apendices metodos pruebaantimicrobianos
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225
Apéndice
REGLAS BASICAS DE BIOSEGURIDAD Se beben tomar las siguientes precauciones cuando de hacen las pruebas de sus-ceptibilidad:
1. Siga las prácticas de Bio-Seguridad Nivel 2 (BSL2).* No se requiere usar guantes y mascarilla cuando se trabaja con bacterias BSL2 en cultivo puro.
2. Use una bata de laboratorio abotonada. 3. Desinfecte el área de trabajo antes de trabajar, si se derrama algún material, y
al fi nal de la jornada de trabajo. 4. Evite crear aerosoles. Para la prueba de difusión por discos, remueve el exceso
de inoculo del hisopo antes de inocular el agar. Si se requiere usar el vortex, use tubos con tapas de rosca y sello.
5. Use el envase para agudos cuando disponga de pipetas, lupas para inocular, hisopos, palitos de madera, hisopos o cualquier material agudo.
6. Todo material contaminado debe ser descartado en envases para material bio-lógico peligroso.
*A ningún costo, podrá encontrar en la “Web,” en español y en ingles, un manual con información esencial sobre las prácticas de bioseguidad BSL-2.
“Bioseguridad en Laboratorios Biomédicos y de Microbiología (BMBL):, 4 a edición.” http://www.cdc.gov/od/ohs/biosfty.htm
El manual se puede comprar enviando su pedido a la siguiente dirección: US Government Printing Offi ce Washington, DC 20202 Stock #: 017-040-00547-4
226 Apéndice
MÉTODO DE PREPARACIÓN DEL 0,5 STANDARD DE MCFARLAND Reactivos
1% Cloruro de Bario (BaCl 2 ) anhídrido 1% Ácido sulfúrico (H 2 SO 4 ) puro y frío
Método de Preparación
1. Añadir 0,5 mL de 1% BaCl 2 a 99,5 mL de 1% de H 2 SO 4 . 2. Revuelva para mantener en suspensión. 3. Mezclar completamente ante de proceder al siguiente paso. 4. Distribuya 5 mL de la solución de McFarland en tubos de diámetros similares.
Se sugiere usar los mismos tubos que se utilizan rutinariamente para ajustar la densidad de las suspensiones antes de la inoculación.
5. Cuando estos estándares están en suspensión completa, la turbidez equivale a un cultivo que contiene 1,5 x 10 8 células.
6. Los tubos que contienen la solución de 0.5 McFarland se deben guardar en un lugar oscuro, a temperatura ambiente.
7. Consulte el documento M2 de la NCCLS para mas detalles y también para el procedimiento para el control de calidad.
Apéndice 227
...De NCCLS M100-S14 (M7)La siguiente tabla refl eja los medicamentos listados para ser probados contra los organismos respectivos en las Tablas 2A-2J en M100 y da algunos ejemplos a considerar para protocolos de verifi cación en dada institución. La lista incluye Fenotipos que 1) nunca han sido documentados, 2) no son comunes, y/o 3) representan resultado que fácilmente pueden ocurrir de errores técnicos y que pueden tener consecuencias clínicas signifi cativas.
Tabla 8. Sugerencias para Verifi cación de Resultados de Prueba de Susceptibilidad Antimicrobial y Confi rmación de Identifi cación de Organismos
Organismo o Grupo
Categoría Ia
Fenotipos que no han sido reportados, no son comunes
y/o resultan de errores técnicos
Categoría IIb
Fenotipos que pueden ser poco comunes en dada institución y/o
resultan de errores técnicos
Organismos gram-negativos
Enterobacteriaceae (cualquiera) carbapeneme-I o R amikacina-Rfl ouroquinolona-R
Citrobacter freudiiEnterobacter spp.Serratia marcescens
ampicilina, cefazolina o cefatolina-S
Escherichia coli BLEE confi rmado positivo
Klebsiella spp. ampicilina-S BLEE confi rmado positivo
Proteus vulgarisProvidencia spp.
ampicilina-S
Pseudomonas aeruginosa gentamicina concurrente y tobramicina y amikacina-R
Stenotrophomonas maltophilia carbapeneme-S trimetrhoprim-sulfamethoxazole-R
Haemophilus infl uenzae aztreonam-NScarbapeneme-Scefalosporina 3era generación-NSc
fl uoroquinolona-NS
ampicilina-R y beta-lactamasa negativa amoxicila-ácido clavulánico-R
Neisseria gonorrhoeae cefalosporina 3era generación-R fl uoroquinolona-R
Cualquier organismo Resistente a todos los agentes probados rutinariamente.
Organismos gram-positivos
Enterococcus spp vancomicina-R
Enterococcus faecalis ampicilina o penicilina-Rquinupristina-dalfopristina-Slinezolida-R
aminoglucósido-R de alto-nivel (particularmente si aislado de área de cuerpo estéril)
228 Apéndice
Organismos gram-positivos
Enterococcus faecium linezolida-R aminoglucósido-R de alto-nivel (particularmente si aislado de área de cuerpo estéril)
Staphylococcus aureus linezolida-NSquinupristina-dalfopristina-I o Rvancomicina-I o R
oxacilina-R
Staphylococcus, coagulosa-negativa linezolida-NSvancomicina-I o R
penicilina-Rcefalosporina-R 3era- generación
Streptococcus pneumoniae fl uoroquinolona-Rlinezolidac -NSvancomicinac -NS
Streptococcus grupo beta ampicilina o penicilinac -NScefalosporina 3era-generación-NSlinezolida-NSvancomicinac-NS
Streptococcus grupo viridian linezolida-NSvancomicina-NS
penicilina-I o -R
Cualquier organismo Resistente a todos los agentes probados rutinariamente.
aCategoría I
Cuando los resultados listados en esta categoría son observados en aislamientos individuales de pacientes, deben ser verifi cados por uno o más de los
siguientes:
1. Asegurando que los resultados inusuales no son debido a errores de trascripción, contaminación o uso de un panel, cultivo o medio defectuoso.
2. Checando reportes anteriores del paciente para determinar si el aislamiento fue encontrado y verifi cado anteriormente.
3. Confi rmando la identifi cación de aislamientos.
4. Repitiendo la prueba de susceptibilidad para confi rmar los resultados. Algunas veces ayuda el usar métodos de prueba alternativos para la prueba a
repetir.
5. Para aislamientos que muestran resultados otros que susceptibilidad para esos agentes antimicrobianos para los que solo son proveídos criterios
interpretativos de susceptibilidad en las Tablas 2A-2J (listados con “NS” arriba) y para estafi lococos con vancomicina intermedia o resultados
resistentes; 1) confi rmar la identifi cación del organismo; 2) confi rmar el resultado de la prueba de susceptibilidad antimicrobial; 3) guardar el
aislamiento; y 4) mandar el aislamiento a un laboratorio de referencia que lo probará por medio de un método de dilución de referencia NCCLS.bCategoría II
Cuando los resultados listados en esta categoría son observados en aislamientos individuales de pacientes, los pasos de verifi cación como se resalta en la
Categoría I, deben ser considerados si la resistencia es poco común en dada institución. cPara estas combinaciones de agentes/organismos antimicrobiales la resistencia no ha sido documentada a la fecha.
Apéndice 229
Prueba de Susceptibilidad por Difusión por discos Guía para la Resolución de Problemas
RESULTADOS ABERRANTES CAUSAS PROBABLES ACCION CORRECTIVA(documentar todos los errores)
EFECTO EN LOS REPORTESDIARIOS
El halo (zona) de tetraciclina esmuy grande y el de clindami-cina muy pequeno en las ce-pas control de Escherichiacoli y Staphylococcus aureus
El halo de tetraciclina es muypequeno y el de clindamicinamuy grande en las cepas con-trol de Escherichia coli yStaphylococcus aureus
pH del medio demasiado bajo
pH del medio demasiado alto
Ajustar el pH del medio a 7,2–7,4 antes de verter el medio
Use un lote nuevoLos medios comerciales no de-
ben tener problemas de pH
NO REPORTAR los resultadoshasta que se haya corregido elproblema y que un lote nuevodel medio produzca resultadossatisfactorios con las cepascontrol
El halo de los aminglycosidos esmuy pequeno con la cepacontrol de Pseudomonas ae-ruginosa
Los halos en los aminoglycosi-dos con la cepa control dePseudomonas aeruginosa esmuy grande
La concentracion en Ca�� y/oMg�� es muy alta en el me-dio
La concentracion en Ca�� y/oMg�� es muy baja en el me-dio
(La incubacion en CO2 puede al-terar el pH de la superficie delagar)
Adquirir un nuevo lote de agarque cumpla con los requisitosdel control de calidad
NO REPORTAR los resultadosde aminoglycosidos en P. ae-ruginosa y Acinetobacterhasta que los halos correspon-dan a los estandares del con-trol de calidad
Los halos son universalmentemuy grandes en las placas(platos) control
Bajo inoculo Ajustar el inoculo a la turbidezde 0,5 McFarland
No reportar hasta que el controlde calidad este dentro de losrangos (limites) aceptables
El nivel nutritivo del medio esmuy bajo
Usar solamente el agar Mueller-Hinton
NO REPORTAR hasta que seuse agar Mueller-Hinton
Organismos de crecimientolento (no se evidencia en loscontroles)
Usar el procedimiento de la con-centracion mınima inhibitoria(CIM) solamente
NO REPORTAR los resultadospor difusion en discos conningun organismo de creci-miento lento
Medio de profundidad inadecu-ada (muy delgado)
Usar un medio con profundidadde 4 mm
NO UTILIZAR este lote paralas pruebas
Los halos son universalmentemuy pequenos en las placas
Inoculo demasiado concentrado Ajustar el inoculo a la turbidezde 0,5 McFarland
NO REPORTAR hasta que seuse agar Mueller-Hinton
control Medio de profundidad inade-cuada (muy grueso)
Usar un medio con profundidadde 4 mm
NO UTILIZAR este lote del me-dio para las pruebas
Los resultados para un solodisco son mas altos o mas ba-jos que el nivel especificadopara las cepas control
Error en la lectura de la zonaborrosa.
Errores de trascripcion.Disco malo. (los discos malos
tienen tendencia a deteriorarsegradualmente)
El disco no se adhirio´ firmementea la superficie del agar.
Note el error. Repita la lectura ypida una segunda opinion.
Estadısticamente, se puede es-perar ocasionalmente algunresultado fuera de los rangos.
Los valores suelen caer dentrode los rangos al repetir laprueba.
Reportar los resultados con losotros discos siguiendo el pro-tocolo establecido.
Repetir la prueba con el antibió-tico fuera de rango con lacepa control y las cepas delos pacientes antes de reportarlas pruebas actuales.
RESULTADOS ABERRANTES CAUSAS PROBABLES ACCION CORRECTIVA(documentar todos los errores)
EFECTO EN LOS REPORTESDIARIOS
Colonias dentro de la zona deinhibicion
Cultivo mixto o contaminado Aislar, identificar y repetir laprueba con un cultivo purosolamente
NO REPORTAR los resultadosde esta placa
Mutantes resistentes dentro de lazona de inhibicion
Hacer una tincion de Gram o al-guna otra prueba para recono-cer el contaminante. Repetirla prueba
Medir las zonas libres de colon-ias e interpretar
Halos muy grandes con los ana-erobios
NO USAR el procedimiento dedifusion por discos para pro-bar anaerobios
La cepa de S. aureus de un pa-ciente es resistente a oxacilinaun dıa y sensible el otro dıa
Pueden ser dos organismos di-ferentes
El cambio de temperatura de37�C a 35�C puede alterar eltamano del halo en este caso.
Controlar la temperatura de laprueba. La prueba se debehacer a 35�C y la placa debeser incubada por 24 horas.
Hacer la prueba de disco con ce-foxitina, si no fue hecha antes(referencia al documentoNCCLS).
Reportar los resultados obteni-dos despues de 24 horas com-pletas de incubacion a tem-peratura de 35�C
Zonas de inhibicion solapadas Discos colocados muy cerca unode cada uno
No utilizar mas de 12 discos enlas placas 150 mm y 4 o 5discos en placas de 100 mm.Colocar los discos no mas de15 mm del borde de la placa.
Repetir la prueba
Halos indistintos con coloniasindividuales evidentes en laplaca de agar
Inoculacion inapropiada, Inoculoinadecuado.
Usar el inoculo apropiadamenteajustado y repetir la prueba
Repetir la prueba antes de repor-tar
Fenomeno de “Zona” Velo de crecimiento “swarming”de Proteus
Leer la zona ancha y clara. Pa-sar en alto el “swarming”dentro de la zona
Reportar los resultados del halobien definido.
Ignore el “swarming”Un borde borroso de las zonas
alrededor de los discos depenicilina o ampicilina usual-mente ocurre con cepas de S.aureus que son beta-lacta-masa negativa.
Medir el punto donde se nota lademarcacion obvia entre elcrecimiento y la falta de cre-cimiento. Procure no hacer es-fuerzo para ver las coloniasmas pequenas.
Reportar los halos como se in-dico anteriormente.
Sulfonamides Ignore el crecimiento escaso enla zona de inhibicion. Medirel halo donde haya 80% dereduccion en el crecimiento.
Reportar los halos como se in-dico anteriormente.
Beta-lactamase positiva Haemo-philus influenzae beta-lacta-masa positiva con penicilina oampicilina
Use el halo interior Notificar al medico si el diag-nostico es meningitidis.
Halos indistintos con sulfa-methozazone con o sin tri-methoprim o con trimetoprimsolamente
El exceso de tiamina o timidinaen el medio permite que cier-tos organismos adopten vıasmetabolicas alternas a losblancos metabolicos usualesde estos antibioticos
Use placas comerciales libres detimidina. Medir el halo dondehaya 80% de reduccion en elcrecimiento.
Reportar como de costumbre siconfıa que los resultados sonbuenos
NOTA: Para mas informacion, refierase a el Apendice de este Manual: la Tabla 8 “Sugerencias para la Verificacion de los Resultados de la Prueba deSusceptibilidad Antimicrobiana y Confirmacion de la Identificacion de los Organismos”: del documento M100 de la NCCLS.
230 Appéndice