Aislamiento de una levadura secretora de lipasas para la producción de la enzima en escala planta piloto de una fermentación por lotes

Resumen

Se evaluó la producción de lipasa de veintinueve levaduras aisladas del filoplano de Hibiscus rosa-sinensis. Los productores más altos de lipasa fueron Pseudozyma hubeiensis HB85A, Debaryomyces occidentalis como HB83 y Cryptococcus sp. HB80. Los lotes de Fermentación de P. hubeiensis HB85A se llevaron a cabo en un biorreactor y la producción de lipasa mejoró 3,2 veces en comparación con cultivos en matraz sumergido. El proceso de producción se redujo significativamente de 48 h (en frascos) a 18 h (en el biorreactor). La mejor actividad hidrolítica se logró con éster de p-nitrofenil C16. La actividad máxima se observó a pH 7, la temperatura óptima fue de 50 C a pH 7 y la enzima era estable a 30 y 40 C. La actividad lipolítica fue estimulada mediante sales de Mg2 +, K + y Ba2 + y AEDT y ligeramente inhibida por sales de Ca2 +. Detergentes no iónicos tales como Triton X-100, Tween 80 y Tween 20 estimularon fuertemente la actividad de la lipasa, mientras que SDS la inhibió. La lipasa fue estable en iso-octano y hexano a 80%.

Introducción

Las lipasas (acilhidrolasa triacilglicerol, EC 3.1.1.3) se han definido como carboxilesterasas que catalizan la hidrólisis de glicéridos de acilo con cadenas de acilo con más de diez átomos de carbono. Bajo ciertas condiciones, también catalizan la reacción inversa, produciendo glicéridos a partir de glicerol y ácidos grasos. El papel fisiológico de las lipasas es hidrolizar los triglicéridos en diglicéridos, monoglicéridos, ácidos grasos y glicerol. Ellos actúan en la interfase entre una fase de sustrato y una fase acuosa, en la que se disuelve la enzima. Las lipasas son también capaces de catalizar la interesterificación, transesterificación y reacciones enantioselectivas en medios no acuosos (Saxena et al., 2003; Schmid y Verger, 1998;. Sharma et al, 2001). Constituyen el grupo más importante de biocatalizadores para aplicaciones biotecnológicas y son enzimas muy importantes tanto desde el punto de vista fisiológico y biotecnológico.

Las enzimas lipolíticas actualmente llaman considerablemente la atención debido a sus características únicas: especificidad de sustrato, regio-especificidad y selectividad quiral. (Castro Ochoa et al, 2005). Debido a estas características, nuevas aplicaciones biotecnológicas se han establecido con éxito utilizando lipasas en la síntesis de biopolímeros y la producción de biodiesel, productos farmacéuticos, agroquímicos enantiopuros, biosensores y compuestos de sabor (Bornscheuer et al., 2002; Castro-Ochoa et al., 2005; Jaeger y Eggert, 2002; Kim et al., 2004; Linko et al., 1998; Sharma et al, 2001). Las Lipasas útiles industrialmente producidas por levaduras se obtienen principalmente de Candida rugosa (CRL) y Candida antarctica (CAL). Las preparaciones comerciales se componen de una mezcla de isoenzimas con diferentes características y preferencias de sustrato (Akoh et al., 2004; Chang et al, 2006;. De Maria et al, 2006;. Ferrer et al, 2001;.. Kose et al, 2002; Qian y Lutz, 2005; Xin et al., 2002). Aunque la mayoría de los estudios de levadura lipasas se ocupan de las especies antes mencionadas, hay algunas levaduras productoras de lipasa emergentes que representan una esperanza para la innovación biotecnológica en esta área (Ciafardini et al, 2006;. Fernández et al, 2006;. Kim y Hou, 2006).

Un enfoque útil para la obtención de nuevos biocatalizadores es el aislamiento de microorganismos a partir de fuentes naturales, seguido por ensayos de cribado funcionales en la búsqueda de la capacidad enzimática deseada y la selección de los mejores productores (Schäfer et al., 2007). Hasta la década de 1980, sólo el 2% de los microorganismos del mundo había sido probado como fuentes de enzimas. Más recientemente, varios miles de muestras microbianas aisladas de suelo se ensayaron para la producción de lipasas, revelando que el 20% eran productores de lipasas, incluyendo hongos y levaduras filamentosos (Cardenas et al., 2001; Schäfer et al., 2007). El objetivo del presente estudio fue la bioprospección de las levaduras productoras de lipasa de un sustrato natural inexplorado con miras a la consecución de una lipasa para aplicaciones industriales. El hábitat filoplano fue elegida para el aislamiento de microorganismos debido a que la cutícula de la hoja se compone principalmente de los componentes lipídicos; Por lo tanto, es un sustrato apropiado para la detección de microorganismos productores de lipasa en la búsqueda de novedades en este ámbito.

Metodología

Selección de las levaduras productoras de lipasa utilizando Tween 20 como el sustrato de crecimiento

Levaduras y levaduras como cepas fueron aisladas de la filoplano de Hibiscus rosa-sinensis (Parque Farroupilha, Porto Alegre, RS, Brasil) mediante hoja de impresión en placas de agar YEPG con la siguiente composición (g / l): extracto de levadura 5,0, peptona 10.0, glucosa 20,0 y 20,0 agar. Después de la incubación a 22-25 C durante 3-5 días, se aislaron colonias representativas de cada tipo morfológico y purificado en un medio de agar YEPG. Las cepas se mantuvieron en medio GYMP (g / l): glucosa 20,0, extracto de levadura 5,0, extracto de malta 20.0, fosfato de sodio monobásico 2,0 y 20,0 agar, cubierto con una capa de aceite mineral estéril, y se mantiene a 4 C. Las levaduras fueron fenotípicamente caracterizadas por pruebas morfológicas y fisiológicas estándar (Yarrow, 1998), y la identificación se realizó según Barnett et al. (2000) y al programa informático YEASTCOMPARE (Ciriello C y Lachance MA, derechos de autor? 1999-2001). La Identificación de la cepa Pseudozyma hubeiensis HB85A fue confirmada por secuenciación de la región D1 / D2 del 26S rDNA, de acuerdo con Kurtzman y Robnett (1998). La Selección de productores de lipasa se realizó en tubos que contienen levadura y 0,5% de Tween 20 (Von Tigerstrom y Stelmaschuk, 1989). Los microorganismos aislados previamente habían sido cultivadas en placas de agar YEPG a 22-25 C por 2 días, y se inocula en agua destilada durante 24 horas con el fin de agotar sus recursos endógenos nutricionales. El crecimiento en los tubos de ensayo de Tween 20 durante un máximo de 7 días indicó la presencia de la actividad enzimática. Las cepas seleccionadas fueron adicionalmente evaluadas con materias primas de bajo costo (aceite de soja o de grasa bovina) para la producción de enzimas.

La inducción de la secreción de lipasa con grasa bovina y / o aceite de soja en cultivos líquidos

El medio basal que contiene glucosa (2,0 g / l), peptona (5,0 g / l), MgSO4 (0,1 g / l) y K2HPO4 (1,0 g / l) se complementó con aceite de soja (20,0 g / l) o grasa bovina (20,0 g / l) para la inducción de la lipasa. El medio se esterilizó durante 30 min a 120 C, excepto para el aceite de soja y la grasa bovina, que se esterilizaron por separado por calor seco (180 C durante 60 min) y asépticamente se agregaron al medio antes de la inoculación.

Para la preparación del inóculo, los cultivos se hicieron crecer a 28 C durante 16 h en matraces Erlenmeyer de 250 ml que contienen 50 ml de caldo de GYMP. Matraces Erlenmeyer que contienen 20 ml de medio basal añadidos a 20,0 g / l de aceite de soja o grasa bovina se inocularon con 2 ml del inóculo de levadura y se incubaron a 28 C durante 48 h en un agitador orbital (200 rpm). Sólo los 10 mejores productores de lipasa con grasa bovina fueron evaluados con aceite de soja. Las células se retiraron por centrifugación a 14.000 rpm durante 10 min, y los sobrenadantes de cultivo se evaluaron para la actividad enzimática.

Fermentaciones por lotes a escala planta piloto

Para la preparación del inóculo, los cultivos se hicieron crecer a 28 C durante 16 h en matraces de 1000 ml Erlenmeyer que contienen 250 ml de caldo de GYMP. Las fermentaciones discontinuas se llevaron a cabo en un fermentador 14 l Nueva Brunswick MF 14 que contiene un eje con palas para la agitación. Como se describió anteriormente, se preparó 10 l de medio basal con 20,0 g / l de aceite de soja. El medio se esterilizó en el fermentador durante 30 minutos a 120 C, y el aceite de soja esterilizado mediante calor seco se añadió asépticamente al medio antes de la inoculación. El reactor se inoculó con 250 ml de inóculo. Las Condiciones de operación estándar fueron: velocidad de agitación 200 rpm, temperatura 28 C, la tasa de flujo de aire 1 vvm y tiempo de fermentación 24 h, sin control de pH. Las muestras (20 ml) se tomaron a intervalos regulares, las células se eliminaron por centrifugación a 14.000 rpm durante 10 min, y los sobrenadantes de cultivo se evaluaron para la actividad enzimática. La fermentación por lotes se repitió para comprobar la reproducibilidad, con cada muestra analizada por triplicado. Los valores reportados en las figuras representan el promedio de las mediciones. La Concentración de biomasa se midió por turbidimetría a 600 nm en un espectrofotómetro visible (Ultrospec 2000).

Métodos analíticos

El ensayo de lipasa se realizó midiendo el aumento en la absorbancia a 410 nm en un espectrofotómetro visible (Ultrospec 2000) causada por la liberación de p-nitrofenol después de la hidrólisis de palmitato de p-nitrofenilo (pNPP) a 37ºC durante 30 min a pH 8,0 , con respecto a un control sin enzima. Para inicializar la reacción, se añadió a 0,9 ml de la solución de sustrato que contiene 3 mg de pNPP disuelto en 1 ml de isopropanol y 9 ml de la siguiente solución 0,1 ml del cultivo sobrenadante libre de células: 50 mM Tris-HCl pH 8,0, más 40 mg de Triton X-100 y 10 mg de goma árabe (Silva et al., 2005). Una unidad de lipasa (U) se definió como la cantidad de enzima que libera 1 lmol p-nitrofenol por minuto, en las condiciones de ensayo descritas anteriormente. La curva de calibración se preparó usando p-nitrofenol como estándar. Los valores se expresan como la media ± la desviación estándar por triplicado para cada punto. La actividad de proteasa se determinó midiendo el aumento en la absorbancia a 400 nm en un espectrofotómetro visible (Ultrospec 2000) causada por la hidrólisis de la azocaseína a 50ºC durante 1 h. Las alícuotas de 0,1 ml de la solución de azocaseína (20 g / l) y 0,2 ml de tampón de fosfato de sodio mM 50 (pH 7,9) se mezclaron con 0,1 ml de los sobrenadantes de cultivo libre de células (Silva et al., 2005). Después de la incubación durante 15 min a 50 C, se añadieron 0,8 ml de ácido tricloroacético al 20% con el fin de detener la reacción. Después de la centrifugación (5 min / 10.000 rpm), la absorbancia del sobrenadante se leyó a 400 nm en un espectrofotómetro visible. Una unidad de proteasa (U) se define como la variación de la absorbancia en las condiciones de ensayo descritas anteriormente. Los valores se expresan como la media ± la desviación estándar por triplicado para cada punto. La

determinación de proteínas se realizó según Bradford (1976) utilizando albúmina de suero bovino como estándar. Los valores se expresan como la media ± la desviación estándar por triplicado para cada punto.

Caracterización de la lipasa

La caracterización de Lipasa se realizó utilizando como fuente de enzima los sobrenadantes de cultivo a partir del cultivo del biorreactor. Las Condiciones para la evaluación de la actividad de la lipasa fueron los mismos como se describió anteriormente, a menos que se indique lo contrario. El sustrato palmitato de p-nitrofenilo (pNPP) se utilizó para la mayoría de determinaciones de la actividad lipasa en este trabajo. Los Ensayos de actividad se realizaron también con otros ésteres de p-nitrofenol (PNP), a saber, acetato de p-nitrofenilo (ya pirimifos metil), butirato de p-nitrofenilo (PNPB) y miristato de p-nitrofenilo (PNPM).

Una unidad de lipasa (U) se definió como la cantidad de enzima que libera 1 lmol pnitrophenol por min a 37ºC y pH 8,0. El pH óptimo se determinó usando pNPP como sustrato en soluciones tampón de valores de pH que oscila desde 3,0 hasta 9,0 (50 mM de citrato-fosfato de pH 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 y 7,0; Tris-HCl 50 mM pH 8,0 y 9,0). La temperatura óptima para la actividad de la lipasa se determinó usando pNPP como sustrato a diferentes temperaturas (30-70 C) con tampón de citrato-fosfato 50 mM a pH 7,0. La estabilidad de la temperatura de la lipasa se determinó mediante la incubación de 0,1 ml de los sobrenadantes de cultivo de 20, 40 min y 1 h a los 30, 40, 50 y 60 C en ausencia de un sustrato. La actividad residual se midió mediante el ensayo espectrofotométrico a 50 C y pH 7,0. Los valores se expresan como la media ± la desviación estándar por triplicado para cada punto. Para probar el efecto de los detergentes y otros productos químicos sobre la actividad de la lipasa, los sobrenadantes de cultivo (0,1 ml) se incubaron durante 1 h a 40 C en presencia de 1% (v / v) de los detergentes (Triton X-100, Tween 80, Tween 20 y SDS) y 20 mM de BaCl2, CaCl2, MgCl2, KCl y EDTA. La actividad residual se midió mediante el ensayo espectrofotométrico a 50 C y pH 7,0. Los valores se expresan como la media ± la desviación estándar por triplicado para cada punto. Para probar la estabilidad de la lipasa en presencia de disolventes orgánicos, los sobrenadantes de cultivo (0,1 ml) se incubaron en 0,1 ml de acetona, metanol, etanol, 2-propanol, n-butanol, iso-octano y hexano a diferentes concentraciones (20%, 50% y 80%) durante 1 hora a 40 C. para el control, 0,1 ml de sobrenadante de cultivo se incubó con agua destilada durante 1 hora a 40 C. la actividad residual se midió mediante el ensayo espectrofotométrico usando 0,1 ml de la mezcla de incubación a 50 C y pH 7,0. Los valores se expresan como la media ± la desviación estándar por triplicado para cada punto.

Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron por triplicado y el análisis estadístico se realizó mediante el programa SPSS 13.0. El análisis de varianza se llevó a cabo utilizando el procedimiento ANOVA por el procedimiento de comparación múltiple de Tukey para determinar las diferencias significativas entre las medias.

Resultados y discusión

Un total de 84 de la levadura y levadura como colonias aisladas del filoplano de H. rosa-sinensis fueron elegidos y purificados al azar. Las cepas identificadas con el nombre de la especie y el sufijo '' -como "significan que difieren ligeramente de la descripción estándar de la especie. Algunos

linajes se identificaron sólo en el nivel de género. La Proyección sobre Tween 20 de cultivo líquido nos permitió seleccionar 29 aislamientos que tuvieron un buen crecimiento en este sustrato (Tabla 1). Estos 29 aislamientos fueron adicionamente seleccionados para la producción de lipasa con grasa bovina; y, entre ellos, los diez mejores secretores de lipasa se rastrearon adicionalmente utilizando aceite de soja como fuente de carbono (Tabla 2). Estos sustratos fueron elegidos porque son materias primas de bajo costo para la producción de enzimas. Los mejores productores de lipasa en grasa y aceite de soja bovina fueron P. HB85A cepa hubeiensis (610 U / l en grasa bovina y 386 U / l en el aceite de soja), cepa Debaryomyces occidentalis similar HB83 (306 U / l en grasa bovina y 352 U / l en el aceite de soja) y Cryptococcus sp. La cepa HB80 (293 U / l en grasa bovina y 350 U / l en el aceite de soja). S. cepa salmonicolor como HB75, Cryptococcus sp. 2 HB87 y el fermentador de levadura negro HB49 no presentó actividad lipolítica en el aceite de soja, aunque su actividad en la grasa bovina era bueno.

Las lipasas son en su mayoría enzimas inducibles y sus inductores, tales como aceites, son necesarios para la producción de enzimas (Sharma et al., 2001). Para la fermentación por lotes a escala planta piloto, el aceite de soja fue elegido como la fuente de carbono. La levadura seleccionada para la fermentación a escala de planta piloto fue la cepa P. hubeiensis HB85A porque tenía la mejor actividad de la lipasa tanto en la grasa bovina como el aceite de soja. la Identificación de la cepa P. hubeiensis HB85A fue confirmada por secuenciación de la región D1 / D2 del 26S rDNA (número de acceso de GenBank DQ123912). Se observó crecimiento de la levadura durante todos los períodos de fermentación con un pH constante (Fig. 1A). Hubo un pico en la actividad de la lipasa (1.232 U / l) a 18 h de tiempo de fermentación, seguido de una breve descenso que se mantuvo constante hasta 22 h, mientras que el pico en la actividad específica estaba en 16-18 h, con 4.8 102 U de lipasa / lg de proteína total (Fig. 1B). Esto corresponde a la fase de crecimiento exponencial media. Por lo tanto, como varios otros microorganismos, como C. rugosa (Valero et al., 1991) y Aspergillus terreus (Gulati et al., 2000), la producción de lipasa por la cepa de P. hubeiensis HB85A era un fenómeno de crecimiento asociada. En contraste con esto, la producción de lipasa por las bacterias Pseudomonas aeruginosa (CHARTRAIN et al., 1993) no fue un crecimiento asociado, ya que la lipasa se indujo sólo en la fase exponencial tardía y alcanzó un pico en la fase estacionaria tardía.

Comparando el proceso de fermentación por lotes en el biorreactor 14 l (aceite de soja, 28 C y la agitación tasa de 200 rpm) a los estudios anteriores en matraces Erlenmeyer en las mismas condiciones, la producción de lipasa se mejoró 386 a 1.232 U / l en el reactor y, más importante, la duración del proceso de producción se redujo significativamente 48 a 18 h. También se observó Este comportamiento durante la producción de lipasa por A. terreus en un 10 l de fermentación por lotes (Gulati et al., 2000) con una actividad de la lipasa 10% mayor en el reactor que en matraces de agitación, y una disminución significativa en la duración de la fermentación, 96-54 h. Gulati et al. (2000) sugirieron que tanto el aumento de la producción de lipasa, así como la reducción en el tiempo de fermentación se debieron a mayores tasas de transferencia de oxígeno causada por el aumento de la agitación. Por lo tanto, la mejora en la tasa de producción de lipasa por P. HB85A hubeiensis en el reactor fue probablemente debido a la cantidad de oxígeno inyectado continuamente a través del sistema, mientras que sólo el oxígeno difunde en el matraz Erlenmeyer. Este argumento está de acuerdo con las investigaciones realizadas por Domínguez et al. (2005) y Li et al. (2005), quien informó que la producción de la enzima lipolítica por Thermus

thermophilus HB27 y Acinetobacter radioresistens sólo se produjo cuando el aire se suministró continuamente al biorreactor. Otras consecuencias del sistema de agitación que podría explicar el aumento en la producción de lipasa fueron el mayor contacto de los componentes del medio con microorganismos y la mejor dispersión de aceite en el medio. Estos parámetros hacen posible una producción de mayor y más rápido de lipasa.

Es posible que otras proteínas pueden influir en la actividad de la lipasa durante la fermentación, especialmente proteasas. Los lotes se evaluaron también por el contenido de proteasa en el medio (Fig. 1B). Las proteasas aparecieron en el caldo después de 19 h de fermentación (2,33 U / ml h) y su concentración se mantuvo constante hasta las 21 h. A las 22 y 23 h de fermentación, hubo una disminución en la actividad de la proteasa (1,8 y 1,2 U / ml h, respectivamente). Como la actividad de la lipasa se redujo en 19 h, es posible que la proteasa fue uno de los factores responsables de la reducción de la actividad de la lipasa durante la fermentación. También se observó una reducción en la actividad de la lipasa, debido probablemente a la actividad de la proteasa en la producción de lipasa de C. rugosa en 2,0 l de fermentación por lotes (Puthli et al., 2006). La enzima producida se estudió con ésteres de p-nitrofenilo de diferentes longitudes de cadena alquilo (Tabla 3). La mayor actividad hidrolítica se obtuvo con éster de p-nitrofenil C16, lo que indica una preferencia clara de lipasa para cadenas largas de alquilo. Trabajos recientes han sugerido el uso de sustratos de cadena larga sintéticas, tales como pNPP para caracterizar la actividad de '' verdaderas " lipasas (Lima et al., 2004). Bajo esta definición, el extracto crudo de P. hubeiensis (HB85A cepa) podría decirse que contienen lipasas '' verdaderas "ya que esta lipasa mostró una preferencia notable por pNPP (C16). Como pNPP fue el mejor sustrato, fue elegido para todas las otras pruebas destinadas a la caracterización de la enzima.

La lipasa de P. hubeiensis (cepa HB85A) mostró una alta actividad en un intervalo de pH de 3,0-7,0 (Fig. 2A). La actividad máxima se observó a pH 7,0 (60 U / ml), decayendo rápidamente a valores de pH por encima de 7,0, permaneciendo aproximadamente 3,8% de la actividad residual a pH 8,0 (2,3 U / ml), y a pH 9,0 no se observó actividad de la lipasa. Por lo tanto, pH 7,0 se usó en todas las otras pruebas destinadas a la caracterización de la enzima. Las Determinaciones de actividad más allá de pH 9,0 no se han realizado a causa de las dificultades en la estimación de la tasa causadas por la hidrólisis espontánea de pNPP a valores de pH por encima de 9,0. La mayoría de las lipasas en la literatura tienen una actividad óptima a valores de pH neutros o ligeramente básicos (Aryee et al., 2007;. Castro-Ochoa et al., 2005; Lima et al., 2004; Segura et al, 2006). La lipasa de P. hubeiensis (cepa HB85A) presentó una buena actividad en pH neutro (pH 7,0) y también en pH ácido (pH 3,0 y 4,0). Preferencia por condiciones ácidas también se destacó por la lipasa de Kurtzmanomyces sp. (Kakugawa et al., 2002). Una lipasa ácida puede abrir una nueva gama de aplicaciones a desarrollar el uso de esta enzima como catalizador. La actividad de la lipasa aumentó con la temperatura de 30 ° C hasta 50 ° C. La mayor actividad se observó a 50 C (45,3 U / ml) y a los 60 y 70 C hubo una disminución en la actividad de lipasa (38,7 actividad residual y 10,6 actividad residual, respectivamente) (Fig. 2B). La alta actividad obtenida a 50 C para la lipasa de P. hubeiensis HB85A es también similar a las lipasas a partir de otros microorganismos, tales como P. aurantiogriseum (Lima et al., 2004) y termoleovorans Bacillus (Castro-Ochoa et al., 2005). Como la mayor actividad de la lipasa P. hubeiensis estaba en 50? C, se utilizó esta temperatura en los ensayos espectrofotométricos lipolíticas de este experimento en adelante. Los resultados observados para la lipasa de P. hubeiensis HB85A sugieren que esta enzima puede utilizarse en

aplicaciones con sustancias lábiles y compuestos de bajo punto de ebullición a una temperatura baja.

La estabilidad térmica de la lipasa de P. hubeiensis HB85A se ensayó después de la incubación a diferentes temperaturas durante 20, 40 y 60 min a pH 7,0 (Fig. 2C). Aunque no hubo una pérdida significativa en la actividad residual durante la incubación para un máximo de 60 min a 30 y 40? C, después de incubación a 50? C durante 20 min había sólo 15% de actividad residual, y la enzima pierde su actividad completamente después de la incubación a 60? C durante 20 min, lo que demuestra que esta enzima no es particularmente estable a altas temperaturas (Fig. 2C). En vista de ello, si bien la actividad óptima de la lipasa de P. hubeiensis HB85A fue a los 50? C, sugerimos la mejor temperatura para ser considerado para la utilización de esta lipasa cruda en los procesos industriales es de 40? C. La Baja estabilidad en altas temperaturas también se observó para las lipasas de P. aurantiogriseum, que presentan actividad residual 32% después de 30 min de incubación a 50? C (Lima et al., 2004). La lipasa de Kurtzmanomyces sp., Por el contrario, presenta buena estabilidad a 70? C (Kakugawa et al., 2002). Los tensioactivos se utilizan con frecuencia en la preparación de la emulsión en ensayos lipolíticas y también en la purificación y caracterización de las lipasas. Ellos pueden potencialmente causar la desnaturalización de la enzima mediante la interrupción de su estructura terciaria. Por otro lado, pueden prevenir la agregación de la enzima y, en consecuencia, su adición puede aumentar la actividad de la lipasa, por lo tanto Por lo tanto, la elección del agente tensioactivo, ya sea en la preparación de la emulsión o en las etapas de purificación es crucial. La lipasa de P. hubeiensis HB85A se incubó durante 1 h a 40? C, su temperatura alta más estable, en presencia de 1% (v / v) de Triton X-100, Tween 80, Tween 20 y SDS. Los detergentes no iónicos Triton X-100, Tween 80 y Tween 20 estimularon fuertemente la actividad de la lipasa (185,5%, 150,8% y 183,2% de actividad residual, respectivamente) (Tabla 4). Sin embargo, la actividad de la lipasa se inhibió completamente en presencia de SDS al 1%. Es posible sugerir que, además de prevenir la agregación de la lipasa, los detergentes no iónicos, tales como sustancias tensioactivas, estabilizan el área interfacial facilitando el acceso del sustrato a la enzima, ya que la reacción catalítica de lipasas tiene lugar en una interfase aceite-agua (Karadzic et al., 2006). La respuesta a la presencia de detergentes por las lipasas es variable en cierta medida. La actividad de la lipasa de B. thermoleovorans CCR11 aumentó ligeramente con la adición de 1% de Triton X-100 después de 30 min a 60? C, pero la lipasa se inhibió completamente en presencia de SDS al 1%, Tween 80 y Tween 20 (Castro-Ochoa et al., 2005). Un efecto inhibitorio sobre la actividad de la lipasa se detectó en P. aurantiogriseum después de la adición de 0,01% de Triton X-100, mientras la enzima fue estable en 0,01% de Tween 80% y el 0,01% de SDS después de ser incubadas durante 1 hora a 28? C (Lima et al., 2004).

El efecto de diferentes iones metálicos sobre la actividad de la lipasa se muestra en la Tabla 4. Un ligero aumento en la actividad de la lipasa, debido a 20 mM de sales de Mg2 +, K + y Ba2 + (114%, 115% y 114,9% de actividad residual, respectivamente) fue observado después de 1 h de incubación a 40? C. A diferencia de nuestros resultados, la lipasa de Kurtzmanomyces sp. no se vio afectada por 1 mM de sales de Ba2 +, Mg2 + y Ca2 + después de 1 h de incubación a 37? C (Kakugawa et al., 2002). Por otra parte, una mejora en la actividad de la lipasa de P. aurantiogriseum por la presencia de 1 mM de sales de Mg2 + (actividad residual 113%) y Se observó una reducción en la actividad lipolítica por la presencia de 1 mM de sales de Ba2 + (actividad residual 70%) (Lima et al., 2004). En general, concentraciones de sal superiores a 1 mM

inhiben la actividad de la enzima, como se ha observado para la lipasa de las vísceras de mújol, que presentó una reducción de la actividad lipasa por la presencia de 10 mM de sales de Mg2 + y Ca2 + en comparación con 1 mM de las mismas sales (Aryee et al., 2007).

Además, Con el fin de caracterizar la lipasa, se observó el efecto de EDTA, un agente quelante de metal. Esto provocó un aumento de la actividad de la lipasa (actividad residual 123,4%), lo que sugiere que la lipasa de P. hubeiensis no es un metalloprotein (Tabla 4). El efecto potenciador de EDTA era bastante diferente de la observada con la lipasa de Y. lipolytica, que no se ve afectado por este reactivo (Yu et al., 2007). Podemos explicar tentativamente este efecto potenciador en asociación con el efecto de las sales (Tabla 4). La sal de Ca2 + mostraron un ligero efecto inhibidor sobre el P. hubeiensis (cepa HB85A) lipasa, lo cual es coherente con la activación observada con EDTA, ya que EDTA puede unir iones de Ca en la reacción, explicando la activación obtenido con este quelante. Aunque la mayoría de las lipasas están fuertemente activados por la sal de Ca2 + (Castro-Ochoa et al, 2005;.. Yu et al, 2007), posiblemente debido a la estabilización de la estructura terciaria de la enzima, otros son no influenciado por calcio (Lima et al,. 2004).

Desde un punto de vista biotecnológico, hay muchas ventajas en el uso de lipasas para las conversiones enzimáticas en disolventes orgánicos, como la mejor solubilidad de los sustratos en disolventes orgánicos, la capacidad de actuar en un medio no acuoso, la especificidad en la reacción de síntesis, y suministro de un producto con alta pureza y menos problemas ambientales. Sin embargo, generalmente, las enzimas pierden su actividad a concentraciones de disolventes orgánicos por encima del 10-20% (Karadzic et al., 2006). Se cree que los disolventes orgánicos miscibles en agua toman agua de las enzimas, lo que lleva al despliegue de la molécula y, en consecuencia, a la ocurrencia de desnaturalización a una tasa mucho más rápida que en un sistema acuoso puro (. Lima et al, 2004; Yu et al., 2007). Por a esta razón, los efectos de diversos disolventes orgánicos en las concentraciones de 20%, 50% y 80% (v / v) fueron examinados (Tabla 5). La alta temperatura más estable (40? C) fue elegida para el tratamiento del sobrenadante con los diferentes disolventes. Se observó un grado significativo de la estabilización de la lipasa en etanol y 2-propanol a una concentración de 20%. (40% y 43% de actividad residual respectivamente). Las concentraciones más altas de estos disolventes (50% y 80%) causaron una pérdida inmediata de la actividad lipolítica, probablemente debido a que promueven la rápida desnaturalización de las proteínas. Sin embargo, la lipasa de P. hubeiensis (cepa HB85A) era estable en presencia de iso-octano y hexano a la concentración de 80% (104,86% y 103,23% de actividad residual, respectivamente) ligeramente estable a la concentración de 50% de metanol, n-butanol y acetona (8,7%, 20,5% y 11,3%, respectivamente). Se detectó una actividad de lipasa residual (12,7%) cuando la solución de enzima se incubó en n-butanol a una concentración de 80%. De hecho, las lipasas son diversas en su sensibilidad a los disolventes orgánicos miscibles. A diferencia de P. hubeiensis HB85A, la lipasa de Kurtzmanomyces presentó una estabilidad significativa en acetona, etanol y 2-propanol a las concentraciones de 20%, 40%, 60% y 80% después de la exposición durante 1 h a 30? C (Kakugawa et al ., 2002). La lipasa de B. thermoleovorans también mostró una alta estabilidad en presencia de disolventes orgánicos miscibles con agua, ya que ha retenido casi el 100% de actividad después de la exposición durante 1 h a 30? C en 70% de metanol, etanol 70%, 70% de 2-propanol y 70% de acetona (Castro-Ochoa et al., 2005). La lipasa de P. aurantiogriseum, por otra parte, perdio su actividad lipolítica en

presencia de metanol, etanol y acetona y tenía un poco de actividad residual en la presencia de 2 propanol (1,9%) después de 1 h a 28? C (Lima et al., 2004).

Conclusiones

La fermentación por lotes a escala de planta piloto para la producción de lipasa por P. hubeiensis (cepa HB85A) en un reactor de 14 L mostró una tasa de buena relación coste / beneficio para la consecución de la enzima, que denota que la producción de lipasa a escala industrial puede suceder de una manera económicamente atractiva. La lipasa se caracterizó, con el objetivo de nuevas aplicaciones industriales. La buena estabilidad de la enzima en disolventes orgánicos, así como en pHs ácidos, y su actividad óptima a 40? C hacen de la lipasa de P. hubeiensis (HB85A cepa) un buen candidato para potenciales aplicaciones principalmente en biocatálisis no acuoso, tal como la producción de biopolímeros, biodiesel, productos farmacéuticos, productos agroquímicos y enantiopuros compuestos de sabor.