Aplicaciones Potenciales de las Microalgas Marinas en Baja...
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Aplicaciones Potenciales de las Microalgas
Marinas en Baja California
Chihuahua, Chih., CIMAV 26 de Octubre de 2010
Jose Luis Stephano Hornedo
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Necesidad de Energías Alternas
283309
347 366400
447
511559
607654
702
1
Consumo Mundial de EnergíaMiles de billones de BTUs
1980 1985 1990 1995 2000 2004 2010 2015 2020 2025 2030
Energy Information Administration, E.E.U.U., 20051BTU= 0.293Whr
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Necesidad de Energías Alternas
Energy Information Administration, E.E.U.U., 2008
Dic-19989.16
Jul-2008137.11
Ene-197813.08
2010: Precio Internacional del Petroleo: $81.25 dolares/barril
2010: Precio de la gasolina: 0.63 dolares/litro
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Necesidad de Energías Alternas
2%
1.4%
2.5%
-0.3%
Consumo de Energia Produccion de Petroleo
Consumo de Energía y Producción PetroleraProyección a 2030
Cambio Porcentual Anual
Mundial Mexico
Energy Information Administration, E.E.U.U., 2006
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Seguridad Energética
• Cantarell proveía el 60% de la producción Nacional
• En el 2003 Cantarell alcanzó su pico de producción.
• Hoy produce menos de la mitad.
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•México posee el 1.2% de las reservas mundiales de petróleo
•Extrae el 5% de la producción mundial.
•El total de las reservas estimadas alcanzará para 30 años.
•Las reservas probadas solo alcanzan para 10 años.
14621.2
15144.4
14717.2
2008
Reservas de Petróleomillones de barriles
Posibles Probables Probadas
Seguridad Energética
Sistema de Información de Energía, México, 2008
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Seguridad Energética
Sistema de Información de Energía, México, 2008
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
Exportación Importación
Balanza Comercial de HidrocarburosPEMEX Ene/2008 Miles de barriles equivalentes
Petroquímicos
Prod. Petrolíferos
Gas Natural
Crudo
Petroquímicos: Derivados del petróleo no combustibles (etileno, benzeno, etc)
Prod. Petrolíferos: Gasolinas
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Necesidad de Biocombustibles
2004 2010 2015 2020 2025 2030
Consumo Mundial de Combustibles Líquidosmiles de billones de BTUs
Electricidad
Transporte
Industrial
Comercial
Residencial
Energy Information Administration, E.E.U.U., 2005
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Biodiesel• Resultado de la transesterificación de
triglicéridos.
VariableBiodiesel de Microalgas
Diesel de Petróleo
Densidad (Kg/L) 0.864 0.838
Punto de Inflamación (ºC) 115 75
Viscocidad (mm2/s @40ºC) 5.2 1.9—4.1
Valor de Calentamiento (MJ/Kg) 41 40—45
Relación H/C 1.81 1.81
Punto de Solidificación (ºC) -12 -50 – 10
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Ventajas del Biodiesel• Compatible con todos los
motores diesel.
• Biodegradable.
• Menor contaminación.
• Renovable
• Tecnología disponible para su producción.
• Puede utilizarse solo o mezclado con diesel de petróleo
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Biodiesel vs Diesel de Petróleo
Emisiones Contaminantes de B20 comparado con
100% Diesel
Emisión %
NOx +2.0
Partículas -10.1
HAPs -21.1
CO -11.0
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Microalgas• Organismos fotosintéticos
unicelulares
• Se estima que existen entre 1 y 1.5 millones especies, solo se han identificado alrededor de 65,000
• Son capaces de reproducirse hasta 6 veces en 24 horas
• Existen especies que producen hasta 70% de peso seco en lípidos.
• Presentes en prácticamente todos los hábitats
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Ventajas de las Microalgas• No compiten con los alimentos ni
asentamientos humanos
– Se utiliza agua de mar o
salobre.
– Se cultivan en tierras infértiles
• Alcanzan grandes densidades
• Producen hasta 200 veces más
aceites que los cultivos tradicionales.
• El 90% de su peso seco es CO2
absorbido
• No generan desechos
• Aumentan la disponibilidad de alimento
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Impacto Ambiental de la Producción de Biocombustibles
Cultivo Producto Emisión de CO2
Kg/MJ
Uso de Recursos
Agua dulce Fertilizante Pesticidas Energía
Maíz Etanol 81-85 Alto Alto Alto Alto
Caña Etanol 4-12 Alto Alto Medio Medio
Pastos Etanol -24 Medio Bajo Bajo Bajo
Madera Etanol/
Biodiesel
N/D Medio Bajo Bajo Bajo
Algas Etanol/
Biodiesel
-183 Bajo Bajo Bajo Medio/
Alto
Soya Biodiesel 49 Alto Medio Medio Medio
Canola Biodiesel 37 Alto Medio Medio Medio
Jatropa Biodiesel N/D Medio Medio/
Bajo
Medio Medio
Palma Biodiesel N/D Alto Bajo Medio Medio
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Rendimientos
Cultivo Rendimiento
L /Ha
Superficie Necesaria* Ventajas
Hectáreas
(Millones) %**
Desventajas
Soya 446 594 326
Tecnología Disponible
Compite con Alimentos, Agua.
Canola 1,190 223 122
Tecnología Disponible
Compite con Alimentos, Agua.
Jatropa 1,892 140 77
Tecnología Disponible
Compite con Alimentos, Agua (250 a 600mm),
Crecimiento Lento
Palma 5,950 45 24
Tecnología Disponible
Deforestación
Microalga
20%
Lípidos
39,100 6.8 3.8
Alto potencial de producción de Biocombustibles
y Alimento.
Microalga
50%
Lípidos
97,750 2.8 1.6 Tecnología aún en Desarrollo
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Baja California• 3.6% del Territorio
Nacional (71,446 Km2)
• 13.41% de los litorales
mexicanos
(1555.23Km)
– 880Km Pacífico
– 675Km G. California
• Precipitación total anual
de ~100mm.
• Las costas del G. de
California reciben la
menor precipitación
anual del país (40mm)
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Baja California
•Temperatura media
anual de 17ºC. •Dic y Ene: 11 y 12ºC
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Reuso de Suelos
• Uso intensivo de suelos
para agricultura
– Salinización
– Agotamiento
• Erosión por viento
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• Nuevos usos para suelos agrícolas agotados
• Aprovechamiento de suelos sin uso productivo
• Impacto directo en comunidades remotas/marginadas
• Abasto de combustible
• Captura de CO2
– Posible acceso a bonos de carbono
• Creación de una Nueva Industria
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Microalgas
Lípidos
Biodiesel
Suplementos Alimenticios
Proteína
Forraje
Alimento
ProteínasRecombinantes
Vacunas
Carbohidratos
Bioetanol
Biomasa
Electricidad
Alimento para Acuacultura
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Lagunas de San Quintin,
Baja California.
Salinera San Martin
La Cooperativa Litoral de Baja
California S.A. de C.V. Tiene mas
de 14 lagunas de 10 a 30
hectareas cada una y mas de
1000 hectareas disponibles para
el cultivo de microalgas.
La coloracion roja se debe a
la presencia de Dunaliella
salina.
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Cinética de crecimiento de Dunaliella salina
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
0 5 10 15 20
Nú
mer
o d
e cé
lula
s
Días
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 5 10 15 20
DO
63
0 n
m
Días
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Desarrollo de Microalgas Modificadas
Genéticamente para incremetar la sintesis de
Lipidos
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Mutagenesis con Sulfonato de Etil-metano
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Importancia del gen de P4H• Modifica proteínas de pared celular
• evitando su integración a esta.
• Glicoproteinas ricas en
hidroxiprolina, extensinas y
arabinogalactinas.
A: pared celular con silenciamiento, las capas
w2 a w6 se pierden mientas que la w1 y w7
pierden densidad.
B: pared celular con silenciamiento, el efecto es
mas acentuado, la pared llega a desprenderse
de la membrana celular.
C: pared celular de Chlamydomonas
normal, con sus capas diferenciadas.
The Plant Cell, Vol. 19: 256-269, January 2007, www.plantcell.org ェ 2007 American Society of Plant
BiologistsChlamydomonas reinhardtii Has Multiple Prolyl 4-Hydroxylases, One of Which Is Essential for Proper Cell Wall
AssemblyKatriina Keskiaho, Reija Hieta, Raija Sormunen, and Johanna Myllyharjua
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Síntesis del gen de P4H y construcción de la
resistencia nourseotricina
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• Áreas:
– Suministro de Agua de mar
– Filtración
– Suministro de CO2
– Escalamiento
– Cosecha
– Disrupción celular
– Separación de Biomasa y Aceite
Planta Piloto de
30,000 L para
producción de
aceite crudo
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Desarrollo de Microalgas Modificadas Genéticamente para
Produccion de Vacunas y Proteinas Recombinantes
(HA, Interferon 2 alfa, Interleucina 2, Proteina G, etc)
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Menor tiempo de transformación a producción de proteínas recombinante
Obtención de líneas transgénicas estables encorto tiempo
Producción en medios de cultivo baratos
Producen proteínas complejas
Maquinaria de plegamiento y ensamblaje de proteínas
Interferón alfa 2B (hepatitis B)
Vacunas (anticuerpos,antígenos)
Interleucina 2 (efectoanti-tumoral)
Produccion de Proteinas Recombinantes en Microalgas
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Secuencia de HA optimizada para expresion en nucleo
Secuencia de HA optimizada para expresion en cloroplasto
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aa 264 PstI NcoI
Digestión con
NcoI y PstI
4,464 pb
2,710 pb pUC57
1,754 pb HA
1 2 3
MW
4 5 6
Digestión
NcoI y PstI
3,687 pb pUC57-UTRs
1,754 pb HA
Ligación
pUC57-UTRs-HA
1
MW
2Ligación pUC57-HA
Región Intergénica de D. salina
≈ 680pb
1 2 3 4 5
MW MWpsbA y R.I
≈ 4.8Kb
Cassette de
Expresion en
Cloroplastos
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Anticuerpos VHH de Llama contra A/H1N1 2009
• Fácil manipulación genética.
• Tamaño de 12-15 KDalton.
• Estable a altas temperaturas.
• Alta solubilidad.
• Se une con alta afinidad alantígeno.
• Reconocimiento de sitios
• antigénicos ocultos.
• Rápida penetración de tejidos.
• Buena expresión en sistemas de
• expresión recombinantes.
• Incremento del tamaño funcional de
• las bibliotecas inmunes.
• 85% de similitud con los
• dominios VH humanos.
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ATGCCTCTCCCAGCAACCCACGATTTACACATCTCCGGCTCA
ATCAATGGACATGAGTTTGACTTGGAAGGCAGTGGCAAAGGC
AATGCAAAAGAAGGTTATCAGGAGCTCCACCTAAAGTCCAAC
AAGGGTGACCTGTCATTCTCCCCCTGGATCCTGGTCCCAAAC
ATCGGCTACGGCTTCTACCAGTACCTGCCCTTCCCCGACGGA
GCGATGTCGCCTTACCAGGCCGCCATGCACGATGGCTCCGG
ATACGTGATGCATCGTTCAATGCAGTTTGAGGATGGTGCCAT
GCTGCATTCAGACCACCGCTACATCTATAAGGGAAACCATATC
AAAGGAGAGTTTCGGCTGACCGGAAGCGGTTTCCCTGCTGA
CGGCCCTGTGATGACCAACTCGCTGACCGCTGCGGACTGGT
GCGTCGACAAGCTGCTGTACCCAAACGACAACACCATAATCG
GGAAATTCGACTGGACCTACACCACTACCAGTGGCAAGCGCT
ACCAAAGTGATGTGCAGACCAACGTCACATTTGGCAAGCCAA
TAGCGGCCGACATTTTGAAGAAGCAGCCAATGTTCGTGTTCC
GCAAGGTGGAACTCAAGCACACCAAGACTGAGCTCAACTTC
AAGCAGTGGCAGAAGGCATTCCAGGACATCGCCTAG
Proteína Fluorescente Wasabi:
-Estable a temperatura ambiente.
-Madura mas rápidamente que el resto
de las proteínas fluorescentes.
-PFW:663 bp, 221 aa
-Anticuerpo de llama: 450 bp, 150 aa
371 aa, aprox. 37,000 kDa
400 bp500 bp
Regiones Variables de los Anticuerpos de llama (VHH)
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Proteína G de Streptococcus sp. recombinante expresada en E. coli
1 mg ---- 69.8 Dlls Liofilizada en polvo Capacidad de unión ~10mg/mg
En microalga expresa 0.0002—0.0006 mg/ml de proteína recombinante de hormona de crecimiento Si se expresa la Proteina G a similares concentraciones la ganancia bruta por L de cultivo es la siguiente:
0.2 mg/L 13,000 L/semana----2600 mg 179140 dlls
Organismo Afinidad proteína A Afinidad proteína G
Humano ++++ ++++
Caballo ++ ++++
Vaca ++ ++++
Cerdo +++ +++
Chivo +/- ++
Borrego - ++
Conejo ++++ +++
Gallina - +
Hámster + ++
Cobayo ++++ ++
Rata +/- ++
Ratón ++ ++
Tabla. Afinidad para anticuerpos de diferentes organismos
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Péptido Señal
2 Sitios GA (enlace albumina) 3 Sitios de unión a IgG
Proteina G (P19909)Immunoglobulin G-binding protein G Streptococcus sp.
Propiedades:
593 aa (1,779 pb)
63 kDa
Nco I 6-His Enterokinasa MET 3 Sitios de unión a IgG STOP Pst I
Proteina G (Lab. Meredith Gould)Immunoglobulin G-binding protein G
Streptococcus sp.
Propiedades:
216 aa (657 pb)
24 kDa
Codones optimizados para alta expresión en cloroplasto
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PRUEBAS DE
SELECCIÓN CON
PRUEBAS DE TRANSFORMACION
CON
CONSTRUCCION
PARA
TRANSFORMACION
MUTACIONES
DIFERENTE
REGIÓN DE
RECOMBINA
CION
GEN
INTRODUCID
O
SILENCIAMIENTO
DEL GENPROMOTOR FUNCION
ATR
AZI
NA
O D
CM
U
HIG
RO
MIC
INA
CLO
RA
NFE
NIC
OL
NO
UR
SEO
TRIC
INA
LASS
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AG
RO
BA
CTE
RIU
M
TUM
EFA
CIE
NS
BO
LITA
S D
E
VID
RIO
BIO
BA
LIST
ICA
NU
CLE
O
CLO
RO
PLA
STO
ALMA L. SANCHEZ
QUIÑONES
EXPRESION
DE HASS35 VACUNA
FERNANDA ANA
SOSA B.
SERGIO QUIÑONES P.
JOSE A. ECHANOVE J.
EXPRESION
DE HASS35 VACUNA
IBRAHIM GUZMAN
OROSTICO
1.4 PROPIL
HIDROXILASARBCS2 FACILITAR LA
RUPTURA DE LA
PARED CELULAR
PARA LA
OBTENCION DE
ACEITE CRUDO.
RAYMUNDO AGUAS EXPRESION
DE DGTAATPA AUMENTO DE
SINTESIS DE
LIPIDOS
DANTE MAGDALENO
MONCAYO; HAYDEE
LOPEZ RODRIGUEZ
INTERLEUCIN
A 2
MUTACION
HA
MODIFICADA
TERAPIA ANTI-
TUMORAL.
AUMENTO DE
SINTESIS DE
LIPIDOS.
VACUNA
CAROLINA MENDOZA
DAMIAN;
CEASAR IVAN ORTIZ
ALCARAZ
EXPRESION
DE HA
INTERFERON
2 α
ATPA VACUNA
TRATAMIENTO DE
HEPATITIS C
ALEJANDRO
CARBALLO AMADOR
PROTEÍNA G ATPA PURIFICACION DE
ANTICUERPOS
ETAPA 2: DESARROLLO DE ALGAS MODIFICADAS GENETICAMENTE
07/Ago/2010 al 06/Ago/2011
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Transformacion con Laseres pulsados
Mediana potencia
Mediana Potencia
Veneranda Garces (CICESE, UABC)
Alta Potencia
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Adaptación de D.salina a diferentes concentraciones de NaCl y en
diferentes medios previo a la transformación con A.tumefaciens
Concentraciones de NaCl: 50, 100, 150, 200 y 250 mM
Medio Yu Sun et al. 2006.
Medio Johnsons Modificado (Borowitzka,M.A.,1988)
Se seleccionó 250mM de NaCl debido a que
Dunaliella salina muestra mejor crecimiento que
a las demás concentraciones de NaCl.
Adaptación de A.tumefaciens a diferentes concentraciones de NaCl
Agrobacterium crece en cualquier concentración de NaCl en medio YEM, sin embargo se
decidió utilizar 250mM para que ambas células estén a la misma salinidad.
Concentraciones de NaCl: 50, 100, 150, 200 y 250 mM
Dia 0Dia 3
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Seleccion de las Microalgas Transformadas
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Selección y Mantenimiento
4 a 6 Semanas
9 a 15 meses
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Selección y Mantenimiento
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Escalamiento
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Producción en Planta Piloto16,000L
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1 2 3 4 5
ProductosPrimera Planta Piloto
16,000 Litros
Especies Actuales
Segunda Planta Piloto
2,000,000 Litros
Colección de Especies
para uso en Biotecnología
Especies Mejoradas
Genéticamente
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Productos
• Colección inicial de microalgas
– Lípidos
– Proteínas
– Carbohidratos
• Aceite crudo de microalgas