IMPACTO DE LAS FUENTES DE CARBONO Y LAS CONDICIONES VARIABLES DE NITROGENO EN LA

BIOSINTESIS BACTERIANA DE POLIHIDROXIALCANOATOS A PARTIR DE AGUAS DEL RIO PASTO

Burbano Paola1, Mera Felipe1, Riascos Edison1, Rosales Esteban1, Villaquiran Zulma1., Revelo Romo Dolly2.

1. Estudiantes facultad de Ingeniería Agroindustrial – Universidad de Nariño2. Docente guía en este trabajo, profesora del departamento de Biología de la Universidad de Nariño

RESUMEN

Palabras Clave:

INTRODUCCIÓN

El uso de polímeros convencionales derivados del petróleo origina enormes problemas de contaminación ambiental, debido a que no son materiales biodegradables, perduran en los rellenos sanitarios como contaminantes durante largos períodos de tiempo, bloqueando la circulación de gases y líquidos e impidiendo la estabilización de la materia orgánica. Dado que cualquier sustancia de origen biológico puede ser degradada por microorganismos presentes en el ambiente, el reemplazo de dichos materiales por polímeros biodegradables podría resolver los problemas de contaminación mencionados.

Entre estos biopolímeros, la familia de Polihidroxialcanoatos (PHAs) son los únicos completamente sintetizados de forma biológica, presentan altas tasas de biodegradabilidad, son biocompatibles y tienen propiedades físico-mecánicas comparables a las de los plásticos convencionales producidos a partir de petroquímicos (Chen, 2010), presentándose como los candidatos ideales para reemplazar los polímeros sintéticos (Barbosa at al, 2005).

Los PHAs son polímeros de ácidos R-hidroxialcanóicos, son termoplásticos elastoméricos

(Sudesh et al., 2000), que son sintetizados por un gran número de bacterias Gram positivas y Gram negativas como material de almacenamiento de energía y carbono intracelular. En muchos casos son acumulados bajo condiciones de estrés como limitación de nitrógeno, fósforo u oxígeno con exceso de fuente de carbono.

Existen como inclusiones que son típicamente de 0,2 a 0,5 µm de diámetro localizadas en el citoplasma y pueden visualizarse con un microscopio de contraste de fases debido a su alta refractividad o pueden ser teñidas con negro de sudan (Khanna & Srivastava, 2005). Estructuralmente estos polímeros son clasificados de acuerdo al número de átomos de carbono en un rango de 3 a 14 y el tipo de unidades monoméricas, produciendo homopolímeros o heteropolímeros (Keshavarz & Roy, 2010). PHAs con 3-5 átomos de carbono se considera un PHA de cadena corta (PHASCL) y con 6 a 14 átomos de carbono son llamados PHAs de cadena media (PHAMCL) (Keshavarz & Roy, 2010; Suriyamongkol et al., 2007; Ojumu et al., 2004).

Un número apreciable de PHAs con más de 150 monómeros ha sido identificado con masas moleculares en el rango de 50.000 a 1’000.000 Da., por eso los PHAs y sus tecnologías asociadas forman una cadena de valor industrial desde procesos de

fermentación, materiales, alimentos y energía hasta los campos de la medicina debido a que estos son biodegradables e inmunológicamente inertes (Keshavarz & Roy, 2010).

La elección del microorganismo para la producción industrial del biopolímero varía dependiendo de factores como la habilidad celular para utilizar fuentes de carbono no costosas, la velocidad de crecimiento, la velocidad de síntesis del biopolímero, la calidad y cantidad de PHA y el costo de los procesos de recuperación (Lee & Choi, 2001). A nivel industrial se emplean cepas como la Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas oleovorans, Paracccus denitrificans, Protomonas extorquens y E. coli recombinante (Lee, 1996).

MATERIALES Y MÉTODOS

Las muestras fueron recolectadas de aguas contaminadas del rio Pasto, en el sector del puente del polvorín (Barrio Pandiaco) se tomó una muestra inicial de 500 ml en una botella de agua higienizada, la cual se llevó de inmediato al laboratorio; se procedió a tomar 1 ml de la muestra adicionándola a 10 ml de solución salina. Luego por el método de dilución seriada se realiza la disolución en tubos de ensayo con la misma cantidad de solución salina, llegando a una dilución final de 10-6.

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

La preparación del medio de cultivo se realizó en dos fases, en la primera de ellas se empleó un medio de cultivo con glucosa como fuente de carbono y (NH) 2SO4 como fuente de nitrógeno, al medio de cultivo con fuente de carbono y nitrógeno se lo denominó Medio Mineral (MM) y al medio de cultivo con fuente de carbono pero sin fuente de nitrógeno se le denomino (MM-N); para evaluar el crecimiento de la bacteria en condiciones desbalanceadas se empleó el mismo medio exceptuando la fuente de nitrógeno. Para la segunda fase se empleó el medio empleado en la primera fase variando las fuentes de carbono (Glucosa, Lactosa, Glicerol, Ácido Cítrico), además se omitió la fuente de nitrógeno. La composición detallada del medio fue tomada de Shahid y colaboradores (2013), y se presenta a continuación:

Tabla 1. Composición de macronutrientes en un medio de cultivo (MM) para la obtención de PHA’s

COMPUESTO CANTIDAD UNIDADESKH2PO4 3.6 g/L

Na2HPO412H2O 14.4 g/LMgSO47H2O 0.5 g/L

NaCl 0.015 g/LCaCl22H2O 0.05 g/LFeSO47H2O 0.009 g/L(NH) 2SO4 3 g/L

Fuente de Carbono 5 g/L

Para los elementos traza se tomó 1 g/L de la solución, la composición es la siguiente:

Tabla 2. Composición de micronutrientes en un medio de cultivo (MM) para la obtención de PHA’s

COMPUESTO CANTIDAD UNIDADESMnSO4H2O 1 g/LCoCl26H2O 0.5 g/LCuCl22H2O 0.2 g/L

ZnCl2 0.1 g/LNa2MoO42H2O 40 mg/L

H3BO3 0.5 g/LNiCl2 50 mg/L

El pH se ajustó a 7.4.

SELECCIÓN DE CULTIVO CON MEJOR CRECIMIENTO

Para la determinación del mejor crecimiento, se tomó 8 aislamientos de diferentes cultivos los cuales se conservaron a temperaturas de refrigeración, teniendo en cuentas las reglas de asepsia se tomó una colonia de cada aislamiento (71, 71*, 72, 74, 74*, 75. 75*,76) en donde el símbolo * indica que para esos aislamientos existía una réplica, se cultivaron los aislamientos en MM (medio mineral) adaptado a este trabajo de acuerdo a lo reportado anteriormente por Shahid y colaboradores (2013). La siembra se llevó a cabo por el método de siembra por agotamiento en cajas Petri, cada cultivo se dejó a temperatura ambiente durante 48 horas sin agitación, paso continuo se seleccionaron los 4 cultivos que evidenciaron un mejor crecimiento, para comprobar la pureza de los cultivos se realizó tinción de Gram tomando una colonia de los cultivos anteriores. La

tinción revelo que los nuevos cultivos se encontraban en un estado puro y que poseían forma de bacilos.

Teniendo en cuenta los cultivos seleccionados, se cultivaron colonias en MM-N (Medio mineral sin nitrógeno) en las mismas condiciones trabajadas anteriormente. Después de 48 horas se determinó que el mejor crecimiento evidenciado en la adaptación al medio desbalanceado se presentó para el cultivo del aislamiento 75, manteniéndose el aislamiento a refrigeración a temperatura de 4ºC.

PREPARACIÓN DEL INOCULO Y EL REACTOR

Tomando la preparación del medio desbalanceado se cambió la fuente de carbono original y se preparó 4 medios de cultivo con diferentes fuentes de carbono (glucosa, lactosa, glicerol, ácido cítrico). Se tomó un tubo ensayo de 10 ml y se añadió 9 ml del medio preparado con cada fuente de carbono, cultivando una colonia del medio seleccionado en cada uno, dejando durante 5 días a temperatura ambiente, sin agitación.

Transcurrido el tiempo de crecimiento se preparó los reactores donde se añadió el inoculo a 90 ml MM-N en un Erlenmeyer de 250 ml, sin agitación, sin aireación, empleando un sistema de cultivo batch.

OBTENCIÓN DE BIOMASA (MÉTODO GRAVIMÉTRICO)

Para la determinación del cambio de biomasa, se tomó 1 ml de muestra de cada reactor y de depósito en un tubo eppendorf, tomando el peso inicial, a las 48 horas se tomó la muestra del peso final. Para conocer el cambio de biomasa cuantitativo se empleó el método gravimétrico donde se sometió cada muestra a un proceso de separación mecánica (centrifugación) en una centrifuga Marca de centrifuga a 8000 rpm durante 15 min, se descartó el sobrenadante y se secó hasta peso constante en una mufla a 60ºC durante 2 horas, al final se pesó cada eppendorf en una balanza analítica marca Denver Instrument. APX-200 Max

OBTENCIÓN DEL PHA

Para conocer la cantidad de polihidroxialcanoato producida se realizó un proceso de separación mediante centrifugación con una posterior

extracción, en donde se tomó una muestra 20 ml de cada reactor en un falcón de 50 ml, se realizó la separación del material en una centrifuga *marca a 7800 rpm durante 20 min, descartando el sobrenadante de cada falcón, posteriormente se añadió 2ml de NaClO al 5% y EDTA 10 mM , se colocó todas las muestras a 60ºC durante 30 minutos en baño maría y se centrifugo a 7800 rpm durante 5 minutos, descartando el sobrenadante, nuevamente se añadió 2 ml de agua destilada y se llevó la muestra centrifugación en las mismas condiciones, se descartó el sobrenadante y añadió 2 ml de acetona, se procedió a centrifugar en las mismas condiciones por último se descartó el sobrenadante y se pesó el falcón con en una balanza analítica Denver Instrument. APX-200 Max.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tabla 1. Datos para la determinación de Biomasa por el método gravimétrico

FUENTE DE

CARBONO

PESO INICIAL (g)

PESO FINAL (g)

DIFERENCIA (g)

Lactosa 0,919 1,024 0,105Glucosa 0,8975 1,0951 0,1976

Ác. Cítrico 0,945 1,107 0,162Glicerol 1,0204 1,0997 0,0793

Después de realizados los procedimientos de extracción mencionados anteriormente se encontró que la única fuente de carbono sobre la cual se evidencio precipitado que podría atribuirse a la formación de PHA’s es la Glucosa, para la cual se determinó la producción a partir de una muestra de 20 ml del medio de cultivo (reactor).

Tabla 2. Datos para la determinación de la producción de PHA’s en Glucosa como fuente de

Carbono

GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONOPESO

INICIAL (g)

PESO FINAL (g)

DIFERENCIA (g)

PRODUCCIÓN PHA (g/L)

13,321 13,3526 0,0316 1,58

REFERENCIAS

Barbosa M, Espinosa A, Malagón D, Moreno N. (2005). Producción de poli-B BB BB-hidroxibutirato (PHB) por Ralstonia eutropha ATCC 17697. Universitas Scientiarum, 45-54.

Chen G. (2010). Plastics from Bacteria Natural Functions and Applications. Berlin: Springer.

Keshavarz, T, Roy, I. (2010). Polyhydroxyalkanoates: bioplastics with a green agenda. Current Opinion in Microbiology. 21–326.

Khanna S, Srivastava A. (2005). Recent advances in microbial polyhidroxyalkanoates. Process Biochemistry. 607-619.

Lee S. (1996). Plastic bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria. Trends Biotechnol, 14: 431-438.

Lee S, Choi J. (2001). Production of microbial polyester by fermentation of recombinant microorganisms. T. Scheper. Advances in biochemical engineering/biotechnology. 71: 183-207.

Ojumu T, Yu J, Solomon B. (2004). Minireview Production of Polyhydroxyalkanoates, a bacterial biodegradable polymer. African Journal of Biotechnology. 18- 24.

Shahid S, Mosrati R, Dedauphin J, Amiel C, Fontaine P, Gillard J, Corroler D. 2013. Impact of carbon source and variable nitrogen conditions on bacterial biosynthesis of polyhydroxyalkanoates: Evidence of an atypical metabolism in Bacillus megaterium DSM 509. Journal of Bioscience and Bioengineering. 16: 302- 308.

Sudesh K, Abe H, Doi Y. (2000). Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters. Progress in Polymer Science. 1503- 1555.

Suriyamongkol P, Weselake R, Narine S, Moloney M. Shah, S. (2007). Biotechnological approaches for the production of polyhydroxyalkanoates in

microorganisms and plants — A review. Biotechnology Advances. 148-175.