de brotes adventicios ocurre en el hipocótilo y cotiledones del
embrión, así como en hojas jóvenes de plántulas (Bonga y von Aderkas, 1992).
3) Embriogénesis somática, se refiere a la formación de embriones a partir de tejido
somático, es decir, no como resultado de la unión de dos celulas gameticas; con la
capacidad de germinar para dar lugar a una planta completa; esta técnica es preferida
cuando un pequeño grupo de individuos van a ser propagados a gran escala, por que
produce una mayor cantidad de propágulos, involucra menor mano de obra y por
último, la encapsulación de embriones somáticos ha permitido la producción de
semillas artificiales para ser llevadas al campo (Bonga y von Aderkas, 1992).
Estos tres tipos de respuestas morfogenéticas se pueden obtener de manera directa o de
manera indirecta, es decir, a través de otra respuesta morfogética intermedia de células no
diferenciadas, conocida con el nombre de callo.
El CTV ha sido más exitoso en las angiospermas que en las gimnospermas; dentro de
estas últimas, las coníferas han sido un grupo difícil de micropropagar, en particular el género
Abies, se ha reportado como uno de los géneros con mayores obstáculos en el CTV (Bonga y Von
Aderkas, 1992). Hasta el momento no hemos encontrado trabajos de cultivo de tejidos en Abies
religiosa o A. hickelii y en otras especies del género son muy escasos. Se ha reportado
18
embriogénesis somática cultivando embriones cigóticos inmaduros de A. alba; (Hristoforoglu et
al., 1995; Schuller et al., 1989) y en A. fraseri a partir de embriónes cigóticos maduros (Guevin y
Kirby, 1997). Hristoforoglu et al. (1995) reporta el desarrollo y germinación de embriones
somáticos de A. alba, siendo los primeros en obtener plántulas producidas in vitro de este género.
También se ha reportado brotación múltiple cultivando yemas en crecimiento de A. balsamaea,
aunque no se logró obtener plántulas (Bonga, 1977, citado por Conger, 1984).
3.5.1 Formación de callo
Un callo es una masa amorfa de células parenquimatosas que tienen su origen en las
células que proliferan del tejido parental (Dodds y Roberts, 1984). El desarrollo de un callo a
partir de un fragmento de tejido vegetal se divide en tres etapas: inducción, división o
proliferación y diferenciación (Aitchison et al., 1977). Las dos primeras etapas son las que
caracterizan la formación del callo, y la tercera es la que generalmente se persigue y en la
mayoría de los casos es la más difícil de obtener.
La inducción del callo ocurre cuando el explante se pone en contacto con un medio
nutritivo con reguladores del crecimiento capaces de estimular y mantener la división celular.
Durante esta fase, el metabolismo es activo, aunque el tamaño de las células permanece
constante; en cambio, la división es una fase de síntesis activa y se caracteriza por la disminución
en el tamaño celular, etapa en que ocurre la desdiferenciación con la aparición de células
meristemoides (Aitchison et al., 1977).
Los reguladores del crecimiento, principalmente utilizados, en la inducción de callos,
han sido las auxinas (Yeoman y Macleod, 1977), dentro de éstas el ácido 2,4-diclofenoxiacético
(2,4-D) ha sido predominantemente utilizada (Wann,1988); aunque se tienen reportes en los que
el proceso también se ha dado bajo un régimen de citocininas (Druart,1980; Yasuda et al., 1985).
Por otro lado, una relación de auxina y citocinina de 10 a 100 favorece l formación de yemas
(Dodds y Roberts, 1984).
19
Desde un punto de vista funcional, la característica más importante de un callo es que
éste es capaz de desarrollar brotes, raíces o embriones, los cuales pueden dar lugar a plantas
normales (Dodds y Roberts, 1984). Por consiguiente, la regeneración de plantas puede ocurrir por
vía organogenética o por embriogénesis somática indirectamente al pasar por la etapa de callo
(Bhojwani y Razdan, 1983). De las especies de gimnospermas cultivadas in vitro en menos del
5% se ha logrado obtener plántulas indirectamente a través de callos (Harry y Thorpe, 1994).
3.5.2 Oxidación
La oxidación es un problema frecuente de los cultivos in vitro de especies forestales, los
explantes tienden a ponerse cafés o negros rápidamente después de aislarlos; como consecuencia,
la tasa de crecimiento se reduce y eventualmente el tejido muere.
La oxidación del tejido es un proceso autocatalítico. Los exudados fenólicos producen
daño al tejido, los cuales crean más exudados y, por consiguiente, mayor oxidación (Bonga y von
Aderkas, 1992). La inhibición del crecimiento es más severa en las especies que contienen altos
niveles de taninos u otros hidroxifenoles. Los tejidos provenientes de plántulas son menos
propensos a la oxidación por disección que los tejidos de plantas adultas.
La oxidación también esta influenciada por el estado fisiológico del explante (Mata,
2000); sin embargo, en algunas ocasiones el callo está asociado de manera directa a la formación
de brotes adventicios; como ocurre en Larix x eurolepsis (Laliberté y Lalonde, 1988). En Picea
abies la formación de brotes y raíces se inician preferentemente de callos oxidados originados del
megagametófito (Simola y Honkanen, 1983).
La necrosis del tejido ocurre por la acción de las enzimas oxidasas que contienen cobre
tales como las polifeniloxidas y la tirosinasa, las cuales son liberadas o sintetizadas en el
momento en que los tejidos son dañados. Los sustratos de estas enzimas varían en cada tejido,
siendo las más comunes la tirosina o hidroxifenoles como el ácido clorigénico. Las enzimas y
sustratos son normalmente retenidos dentro de diferentes compartimentos de las células y se
20
liberan cuando éstas son dañadas o se encuentran moribundas. La toxicidad de los fenoles se
debe, a la unión reversible del hidrógeno a las proteínas. La inhibición irreparable del crecimiento
se presenta cuando los fenoles son oxidados a compuestos quinona altamente activos,
polimerizan y/o oxidan proteínas para formar de manera creciente compuestos melánicos (George
y Sherrington, 1984).
La oxidación del tejido se puede prevenir de varias maneras, unas con mejores
resultados que otras. En algunos casos se necesita la conjunción de dos o más alternativas y en
los casos más severos es muy difícil prevenirla. Las acciones para prevenir la oxidación se
pueden dividir en tres: 1) eliminación física de las sustancias fenólicas, 2) adición al medio de
cultivo de compuestos que absorban los oxidantes y por último, 3) mediante el uso de agentes
reductores.
La primera acción es remover las sustancias fenólicas de los explantes, las cuales son
frecuentemente exudados del tejido. Para ello se realizan lavados con agua corriente, antes de que
los explantes sean esterilizados; también se pueden dejar algunos minutos en agua estéril antes de
la disección del material; otra operación común es realizar subcultivos frecuentes. En las
transferencias a cultivos de intervalos frecuentes, las partes necrosadas del tejido pueden
removerse antes de que afecten al tejido sano (Bonga y von Aderkas, 1992).
Otra acción es, la adición de compuestos que absorban los elementos tóxicos e
inhibitorios; el carbón activado tiene una gran capacidad para absorberlos, generalmente se
emplea en concentraciones de 0.5 a 3 g l-1
(George y Sherrington, 1984); sin embargo, también
puede absorber químicos esenciales del medio entre los que se encuentra la tiamina y el ácido
nicótinico, así como, algunos reguladores del crecimiento tales como auxinas, citocininas y ácido
abscísico (Weatherhead, et al,1979, citado por Bonga y von Aderkas, 1992). Otros compuestos
como el polivinilpirrolidona (PVP) (Hohtola, 1988), la cafeína y el B-mercaptoetanol han
mostrado ser benéficos en la absorción de polifenoles y taninos. El PVP absorbe fenoles a través
de la unión con el hidrógeno, previniendo la oxidación del tejido (George y Sherrington, 1984).
21
El uso de agentes reductores se basa en que la tendencia de los compuestos a oxidarse o
reducirse depende del potencial de reducción-oxidación (redox) de la solución. Cuando los
tejidos son susceptibles a la oxidación, éstos se sumergen en una solución de un agente reductor
(antioxidante) inmediatamente después de su disección. La lista de compuestos útiles que se ha
usado para este propósito incluye al ácido ascórbico, ácido cítrico, L-cisteina HCl, ditiotreitol y
mercaptoetanol. También se han incorporado agentes reductores dentro del medio de cultivo
(George y Sherrington, 1984).
Diferentes componentes del medio pueden influir en la oxidación de los explantes. Los
brotes obtenidos de Pseudotsuga menzeisii se oxidan severamente con sacarosa al 6% en el
medio y se reduce en concentraciones menores (Bonga y von Aderkas, 1992). Algunas especies
son susceptibles a la oxidación en presencia de cobre contenido en el agar empleado para
solidificar el medio de cultivo (Debergh, 1983).
22
4. MATERIAL Y MÉTODOS
4.1. Localización
La presente investigación se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales
del Jardín Botánico Francisco Javier Clavijero del Instituto de Ecología, A.C., en la ciudad de
Xalapa, Veracruz, durante el periodo comprendido entre agosto de 2000 y julio de 2002.
4.2. Material biológico
El material biológico empleado fue embriones somáticos de Abies religiosa y A. hickelii,
obtenidos de semillas provenientes de conos colectados en la región del Cofre de Perote,
Veracruz. Los conos de A. religiosa se obtuvieron de la población localizada en el ejido El
Conejo, municipio de Perote, Veracruz, México; mientras que los conos de A. hickelii se
colectaron en los ejidos de Tembladeras e Ingenio del Rosario, municipio de Xico, Veracruz.
El Cofre de Perote es un macizo montañoso que se encuentra situado sobre el paralelo
19° 3´ N y en el meridiano 97° 10´ W (figura 6), cerca del límite entre los estados de Veracruz y
Puebla; forma parte del Eje Neovolcánico Transversal. El área de los bosques de Oyamel abarca
parte de los municipios de Perote, Xico, Ayahualulco, las Vigas y una pequeña porción de
Coatepec (Narave y Taylor, 1997). El clima que predomina en la zona corresponde al tipo
semifrío húmedo, con verano fresco corto. La temperatura y precipitación media anual son 9.1 °C
y 1577.5 mm, respectivamente (Gómez, 1991).
Los embriones obtenidos de los 3 diferentes estados de maduración, se definen y
colectaron en las siguientes fechas: 1) los conos inmaduros se colectaron a fines en mes de
octubre de 2000, son conos con escamas compactas y los embriones en etapa de formación; 2).
los conos maduros con escamas cerradas se colectaron en el mes de septiembre de 2001, son
conos con las escamas compactas y los embriones completamente formados; 3). por último, los
23
conos maduros con escamas abiertas se colectaron a principios del mes de octubre de 2001, son
conos con las escamas menos compactas, las escamas se desprenden al tacto con facilidad y los
embriones se encuentran completamente formados.
Figura 6. Localización geográfica del Cofre de Perote.
Las semillas se extrajeron manualmente de los conos, se colocaron en bolsas de estraza y
se almacenaron en refrigeración a 4 °C hasta el momento de su utilización.
4.3. Preparación de medios y condiciones de cultivo
4.3.1. Medios de cultivo
Los medios de cultivo empleados fueron Woody Plant (WP) (Lloyd & McCown, 1980)
(Anexo 1a) y el medio modificado por Blaydes (MB) (Merkle y Sommer, 1991) (Anexo 1b). A
los dos medios se les ajustó el pH a 5.7 con NaOH y HCl 1N. Como agente gelificante se utilizó
Phytagel (Sigma) en concentración de 2.7 g·L-1
. Se vertió de 20 a 25 ml de medio por frasco de
24
alimento infantil (gerber) de 120 ml de capacidad. Posteriormente, los frasco con el medio fueron
esterilizados en una autoclave a 120 °C, 15 lb psi-1
durante 17 minutos.
4.3.2. Condiciones de incubación
Todos los explantes fueron incubados en un cuarto de crecimiento a una temperatura de
24 2 °C; con un fotoperiodo de 16 horas luz, la cual es proporcionada por lámparas de luz
blanca General Electric de 75 W, bajo una intensidad luminosa de 1,230 lux. Por tratarse de una
especie no tolerante al sol (Jardel, 1986) se utilizó sobre los frascos una malla de sombra del
30%, para disminuir la intensidad lumínica hasta 300 lux.
4.4. Desinfección de semillas
4.4.1 Desinfección de semillas de conos maduros abiertos
Las semillas de A. religiosa y A. hickelii provenientes de conos maduros con escamas
abiertas, se lavaron en una solución de detergente líquido comercial (Axion) y se enjuagaron con
abundante agua destilada, posteriormente se remojaron en agua destilada de 24 a 36 h con el fin
de separar por flotación a las vanas de las viables.
A las semillas viables se les aplicaron 4 diferentes tratamientos de desinfección
superficial:
1) Alcohol 70% 1 minuto; solución al 30% (v/v) de hipoclorito de sodio (NaOCl)
comercial (6% de cloro activo) 30 minutos (Mata, 2000), a este tratamiento se le
denominó de cloro 30%;
25
2) Peróxido de hidrógeno (H2O2) comercial 30 vol. por 15 min; alcohol al 70% por 1
minuto; NaOCl comercial al 30% (v/v) por 30 minutos, al cual se le llamó peróxido de
hidrógeno;
3) Acido sulfúrico concentrado (H2SO4) por 15 segundos; H2O2 comercial de 30 vol.
por 15 min; alcohol 70% 1 minuto; NaOCl comercial 30% (v/v) 30 minutos (modificado
de Martínez-Pulido et al., 1990), a este tratamiento se le denominó de ácido sulfúrico
concentrado;
4) Solución de Benlate (Bayer) 2.5 g/l, adicionado con Bactericida (Mycrodin) 2-3
gotas/100 ml por 12 h; alcohol 70% 1 minuto; NaOCl comercial al 30% (v/v) 30
minutos, a este tratamiento se le llamó solución de benlate.
Finalmente, en todos los casos se aplicaron, bajo condiciones asépticas (campana de
flujo laminar), tres enjuagues con agua destilada y esterilizada. Con la ayuda de microscopio e
instrumental de disección se extrajeron los embriones cigóticos y se sembraron en los medios de
cultivo WP y MB.
El periodo de incubación fue de 30 días; se evaluó la presencia de contaminación por
hongos y bacterias, registrándose como porcentaje de explantes contaminados por repetición en
cada tratamiento; tomándose datos semanalmente.
Los 4 tratamientos de desinfección fueron distribuidos conforme a un diseño
completamente al azar, con 6 repeticiones para cada especie, de las cuales 3 repeticiones se
sembraron en medio MB y 3 en medio WP; las unidades experimentales, fueron las mismas
repeticiones, conformadas por lotes de 20 embriones. El análisis estadístico se realizó con los
datos obtenidos a los 30 días de desarrollo. Se realizó, con la ayuda del programa Statistica (Stat-
Soft, 1998), un análisis de varianza de una clasificación por rangos de Kruskal-Wallis con un
diseño completamente al azar para cada tratamiento: especie, medio y tratamiento de
desinfección; y se utilizó la prueba de U de Mann-Whitney para la comparación de medias.
26
4.4.2. Desinfección de semillas de conos en diferentes estados de maduración
Se utilizaron semillas A. religiosa y A. hickelii de conos de las tres etapas de
maduración: conos inmaduros, conos maduros con escamas cerradas y conos maduros con
escamas abiertas. Las semillas se lavaron en una solución de detergente líquido comercial
(Axion) a una concentración del 5% y se enjuagaron con abundante agua destilada;
posteriormente se mantuvieron en agua destilada durante 36 h con el fin de separar por flotación
las semillas vanas.
Las semillas provenientes de los tres tipos de cono (Tabla 2) fueron sometidas al
procedimiento de desinfección utilizado por Mata (2000): alcohol al 70% por 1 minuto; solución
al 30% de hipoclorito de sodio (NaOCl) comercial (6% de cloro activo) por 30 minutos.
Posteriormente, se dieron tres enjuagues con agua destilada y esterilizada bajo condiciones
asépticas (campana de flujo laminar). Con la ayuda de microscopio e instrumental de disección se
extrajeron los embriones cigóticos y se sembraron en medio de cultivo WP y MB.
El diseño experimental utilizado fue completamente al azar, los tratamientos se
conformaron por los embriones de las semillas provenientes de los tres tipos de conos (tabla 2),
con 6 repeticiones cada uno, las unidades experimentales, fueron las mismas repeticiones,
conformadas por lotes de 20 embriones.
Tabla 2. Tratamientos aplicados en la etapa de desinfección de embriones.
Tratamiento Repeticiones
Factor Nivel
Madurez del cono
Embriones de conos inmaduros 6
Embriones de conos maduros con las escamas
cerradas 6
Embriones de conos con las escamas abiertas 6
La variable a evaluar fue, al igual que en el experimento anterior, la presencia de
contaminación por hongos y bacterias, registrándose el porcentaje de explantes contaminados por
repetición en cada tratamiento. El periodo de incubación fue de 30 días, tomándose datos
27
semanalmente. Para determinar la existencia de diferencia significativa se realizó un análisis de
varianza de una clasificación por rangos de Kruskal-Wallis con un diseño completamente al azar.
Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para la comparación de medias, en el programa
Statistica (Stat-Soft, 1998). Los análisis estadísticos se realizaron con los datos obtenidos a los 30
días de incubación.
4.5. Comparación de medios y reguladores de crecimiento en la inducción de
respuestas morfogenéticas en Abies religiosa
Los medios de inducción empleados para el cultivo de los embriones cigóticos de A.
religiosa fueron WP y MB, adicionado con todas las combinaciones de 6-Benciladenina (BA) con
ácido 2,4-Diclorofenoxiacético (2,4-D) o ácido naftalen-acético (ANA), las concentraciones se
presentan en la tabla 3. El periodo de cultivo en los medio de inducción fue de 35 días,
posteriormente se realizaron subcultivos periódicos cada 15 días a sus respectivos medios
básales, es decir, sin reguladores de crecimiento.
El material biológico empleado para la implementación de este ensayo fueron los
embriones provenientes de semillas obtenidas de conos maduros con las brácteas cerradas, ya que
fueron los que pudieron ser desinfectados con el tratamiento convencional utilizado por Mata
(2000) presentando altos porcentajes de desinfección.
Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con una distribución factorial
completo (2 x 4 x 8) con un total de 16 a 20 repeticiones por tratamiento.
Tabla 3. Concentraciones de BA, auxinas y medios evaluados en la inducción de respuestas morfogenéticas de Abies
religiosa.
Factores Niveles
BA
Auxina
Medio
0, 1, 3, 5 (mg l-1)
0, 0.1, 0.5 y 1 de 2,4-D; 0, 0.1, 0.5 y 1 de ANA (auxina/ mg·L-1)
WP, MB
28
Las variables que se evaluaron es este ensayo fueron:
a) Formación de callo y tamaño del callo, registrándose con cero la ausencia de éste,
cuando el callo estaba presente se tomó el diámetro mayor aproximado de cada uno de los
explantes.
b). Aspecto físico del callo: compacto, desmenuzable, la presencia de vellos y la
oxidación. También se evaluó sobrevivencia, vivos se le llamó a los explantes que formaron
callos y que presentaron segmentos con signos de vitalidad a los seis meses de cultivo.
Los datos se tomaron bimestralmente y el análisis estadístico se realizó con los datos
obtenidos a los seis meses de desarrollo. Para el tamaño del callo se realizó un análisis de
varianza para determinar la existencia de diferencia significativa entre los factores;
posteriormente se realizó una ordenación de medias, con un nivel de significancia de p0.05,
cabe señalar que debido a la presencia de valores de cero se utilizó la transformación (X+3)0.5
(Compton, 1994), para lograr la homogeneidad de varianzas y normalidad de los residuales de los
datos. Los análisis se realizaron en el programa Statistica (Stat-Soft, 1998).
El modelo estadístico empleado en el análisis de varianza fue:
Yijkl = + Mi + Bj + Dl + (MBD)ijl + ijkl
Donde:
Yijlk = Tamaño del callo.
U = Media general de los factores constantes controlables en el experimento.
Mi = Efecto i-ésimo nivel del factor medio empleado.
Bj = Efecto de j-ésimo nivel del factor de nivel de concentración de BA.
Dl = Efecto de l-ésimo nivel del factor auxina.
(MBD)ijl = Efecto del i-ésimo nivel del factor medio empleado y el j-ésimo nivel del
factor de nivel de concentración de BA y el l-ésimo nivel del factor auxina.
ijlk = Error experimental
29
Posteriormente, con los resultados de la ordenación de medias y una vez identificados
los mejores tratamientos en cuanto al tamaño del callo se realizó un análisis de varianza no
paramétrico complementario tomando en cuenta la presencia y aspecto físico del callo, para
seleccionar nuevamente el o los mejores tratamientos. El análisis de varianza no paramétrico se
realizó utilizando la chi-cuadrada de máxima verosimilitud (CCMV) y el valor absoluto de t (|t|)
para realizar una ordenación de porcentajes; con la siguiente formula:
|t|=Sqrt[(N1*N2)/(N1+N2)]*|p1-p2|/Sqrt(p*q)
Donde:
p = (p1*N1+p2* N2)/(N1+N2)
q = 1-p.
Los grados de libertad (gl) son calculados como
gl = N1 + N2 –2
4.6. Comparación de reguladores de crecimiento en la inducción de respuestas
morfogenéticas en Abies hickelii
El medio de inducción empleado para el cultivo de los embriones cigóticos de A. hickelii
fueron el medio MB adicionado, con todas las combinaciones de BA con 2,4-D o ANA (Tabla 4).
El periodo de cultivo en los medio de inducción fue de 35 días, posteriormente se realizaron
subcultivos periódicos cada 15 días a sus respectivos medios básales, sin reguladores de
crecimiento.
El material biológico empleado para la implementación de este ensayo fueron los
embriones provenientes de conos maduros con las brácteas cerradas, ya que son los que
presentaron las más altas tasas de desinfección en el tratamiento utilizado por Mata (2000).
30
Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con un arreglo factorial
completo (4 x 8) con un total de 16 a 20 repeticiones por tratamiento.
Tabla 4. Concentraciones de BA y auxinas evaluados en la inducción de respuestas morfogenéticas de A. hickelii.
Factores Niveles
BA
Auxina
0, 1, 3, 5 (mg l-1)
2,4-D 0, 2,4-D 0.1, 2,4-D 0.5, 2,4-D 1, ANA 0, ANA 0.1, ANA 0.5, ANA 1 (auxina mg·L-1)
Las variables que se evaluaron es este ensayo y la estrategia de análisis fueron las
mismas que en el experimento anterior, únicamente que con sólo 2 factores, esto es, sin la
presencia de medios de cultivo.
4.7. Comparación de antioxidantes en el control de la oxidación
Se sembraron los embriones cigóticos provenientes de conos maduros con las brácteas
cerradas de A. religiosa y A. hickelii; desinfectadas con el tratamiento utilizado por Mata (2000).
Los cuales se colocaron en medio MB adicionado con 5 mg·L-1
de BA y con 1 mg·L-1
de 2,4-D,
así como, con diferentes antioxidantes. Los antioxidantes y concentraciones utilizados fueron:
ácido ascórbico a una concentración de 250 mg·L-1
; ácido cítrico a 250 mg·L-1
;
polivinilpirrolidona a 3000 mg·L-1
y carbón activado a 1000 mg·L-1
; además, se agregó un testigo
al que no se le adicionó ningún antioxidante. El periodo de cultivo en los medio de inducción fue
de 35 días, posteriormente se realizaron subcultivo a sus respectivos medios básales, sin
reguladores de crecimiento con los mismos antioxidantes respectivos.
Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con un total de 25 repeticiones
por tratamiento.
Las variables que se evaluaron es este ensayo fueron:
a). Presencia o ausencia del callo.
b). Porcentaje de oxidación del callo, tomado por observación directa del explante.
c). Tamaño del callo.
31
Los datos se tomaron quincenalmente y el análisis estadístico se realizó con los datos
obtenidos a los 2 meses de desarrollo. Se realizó un análisis de varianza con el porcentaje de
oxidación y el tamaño del callo para determinar diferencia significativa entre especies y
tratamiento, así como, la comparación de medias de acuerdo al algoritmo de Tukey utilizando el
programa Statistica (Stat-Soft, 1998). Se utilizó la transformación de arcoseno recomendada para
valores de porcentaje y la raíz cuadrada para la variable tamaño de callo por presentar valores
iguales a cero (Compton, 1994).
El modelo empleado en el análisis estadístico fue:
Yijk= μ +Ei+Τj +ijk
Donde:
Yijk= Valor observado en la variable respuesta
μ = Media general del ensayo
Ei = Efecto de la i-esima especie
Τj = Efecto del j-ésimo tratamiento
ijk = Error experimental
32
5. RESULTADOS
5.1. Desinfección de semillas
5.1.1. Desinfección de semillas de conos maduros abiertos
El porcentaje de semillas que se precipitaron después del periodo de remojo fue
aproximadamente del 18%. Es importante destacar que las semillas que flotaron, en general eran
vanas, encontrándose vacías o el megagametófito presentaba una coloración blanquecina,
traslúcida de aspecto seco y duro, con depósitos de resina. En otros casos cuando se encontraba
turgente, el embrión no se había desarrollado. De las semillas que se precipitaron, el 12% no eran
viables; en algunas ocasiones las semillas estaban vanas y en otras ocasiones se encontraban
parasitadas por la larva de un lepidóptero, por lo que el porcentaje de semillas viables se redujo
aún más.
La contaminación se presentó de manera diferencial dependiendo del tratamiento de
desinfección. De manera general la contaminación por hongos y bacterias fue evidente al tercer
día de cultivo y a los 5 días ya cubría la totalidad del explante. También se presentó
contaminación al parecer por organismos sistémicos, debido a que cerca del 20% de los explantes
no manifestaron contaminación en los primeros días de cultivo, sino que ésta se presentó hasta
que el explante inicio su desarrollo, alrededor de la segunda semana de cultivo.
Se logró establecer diferencia significativa entre los tratamientos de desinfección
empelados; sin embargo, no se encontró diferencia significativa entre especies y medios
utilizados. En la tabla 5 se puede observar que en el tratamiento con H2SO4 fue donde se obtuvo
el menor porcentaje de contaminación 43.37%, y se pudo establecer una diferencia significativa
con el resto de los tratamientos, en donde la contaminación fue mayor.
33
Tabla 5. Porcentaje de contaminación obtenido después de aplicar diferentes tratamientos de desinfección a las
semillas maduras de A. religiosa y A. hickelii, sembradas en medio de cultivo.
Tratamiento Porcentaje de contaminación EE
A. religiosa A. hickelii Total
1) Cloro 30%; 90.89 3.79 b 89.23 3.61 b 90.06 3.69 b
2) Peróxido de hidrógeno; 94.44 5.55 b 93.34 4.50 b 93.89 2.72 b
3) Acido Sulfúrico concentrado 43.37 7.34 a 40.90 6.52 a 42.13 3.71 a
4) Solución de Benlate 89.38 3.58 b 91.67 2.00 b 90.52 2.26 b
Medias con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p<0.05)
EE = error estándar
5.1.2. Desinfección de semillas de conos en diferentes estados de maduración
Debido a que el porcentaje de contaminación del ensayo anterior fue todavía alto, se
aplicó el método de desinfección propuesto por Mata, (2000) a embriones cigóticos provenientes
de conos en diferentes estados de maduración (tabla 2), con la finalidad de probar si con otros
tipos de explantes se puede mejorar el porcentaje de desinfección.
Las semillas de los conos inmaduros fueron mucho más difíciles de extraer, son de un
color blanquecino, muy suaves y las bolsas de resina aún no se encuentran desarrolladas. Los
embriones son una masa blanca pequeña, difícil de distinguir sin la ayuda del microcopio de
disección, miden aproximadamente 0.5 mm y no están todavía diferenciados los cotiledones. Es
importante destacar que el 98% de los conos inmaduros las semillas presentaron embrión (Figura
6).
La contaminación de los embriones de las semillas de los conos inmaduros fue baja
(tabla 7), solo el 5.42% en promedio se contaminaron, encontrándose diferencia significativa
(p0.05) con respecto a los otros dos estados de madurez del cono. El principal agente
contaminante fueron bacterias, manifestándose a las dos semanas de la siembra. Estos explantes
generalmente presentaron poco desarrollo. Se murieron de los dos a los tres meses de cultivo;
independientemente del tipo del medio que se empleó, ya que no mostraron diferencia
significativa entre los dos tipos de medio.
34
Figura 7. a) Embrión cigótico inmaduro de A. hickeli, b) embrión cigótico inmaduro de A. religiosa, c)
embrión cigótico maduro de A.hickeli, d) embrión cigótico maduro de A.religiosa.
Las semillas de los conos maduros con las escamas cerradas fueron mucho más fáciles
de extraer; la coloración que presentó fue blanco-amarillento y relativamente duras, las bolsas de
resina se encontraron desarrolladas. Los embriones ya estaban desarrollados y se distinguieron
fácilmente a simple vista; midieron aproximadamente 1.3 cm, el suspensor prácticamente no se
distinguió y los cotiledones ya estaban desarrollados en la mayoría de los casos.
35
Aproximadamente el 20% de las semillas presentaron embrión, el resto eran vanas o estaban
parasitadas.
La contaminación de los embriones de los conos maduros con las escamas cerradas fue
también baja, en promedio el 14.78% de los embriones presentaron algún tipo de contaminación
(tabla 6), encontrándose diferencia significativa (p0.05) con respecto a los otros dos estados de
madures del cono. El principal agente contaminante fueron hongos y en menor proporción
bacterias presentándose en los primeros 7 a 10 días de la siembra. Estos explantes, en ausencia de
reguladores de crecimiento presentaron las primeras etapas del proceso normal de germinación;
es decir, los embriones se tornaron de color rosa en la base, se alargó la radícula, y los cotiledones
adquirieron un color verde claro, abriéndose en forma de roseta.
Tabla 6. Contaminación obtenida después de aplicar diferentes tratamientos de desinfección a las semillas maduras
de A. religiosa y sembradas en medio de cultivo WP y MB.
Tipo de cono empleado Porcentaje de contaminación EE
Embriones de conos inmaduros 5.42% 2.76 a
Embriones de conos maduros con las escamas cerradas 14.78% 3.21 b
Embriones de conos con las escamas abiertas 91.47% 6.98 c
Medias con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p<0.05)
EE = error estándar
Finalmente, los embriones de conos con las escamas abiertas presentaron en promedio
un porcentaje de contaminación alto (91.47%), aunque también en ausencia de reguladores de
crecimiento presentaron las primeras etapas de germinación.
5.2.Comparación de medios y reguladores de crecimiento en la inducción de
respuestas morfogenéticas en Abies religiosa
Los embriones cigóticos de Abies religiosa presentaron un buen desarrollo durante el
primer mes en el medio de inducción; los embriones se hincharon ligeramente, toman una
coloración rosada e inmediatamente se tornan verdes, los cotiledones se definen y en la mayoría
de las ocasiones abren en forma de roseta. El 89% de éstos embriones sobrevivieron durante este
36
periodo y el 11% murió sin ninguna causa aparente; aunque lo más probable es que se deba a un
mal manejo durante la disectación de los mismo, o tal vez, su desarrollo no estaba completo. Sólo
un pequeño porcentaje de embriones se tuvo que eliminar por que se contaminaron.
En el segundo mes, ya en medio de expresión, es decir, en los mismos medios basales
sin reguladores de crecimiento, generalmente se manifestaron cuatro tipos de desarrollo. 1) El
primero se caracterizó por seguir un proceso de germinación, en el que los embriones se
alargaron junto con los cotiledones, este tipo de desarrollo se presentó en muy pocas ocasiones.
2) En otros casos los embriones se hincharon tomando una forma ovoide, a lo largo aumentaron
poco su tamaño, lo que incrementaron fue su diámetro. Este fue el más común de los cuatro. 3) El
tercer tipo de desarrollo fue una combinación de los dos anteriores; es decir, el embrión y los
cotiledones se alargaron en el extremo basal, que generalmente quedó en contacto con el medio,
se hinchó formando un callo el cual fue por lo regular pequeño, aunque en ocasiones pudieron
llegar a crecer tanto como en los embriones que solo formaron callo. 4) Por último, los embriones
que a pesar de haber permanecido vivos durante el primer mes, no manifestaron ningún cambio
posterior. Los explantes y callos empezaron un proceso de oxidación leve, que se caracterizó por
la presencia de zonas cafés, siendo más frecuente en los callos.
Hacia el tercer mes, los callos tomaron, en su mayoría, forma compacta y en muy pocas
ocasiones adquirieron un aspecto desmenuzable. En los explantes que no manifestaron ningún
cambio posterior, la oxidación avanzó rápidamente, provocando su muerte, evidente por el
necrosamiento del tejido. Prácticamente el 100% de los explantes presentaron oxidación en
diferentes grados, aun de los que respondieron favorablemente.
Aunque fue una respuesta aislada, es necesario destacar la formación de brotes, en dos
explantes. Uno formó cinco brotes bien definidos, en el tratamiento con 5 mg·L-1
de BA y 1
mg·L-1
de ANA y el otro formo tres brotes con la misma concentración de BA y 0.5 mg l-1
de
ANA; aunque este último se oxido y murió. En ambos casos el medio empleado fue el MB.
Durante el periodo de inducción los cotiledones presentaron un alargamiento de los cotiledones y
se hinchó todo el explante, fue evidente la formación de pequeños nódulos en la superficie en la
base de los cotiledones, lo que le confirió un aspecto rugoso a la superficie. La presencia de los
37
nódulos ocurrió en ambos medios de cultivo y en varios tratamientos. Los nódulos eran
numerosos, sin embargo, la mayoría no logro desarrollar brotes adventicios, se oxidaron y
finalmente se necrosaron (figura 8).
Figura 8. Brotes adventicios en embriones cigóticos de Abies religiosa a los seis meses de cultivados en medio
MB. a) cultivado con BA (5 mg·L-1) y ANA (1 mg·L-1), b) cultivado con cultivado con BA (5 mg·L-1) y ANA
(0.5 mg·L-1).
En los dos explantes que lograron la formación de brotes adventicios, los nódulos
incrementaron su tamaño con el subcultivo a medio basal, en donde después de dos meses
empezó la formación de los brotes adventicios en los que el domo meristemático y la formación
de los primordios de hojas se distinguieron fácilmente. Posteriormente adquirieron una
coloración más intensa y a los seis meses de cultivo el brote más grande alcanzó una talla de
centímetro y medio. No todos los nódulos lograron desarrollarse en brotes adventicios, la
mayoría fueron absorbidos por brotes adventicios de mayor tamaño.
5.2.1. Formación de callos por tipo de medio
De los tipos de medio empleados, encontramos que en el medio MB se presentaron los
callos de tamaño más grande que en el medio WP (p< 0.05; Tukey); los cuales fueron compactos
y en muy pocas ocasiones se presentan de tipo desmenuzable.
38
El porcentaje de explantes vivos después de la inducción fue mayor en el medio MB
(87.02%); así mismo, en este medio el 100% de los explantes que respondieron formando callo
(tabla 7).
Tabla 7. Resultados del Análisis de varianza no paramétrico de las variables cualitativas por tipo de medio en
embriones de Abies religiosa.
Medio Total explantes vivos después
de la inducción (p 0.05)
explantes que formaron
callo. (p 0.05)
Callos vivos a los 6
meses de cultivo(NS)
MB 478.000 416 / 478
(87.02%) a
416 / 416
(100.00 %) a
130 / 416
(31.25%)
WP 413.000 319 / 413
(77.23%) b
307 / 319
(96.23%) b
88 / 307
(28.66%)
Porcentaje con la misma letra no presentan diferencia significativa (p0.05)
5.2.2. Formación de callos con BA
Al analizar el efecto de las cuatro concentraciones de BA sobre el tamaño callo no se
pudo establecer diferencia significativa entre ellas. En el análisis de varianza no paramétrico con
las variables cualitativas, el porcentaje de explantes que formaron callo, al parecer está
relacionado a la concentración de BA empleado, ya que se pudieron establecer diferencia
significativas entre ellos. A los seis meses de cultivo la mayor proporción de callos formados que
continuaron con vida se registró en el testigo (42.50%), es decir cuando el medio se encuentra
libre BA, estableciéndose una diferencia significativa (p0.05) con respecto a las demás
concentraciones empleadas (tabla 8); al parecer los medios sin BA son los mejores para mantener
el explante vivo; sin embargo, en las concentraciones de BA de 1 y 5 mg·L-1
se presentaron los
mayores porcentajes de explantes vivos después de la inducción, 90.62 y 84.27%
respectivamente; además los mayores porcentaje (100%) de explantes que formaron callo se
presentaron cuando se adiciona el medio con cualquier concentración de BA (1, 3, 5 mg·L-1
)
difiriendo significativamente con respecto al testigo.
39
Tabla 8. Resultados del Análisis de varianza no paramétrico de las variables cualitativas por concentración de BA en
embriones cigóticos de Abies religiosa.
Concentraciones
de BA (mg l-1) Total
Explantes vivos después de
la inducción
(p 0.05)
Explantes que formaron
callo (p 0.05)
Callos vivos a los 6 meses
de cultivo (p 0.05)
0 222 172/222 (78.48%) b 160/172 (93.02%) b 68/160 (42.50 %) a
1 213 193/213 (90.62%) a 193/193 (100.00%) a 42/193 (21.76 %) b
3 227 177/227 (77.98%) b 177/177 (100.00%) a 52/177 (29.37 %) b
5 229 193/229 (84.27%) ab 193/193 (100.00%) a 56/193 (29.01 %) b
Porcentaje con la misma letra no presentan diferencia significativa (p0.05)
5.2.3. Formación de callos con auxinas
Las auxinas juegan un papel más activo en la formación y tamaño de callo. Los callos
con los tamaños en promedios más altos se desarrollaron en las concentraciones de 0 y 1 mg l-1
de 2,4-D y 0.5 y 1 mgl-1
de ANA determinándose diferencia significativa (p 0.05) con respecto a
las demás concentraciones de auxinas empleados (tabla 9).
Tabla 9. Efecto del tipos y concentración de auxinas empleadas para la formación de callos a partir de embriones
cigóticos maduros de A. religiosa.
Auxina Concentración
(mg·L-1) Total N
Explantes vivos después
de la inducción. Tamaño del callo* EE
2,4-D
0 107 69/107 (64.48%) 1.05 0.06 a
0.1 81 51/81 (62.96%) 0.85 0.06 c
0.5 97 86/97 (88.65%) 0.86 0.04 c
1 123 100/123 (81.30%) 0.97 0.04 a b c
ANA
0 114 91/114 (79.82%) 0.90 0.04 c
0.1 125 106/125 (84.80%) 0.88 0.03 c
0.5 121 113/121 (93.38%) 1.02 0.05 a
1 123 119/123 (96.74%) 1.00 0.04 a b
Medias con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p0.05)
EE = error estándar
* se presentan los datos sin transformar
Para discernir entre estos cuatro tratamientos, y seleccionar uno con mayor desarrollo de
callos nos apoyamos en las características cualitativas (tabla 10). Las proporciones mayores de
explantes que formaron callos se encuentra ligada al tipo de auxina empleado. Los tratamientos
40
con ANA presentan la mayor proporción de explantes que sobrevivieron después de la inducción
con respecto a aquellos en los que se utilizó 2,4-D; así mismo, en lo que respecta a la formación
de callo, ya que en las concentraciones de 0.5 y 1 mg·L-1
de ANA se presentaron los mayores
porcentajes de explantes con formación de callos, diferentes estadísticamente con respecto a los
demás tratamientos con 2,4-D (tabla 10).
El mayor porcentaje de callos vivos después de seis meses de cultivo lo presentan los
explantes cultivados con ANA con una diferencia significativa (p0.05) con respecto a los demás
tratamientos presentados (Tabla 10).
Tabla 10. Características cualitativas de las respuestas morfogenéticas de los embriones maduros de A. religiosa; solo aparecen los 4 tratamientos (auxina/concentración) con los callos más grandes (ver tabla 10).
Auxina /
Concentración
(mg l-1)
Total
Explantes vivos después
de la inducción
(p 0.05)
Explantes que
formaron callo
(p0.05)
Callos vivos a los 6 meses
de cultivo
(p0.05)
ANA /0.5 121 113/121 (93.38 %) a 113/113 (100.00 %) a 37/113 (32.74 %) a b
ANA /1 123 119/123 (96.70 %) a 119/119 (100.00 %) a 119/119 (43.69 %) a
2,4D /0 107 69/107 (64.50 %) c 69/69 (100.00 %) c 14/69 (20.28 %) b
2,4D /1 123 100/123 (81.30 %) b 97/100 (97.00 %) b 23/97 (23.71 %) b
Porcentajes con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p0.05)
5.2.4. Formación de callos de los embriones de Abies religiosa en los tratamientos
completos (medio, BA y auxina)
De los 64 tratamientos conformados por la interacción de los diferentes niveles de los
factores: medios, BA y Auxinas; se determinó diferencia significativa entre los tratamientos (p
0.05) y a través de la ordenación de medias de Tukey se identificaron 10 tratamientos con los
valores promedios más altos con respecto al tamaño del callo (tabla 11). Con el análisis de
varianza no paramétrico, podemos considerar, que de los 10 tratamientos seleccionados, el mejor
tratamiento es con el medio MB en ausencia de reguladores de crecimiento, ya que el 100% de
los callos formados permanecieron vivos a los seis meses de cultivo, y difieren
significativamente con respecto a los demás tratamientos presentados (tabla 11); así mismo,
41
también es uno de los porcentajes más altos con sobrevivencia de explantes después de
permanecer en el medio de inducción (92.85 %).
Tabla 11. Análisis de las variables cualitativas de los 10 tratamientos con los mejores promedios en cuanto a tamaño
del callo y diferentes (p<0.05) a los otros 54 tratamientos propuestos.
Medio
Concentra
ción BA
(mg·L –1)
Auxina/
Concentración
(mg·L–1)
Total
N
Explantes vivos después de
la inducción
(p 0.05)
Explantes que
formaron callo
(NS)
Callos vivos a los 6
meses de cultivo
(p 0.05)
MB 0 ANA /0 14 13/14 (92.85 %) a 100 % 13/13 (100.00 %) a
MB 0 2,4-D /1 14 14/14 (100.00 %) a 100 % 3/14 (21.42 %) c
MB 1 2,4-D /0 16 16/16 (100.00%) a 100 % 2/16 (12.25 %) c
MB 1 ANA /0.1 17 17/17 (100.00 %) a 100 % 5/17 (29.41 %) c
MB 3 ANA /0.1 16 16/16 (100.00 %) a 100 % 5/16 (31.25 %) bc
MB 5 2,4-D /0 16 5/16 (31.25 %) c 100 % 0/5 (0 %) d
MB 5 2,4-D /1 8 8/8 (100.00 %) a 100 % 4/8 (50.00 %) b
WP 0 ANA /1 13 12/13 (92.30 %) a 100 % 5/12 (41.66 %) b
WP 1 ANA /0.5 19 17/19 (89.47 %) a b 100 % 5/17 (29.41 %) c
WP 3 2,4-D /0 10 6/10 (60.00 %) b 100 % 1/6 (16.66 %) c
Porcentajes con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p 0.05)
5.3. Comparación de reguladores de crecimiento en la inducción de respuestas
morfogenéticas en Abies hickelii
Los embriones cigóticos de Abies hickelii, al igual que los embriones de A. religiosa,
presentaron un buen desarrollo durante el primer mes en el medio de inducción. Debido a que el
21% de los embriones murieron por un mal manejo en el momento de la disectación y el 7% se
contaminó; sólo 72% de los embriones de A. hickelii fueron subcultivados a los medios de
expresión (medios sin reguladores de crecimiento). Los cambios observados fueron que el
embrión se hinchó ligeramente, tomó una coloración rosada e inmediatamente se torna verde, los
cotiledones se desarrollan y en la mayoría de las ocasiones abren en forma de roseta, éstas
mismas características se presentaron en A. religiosa.
En medio de expresión, generalmente se presentaron los mismos cuatro tipos de
desarrollo que en el ensayo anterior con A. religiosa. Con la particularidad de que hacia el tercer
mes, los callos tomaron forma compacta o desmenuzable, siendo esta última la que se presentó en
42
menor medida. La oxidación se incrementó; siendo más severa en los explantes que no
presentaron ningún cambio posterior, provocando su muerte, evidente por el franco
necrosamiento del tejido. Prácticamente el 100% de los explantes presentaron oxidación en
diferentes grados, en algunos casos hasta provocar su muerte, iniciándose a partir del tercer mes,
aún de los que respondieron formando callo.
5.3.1. Formación de callo con BA
El análisis de varianza de la única variable cuantitativa, tamaño del callo, mostró
diferencia significativa entre las concentraciones (p 0.05), lo que justificó la ordenación de
medias, donde se identificó al testigo como el poseedor de los callos de mayor tamaño, es decir,
cuando no se empleó BA, difiriendo significativamente (p 0.05) con respecto a los tratamientos
donde se adicionó BA.
El análisis de varianza no paramétrico de los aspectos cualitativos considerados, ratificó
al medio carente de BA como uno de los mejores tratamientos; ya que presentó los porcentajes
más altos de callos vivos a los seis meses de cultivo (29.03%), aunque, en lo que respecta al
porcentaje de formación de callo, el porcentaje más bajo se reportó en éste (54.86%) (tabla 12).
Tabla 12. Análisis de las variables cualitativas de Abies hickelii cultivado con 4 concentraciones diferentes de BA.
Concentración de
BA (mg l-1)
Total
N
Explantes vivos después de la
inducción (NS)
Explantes que formaron
callo (p 0.05)
Callos vivos a los 6 meses
de cultivo (p 0.05)
0 127 113/127 (88.97 %) 62/113 (54.86 %) b 18/62 (29.03 %) a
1 123 109/123 (88.61 %) 103/109 (94.49 %) a 11/103 (10.67 %) b
3 120 98/120 (81.66 %) 91/98 (92.85 %) a 10/91 (10.98 %) b
5 122 108/122 (88.52 %) 108/108 (100.00%) a 9/108 (8.33 %) b
Porcentajes con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p 0.05)
Cuando los embriones de Abies hickelii, son sometidos a medio sin BA, un alto
porcentaje de ellos sólo desarrollaron un proceso de germinación, produciendo como respuesta
morfogenética un callo visible. Generalmente estos embriones se alargaron y desarrollaron los
cotiledones, en el extremo inferior se forma el callo.
43
5.3.2. Formación de callo con Auxina
En el análisis de varianza se pudo determinar diferencias significativas entre los ocho
tratamientos en cuanto al tamaño del callo; al comparar los promedios resaltaron cuatro de ellos
como los más altos, en cuanto al tamaño del callo. Estos tratamientos se presentan en la tabla 14,
que muestra los resultados del análisis con las variables cualitativas; encontrándose diferencia
significativa en el número de explantes que formaron callo y que sobrevivieron a los seis meses
de cultivo, reportándose que en 2,4-D 0 (82.50%), 0.1 (76.74%) y 0.5 (74.00%) presentan los
porcentajes más altos de explantes que formaron callo; y en ANA 0 y 2,4-D 0.1 presentaron los
porcentajes más altos de callos vivos a los seis meses de cultivo, con porcentaje de 15.90 y 12.12
% respectivamente (tabla 13).
Tabla 13. Análisis de las variables cualitativas en los tratamientos con los promedios más altos del tamaño del callo.
Auxina
/concentración
(mg·L-1)
Total
Explantes vivos después
de la inducción
(p 0.05)
Explantes que formaron
callo
(p 0.005)
Callos vivos a los 6 meses
de cultivo
(p 0.05)
2,4D_0.1 60 43/60 (71.66 %) b 33/43 (76.74 %) ab 4/33 (12.12 %) a
2,4D_0.5 61 50/61 (81.96 %) b 37/50 (74.00 %) ab 3/37 (8.10 %) ab
ANA_0 65 64/65 (98.46 %) a 44/64 (68.75 %) b 7/44 (15.90 %) a
2,4D_0 58 40/58 (68.96 %) b 33/40 (82.50 %) a 0/33 (0.00%) b
Porcentajes con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p 0.05)
5.3.3. Formación de callos de los embriones cigóticos de Abies hickelii en las
combinaciones de BA con Auxinas
Con el análisis de varianza se pudo establecer diferencia significativa en lo que respecta
al tamaño de los callos; y en la ordenación de medias se destacaron 6 tratamientos con los
mejores promedios iguales estadísticamente entre ellos y diferentes significativamente de los
otros 26 tratamientos propuestos. En la tabla 14 se muestran las proporciones y los resultados del
análisis no paramétrico de las variables cualitativas. Entre los mejores tratamientos se encuentra
BA 0 en combinación con ANA 0.1 y 2,4-D 0.5 ya que presentan altos porcentajes de explantes
vivos a los 6 meses, con 40.00 y 22.22%, respectivamente; el porcentaje más altos de explantes
que formaron callos se registró en el testigo, es decir, cuando al medio no se adiciona ni con BA
44
ni con auxinas. El 100% de los explantes vivos después de la inducción se presentó en el testigo y
en medios adicionados con BA 0 y ANA 0.1 mg·L-1
.
Tabla 14. Análisis de las variables cualitativas en los tratamientos con los promedios más altos del tamaño del callo.
Regulador
(mg·L-1) Total
Explantes vivos después de
la inducción
(p 0.05)
Explantes que formaron
callo
(p 0.05)
Callos vivos a los 6 meses
de cultivo
(p 0.05)
BA 0; ANA 0 17 17/17 (100.00%) a 16/17 (94.11 %) a 0/16 (0.00%) b
BA 0; ANA 0.1 17 17/17 (100.00%) a 10/17 (58.82 %) b 4/10 (40.00 %) a
BA 0; 2,4-D 0 16 12/16 (75.00%) ab 7/12 (58.33 %) b 0/7 (0.00%) b
BA 0; 2,4-D 0.1 16 10/16 (62.50 %) b 7/10 (70.00 %) ab 0/7 (0.00%) b
BA 0; 2,4-D 0.5 15 14/15 (93.33 %) a 9/14 (64.28 %) ab 2/9 (22.22 %) a
BA 3; 2,4-D 0.5 16 12/16 (75.00 %) ab 9/12 (75.00 %) ab 0/9 (0.00%) b
5.4. Comparación de antioxidantes en el control de la oxidación
En los primeros 35 días de cultivo, durante la fase de inducción, el desarrollo de los
embriones fue más lento en los medios suplementados con ácido cítrico y ácido ascórbico que los
otros tratamientos. En el carbón activado, la mayoría de los embriones, empezaron un proceso de
germinación, alargándose y desarrollando los cotiledones, posteriormente desarrollaron un callo
en el extremo basal del explante, que generalmente estaba en contacto con el medio. El testigo,
aunque tiende a la oxidación, los callos fueron más vigorosos. En el PVP los embriones se
hincharon, se desarrollaron los callos de manera rápida y fueron más grandes y vigorosos.
En el medio de expresión, sin reguladores de crecimiento, después del periodo de
inducción, el incremento en el tamaño de los callos fue notorio. El alargamiento de los embriones
del tratamiento de carbón activado se detuvo y se desarrolló callo en la base y los cotiledones en
algunos casos mostraron un considerable desarrollo. Los explantes del testigo incrementaron su
tamaño y el proceso de oxidación disminuyó.
El efecto de los antioxidantes en los explantes de A. religiosa (tabla 15) mostraron
diferencia significativa (p0.005). De acuerdo con la ordenación de medias el carbón activado, el
PVP y el testigo fueron los que presentaron los promedios más bajos de oxidación, que van de
45
68.3 al 81.2% de superficie oxidada. Sin embargo, el carbón activado es el único que presentó
diferencia significativa (p0.05) con respecto a los demás tratamientos.
Tabla 15. Efecto de los antioxidantes en el porcentaje de oxidación de los expantes de A. religiosa a los dos meses
de incubación.
Tratamiento N Vivos después de la inducción % de Oxidación DE
Carbón activado 40 31/40 (77.50%) 68.39 5.08 a
PVP 40 34/40 (85.00%) 76.18 0.40 a b
Testigo 40 31/40 (77.50%) 81.30 3.92 a b
Ácido cítrico 40 27/40 (67.50%) 88.51 3.44 b
Ácido ascórbico 40 24/40 (60.00%) 89.17 3.72 b
Media con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p 0.05)
EE = error estándar
* se presentan los datos sin transformar
En A. hickelii también se logró establecer diferencia significativa entre los diferentes
tratamientos de antioxidantes utilizados, en lo que respecta al porcentaje de oxidación de los
explantes según el antioxidante. Al igual que en A. religiosa, en la ordenación se obtuvo que el
carbón activado con un promedio de 81.2% de oxidación es diferente significativamente (p0.05)
con respecto a los demás tratamientos, seguido por PVP y el testigo, con promedios de oxidación
de 92.5 y 94.2 de porcentaje de oxidación de los callos, respectivamente, aunque sólo en los
medios suplementados con PVP se pudo establecer diferencia significativa con respecto a los
demás tratamientos (tabla 16). Aunque es esta especie se obtuvieron porcentajes más altos de
oxidación con respecto a A. religiosa.
Tabla 16. Efecto de los antioxidantes en el porcentaje de oxidación de los expantes de A. hickelii a los dos meses de
incubación.
Tratamiento N Vivos después de la inducción % de Oxidación (media) DE
Carbón activado 40 24/40 (60.00 %) 81.25000 3.96 a
PVP 40 36/40 (90.00 %) 92.50000 2.04 b
Testigo 40 40/40 (100.00 %) 94.25000 1.47 b c
Ácido ascórbico 40 37/40 (92.50 %) 97.56757 1.05 c
Ácido cítrico 40 40/40 (100.00 %) 97.67442 1.04 c
Media con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p 0.05)
DE = desviación estándar
46
Al igual que en los otros ensayos, se evaluó el tamaño del callo, como indicador de
vigor. Tanto en A. religiosa como en A. hickelii; de acuerdo con el análisis de varianza realizado
se determinaron diferencias significativa entre los tratamientos, en ambas especies. En la
ordenación de medias de A. religiosa (tabla 17) se observó que el carbón activado y el PVP
conforman un grupo con medias significativamente iguales, presentando los tamaños promedios
de callo más altos, pero únicamente el tamaño promedio de las callos que se desarrollaron en los
medios con carbón activado es significativamente diferente con respecto a los demás tratamientos
(tabla 18).
Tabla 17. Efecto de los antioxidantes en el tamaño de los callos de A. religiosa a los dos meses de incubación.
Tratamiento N Vivos después de la inducción Tamaño del callo* (media) EE
Carbón activado 40 31 / 40 (77.50 %) 1.12 0.08 a
PVP 40 34 / 40 (85.00 %) 0.89 0.07 a b
Testigo 40 31 / 40 (77.50 %) 10.79 0.08 b
Cítrico 40 27 / 40 (67.50 %) 0.68 0.07 b
Ácido ascórbico 40 24 / 40 (60.00 %) 0.38 0.06 c
Media con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p 0.05)
EE = error estándar
* se presentan los datos sin transformar
En Abies hickelii también se logro, con el análisis de varianza, establecer diferencia
significativa (p0.05) entre los tratamientos; en la ordenación de medias, el grupo homogéneo
con los tamaños de callo promedio mayores se conformo, con los tratamientos de carbón
activado, PVP y el testigo, significativamente iguales entre ellos (p0.05); pero sólo en el carbón
activado y el testigo se pudo establecer diferencia significativa (p0.05) con respecto a los demás
tratamientos (tabla 18).
47
Tabla 18. Efecto de los antioxidantes en el desarrollo de los callos de A. hickelii a los dos meses de incubación.
Tratamiento N Vivos después de la inducción Tamaño del callo* (Media) DE
Carbón activado 40 24/40 (60.00 %) 0.95 0.11 a
Testigo 40 40/40 (100.00 %) 0.94 0.06 a
PVP 40 36/40 (90.00 %) 0.82 0.07 a b
Ácido ascórbico 40 37/40 (92.50 %) 0.72 0.06 b
Ácido cítrico 40 40/40 (100.00 %) 0.71 0.04 b
Medias con las mismas letras no presentan diferencia significativa (p 0.05)
EE = error estándar
* se presentan los datos sin transformar
48
6. DISCUSIÓN
En la horticultura tradicional el ácido sulfúrico se ha utilizado con el fin de alterar
mecánicamente o ablandar la cubierta de las semillas para hacerlas permeables al agua y a los
gases (Hartmann y Kester, 1989). Con el ácido se logró un menor porcentaje de contaminación en
los explantes, debido al rompimiento de las bolsas de resina de las semillas, lo que facilitó la
penetración de H2O2 y la solución al 30% de NaOCl. Otra ventaja de tratar las semillas con
H2SO4 es que éste ablandó la testa, facilitando la extracción del embrión, logrando el
establecimiento aséptico de cultivos in vitro en embriones cigóticos de A. religiosa y A. hickelii.
Debergh y Zimmerman (1991) mencionan que para cualquier intento de establecer cultivos in
vitro, es necesario contar con un buen método de desinfección.
El uso de ácido sulfúrico en las técnicas del cultivo de tejidos de coníferas es poco
frecuente. Sin embargo, en Pinus canariensis se utilizó ácido sulfúrico concentrado para
escarificar la semilla (Thorpe y Harry, 1991). Así como, en especies de otros grupos, como por
ejemplo en cactáceas (Moebius, 2000) y Diospyros riojae (Sánchez, 2002) con el mismo fin.
En el primer ensayo de desinfección, la contaminación obtenida en la mayoría de los
explantes se puede deber a que la muestra se tomó de individuos que presentaban conos, que en
la mayoría de los casos, ya se encontraban en la etapa de liberación de semilla, es decir, las
escamas ya se habían abierto exponiendo las semillas al medio ambiente y ocasionando el
almacenamiento de una gran cantidad de agentes contaminantes difíciles de eliminar. Esta
contaminación se redujo colectando conos que todavía no estaban abiertos, como se pudo
observar en el segundo ensayo de desinfección.
Los embriones provenientes de conos maduros cerrados fueron la mejor opción, para el
establecimiento de cultivos asépticos tanto de Abies religiosa como para A. hickelii, ya que
presentan un bajo porcentaje de contaminación y alta sobrevivencia para la inducción de
respuestas morfogenéticas. Los embriones inmaduros han sido empleados en otras especies como
49
Abies alba (Hristoforoglu et al., 1995; Schuller et al., 1989), Picea abies, P. mariana, P. glauca,
Pinus caribae y P. taeda (Atree y Fowke, 1991) con respuestas favorables.
Aunque la formación de brotes adventicios, fue una respuesta aislada en A. religiosa, es
necesario destacar que su formación se presentó en la misma concentración de BA (5 mgl-1
) que
en otras especies forestales; como en Pinus caribaea var. hondurensis (Go et al., 1993); Pinus
ponderosa (Ellis y Bildercack, 1989) y Picea chihuahuana (Mata et al., 2001).
El medio MB no ha sido empleado en otras especies de gimnospermas forestales; sin
embargo, demostró que puede mantener vivos a los explantes por mas de seis meses como
ocurrió en los ensayos para las dos especies (Tabla 8). Aunque mostró una clara superioridad con
respecto al medio WP, es necesario ensayar otros tipos de medios para encontrar el que permita
un mejor desarrollo de las especies de Abies con mejores resultados.
Para la inducción de callo a partir de embriones cigóticos de Abies religiosa y A.
hickelii, respuesta morfogenética expresada en la mayoría de los explantes de ambas especies,
indica que la presencia de BA no es necesaria para la formación de éstos, ya que BA a sido
reportada preferentemente para la formación de brotes adventicios en muchas especies forestales
(Thorpe y Harry, 1991; Kolevska-pletikapic y Buturovic-Deric, 1995; Go et al., 1993; von Arnold
y Eriksson, 1981; Atree y Fowke, 1991) y en algunas especies del mismo género (Schuller et al.,
1989). Sin embargo, existen algunos reportes donde son necesarias las auxinas y las citocininas
para la obtención de callos embriogénicos, como en Picea abies (Von Arnold, 1986).
De las auxinas empleadas en el presente trabajo, no se encontró que alguna de ellas
estimulara en mayor medida la indución de respuestas morfogenéticas; esto concuerda con los
datos obtenidos por Von Arnold (1986). Sin embargo, en A. religiosa ANA demostró ser mas
eficiente, ya que indujo en mayor medida la formación de callos; a pesar de que no siempre se
pudo establecer diferencia significativa.
En Abies hickelii, la presencia de auxina no se encontró indispensable para la inducción
de callo cuando se analizó únicamente esta variable. Sin embargo, en el análisis de los
50
tratamientos de BA con auxinas se determimó que los embriones cigóticos con los mayores
porcentajes de callos con mejores características cualitativas cuando se utilizó BA 0 con ANA 0.1
y 2,4-D 0.5 mg·L-1
.
Es necesario destacar que la presencia de reguladores del crecimiento no es
indispensable para la formación de callo, sin embargo, en ausencia de estos la germinación de los
embriones se presentó en mayores porcentajes que cuando éstos están presentes; esto contrasta
con lo reportado en Pinus pinea (García-Ferriz et al., 1994) en donde el explante muere en la
ausencia de BA.
El mayor deterioro causado a los explantes se debe a la oxidación y en la mayoría de los
casos el necrosamiento avanzó completamente por los explantes, causando su muerte. Sin
embargo, los porcentajes más altos de callos vivos a los seis meses de cultivo se registraron en
ausencia de los reguladores de crecimiento.
De los agentes antioxidantes empleados, el carbón activado presentó los porcentajes de
oxidación más bajos y a su vez los callos más grandes de los ensayos con antioxidantes; el
proceso por el que pasan los embriones se encontró que en el carbón activado incluyeron las
primeras etapas de germinación. A pesar de que el carbón activado es ocupado en muchos
trabajos como agente antioxidantes (Ill-Whan y Koran, 1998); en el presente trabajo observamos
que el carbón deja poco disponible a los reguladores del crecimiento (Weatherhead, et al,.1979
citado por Bonga y von Aderkas, 1992); por consiguiente proponemos que seria mejor utilizar
PVP en A. religiosa; o para A. hickelii el uso de PVP o nada ya que el testigo no presenta
diferencia significativa con el efecto del carbón activado y el PVP, en esta especie.
51
7. CONCLUSIONES
La contaminación está en relación con la madurez de los explantes utilizados; mientras
más maduros sea el cono de donde se obtenga el embrión necesitará protocolos de desinfección
más severos.
Se pudo demostrar que es posible la obtención de brotes adventicios a partir de
embriones maduros de Abies religiosa. Aunque fueron dos explantes los que presentaron
formación de brotes adventicios de manera múltiple; esta respuesta se obtuvo en medio MB
adicionado con altas concentraciones de BA (5 mg·L-1
) y bajas concentraciones de ANA (0.5 y 1
mg·L-1
).
La mejor condición encontrada para la formación de callos en A. religiosa fue con el
medio MB sin reguladores del crecimiento.
En A. hickelii se obtuvo la formación de callo de mayor tamaño en ausencia de BA y
con nulas o bajas concentraciones de ANA o 2,4-D (0.1 y 0.5 mg·L-1
).
En los embriones cigóticos provenientes de conos maduros la oxidación no fue reducida
con la utilización de antioxidantes; por lo que se sugieren 2 hipótesis: 1) para el control de la
oxidación necesita la utilización de otros antixidantes o la utilización combinada de estos; 2) la
segunda hipótesis se refiere a la composición del medio; algún componente en el medio, está
causando la oxidación o bien que la falta de algún elemento indispensable para el desarrollo
exitoso de los explantes.
Debido a que el género Abies es reportado como recalcitrante en el cultivo in vitro y a
que hasta donde sabemos, no existen reportes del cultivo con estas técnicas de A. religiosa y A.
hickelii por lo que los resultados en el presente trabajo son altamente significativos. Sin embargo,
es necesario realizar estudios donde se incremente la muestra y se incluyan variables mas
específicas, sobre todo en lo que se refiere a la composición de medios, y condiciones físicas para
52
la inducción de brotación múltiple de éstas especies, y lograr la obtención de plantas completas
que sirvan la conservación y propagación en masa, de manera que puedan ser utilizadas con fines
comerciales o de reintroducción.
53
8. RECOMENDACIONES
El trabajo con los embriones inmaduros, es importante debido a que el 98% de las
semillas presentan embrión. Es necesario ensayar con otros medios cultivo; sobre todo con
medios ricos en aminoácidos, pueden ser una opción en estructuras poco desarrolladas como
éstas.
En los embriones cigóticos inmaduros, por tratarse de un explante menos desarrollado,
sus requerimientos son más específicos en cuanto a los componentes del medios para su
establecimiento; por lo que se tendrían que probar otros tipos de medios o variar los componentes
de los medios hasta lograr obtener el adecuado para cada especie.
Los reguladores de crecimiento utilizados en el presente trabajo son los más
recomendados y de uso extensivo; pero es necesario realizar otros ensayos utilizando más
reguladores de crecimientos. De las citocininas más utilizadas en la actualidad con buenos
resultados en las gimnospermas es el thidiazuron. Es necesario probarlos de manera aislada, así
como combinada. Otros aspecto que hay que considerar es el tiempo de inducción, para lograr
una competencia óptima de los explantes.
Con respecto a la utilización de los antioxidantes, es necesario ampliar la gama tanto de
productos como de técnicas y además de probarlos de manera aislada, también realizar ensayos
en el que se utilicen de forma combinada, para lograr el control de la oxidación de los embriones
cigóticos de Abies religiosa y A. hickelii.
54
9. LITERATURA CITADA
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62
ANEXO 1
Anexo 1a
Medio Woody Plant (Lloyd y McCown, 1980)
Macronutrientes mgl-1
NH4NO3 400.00
K2SO4 990.00
KH2PO4 170.00
MgSO4.7H2O 370.00
Calcio
CaCl2.2H2O 96.00
Ca(No3)2.4H2O 556.00
Micronutrientes
H3BO3 6.20
Na2MoO4.2H2O 0.25
MnSO4.H2O 22.30
ZnSo4.7H2O 8.60
CuSO4.5H2O 0.25
Solución de Hierro
FeSO4.7H2O 27.8
Na2EDTA 37.3
Vitaminas
Tiamina HCl 1.00
Ácido nicotínico 0.50
Piridoxina HCl 0.50
Inositol
Inositol 100.00
Glicina
Glicina 2.00
Sacarosa 60000
63
Anexo 1b
Medio modificado de Blaydes (Merkle y Sommer, 1991)
Macronutrientes mgl-1
KNO3
1000.00
NH4NO3 1000.00
MgSO4.7H2O 35.00
KCl 65.00
KH2PO4 300.00
Calcio
Ca(NO3)2.4H2O 347.00
Micronutrientes
MnSO4. H2O 6.06
ZnSo4. 7H2O 4.00
H3BO3 2.00
Kl 0.60
Na2MoO4.2H2O 0.025
CuSO4.5H2O 0.025
CoCl2.6H2O 0.025
Fierro
Na2EDTA.2 H2O 37.250
FeSO4.7H2O 27.850
Vitaminas
Tiamina 10.00
Ácido nicotínico 1.00
Piridoxina 1.00
Biotina 2.00
Inositol
Inositol 100.00
Hidrolizado de caseína 1000
Sacarosa 40000
64
ANEXO 2. Artículo publicado como requisito parcial
