ASPERGILOSIS

• Dra. Marisa Biasoli

• Centro de Referencia de Micología

Conjunto de enfermedades producidas por

hongos del género Aspergillus

Alérgicas Patogénicas

Interacción del hospedero sensibilizado

con Ag fúngico inmunológicamente

reactivo

Los agentes causales de la infección, hifas y conidios, producen una

inflamación de los tejidos infectados

ASPERGILOSIS

Las micotoxicosis, producidas por

metabolitos secundarios tóxicos

(micotoxinas) no están incluidas dentro de

las Aspergilosis

Agentes Etiológicos:

- Aspergillus fumigatus

- Aspergillus flavus

- Aspergillus niger

- Aspergillus terreus

- Aspergillus nidulans

Hábitat natural:

Hongos ambientales,

sustrato orgánico +

humedad

Vía de ingreso:

Sitio de infección más frecuente: vías respiratorias

Patogenia de la infección

CUADROS CLÍNICOS DE ASPERGILOSIS

Alérgica

Invasiva

- Cutánea

- Ótica

- Oftálmica

- Aspergilosis Broncopulmonar Alérgica (ABPA)

- Sinusitis

- Aspergiloma

- Aspergilosis Pulmonar Cavitaria

Crónica (APCC)

Pulmonar Crónica

- Aspergilosis Pulmonar Invasiva

- Traqueobronquitis

- Sinusitis Invasiva

- Aspergilosis del SNC

Extrapulmonar

Aspergilosis Alérgica

Aspergilosis Broncopulmonar Alérgica:

Malestar general, tos, dificultad respiratoria, asma (episodios de

sibilancia), infiltrados pulmonares (Rayos X).

Eosinofilia y aumento de Ig E total y específica para Aspergillus

Reacción cutánea (+) a Antígenos (extractos) de Aspergillus

Tapones mucosos conteniendo hifas

Ac precipitantes séricos (IgG) para Aspergillus

Sinusitis alérgica:

Congestión nasal, rinorrea, cefaleas, pólipos nasales

Tapones mucosos con eosinofilia e hifas

Reacción cutánea (+) para extractos de Aspergillus

Ac precipitantes séricos (IgG) para Aspergillus

Aumento de Ig E total

Aspergilosis Pulmonar Crónica

Involucra cavidades preexistente (por una enfermedad

pulmonar previa: TBC, sarcoidosis)

Formación de masas fúngicas semejantes a micetomas

Aspergiloma

Aspergilosis pulmonar cavitaria crónica

-Presencia de una o más cavidades en el tejido pulmonar

(puede o no tener bola fúngica)

Pérdida de peso, tos crónica, fatiga, debilidad.

Síntomas similares a ABPA + hemoptisis

Reacción cutánea (+) y Anticuerpos séricos

En ambas se observa:

En pacientes con estado inmune conservado, raramente evolucionan a formas

invasivas

Aspergilosis Invasiva (AI)

-Neutropenia < 500N/mm3 por más de 10 días. - Receptores de un trasplante alogénico de células madre. -Tratamiento con inmunosupresores de células T en los 3 meses previos (ciclosporinas, Bloqueadores de TNF-α, etc). - Enfermedades hematológicas malignas. - Uso prolongado de corticosteroides por más de 3 semanas. - Receptores de trasplantes de órganos sólido - SIDA

Factores de riesgo:

Factores de virulencia y patogénesis

- Peq. tamaño conidios

-Termotolerancia (50ºC)

- Crecimiento rápido

-Sust inhibidoras fagocitosis y lisis de macrófagos y neutrófilos

-Catalasa, superóxido dismutasa.

-Toxinas hemorrágicas (viriditoxina)

-Enzimas líticas (fosfolipasas, proteasas, elastasas)

Invasión de hifas del parénquima pulmonar y vasos sanguíneos

Infarto y necrosis de tejido y diseminación hematógena

Aspergilosis pulmonar invasiva (API)

Neumonitis necrotizante con invasión de vasos sanguíneos.

Puede presentarse como:

Síntomas: tos, disnea, fiebre, dolor pleural, infiltrados

pulmonares, hemoptisis.

Invasión de tejidos contiguos (pleura, peridardio) y

diseminación hematógena, a cerebro, ojos, riñones, y

piel.

Forma grave y frecuentemente fatal (57-100%)

-Neumonía

-Bronconeumonía

-Infarto hemorragico pulmonar

-Abscesos pulmonares

-Nódulos pulmonares

Aspergilosis Invasiva (AI)

Aspergilosis pulmonar invasiva: Diagnóstico por imágenes

Signo del halo: área circular de atenuación en vidrio esmerilado que rodea un nódulo pulmonar. La causa más frecuente es la hemorragia pulmonar.

Pacientes leucémicos y transplantados de MO

Imágenes radiológicas de sinusitis

Úlceras nasales con escaras negras.

Síntomas: fiebre, dolor facial, rinorrea y

cefalea.

A través de las barreras óseas puede diseminar

a SNC.

Sinusitis invasiva

Es más común en pacientes con SIDA y transplantados de pulmón.

El aspecto clínico puede ser traqueobronquitis obstructiva,

pseudomembranosa o ulcerativa.

Síntomas: tos, fiebre, disnea hemoptisis y dolor torácico.

Traqueobronquitis

Aspergilosis Invasiva (AI)

Aspergilosis del SNC:

Neutropénicos, corticoterapia prolongada.

Por diseminación hematológica a partir de la vía pulmonar

o por contigüidad de los senos paranasales

Signos y síntomas: presencia de infiltrados pulmonares y

déficit neurológico con lesiones focalizadas o engrosamiento

meníngeo.

Aspergilosis Invasiva (AI)

Localizaciones extra-pulmonares

- Aspergilosis cutánea 1º y 2º:

Inserción de un catéter venoso, neonatos prematuros,

grandes quemados, o en pacientes con Sida.

Prurito, dolor, otorrea, hipoacusia

- Localización ótica:

Queratitis, endoftalmitis

- Localización oftálmica

Interacción de Aspergillus con el hospedero

Immune dysfunction

Fre

quency

of aspe

rgillosis

Immune hyperactivity

Fre

quenc

y o

f asp

erg

illosis

Acute IA

Subacute IA

Tracheobronchitis Aspergilloma Chronic cavitary

ABPA Allergic sinusitis

.

Normal immune function

www.aspergillus.man.ac.uk

El riesgo de desarrollar aspergilosis invasiva aumenta con el aumento de los niveles de deficiencia inmunológica. En cambio, el riesgo de la aspergilosis alérgica es mayor en las personas cuyo sistema inmunológico está hiperactivo-reactiva (atópica).

DIAGNÓSTICO

MICOLÓGICO

ESTUDIOS MICOLÓGICOS

1- Obtención de la muestra

2- Examen directo

3- Cultivos

4- Identificación de género y especie

5- Estudios complementarios

6- Interpretación e informe de los resultados

1- Muestras: esputo seriado, secreción nasal,

LBA, biopsias, hemocultivos, punción

abscesos, secreción ótica, raspado córnea,

piel, etc

2- Examen directo Observación en fresco

ED en fresco con gueguén de material rinosinusal – 400x

2- Examen directo Observación en fresco

Observación por fijación y tinción

Coloración Grocott de abceso cerebral – 400x Coloración Grocott de abceso cerebral – 400x

Diagnóstico diferencial Candida

Aspergillus

Zygomycetes

Escamas de piel ASG, ASG Cl

Incubar a 28 ºC, 2 semanas

ASG, ASG Cl

Incubar a 28ºC, 2 semanas

Secresión ótica, sec.

nasal, raspado córnea

ASG, ASG Cl, CCS.

Incubar a 28ºC y 37ºC, 1

mes

Esputo seriado, LBA,

biopsia, punción, etc.

Hemocultivos (MUY BAJO % DE RECUPERDACIÓN)

• En caldo

• Lisis-centrifugación ASG, ASG Cl, CCS. Incubar a 28ºC y 37ºC, 1 mes

3- Cultivos • Medios generales

• Medios selectivos: ATB no cicloheximida

Características micromorfológicas del género Aspergillus

4- Identificación de género y especie: Estudios Macro y Micromorfológicos

métula

Características micromorfológicas de diferentes especies de Aspergillus

Fialide

Domain: Eukarya

Kingdom: Fungi

Phylum: Ascomycota

Class: Ascomycetes

Order: Eurotiales

Family: Aspergillaceae

Genus: Aspergillus

Ubicación Taxonómica de Aspergillus

Ubicación Taxonómica de Aspergillus

Grupos establecidos por Rapper y Fennell (1965)

A. fumigatus, baja frecuencia de R a los azoles.

A. lentulus, sensibilidad disminuida frente a AMB, ITZ, VCZ y CPF.

Macro y micromorfología complejo Aspergillus fumigatus (Sección Fumigati)

Micromorfología de Neosartorya fumigata

O’Gorman et al., Nature, 2008

400 µm 100 µm 2 µm

2 µm 20 µm

Especies de la sección Fumigati más frecuentemente recuperados de materiales clínicos y asociados a IFI:

A. lentulus, A. udagawae, A. viridinutans, A. thermomutatus (Neosartorya pseudofischeri), A.

novofumigatus, and A. hiratsukae

Estas especies podrían exhibir algunas características morfológicas distintivas, comparado con A.

fumigatus sensu stricto, como: pérdida de pigmentación, pobre esporulación, presencia of

ascocarpo, o crecimiento variable a diferentes temperaturas.

Aspergillus fumigatus-Related Species in Clinical Practice Frédéric Lamoth* Frontiers in Microbiol., 2016

Tabla 1:Prevalencia de las especies de la sección Fumigati diferentes de A. fumigatus en materiales clínicos

Actualmente, los expertos recomiendan: -Secuenciación de la región ribosomal ITS (ITS1+5,8S+ ITS2) para la identificación a nivel de especies del complejo (las secciones de Aspergillus spp). - Secuenciación de los genes beta-tubulina o calmodulina para la identificación intrasección a nivel de especie.

-Se han desarrollado ensayos de PCR multiplex dirigidos a marcadores de microsatélites o secuencias de genes específicos (región ITS2, benA, rodA) para la rápida detección y discriminación de especies de Aspergillus en la sección Fumigati en muestras clínicas.

-MALDI-TOF MS: También dio resultados prometedores para la distinción entre A. fumigatus and A. lentulus en aislados clínicos

Tabla 2:Características fenotípicas de las especies clínicas relevantes de la sección Fumigati

A. fumigatus, baja frecuencia de R a los azoles.

A. lentulus, sensibilidad disminuida frente a AMB, ITZ, VCZ y CPF.

A. flavus -algunas cepas son resistentes a la anfotericina B

Macro y micromorfología de Aspergillus flavus (Sección Flavi)

Macro y micromorfología de Aspergillus niger (Sección Nigri)

Macromorfología de Aspergillus terreus (Sección Terrei)

www.aspergillus.man.ac.uk

A. terreus – resistente a Anf B

Micromorfología de Aspergillus terreus

www.aspergillus.man.ac.uk

Macromorfología de Aspergillus nidulans (Sección Nidulantes)

www.aspergillus.man.ac.uk

Micromorfología de Aspergillus nidulans www.aspergillus.man.ac.uk

Micromorfología de Emericella nidulans

www.aspergillus.man.ac.uk

La frecuencia relativa de las especies

asociadas con aspergilosis invasiva es la

siguiente:

• 85-90 % de A. fumigatus

•10.5 % A. flavus

• 3-7 % A. niger

•1 % A. nidulans

• 1 % A. terreus

Hay aproximadamente 25 -30 otras especies de

Aspergillus que han causado la enfermedad en

los seres humanos.

CARACTERISTICAS A.fumigatus A.nidulans A.flavus A.niger A.terreus

Colonia

Aspecto Plano, aterciopelado,

algodonoso

Plano, aterciopelado

Pulverulento Punteado negro Aterciopelado, flocoso

Color Verde botella, blanco-grisáceo

Verde amarillento Verde amarillento Blanco amarillento,

negro

Marrón amarillento

Reverso Incoloro, Rojo amarillento

Rojo púrpura Incoloro, café amarillento

Incoloro, amarillento

Incoloro, beige

Reproducci

ón asexuada

Conidióforo Corto, liso, incoloro, 300 m

Muy corto, liso, café

(marrón), 600 m

Regular, pared rugosa

Largo, 1.5 – 3 mm Regular,hialino liso

Vesícula Mazo o domo Hemiesfèrica Esfèrica Globosa Subesférica

Fialides Una serie, paralelas

Dos series, paralelas

Una a dos series radiadas

Dos series radiadas

Dos series Ligeramente

colunnar

Conidios Globosos, equinulados,

verdes

Globosos, equinulados,

verdes

Piriformes o globosos, verde

amarillentos

Globosos, negros Globosos, estriados,

amarronados

Reproducci

ón sexua

da

Cleistotecios Globosos, amarillos 500 m

Globosos, cafè (marròn) 130 m

--- --- ---

Ascosporas Globosos con crestas

ecuatoriales

Rojizas --- --- ---

Células en avellana

--- 20 m --- --- ---

Esclerotes --- --- Blanco o negro --- ---

Otros Temperatura de desarrollo óptimo

37 a 50 ºC 30 a 37 ºC 37 ºC 37 ºC 37 ºC

Características macro y micromorfológicas de especies de Aspergillus

Características micromorfológicas de especies de Aspergillus

Detección de Anticuerpos

Técnicas utilizadas:

- ID

- CIE

Antígenos utilizados:

- Ag metobólicos, específicos de especie

4 mm

4 mm

Ag

Ac

Resultados de la ID:

- ABPA: 4 o más bandas

- Aspergiloma: hasta 18 bandas

- AI: 1 o ninguna banda

- Detección de Ac, - Detección Ag, - Detección ADN

5- Estudios complementarios

Detección de Antígenos

Galactomanano (GM)

-Es un componente de la pared celular de Aspergillus (también de otros

hongos: Fusarium, Acremonium, Histoplasma, Alternaria, Penicillium)

-Es el principal exoantígeno liberado durante la angioinvasión.

-En enfermos con AI el GM puede ser detectado en suero, BAL,

orina, LCR, líquido pericárdico/pleural.

- La detección del GM se ha introducido como criterio micológico en

las definiciones de consenso de AI probable de la EORTC/MSG*, en

plasma, suero, lavado broncoalveolar, o líquidos (pericárdico,

cefalorraquídeo y pleural).

-Es recomendable hacer determinaciones seriadas (2

determinaciones/semana) para aumentar la especificidad y hacer un

diagnóstico precoz.

*European Organization for Research and Treatment of Cancer/ Mycoses Study Group. De Pauw et al.

Definitions of Invasive Fungal disease, CID, 2008:46

Detección de Antígenos

Platelia Aspergillus (Bio-Rad): Ag galactomanano

Anticuerpos utilizados: Ac Monoclonal de rata EBA-2

Técnica: ELISA doble sandwich

Tratamiento del suero: con calor + EDTA para

disociación de inmunocomplejos y precipitación de

proteínas

GM (+) : -2 pruebas consecutivas positivas.

-Punto de corte: ≥ 0,5 ng/ml

Detección de Antígenos

Utilidad diagnóstica:

• Confirmar diagnostico AI

• Screening para detección temprana

de AI

• Control de tratamiento

• Detectar pacientes de bajo riesgo AI

Pacientes neutropénicos adultos (<100 N/mm3 >3 semanas ó

<500 N/mm3 >5 semanas)

Aún no está definido su uso en:

•Receptores trasplante órgano solido

•Enfermedad granulomatosa crónica

•Pacientes críticos no neutropénicos

•SIDA

Limitaciones: Falsos positivos • Ciclofosfamida • ATB (amoxicilina-clavulónico, piperacilina-tazobactam) • Alimentación parenteral • Colonización intestinal conbifidobacterium • Mucositis (alteración barrera intestinal) • Infección Fusarium, Penicilium, Alternaria, Paecilomyces (reacción cruzada) • Alimentos ricos en galactofuranosa (leche maternizada, cereales) • Bacteriemia • Transfusiones Falsos negativos • Encapsulación de la infección • Población no seleccionada

(1-3)-ß-D-glucano

Detección de Metabolitos fúngicos

-Componente de pared celular de la mayoría de los

hongos excepto Cryptococcus neoformans y los

Mucorales.

-No existe en tej. de mamíferos,cel. proc. y virus

-Su eliminación es lenta y no hay glucanasas en suero

-Es un marcador panfúngico combinar con otras

técnicas para la identificación a nivel de género

Buen marcador

de IFI

-Su detección se basa en una técnica cromogénica muy sensible

basada en la activación de la cascada de coagulación del cangrejo

herradura japonés. Emplea una detección cinética de BG y un punto de

corte de 80 pg/ml.

- Existen disponibles 4 equipos comerciales: Fungitell (validado por la

FDA), Fungitec G, Wako, B-G Star

- Se han detectado falsos (+): tratamientos de hemodiálisis con

membrana de celulosa, tratamiento con albúminas, agentes anti-

cancerosos y ciertos ATB.

(1-3)-ß-D-glucano

- Utilidad diagnóstica de (1-3)-ß-D-glucano:

Desventajas: al ser marcador panfúngico debe combinarse

con otras pruebas que permitan identificar la especie fúngica

infectante.

Es útil para el diagnóstico de AI en pacientes oncohematológicos

con neutropenia, con una sensibilidad del 64% al 88%, una

especificidad cercana al 90%.

La deteccion conjunta de ambos marcadores, GM y BG, realizadas

en suero bisemanalmente, permite:

1-aumentar la E y el valor predictivo (+) y (-) a casi un 100 %

2- Permite evaluar la evolución en los enfermos con AI

Se ha introducido como criterio micológico en las definiciones de consenso de Enfermedad Fúngica Invasiva de la EORTC/MSG en suero.

Los patógenos fúngicos oportunistas

incluyen Candida spp., Aspergillus spp.,

Fusarium spp., Trichosporon spp.,

Saccharomyces cerevisiae,

Acremonium spp., Coccidioides immitis,

Histoplasma capsulatum, Sporothrix

schenckii, Exserohilum rostratum, y

Pneumocystis jirovecii. El (1→3)-β-D-

glucano producido por estos y otros

microorganismos puede detectarse

mediante el ensayo Fungitell.

Hay ciertas especies fúngicas

producen concentraciones muy bajas

de (1→3)-β-D-glucano, por lo que el

ensayo Fungitell® no suele

detectarlas. Dichas especies incluyen

el género Cryptococcus, así como

Mucorales como Absidia, Mucor y

Rhizopus.

Detección de ADN fúngico - PCR Standard

- PCR Nested: Riesgo de contaminación

- PCR-RT : es la que más se está utilizando - PCR

-Secuencias target más utilizadas: Genes ribosomales y sus espaciadores internos

-PCR en sangre en pacientes con enf. hematológicas

- S: 75 -88%

- E: 75-87%

La PCR no se incluyó como prueba micológica en los criterios del grupo EORTC /

MSG. Este hecho no está relacionado con un rendimiento insatisfactorio, sino a la

falta de estandarización y que hasta hace poco, las alternativas comerciales no

estaban disponibles.

PCR en tiempo real: Es el modelo más promisorio para obtener una técnica

estandarizada, con bajo riesgo de falsos (+) y que permita generar criterios para

diferenciar entre colonización e infección (ya que permite cuantificar la carga

fúngica)

Métodos comerciales para Detección de ADN :

VYOO® (SIRS-Lab, Jena, Germany): Multiplex PCR

LightCycler® SeptiFast (Roche, Mannheim, Germany): Multiplex PCR: utiliza

sondas dirigidos a la región ITS entre el DNA ribosomal 16S y 23S de

14 bacterias y a la región ITS entre el DNA ribosomal 18S y 5.8S de C.

albicans, C. tropicalis, C. parasilosis, C. glabrata y C. krusei y

Aspergillus fumigatus.

SepsiTest® (Molzym, Bremen, Germany) RT-PCR panfúngica + secuenciación

(16S y 18S rRNA)

Technology Sample Technology Pathogens Abx Resistance Genes

Pre-Analysis Hands On

Time Total Assay

Time

4SeptiFast® Whole blood Real Time PCR 25 bacteria and fungi

None DNA extraction w/MagNA Lyser

3 hr 4.5 hr

5SepsiTest® Whole blood PCR + sequencing

345 bacteria and fungi

None DNA extraction w/SelectNA™

2.5 hr > 9 hrs = 4 hr +

sequencing

6VYOO® Whole blood PCR + electrophoresis

39 bacteria and fungi

mecA, vanA/B, KPC, blaSHV, blaCTX-M

DNA extraction via Looxster®

70 min 7 hr

Factores a tener en cuenta para la detección de ADN para diagnóstico de AI:

Elección de la muestra óptima: Suero o sangre completa? BAL

y plasma??

Método de extracción del ADN

Especificidad de los cebadores

Formato de la PCR

Detección e identificación de varias especies de Aspergillus y

Candida simultáneamente.

Costo

Interpretación de un (+): colonización o infección????

CID 2008;46:1813-1821

Definiciones de consenso de Enfermedad Fúngica Invasora de la EORTC/MSG

INFECCIÓN FÚNGICA PROBADA

-Histopatología o cultivo (+) desde un sitio estéril

INFECCIÓN FÚNGICA PROBABLE

Requiere la presencia de : -Factor del hospedero

-Criterio clínico - Criterio Micológico

INFECCIÓN FÚNGICA POSIBLE

Presencia de : -Factor del hospedero,

-Criterio clínico -Sin evidencia micológica.

• Para definir un diagnóstico es necesario que exista correlación entre:

- examen directo (es muy importante)

- cultivos (es importante si el material es de un órgano estéril)

- cuadro clínico.

• Cuando se aíslan levaduras de una muestra clínica es necesario determinar:

- si es un contaminante

- si está colonizando

- si está causando infección

• Para ello se adoptan distintos criterios dependiendo de:

- hongo involucrado.

- tipo de muestra.

- características del paciente

6- Interpretación e informe de los resultados

Criterios a seguir para el diagnóstico de Aspergilosis

Aspergilosis ocular, Aspergilosis ótica, Aspergilosis de los

senos paranasales:

- Examen directo positivo (hifas tabicadas hialinas) y

- Cultivo positivo para Aspergillus

Aspergilosis Pulmonar Crónica:

- Examen directo positivo (hifas tabicadas hialinas) y

-Cultivo positivo para Aspergillus desde una muestra estéril,

esputo seriado o BAL.

Aspergilosis invasiva:

- Examen directo positivo (hifas hialinas) y

-Cultivo positivo para Aspergillus desde una muestra estéril

- Detección de antígenos y/o anticuerpos positivos.

- BG (+) (confirmar especificidad con otras pruebas)

ESTUDIO MICOLÓGICO DE UN CASO

Paciente adulto , de sexo masculino, con transplante de

riñón realizado hace 3 meses. Presentó un episodio de

rechazo. Está internado desde hace 10 días. Desde hace 2

meses están realizando refacciones en una sala contigua

del Hospital. La sala no posee filtros EPA.

Ingresó con fiebre, tos y dificultad respiratoria. Por TAC se

detecta un nódulo pulmonar. Se solicita estudio micológico.

Material ?????

Punción del nódulo pulmonar

Examen directo en fresco (KOH 20%):

Cultivos: Sb, Sb cl, CCs

ESTUDIO MICOLÓGICO DE NÓDULO PULMONAR

Se observan filamentos tabicados hialinos

Se obtuvo desarrollo del mismo hongo filamentoso en todos los tubos (28 y 37ºC)

Estudio macromorfológico: Se obtuvo desarrollo de colonia de

color ocre, aspecto aterciopelado, acuminada, bordes radiados, de desarrollo regular a abundante

ESTUDIO MICOLÓGICO DE NÓDULO PULMONAR

Estudio micromorfológico de la

colonia:

Se observan hifas tabicadas

hialinas. Conidióforos de pared

gruesa, vesículas globosas, 2

hileras de fialides, conidios

pequeños, cabezas

aspergilares columnares (con

lupa)

ESTUDIO MICOLÓGICO DE NÓDULO PULMONAR

• Identificación del hongo?

• Porqué es importante la identificación de la

especie?

• Repetiría la toma de muestra? Porqué?

• El resultado del examen directo, tienen valor

diagnóstico? y los cultivos?

• Qué estudios complementarios realizaría?

• Cuál podría haber sido la fuente de infección?

- si le interesa saber más acerca del tratamiento consulte:

www.aspergillus.man.ac.uk

http://aspergilosis.reviberoammicol.com/

ESTUDIO MICOLÓGICO DE NÓDULO PULMONAR