IMPACTO DE LAS FUENTES DE CARBONO Y LAS

CONDICIONES VARIABLES DE NITROGENO EN LA

BIOSINTESIS BACTERIANA DE POLIHIDROXIALCANOATOS

A PARTIR DE AGUAS DEL RIO PASTO

Burbano Paola1, Mera Felipe1, Riascos Edison1, Rosales Esteban1, Villaquiran Zulma1., Revelo Romo Dolly2.

1. Estudiantes facultad de Ingeniería Agroindustrial – Universidad de Nariño

2. Docente guía en este trabajo, profesora del departamento de Biología de la Universidad de Nariño

RESUMEN

Palabras Clave:

INTRODUCCIÓN

El uso de polímeros convencionales derivados del

petróleo origina enormes problemas de

contaminación ambiental, debido a que no son

materiales biodegradables, perduran en los rellenos

sanitarios como contaminantes durante largos

períodos de tiempo, bloqueando la circulación de

gases y líquidos e impidiendo la estabilización de la

materia orgánica. Dado que cualquier sustancia de

origen biológico puede ser degradada por

microorganismos presentes en el ambiente, el

reemplazo de dichos materiales por polímeros

biodegradables podría resolver los problemas de

contaminación mencionados.

Entre estos biopolímeros, la familia de

Polihidroxialcanoatos (PHAs) son los únicos

completamente sintetizados de forma biológica,

presentan altas tasas de biodegradabilidad, son

biocompatibles y tienen propiedades físico-

mecánicas comparables a las de los plásticos

convencionales producidos a partir de petroquímicos

(Chen, 2010), presentándose como los candidatos

ideales para reemplazar los polímeros sintéticos

(Barbosa at al, 2005).

Los PHAs son polímeros de ácidos R-

hidroxialcanóicos, son termoplásticos elastoméricos

(Sudesh et al., 2000), que son sintetizados por un gran

número de bacterias Gram positivas y Gram negativas

como material de almacenamiento de energía y

carbono intracelular. En muchos casos son

acumulados bajo condiciones de estrés como

limitación de nitrógeno, fósforo u oxígeno con exceso

de fuente de carbono.

Existen como inclusiones que son típicamente de 0,2

a 0,5 µm de diámetro localizadas en el citoplasma y

pueden visualizarse con un microscopio de contraste

de fases debido a su alta refractividad o pueden ser

teñidas con negro de sudan (Khanna & Srivastava,

2005). Estructuralmente estos polímeros son

clasificados de acuerdo al número de átomos de

carbono en un rango de 3 a 14 y el tipo de unidades

monoméricas, produciendo homopolímeros o

heteropolímeros (Keshavarz & Roy, 2010). PHAs con

3-5 átomos de carbono se considera un PHA de

cadena corta (PHASCL) y con 6 a 14 átomos de

carbono son llamados PHAs de cadena media

(PHAMCL) (Keshavarz & Roy, 2010;

Suriyamongkol et al., 2007; Ojumu et al., 2004).

Un número apreciable de PHAs con más de 150

monómeros ha sido identificado con masas

moleculares en el rango de 50.000 a 1’000.000 Da.,

por eso los PHAs y sus tecnologías asociadas forman

una cadena de valor industrial desde procesos de

fermentación, materiales, alimentos y energía hasta

los campos de la medicina debido a que estos son

biodegradables e inmunológicamente inertes

(Keshavarz & Roy, 2010).

La elección del microorganismo para la producción

industrial del biopolímero varía dependiendo de

factores como la habilidad celular para utilizar fuentes

de carbono no costosas, la velocidad de crecimiento,

la velocidad de síntesis del biopolímero, la calidad y

cantidad de PHA y el costo de los procesos de

recuperación (Lee & Choi, 2001). A nivel industrial

se emplean cepas como la Ralstonia eutropha,

Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii,

Pseudomonas oleovorans, Paracccus denitrificans,

Protomonas extorquens y E. coli recombinante (Lee,

1996).

MATERIALES Y MÉTODOS

Las muestras fueron recolectadas de aguas

contaminadas del rio Pasto, en el sector del puente del

polvorín (Barrio Pandiaco) se tomó una muestra

inicial de 500 ml en una botella de agua higienizada,

la cual se llevó de inmediato al laboratorio; se

procedió a tomar 1 ml de la muestra adicionándola a

10 ml de solución salina. Luego por el método de

dilución seriada se realiza la disolución en tubos de

ensayo con la misma cantidad de solución salina,

llegando a una dilución final de 10-6.

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

La preparación del medio de cultivo se realizó en dos

fases, en la primera de ellas se empleó un medio de

cultivo con glucosa como fuente de carbono y (NH)

2SO4 como fuente de nitrógeno, al medio de cultivo

con fuente de carbono y nitrógeno se lo denominó

Medio Mineral (MM) y al medio de cultivo con fuente

de carbono pero sin fuente de nitrógeno se le

denomino (MM-N); para evaluar el crecimiento de la

bacteria en condiciones desbalanceadas se empleó el

mismo medio exceptuando la fuente de nitrógeno.

Para la segunda fase se empleó el medio empleado en

la primera fase variando las fuentes de carbono

(Glucosa, Lactosa, Glicerol, Ácido Cítrico), además

se omitió la fuente de nitrógeno. La composición

detallada del medio fue tomada de Shahid y

colaboradores (2013), y se presenta a continuación:

Tabla 1. Composición de macronutrientes en un

medio de cultivo (MM) para la obtención de PHA’s

COMPUESTO CANTIDAD UNIDADES

KH2PO4 3.6 g/L

Na2HPO412H2O 14.4 g/L

MgSO47H2O 0.5 g/L

NaCl 0.015 g/L

CaCl22H2O 0.05 g/L

FeSO47H2O 0.009 g/L

(NH) 2SO4 3 g/L

Fuente de Carbono 5 g/L

Para los elementos traza se tomó 1 g/L de la solución,

la composición es la siguiente:

Tabla 2. Composición de micronutrientes en un

medio de cultivo (MM) para la obtención de PHA’s

COMPUESTO CANTIDAD UNIDADES

MnSO4H2O 1 g/L

CoCl26H2O 0.5 g/L

CuCl22H2O 0.2 g/L

ZnCl2 0.1 g/L

Na2MoO42H2O 40 mg/L

H3BO3 0.5 g/L

NiCl2 50 mg/L

El pH se ajustó a 7.4.

SELECCIÓN DE CULTIVO CON MEJOR

CRECIMIENTO

Para la determinación del mejor crecimiento, se tomó

8 aislamientos de diferentes cultivos los cuales se

conservaron a temperaturas de refrigeración, teniendo

en cuentas las reglas de asepsia se tomó una colonia

de cada aislamiento (71, 71*, 72, 74, 74*, 75. 75*,76)

en donde el símbolo * indica que para esos

aislamientos existía una réplica, se cultivaron los

aislamientos en MM (medio mineral) adaptado a este

trabajo de acuerdo a lo reportado anteriormente por

Shahid y colaboradores (2013). La siembra se llevó a

cabo por el método de siembra por agotamiento en

cajas Petri, cada cultivo se dejó a temperatura

ambiente durante 48 horas sin agitación, paso

continuo se seleccionaron los 4 cultivos que

evidenciaron un mejor crecimiento, para comprobar

la pureza de los cultivos se realizó tinción de Gram

tomando una colonia de los cultivos anteriores. La

tinción revelo que los nuevos cultivos se encontraban

en un estado puro y que poseían forma de bacilos.

Teniendo en cuenta los cultivos seleccionados, se

cultivaron colonias en MM-N (Medio mineral sin

nitrógeno) en las mismas condiciones trabajadas

anteriormente. Después de 48 horas se determinó que

el mejor crecimiento evidenciado en la adaptación al

medio desbalanceado se presentó para el cultivo del

aislamiento 75, manteniéndose el aislamiento a

refrigeración a temperatura de 4ºC.

PREPARACIÓN DEL INOCULO Y EL

REACTOR

Tomando la preparación del medio desbalanceado se

cambió la fuente de carbono original y se preparó 4

medios de cultivo con diferentes fuentes de carbono

(glucosa, lactosa, glicerol, ácido cítrico). Se tomó un

tubo ensayo de 10 ml y se añadió 9 ml del medio

preparado con cada fuente de carbono, cultivando una

colonia del medio seleccionado en cada uno, dejando

durante 5 días a temperatura ambiente, sin agitación.

Transcurrido el tiempo de crecimiento se preparó los

reactores donde se añadió el inoculo a 90 ml MM-N

en un Erlenmeyer de 250 ml, sin agitación, sin

aireación, empleando un sistema de cultivo batch.

OBTENCIÓN DE BIOMASA (MÉTODO

GRAVIMÉTRICO)

Para la determinación del cambio de biomasa, se tomó

1 ml de muestra de cada reactor y de depósito en un

tubo eppendorf, tomando el peso inicial, a las 48 horas

se tomó la muestra del peso final. Para conocer el

cambio de biomasa cuantitativo se empleó el método

gravimétrico donde se sometió cada muestra a un

proceso de separación mecánica (centrifugación) en

una centrifuga Marca de centrifuga a 8000 rpm

durante 15 min, se descartó el sobrenadante y se secó

hasta peso constante en una mufla a 60ºC durante 2

horas, al final se pesó cada eppendorf en una balanza

analítica marca Denver Instrument. APX-200 Max

OBTENCIÓN DEL PHA

Para conocer la cantidad de polihidroxialcanoato

producida se realizó un proceso de separación

mediante centrifugación con una posterior extracción,

en donde se tomó una muestra 20 ml de cada reactor

en un falcón de 50 ml, se realizó la separación del

material en una centrifuga *marca a 7800 rpm

durante 20 min, descartando el sobrenadante de cada

falcón, posteriormente se añadió 2ml de NaClO al 5%

y EDTA 10 mM , se colocó todas las muestras a 60ºC

durante 30 minutos en baño maría y se centrifugo a

7800 rpm durante 5 minutos, descartando el

sobrenadante, nuevamente se añadió 2 ml de agua

destilada y se llevó la muestra centrifugación en las

mismas condiciones, se descartó el sobrenadante y

añadió 2 ml de acetona, se procedió a centrifugar en

las mismas condiciones por último se descartó el

sobrenadante y se pesó el falcón con en una balanza

analítica Denver Instrument. APX-200 Max.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tabla 1. Datos para la determinación de Biomasa por

el método gravimétrico

FUENTE DE CARBONO

PESO INICIAL (g)

PESO FINAL (g)

DIFERENCIA (g)

Lactosa 0,919 1,024 0,105

Glucosa 0,8975 1,0951 0,1976

Ác. Cítrico 0,945 1,107 0,162

Glicerol 1,0204 1,0997 0,0793

Después de realizados los procedimientos de

extracción mencionados anteriormente se encontró

que la única fuente de carbono sobre la cual se

evidencio precipitado que podría atribuirse a la

formación de PHA’s es la Glucosa, para la cual se

determinó la producción a partir de una muestra de 20

ml del medio de cultivo (reactor).

Tabla 2. Datos para la determinación de la

producción de PHA’s en Glucosa como fuente de

Carbono

GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO

PESO INICIAL

(g)

PESO FINAL (g)

DIFERENCIA (g)

PRODUCCIÓN PHA (g/L)

13,321 13,3526 0,0316 1,58

REFERENCIAS

Barbosa M, Espinosa A, Malagón D, Moreno N.

(2005). Producción de poli-B BB BB-hidroxibutirato

(PHB) por Ralstonia eutropha ATCC 17697.

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Chen G. (2010). Plastics from Bacteria Natural

Functions and Applications. Berlin: Springer.

Keshavarz, T, Roy, I. (2010).

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Khanna S, Srivastava A. (2005). Recent advances in

microbial polyhidroxyalkanoates. Process

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Lee S. (1996). Plastic bacteria? Progress and

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bacteria. Trends Biotechnol, 14: 431-438.

Lee S, Choi J. (2001). Production of microbial

polyester by fermentation of recombinant

microorganisms. T. Scheper. Advances in

biochemical engineering/biotechnology. 71: 183-207.

Ojumu T, Yu J, Solomon B. (2004). Minireview

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Biotechnology. 18- 24.

Shahid S, Mosrati R, Dedauphin J, Amiel C, Fontaine

P, Gillard J, Corroler D. 2013. Impact of carbon

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an atypical metabolism in Bacillus megaterium DSM

509. Journal of Bioscience and Bioengineering. 16:

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Sudesh K, Abe H, Doi Y. (2000). Synthesis, structure

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Suriyamongkol P, Weselake R, Narine S, Moloney

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