Aplicacion Clinica de Ls Biologia Molecular

APLICACIÓN CLINICA DE LA

BIOLOGIA MOLECULAR

Conceptos básicos

Objetivos del Módulo Al final de este módulo, los participantes estarán en capacidad de: Describir la estructura del material genético Entender el mecanismo de transmisión y las implicaciones fisiológicas Entender la replicación viral

Conceptos básicos

DNA (Acido Deoxyribonucléico) – Provee información genética para la codificación de proteínas RNA (Ácido Ribonucléico) – Provee infromación para convertir la información genómica en proteínas. DNA y RNA Son polinucleótidos

Componentes de los Nucleótidos Deoxyribosa/Ribosa (5-carbon azucar) Base nitrogenada unida al azucar Grupo fosfato

Conceptos básicos

Flujo de Información Genética

Que son las Pruebas de Ácido nucleicos o Pruebas Moleculares?

Son pruebas del laboratorio para detectar, cuantificar o caracterizar un patógeno, utilizando su material genético (RNA o DNA)

Conceptos básicos HIV

HIV es un virus miembro de la familia de los Retrovirus, su material genético está compuesto por RNA. El Grupo de mayor prevalencia es el M (Major) el cual se subdivide en al menos 11 subtipos.


La infección por HIV causa SIDA

SIDA es el estado final de la infección por VIH

SIDA es una condición que gradualmente destruye el sistema inmune haciendo que el cuerpo se vuelva vulnerable a enfermedades por oportunistas.

El Virus se multiplica en las células blancas (CD4) encargadas de proteger el cuerpo de la enfermedad.

La transmisión del VIH se hace por sangre, semen, secreciones vaginales y otros fluidos biológicos de una persona infectada.

La transmisión se da por el uso de material corto punzante contaminado y existe la transmisión Madre-Hijo.

Modulo 1: Conceptos básicos Ciclo de Vida del HIV

Ciclo de Vida del HIV

Unión e Ingreso a CD4: Los receptores del virus se unen a las células de inmunidad. Estos receptores están en la envoltura del virus Las Glicoproteínas gp120 y gp41 se unen a los receptores celulares de

los CD4. Después de la unión, el virión entra a la célula y el RNA viral es

liberado. Transcripción Reversa y Síntesis: El RNA viral es copiado por acción de la transcriptasa reversa en una

cadena doble de DNA


Integración viral y Transcripción: La proteína viral integrasa, integra el DNA viral en el núcleo de la célula. El DNA viral puede ser trascrito en RNA por acción de la RNA

polimerasa de la célula huésped. Síntesis de Proteína virales: En el citoplasma de la célula huésped, los ribosomas transcriben el

RNA viral en proteínas Estas proteínas son transportadas a la membrana celular con le RNA

viral para el ensamble del nuevo material genético de las nuevas células.


Ensamble del nuevo virus y liberación: Los nuevos componentes virales se reúnen en la

membrana celular Los nuevos núcleos que contienen RNA y proteínas son

ensamblados formando nuevas partículas virales llamadas viriones. El virión se vuelve activo cuando la enzima viral proteasa

rompe las proteínas en unidades activas volviendo el virión infeccioso. Las partículas virales son liberadas


Replicación

La vida media de los CD4+ infectados es de 1,6 días

La vida media de los viriones es de 6 Horas.

El Virus se replica logarítmicamente (~10 billones/día)

SUPPLEMENTAL INFO FOR TRAINING PURPOSES ONLY Refer to Product Labeling for updated info.

Cómo afecta el HIV-1 / SIDA

clínicamente a los pacientes?

Cómo afecta el HIV-1 / SIDA clínicamente a los pacientes?

Objetivos del módulo:

Al final de éste módulo los participantes deben estar en capacidad de:

Describir la importancia de la cuantificación de la carga viral

Describir la correlación entre carga viral y la progresión a SIDA.


Los médicos emplean la carga viral junto con el cuadro clínico del paciente y otros marcadores de laboratorio como una ayuda en el manejo de individuos infectados con VIH.

NO es una prueba de diagnóstico.

La carga viral se emplea para determinar la progresión de la enfermedad a SIDA y para monitorear la eficacia de la terapia a con anti-retrovirales mediante la medición de cambios en los niveles de virus circulante durante el curso de la terapia.


Infección por HIV Infección primaria/o Síndrome Agudo retroviral (ARS) Disminución de los CD4+ Altos niveles plasmáticos de HIV (Carga Viral (VL) Síntomas clínicos que se solucionan de 1 a 3 semanas y disminución de la carga viral. Latencia Clínica Alta replicación del virus Disminución de los CD4+ Promedio de duración de 10 años (Sin intervención terapéutica) SIDA El cuerpo se vuelve vulnerable a enfermedades por oportunistas Muy bajos recuentos de CD4+ Altos niveles de VL.

Respuesta Virológica a la infección por VIH

Tipos de Terapia

La terapia Anti-retroviral bloquea la replicación viral en las células: Inhibidores de la Transcriptasa Reversa (RTI), Enzima encargada de iniciar el ciclo reproductivo del virus, bloquendo la transcripción de RNA a DNA. Son de dos Clases: NNRTI: Análogos No-nucleosidos Analogues, se incorporan al DNA y detienen la replicación. NRTI: Análogos Nucleosidos, se unen directamente a la TR y previenen la conversión de RNA a DNA.

Tipos de Terapia

Inhibidores de Proteasa (PI) Bloquean la proteasa enzima necesaria al final del ciclo reproductivo del HIV (Inhibe la maduración de proteína y el ensamble viral)

Tipos de Terapia

Inhibidores de Fusión: Actúan sobre la glicoproteína gp41 del VIH-1

p41 es el nombre para designar la glicoproteína de membrana del virus VIH. Esta glicoproteína está presente en la infección de los linfocitos CD4 por el virus VIH.

La región genómica gp41 esta localizada en el gen de envoltura del VIH ( también llamado gene gp160).

Los inhibidores de fusión son una categoría de medicamentos diseñados para inhibir la infección del virus mediante su capacidad de bloquear la fusión del virus y las células CD4.

TECNICAS MOLECULARES

PARA EL DIAGNOSTICO

DE ENFERMEDADES

INFECCIOSAS HIV, HCV Y

HBV

Que ventajas hay en utilizar Tests de Biología Molecular ?

Las pruebas de Biología Molecular utilizan el

material genético de células como blanco haciendo los ensayos mas sensibles y específicos.

En agentes infecciosos ayuda a:

•DIAGNOSTICAR •MONITOREAR •GUIAR EL TRATAMENTO.

Tests de Biología Molecular

Los ensayos moleculares detectan Ácidos Nucleicos DIRECTAMENTE en una muestra, diferente a los ensayos inmunodiagnósticos que detectan proteínas (Ag/Ac) específicas.

Rastrear el blanco no depende de la cantidad para su detección. Los ensayos de Biología Molecular hacen una “lectura” del material genético revelando información precisa y específica.

Ensayos realizados en un Laboratorio de Biología Molecular

Examenes Cualitativos – TMA / PCR / PCR Tiempo

Real / “in house”

Examenes Cuantitativos – bDNA / PCR / NASBA /

PCR Tiempo Real / “in house”

Genotipaje – LiPA / Secuenciamiento / “in house”

Pruebas Disponibles en el Mercado

b-DNA (Siemens): Amplificación de señal

PCR (Roche): Amplificación del Ácido Nucleico

NASBA (bioMérieux): Amplificación del Ácido

Nucleico

Como funcionan estas pruebas ?

Transcription mediated amplification (TMA)

La amplificación medida por transcripción, o TMA, se utiliza para

amplificar porciones de RNA y/o DNA.

La transcriptasa inversa crea una copia de DNA (cDNA) del ácido

nucleico seleccionado.

La polimerasa del RNA inicia la transcripción, sintetizando RNA. Algunos

de la amplificación del RNA sintetizados de nuevo, vuelven a entrar en

el ciclo de TMA sirviendo de molde para nuevos ciclos de

amplificación. Potencialmente se pueden sintetizar en una hora

billones de copias.

Las sondas marcadas con éster de acridinio (AE), hibridan

específicamente los productos de la amplificación. El proceso de

ensayo de protección de la hibridación (HPA) inactiva selectivamente

el marcado AE sobre las sondas no hibridadas para reducir al máximo

el ruido de fondo.

TMA

La presentación en un solo tubo simplifica el análisis y minimiza la posibilidad de contaminación. » El proceso de captura selectiva no requiere preparación de la muestra, extracción o ultracentrifugación.

ESQUEMA DE TRABAJO DE NASBA

PCR

Esta técnica utiliza una enzima denominada ADN polimerasa

que copia cadenas de ADN en un proceso que simula la forma en la que el ADN se replica de modo natural en la célula.

Este proceso permite a los científicos obtener gran número

de copias a partir de un segmento determinado de ADN.

FUNDAMENTO DE LA RT -PCR

1. Obtención de la muestra

2. Transcripción reversa del ARN ADNc

3. Amplificación del ADN (PCR)

4. Hibridación de amplicones con sondas específicas

5. Detección colorimetrica de productos amplificados

unidos a la sonda

Gen amplificado: Gen gag, 155 bp de largo

Primers SK 145 / SKCC1B

CONVENTIONAL PCR 781P, 1137N PRIMERS

379 bp

PCR en Tiempo Real

Es una PCR convencional en la que los termocicladores llevan incorporados un sistema de detección de fluorescencia, usando unas moléculas específicas denominadas fluoróforos y quenchers.

Monitorea en tiempo real, lo que esta ocurriendo dentro de

cada tubo en cada ciclo de amplificación y va a sustituir a los pasos de amplificación, electroforesis y análisis de imagen de una PCR tradicional.

PCR en Tiempo Real

Los factores que afectan a la PCR cuantitativa son, entre otros:

optimización del protocolo de reacción para maximizar su eficiencia.

Una pequeña diferencia en la eficiencia de reacción por ciclo, tan solo

un 90% tan eficiente como otra, la relación de producto final entre

ambas reacciones después de 40 ciclos será alrededor de 65 a 1

evitar un número excesivo de ciclos de amplificación

adecuado procesamiento de las muestras que asegure la eliminación de

los inhibidores que pueden disminuir la eficiencia de amplificación.

Requiere 3 ambientes exclusivos para evitar contaminación.

La fluorescencia aumenta con cada

enlace de DNA. Fluorescencia es

observada en tiempo real.

El colorante libre emite muy

poca fluorescencia

Detección de DNA con SYBR Green

Alinamiento de los primers

Fundamento del Monitoreo de PCR con

el Sistema LightCycler

Comparación con termocicladores convencionales

Ventajas

CUANTIFICACION

MAS RAPIDO

MAS FACIL

Sondas Taqman® Applied Biosystems

Usan la actividad 5’ exonucleasa de la Taq (Thermus aquaticus) polimerasa. Estas sondas tienen un marcador fluorescente en el extremo 5’ y una molécula que absorbe ("quencher") la fluorescencia emitida por el marcador en el otro extremo. La sonda hibrida con el fragmento específico (si está presente) y, a medida que se sintetiza la hebra complementaria, la sonda se va degradando por la acción exonucleasa, liberando el marcador emitiendo fluorescencia.

Comparación de Pruebas de Carga Viral para HIV-1

178-5,000,000

50-1,000,000

No 0.2 mL

1 mL

RT-PCR Abbott HIV-1

50-100,000 No 500 l TMA Gen-Probe HIV-1

50-50,000 (ultra) 23,500g/1 h 500 l

400-750,000

(standard)

200 L RT-PCR Roche Amplicor

Monitor 1.0

50-500,000 23,500g/1 h 1 mL bDNA Siemens VERSANT

(bDNA)

40-10,000,000 No 50 l-2 mL NASBA Organon Teknika

NucliSens

Dynamic Range

(Copies/mL)

Ultracentrifugation

Required

Input Volume

Method

Test

Características

Rango amplio

(50 – 500,000 copies/mL)

Sensibilidad

(50 copies/mL)

Plataforma automatizada:

Versant 440

Precisión y reproducibilidad

Detección de subtipo

Método de amplificación de señal

Beneficios

No necesita dilución de la muestra

Elimina costo de repetición

Permite el monitoreo de carga viral

De baja carga para determinar la respuesta de pacientes

a la terapia antiviral

hasta 168 muestras por corrida

Máxima eficiencia

Mínimo tiempo de manipulación

Provee resultados confiables

Cuantifica subtipos A–G

Asegura mayor confianza en los resultados

Reduce riesgo de contaminación

VERSANT HIV-1 RNA 3.0 Assay (bDNA)

EXAMEN

CUANTITATIVO (CARGA

VIRAL)

A cuantificación de la Carga Viral es considerada o marcador mas adecuado para o establecimiento del pronóstico (evaluación de la evolución de la infección) y monitoreo clínico.

La prueba de Carga Viral es uno de los métodos mas eficientes para definir el inicio del tratamiento, evaluación de la eficacia del tratamiento, alerta de surgimiento de oportunistas.

MIDE LOS NÍVELES

PLASMÁTICOS DE ÁCIDO NUCLÉICO DEL AGENTE INFECCIOSO (HIV, HCV, HBV)

PUEDE SER DEFINIDA COMO:

HIV - variación de 0,5 log

Resultado en copias/mL

HCV - variación de 2 log

1UI/mL = 5,2 copias/mL

HBV - variación de 1 Log

1UI/mL = 5,6 copias/mL

Respuesta al tratamiento:

Tecnología de Amplificación de Señal emitido por molécula de DNA ramificado

bDNA- branched DNA

Metodología que cuantifica o Ácido Nucleico viral con sondas específicamente diseñadas que se hibridizan directamente al blanco, tornando esta molécula detectable a través de una reacción de quimioluminiscencia.

Hibridización: Una reacción donde se aparean las bases nitrogenadas complementarias (puentes de hidrogeno). Los Híbridos se pueden formar entre DNA-DNA, DNA-RNA o RNA-RNA. Forman entre una fila pequeña a una fila

grande donde exista una región para

complementar entre las dos. Una hibridización

imperfecta también puede ser formada y cuanto

mas imperfecto el pareamiento, menos estable

será la molécula.

Que es una Sonda?

Sonda es un termino utilizado para denominar

un trecho de Ácido Nucleico, de secuencia

previamente conocida, diseñada para la

pesquisa del Ácido Nucleico en cuestión. En

este caso, la secuencia de la sonda es marcada

con una señal de fácil detección (radioactivo o

químico).

HIV - Características Básicas del Ensayo: • Sensibilidad: 50 copias/mL • Linealidad: 500.000 copias/mL

• Especificidad: > 98,5 %

• Productividad: hasta 168 pruebas por ensayo

• No requiere extracción de RNA pero necesita formación de pellet (precipitación viral)

• Incubación overnight de 16 horas

gag gene

pol gene

Tamaño de región utilizada para VERSANT HIV bDNA

> 80 sondas

~2700 pares de bases

Detección de Subtipos - HIV

Capacidad de detectar equivalentemente los

Subtipos de A – K (Grupo M)

2 filas negativas de RNA

HCV - Características Básicas del Ensayo: • Sensibilidad: 3.200 copias/mL • Linealidad: 40.000.000 copias/mL



• No requiere extracción de RNA ni formación de pellet

• Incubación overnight de 15 horas

gag gene 5’UTR

Tamaño de la region utilizada en VERSANT HCV bDNA

6 sondas de captura

17 sondas blanco

Detección de Subtipos - HCV

Capacidad de detectar Genótipos HCV: 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 4a, 5a e 6a.

1 fila positiva de RNA

HBV - Características Básicas do Ensayo:

• Sensibilidad: 2.000 copias/mL • Linealidad: 100.000.000 copias/mL



• No requiere extracción do RNA ni formación de pellet

• Incubación de 1 hora + overnight de 15 horas

gag gene Fila negativa

Tamaño de region utilizada en VERSANT HBV bDNA

Detección de Subtipos - HBV

Capacidad de detectar Genótipos HBV: A, B, C, D, E e F

Doble fila de DNA

Características Básicas del Ensayo Ensayo overnight realizado en 3 etapas : 1. Preparación de pellet (HIV) y Lisis

2. Hibridización de las Sondas (blanco, captura,

pré-amplificación, amplificación y marcado)

3. Lectura en RLU (adición del substrato)

System 340 (bDNA Analyzer) & Data Management Software

- Incubación / Agitación - Lavado - Lectura - RLUs (Reacción de quimioluminiscencia)

Módulo de Fluídos, ensayo y computador integrados.

Módulo de fluídos

Versant 440 Molecular System

Módulo de procesamiento del ensayo

Teclado

Monitor LCD

DriveCD-RW

Versant bDNA 340 System

96 Testes por kit: - 12 Testes : estándares y controles 6 estándares - A,B,C,D,E,F * (HIV / HBV) 3 controles: - Negativo - Positivo Bajo - Positivo Alto - 84 pacientes

* HCV: 4 estándares – A, B, C, D, E

Microplacas de pruebas de bDNA

2 microplacas – 168 pacientes por rutina 84 pacientes/placa + 12 estándares y controles

Reactivo de HIV RNA 3.0 bDNA

El Kit esta compuesto de 2 cajas de reactivos:

Superfície do poço

Secuencia para fijar el vírus a

la placa

Superfície de pozo

Ác. Nucléico Sonda Blanco

Sonda de Captura

Superfície de pozo

Ác. Nucléico Sonda Blanco

Sonda de Captura

Sonda Pré-amplificadora

Superfície de pozo

Sonda de Captura

Sondas Amplificadoras

Sondas Blanco

Pre-amplificadoras

Micropozo

Blanco (vírus)

Sonda de

Captura

Micropozo con Sonda de Captura

Amplificadoras

hibridizadas con

Sondas

Marcadas

Con la adición del Substrato ocurre la reacción de quimioluminiscencia.

Iso C & Iso G

• Bases Nitrogenadas no Naturales – Isómeros de Citosina y Guanina

• Reduce hibridizaciones no-específicas

• Aumento de Especificidad del Ensayo

CURVA

DE

RESULTADOS

bDNA

Pág 1 - Resultado

Pág 1 - Gráfico da curva generada por los estandares

Pág 2 y 3 – Resultados de las Muestras (cópias/ml)

Pág 4, 5 e 6 – Event Log

PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS

Técnica simples, no necesita de extracción de RNA

Poco susceptible a contaminación

Necesita de apenas 01 sala

Reducción importante en relación al costo de insumos consumibles

Reducción de relación técnico / muestra / hora trabajada

hasta 168 pacientes por técnico/día

Métodos de pruebas de Resistencia al HIV

Genotyping Sondas de hibridación, secuenciación DNA. Detecta mutaciones

genéticas especificas sobre el genoma viral que correlaciona con la resistencia viral a una droga particular.

Phenotyping Prueba de susceptibilidad a las drogas Determina a que drogas la muestra del paciente es susceptible o

resistente por exposición directo a la droga.

Uso de Genotipificación para la prueba de Resistencia del HIV a las drogas

Detectar las variaciones en las secuencias génicas del virus que son capaces de

alterar la secuencia final o estructura de la enzima de la transcriptasa reversa (RT)

o enzima proteasa

Trugene

Nuevo iMAC with OpenGene

Version 4.0

El Genoma del HIV

9.8 kb

pol gag env

1.3 kb

Protease Reverse

Transcriptase

TRUGENE target regions:

Flujo de trabajo

DISTRIBUCIÓN AREAS DEL LABORATORIO PARA

EL PROCESAMIENTO DE TRUGENE HIV-1

Procedimiento

Extracción y purificación de Ac.

Nucleico

Trascripción Reversa

Amplificación

CLIP secuenciación bi-direccional

separación por electroforesis

Análisis por GeneObjects

Reporte de Resistencia

TRUGENE HIV-1 Report

(a través de GeneObjects 4.0)

Análisis por GeneObjects

Separacion de gel de electroforesis

(50 min/muestra)

Secuenciamento bidirecional – Reacion CLIP

(2hs)

Amplificacion (4hs)

Extraccion (1h)

Transcripcion Reversa

Preparación del CLIP

A

C

G

T

A

C

G

T

Sample 1

Sample 2

Sample 3

Sample 4

Positive

Negative

RT Beginning

RT Beginning

RT Beginning

RT Beginning

RT Beginning

RT Beginning

P2

P2

P2

P2

P2

P2

Protease

Protease

Protease

Protease

Protease

Protease

RT-Middle

RT-Middle

RT-Middle

RT-Middle

RT-Middle

RT-Middle

MicroCel™ 500

HIV-1

PLACAS DE GEL DE POLIACRILAMIDA

1 2 3 4

Dire

ccio

n d

e m

igra

cio

n

A C G T

N

N

Migracion de los Fragmentos por Electroforesis

Gel Electroforesis y Procesamiento

RT-Beginning

RT-Middle

Protease or P2

ANALIZANDO LA CORRIDA

ANÁLISIS DE MUTACIONES

ELABORACION DE REPORTE DE RESISTENCIA

TRUGENE® HIV-1 Reporte Mutacion

DROGAS ANTI-RETROVIRALES ANALISADAS

Inhibidor de RT Nucleosído y

Nucleotído

Zidovudina

Didanosina

Lamivudina/Entricitabina

Estavudina

Abacavir

Tenofovir

Inhibidor de RT no Nucleosído

Nevirapina

Efavirenz

Inhibidor de Protease

Saquinavir/Ritonavir

Indinavir

Nelfinavir

Amprenavir/Fosamprenavir

Lopinavir + Ritonavir

Atazanavir

Atazanavir + Ritonavir

Tipranavir + Ritonavir

Darunavir + Ritonavir

MUCHAS GRACIAS

Esquema del Ensayo de bDNA HIV 3.0

MICROPLACA

Sondas de

Captura al

Microplaca

Sondas de

Captura

ARN del Virus de VIH-1

Sondas Diana

“target probe”

Sondas del Pre-amplificador

Sonda Marcadora

Substrato

Quimioluminescente

Aplicacion Clinica de Ls Biologia Molecular

Documents

Transcript of Aplicacion Clinica de Ls Biologia Molecular