UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE

BAJA CALIFORNIA SUR`REA INTERDISCIPLINARIA DE CIENCIAS DEL MAR

DEPARTAMENTO DE BIOLOG˝A MARINA

Detección de Herpesvirus Mediante PCR en TortugasMarinas Habitantes en Aguas Costeras de la Península

de Baja California

TESIS

QUE COMO PARTE DE LOS REQUISITOSPARA OBTENER EL T˝TULO DE

BIÓLOGO MARINO

PRESENTA

HÉCTOR EDGAR CASTEL`N MART˝NEZ

La Paz B C S MØxico Febrero de 2004

otC TØJ4Sg

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0060427

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMADE

BAJA CALIP Ol NIA SUR1 Apnrtmlo PoslnI1J n

Codigo 1 slaJ 23080

La Paz ß C

S 1 cls 1280 140 1280569 Y 12804

2Fax 1280801Y

1280880 AREAINTERDlSCIPLlNARIA DECIENCIAS DEL

MAR Departnmento deBiologln

MarinaF echa oEftD n

Lt BIOL MAREMELIO BARJAUGONZALÉZ JEFEDELDEPARTAMENTO DEBIOLOG˝AMARINA

PRESENTE Los abajo firmantes comunicamos a Usted que habiendo revisado el Trabajo de Tesisque realizÓ el pasante I¨˝ ìfEOØt ì AS L8

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tjç Con el

TituloIDI 1ECC1n10 f4f V1˙1lM Yl Al ïc ˙lfl jlrJh rAsMAQ

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NJAIOtorgamos nuestro voto aprobatorio y consideramos que dicho Trabajo estÆ listo

para su defensa a finde obtener el título de

BiólogoMarinoPRESIDENTE ttbLC 1Q í ilC N sen ï If º SP H P

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Nombre CompletoTh OeEPlOCAß 1 Q5liAZGIJ k3UAP

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Completo SECRETARIO DR ï Llre AcxElG 1DJ 1UE

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Completo VOCAL OP1 U v ì R ì H EJ 1f1pu1L

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Completo SUPLENTE H 1 1C eLfW ìïAtELuJA LÒD k

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Completo SUPLENTE l pF L ì Pt Jlc EI lUD1

8uNombre

Completo DIRECTOR Ccp CoordinadordelArea Inlerdisciplinnria de Cienciasdel Mar Cep Director delServicios Escolares

CepInteresado

Permiso de ColectaEl presente estudio se desarrolló dentro del Proyecto CONACYT G35437 B denominadoValoración de la Salud de las Poblaciones de Tortuga Marina en la Península de BajaCalifornia Mediante el Uso de Estudios Toxicológicos Patológicos y Fisiológicosefectuado en el Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste S c contando con elsiguiente permiso de colecta

Oficio No SGPA DGVS 002 2895 Permiso de colecta para la toma de muestras detortugas marinas de la península de Baja California concedido por la Subsecretaría deGestión para la Protección AmbientaL Dirección General de Vida Silvestre SEMARNAT

DEDICATORIA

A la Memoria de Joselyn Para ti bebita dondequiera que estØs

A ti MamÆ por haber sabido desempeæar un doble papel en mi desarrollo como persona

por tu incondicional apoyo y tu fe en mi Mis logros son tuyos te lo debo todo

A mi hermano Alex bro mi mano derecha por ser la persona que sin dudarlo un instante

ha creído siempre en mi gran parte de mi desarrollo profesional es tuyo gracias por todo

A mi hermano Martín por ser nuestro apoyo espiritual y por haberme hecho saber que el

ser constante en lo que quieres lograr se ve siempre recompensado

A mi flaquita Fati por tu impresionante fortaleza personal por ser la alegría de la casa y

habernos hechos sentir orgullosos GraciØls por transmitirme esas ganas de vivir

A mi Dani por hacenne recordar esa innata curiosidad infantil y ansias de aprender de

todo lo que te rodea he aprendido mucho de ti

A los Tíos gracias por nunca dejamos solos

y finalmente a RomÆn y Chayito por ser parte crucial de la familia y haberse sabido

ganar nuestro cariæo

AGRADECIMIENTOS

Sin duda alguna cualquier trabajo de investigación requiere del apoyo de diversas

personas para su realización El presente no es la excepción

Quiero agradecer en primera instancia a quien me ha ofrecido su apoyo en todos

Æmbitos a ti MamÆ y a ti Alex el presente es un reflejo de su largo recorrido ami lado

A la Dra Susan Gardner por habem1e permitido subir a su barco y facilitarme lo

necesario para desarrollar el presente estudio y por haber incrementado en mi el interØs

en aprender mÆs sobre tortugas marinas trabajar en su proyecto ha sido mi mejor acierto

Al Dr Felipe Ascencio por habenne dirigido en el presente trabajo y por haberme

introducido en el increíble mundo de los Herpesvirus por sus facilidades proporcionadas

y por haber sabido tenem1e paciencia por esos jalones de orejas y por dejarme ser

Al M en C Sergio Flores por habenne enseæado lo implica la palabra

Investigación por todos sus valiosos comentarios y por aclararme todas mis dudas cada

vez que surgían pero principalmente por su amistad

Al Dr Roberto V Æsquez por la sorprendente paciencia que tuvo conmigo en

laboratorio gracias a eso aprendí lo que ahora sØ por sus valiosos comentarios y por

haberme enseæado a aterrizar en prÆctica lo que en teoría creí saber

A los colaboradores de los laboratorios de Pato gØnesis Microbiana y GenØtica

Molecular del CIBNOR principalmente al Dr Humberto Mejía Chula Claudia y Delia

por sus comentarios y recomendaciones en el desarrollo del presente y asesoramiento en

el uso de sus equipos

A los Drs Alonso Agu˝lTe Joel Lackovich Thierry Work George Balasz y Jorge

Oros por facilitarme toda su literatura cuando la solicitØ y por sus valiosos comentarios

A Wildcoast y el Grupo Tortuguero de las Califomias a los pescadores de Bahía

Magdalena especialmente Memo y familia a Antonio Resendiz en Bahía de los `ngelesa Miguel y Erubiel en Punta Abreojos y a ASUPMATOMA en Cabo San Lucas sin su

valiosa ayuda la colecta de muestras hubiera sido mÆs prolongadaAl equipo de tortugueros del CIBNOR Arturo JuÆrez Itzel Sifuentes Paloma

Valdivia Siannon Fitzgerald Milagros López Rodrigo Rangel y Amaury Cordero por

su ayuda en la colecta de muestras por tantos consejos y por tenderme su amistad

A CONACYT por la beca proporcionada en el transcurso de el presente

A mis amigos de la carrera Memo GÆlvez Oscar Salazar Edgar Caballero Nadia

Rubio Andrea CuØllar y Carlos Viesca gracias por haber soportado tanto tiempo a

chiquitín y sobretodo por saber serbuenos amigos

A mis mÆs allegadas amigas Katy y Margarita gracias por soportar mi carÆcter

tanto tiempo pero principalmente gracias por estar conmigo en las buenas y en las malas

A Carmen AguiJar tœ sabes porque

Finalmente a aquellos que de alguna manera tuvieron que ver en el desarrollo de

este estudio y que por mi falta de memoria olvidØ mencionarlos de antemano mil gracias

˝NDICE PÆgina

˝NDICE DE FIGURAS I

˝NDICE DE TABLAS III

RESUMEN IV

AßSTRACT V INTRODUCCiÓN

1 ANTECEDENTES

5 JUSTIFICACiÓN

8 OBJETIVO

GENERAL9 OBJETIVOS

PARTICULARES9 `REA

DE ESTUDIO 10 MATERIAL

YMÉTODOS 12 Trabajo

de campo 12 Trabajo

de laboratorio 13 RESULTADOS

17 Descripción

General de los tejidosy órganos analizados 17 AnÆlisis

deMuestras extracción amplificación purificaciónysecuenciación 20 DISCUSIÓN

24 CONCLUSIONES

29 LITERATURA

CITADA30

˝NDICE DE FIGURAS PÆgina

Figura 1 Características morfológicas de tortugas marinas y sus

medidas utilizadas

4

Figura 2 Tortuga marina con fibropapilomatosis 4

Figura 3 Localización del Ærea de estudio 11

Figura 4 Representación de la dirección en la que actœan los primers sobre 15

el templete de ADN

Figura 5 Representación bosquejada de los ciclos realizados durante 15

la Reacción en Cadena de la Polimerasa

Figura 6 Corte histológico de tejido cutÆneo sano de tOliuga prieta 19

Figura 7 Corte histológico de tejido cutÆneo de tortuga marina con 19

fibropapilomatosis

Figura 8 Extracciones de ADN Visualización en gel de agarosa 20

Figura 9 Detección de secuencias herpesvirales por PCR Primario 21de 880 bp Visualización en gel de agarosa

Figura 10 PCR Secundario Productos amplificados a partir del PCR 21

Prim amplicones de 224 bp Visualización en gel de agarosa

Figura 11 Amplicon purificado del PCR secundario HVI previo 22a secuenciación

Figura 12 a Secuencia de nucleótidos del segmento del gen de ADN 23

polimerasa herpesviral amplitìcada de Chelonia m agassiziib Alineación de nucleótidos de la secuencia amplificadaHV TM con la secuencia del Herpesvirus bovino 2

Figura 13 Alineación de aminoÆcidos de la secuencia amplificada contra 23la secuencia de lIerpesvirus bovino 2

Figura 14 a Comparación de aminoÆcidos entre la secuencia amplificada 23y Herpesvirus relacionados con la GTFP en tortugas verdesprocedentes de Hawaib Alineación entre la secuencia amplificada y la secuencia delHerpesvirus causante de la enfermedad de LET

II

˝NDICE DE TABLAS PÆgina

Tabla 1 Tejidos y órganos analizados para cada organismocontemplado en el estudio

17

Tabla 11 Nœmero de muestras de tejidos y órganos por cada

especie de tortuga marina18

Tabla 111 Relación por localidad y especie de tortugas marinasmuestrcadas vivas durante monitoreos y varadas o

muertas por pesca incidental

18

11I

RESUMEN

Las enfermedades infecciosas producidas por agentes patógenos son comunes

en la mayoría de los reptiles no obstante representan una mayor preocupación cuando

se manifiestan en especies en peligro de extinción En tortugas marinas el desplome

poblacional a nivel mundial provocado por diversas actividades antropogØnicas ha

colocado a estos organismos en peligro de extinción los cuales a pesar de mÆs de 20

aæos de esfuerzos de conservación aÚn permanecen vulnerables Herpesvirus

semejantes al Herpesvirus simplex humano I y 2 han sido relacionados como agentes

etiológicos de la lìbropapílomatosis enfermedad que ha afectado a diversas

poblaciones de tortugas verdes C7e ol1ia mydas en proporciones epidØmicas y en

menor grado a tortugas golfinas Lepidochelys olivacea y tortugas caguamas Caretta

caretta a nivel mundial Cinco de las siete especies existentes de tortugas marinas

habitan la costa de la península de Baja California siendo Øste un importante hÆbitat

para su desarrollo alimentación o anidación Para evaluar la presencia de Herpesvirus

causantes de la fibropapilomatosis así como de la enfermedad de LET Lung Eye

Trachea Disease por sus siglas en ingles y la enfermedad de GPO Grey Patch

Disease en tortugas marinas se analizaron muestras de tejidos y órganos de tortuga

prieta Che onia mydas agassizii t0l1uga golfìna Lepidoche ys olivacea y tortuga

caguama Carelo careUa en cuatro zonas ubicadas a lo largo de la península

bajacaliforniana La detección de secuencias herpesvirales se efectuó mediante la

reacción en cadena de la polimerasa PCR en formato anidado utilizando primers

degenerados que amplifican una región altamente conservada del gen de la AON

polimerasa herpesviral Se detectó presencia herpesviral en tres tortugas prietashabitantes en Bahía Magdalena Las secuencias obtenidas fueron comparadas con

otras secuencias herpcsvirales incluidas en el GENBANK mediante el uso del

programa de BLAST Basic Local Alignment Search Tool encontrando similitud en

un 75 con el Herpesvirus bovino 2 siendo Øste el primer Herpesvirus reportado en

tortugas prietas Los resultados obtenidos remiten a la conclusión de que las tortugas

prietas la se ven amenazadas por Herpesvirus causantes de las patologías

mencionadas por otra parte para las dos especies restantes a pesar de que mostraron

negatividad ante la detección herpesviral se sugiere un anÆlisis mÆs extenso debido a

que son especies afectadas por la fibropapilolllatosis

IV

ABSTRACT

The infectious diseases produced by pathogenic agents are common in most

reptile species however they represent a greater threat when encountered in speciesthat are endangered or threatened with extinction In sea turtles population collapses on

a world wide level caused by diverse human activities has placed these organisms in

risk of extinction despite more than 20 years of conservation efforts Herpesvirussimilar to the Hcrpesvims human simplex 1 and 2 has been associated as etiologic

agents of fibropapillomatosis This disease has affected to diverse green turtles

populations Chelonia mydas in epidemic proportions and to a les ser degree olive

ridley turtles Lepidochelys olivacea and loggerhead turtles Caretta caretta at global

leveFive of the world s seven sea turtle species inhabit the coast of the peninsula of

Baja California which provides an important habitat for their development feeding or

nesting In order to evaluate the presence of Herpesvirus associated to the

fibropapillomatosis as well as Herpesvirus causing Lung Eye Trachea disease and

Grey Patch disease in marine turtles samples of tissues and organs of the Eastem

Pacific green turtles locally known as black turtles Chelonia mydas agassizii olive

ridley turtles and loggerhead turtles from four areas located throughout the BajaCalifornia peninsula were analyzed Herpesvirus was detected using sequential nested

concensus pnmer PCR to amplify an internal region of the Herpesvirus DNA

polymerase gene Herpesviral prescnce was dctected in three black turtles collected

from Magdalena Bay The sequences obtained Vere compared with other herpesviraI

sequences released to GENBANK by using the Local Basic Alignment Search Tool

BLAST of the National Center for the Biotechnological Infonnation finding 75 of

similarities with bovine Herpesvims 2 This represents the first reported Herpesvirus in

black turtles from the Baja California peninsula The results obtained send to the

conclusion that the black turtles are not threatened by Herpesvirus associated with the

mentioned pathologies A1though the other tVo species were negative to the herpesviraldetection test since sample number was low n 5 loggerhead and n 10 olive ridley

a more extensive analysis to determine if thesc populations have been affected by

fibropapillomatosis is desirable

v

INTRODUCCIÓN

Las tortugas marinas vivientes representan un grupo monofilØtico de especies que han

subsistido por mÆs de 135 millones de aæos m a conservando gran parte de sus características

anatómicas Fig 1 existiendo registros fósiles que datan del TriÆsico Tardío hace 200 m a

Meylan e Hirayama 1999 Pough el al 1996 Han sido proveedoras de sustento alimenticio y

económico e incluso espiritual de distintos grupos sociales distribuidos alrededor del planetaformando parte del entramado cultural de diversas regiones costeras Frazier 1999 El vasto

antecedente histórico de explotación comercial intensiva entre otras actividades antropogØnicas

como la captura indirecta de adultos y juveniles el saqueo de nidos y la modificación o

degradación de sus hÆbitats Marcovaldi y ThomØ 2000 documentadas para todas las Æreas de

distribución global han contribuido a diezmar diversas poblaciones Plotkin 1995 Actualmente

son consideradas a escala mundial como especies amenazadas o en peligro de extinción

Groombridge 1982 Pritchard 1997 En MØxico las seis especies distribuidas en sus costas

estÆn incluidas dentro de la Norma Oficial Mexicana NOM 059 ECOL 1994 como en peligro de

extinción Anónimo 1994

Dentro de los factores que incrementan el riesgo de declive poblacional para las especies

protegidas se encuentran las enfermedades Azpiri el al 2000 las cuales son un deterioro del

estado fisiológico normal del organismo o de cualquiera de sus componentes en respuesta a

diversos factores ambientales p ej clima malnutrición y contaminación agentes infecciosos

específicos p ej bacterias hongos protozoarios parÆsitos y virus defectos intrínsecos del

organismo p ej alteraciones genØticas o inmunológicas o bien combinaciones de los mismos

Prescott el al 1999 Su papel como factor limitante de supervivencia en vida silvestre puedeser un determinante para la viabilidad de estas especies ya que las enfermedades se comportan

como controladores biológicos naturales al momento en que ponen en peligro la subsistencia de

poblaciones mermadas Deem el al 2001 Gog 2002

Los herpesvirus HV son agentes calIsales de diversas enfermedades son ampliamente

ubicuos y tiene como hospederos a la mayoría de los vertebrados Representan un extenso grupo

de virus con AON de doble cadena de envoltura y simetría icosaØdrica y tamaæo variable de

entre 110 a 200 nm con un genoma de alrededor l60 000 pares de bases que contienen de 50 a

100 genes Prescott el al 1999 Se caracterizan por su capacidad de permanecer en latencia por

largos periodos de tiempo y por su capacidad de reactivación ante condiciones de estrØs

fisiológico por parte de sus portadores Curry el al 2000 Cuando las seæales bioquímicas entre

las hormonas y neurotransmisores y los receptores de los sistemas inmunológico nervioso y

endocrino se ven alteradas modificando la homeostasia fisiológica del organismo en respuesta

ante un estímulo interno o externo alterarÆn a su vez la producción de seæales moleculares

Kuby 1991 resultando en la modificación en cadena de otro sistema y provocando así estrØs

fisiológico condición que favorece la proliferación de Herpesvirus Padgett el al 1998

Las tortugas marinas como cualquier población de vertebrados son susceptibles a

padecer diferentes patologías ocasionadas por herpesvirus George 1997 En la actualidad se

conocen dos enfermedades de etiología herpesviral que afligen a estos organismos la enfermedad

de parches grises o Grcy Patch Disease GPD afecta principalmente a ejemplares juveniles de

tortuga verde Chelonia mydas IIaines 1978 en la que el estrØs inducido por altas

temperaturas favorece la infección y agrava la severidad de sus lesiones que consisten en pÆpulas

y pÚstulas con hiperqueratosis y acantosis de la epidermis y la Enfermedad Respiratoria por

llerpesvirus HRD o enfermedad de LET Lung Eye and Trachea disease por sus siglas en

ingles se ha descrito en ejemplares juveniles de tortuga verde los cuales desarrollan

conjuntivitis purulenta estomatitis necrótica traqueitis y bronconeumonía Jacobson el ar

1986

Una tercera enfermedad la fibropapilomatosis GTFP Fig 2 se ha extendido por todas

las cuencas oceÆnicas del planeta afectando a poblaciones de tortuga verde en pròporciones

epidØmicas Williams el ar 1994 Aunque factores como parÆsitos Murray y Morris 1993

contaminantes ambientales carcinógenos químicos luz ultravioleta susceptibilidad genØtica

biotoxinas Aguirre el al 1994 e inmunosupresión Work el al 2000 Lutz el al 2001 han

sido asociados a esta condición el agente etiológico mÆs relacionado con la GTFP es un Alfa

Herpesvirus GTHV Aguirre y Spraker 1996 Lackovich el al 1999 genØticamente similar al

Herpesvirus simplex humano 1 y 2 Y al de la Varicela zosler el cual ha sido detectado en mÆs

del 95 de los fibropapilomas de tortugas verdes y tortugas caguamas Caretta caretta de

Florida Hawai Klein 1998 Lu el al 2000a y Australia Quackenbush el al 2000

La fibropapilomatosis se caracteriza por la presencia de tumores cutÆneos de naturaleza

fibroepitelial principalmente en conjuntiva ocular y regiones inguinales y axilares desarrollando

fibrom3s en órganos internos como pulmón hígado rifíón y tracto digestivo lo que ocasiona

2

respectivamente problemas de flotabilidad necrOSlS debida a la presión del parØnquima

hepÆtico falla renal y obstrucción intestinal Herbst 1994 histológicamente desarrollan una

hiperplasia epidØrmica papilar pudiendo estar presente o no la proliferación hiperplÆsica de la

dermis y como lesión inicial una degeneración vacuo lar de las cØlulas epidØrmicas del estrato

basal Jacobson el al 1989

Existen siete especies de tortugas marinas distribuidas en todo el planeta cinco de las

cuales habitan las aguas costeras del OcØano Pacifico Oriental la tortuga carey Erelmochelysimbricala cuyos hÆbitos migratorios no se conocen por completo aunque se cree que se alimenta

cerca de Baja California y anida esporÆdicamente en Nayarit e Islas Marías Cliffton el al

1995 y la tortuga laÚd Dermochelys coriacea que anida en bajas proporciones al sur del

estado son las menos comunes en la península de Baja California Por su parte para la tortuga

prieta Chelonia mydas agassizií representa una importante zona tanto de alimentación como de

desarrollo en el Golfo de California y la Costa del PaC˝fico Cliffton el al 1995 para la tortuga

gol fina Lepidochelys olivacea el sur de la península es una importante zona marginal de

reproducción MÆrquez el al 1982 y la tortuga caguama Caretta caretta es una visitante

ocasional habiØndose documentado que tienen su origen en Japón Resendiz el al 1998 Todas

se distribuyen en las costas de MØxico por lo que se considera a nuestro país en particular a la

península de Baja California como un lugar estratØgico en la conservación e investigación de

tortugas marinas

Actualmente son escasos los estudios realizados en la Península de Baja California acerca

de las enfermedades que afectan a las tortugas marinas Al respecto es necesario comenzar a

detectar aquellos agentes infecciosos virales que puedan llegar a tener un efecto nocivo en estos

organismos que pese a mÆs de 20 afíos de esfuerzos de protección aÚn se encuentran en

constante declive poblacional y por ende en peligro de extinción

3

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Fig 1 Características morfológicas y medidas usadas en las tortugas marinas Tomado yModificado de Pritchard y Mortimer 2000

Fig 2 Tortuga marina con fibropapilomatosis en el Ærea dorsal del cuello Æreasaxilares ojos y región bucal Foto procedente de Honokowai Hawai Underwaterobservations with potential broad application httpwww turtles org tumoursa htm

4

ANTECEDENTES

A partir de la segunda mitad del siglo XX el interØs por el comercio de tortugas marinas

comenzó a aumentar rÆpidamente de tal manera que de 1965 a 1982 su captura en MØxico

contribuyó al mercado con mÆs de la mitad de la producción mundial debido a que su piel se

comenzó a utilizar como sustituto de la piel de cocodrilo En el aæo de 1968 la captura de tortugas

alcanzó el mÆximo nivel de 358 300 organismos MÆrquez el al 1976 En total en el periodo

mencionado se desembarcaron poco mÆs de 900 000 tortugas marinas Ésta captura tan elevada

su largo periodo de maduración sexual y la lenta recuperación de su nÚmero pob acionaL

determinaron que su captura disminuyera casi a un tercio de volumen mencionado en aæos

posteriores MÆrquez 996 Baja California Sur a inicios de los sesentas aportaba mÆs del

50 de captura de tortugas marinas a escala nacional MÆrquez el al 1982

Debido al drÆstico efecto en sus poblaciones por el incremento de las pesquerías se

hicieron los primeros intentos de protección y conservación en todo e país Para 1965 inicia un

programa en el que se determinan tallas mínimas y cuotas de captura se proponen vedas en

periodos reproductivos y se instalan campamentos en distintas zonas no obstante continuó la

captura indiscriminada Cervantes el al 1992 En 197 se decretó una veda parcia por dos aæos

para todas las especies distribuidas en MØxico sin embargo a falta de conocimientos acerca de

su ciclo de vida marcó la falla de esta medida puesto que nunca consideraron su maduración

sexual tardía y por consiguiente a partir de 1973 tuvieron capturas relativamente bajas MÆrquez

el al 976 La pesca continuó y por lo tanto las poblaciones siguieron disminuyendo hasta

que en 1990 fuØ declarada la veda permanente para la captura y comercialización de las especies

distribuidas en MØxico Anónimo 1990

Pese a que la Península de Baja California es una importante zona de desarrollo

alimentación y reproducción para estos organismos son escasos los trabajos que se han

realizado Olguín Mena 1990 Nichols 2001 La mayor parte de los estudios efectuados en

tortugas marinas han sido de distribución abundancia migración y usos del hÆbitat de diferentes

zonas como Loreto y Bahía de los `nge es en e Golfo de California y Bahía Magda ena y Punta

Abreojos en a Costa Occidental O guín Mena 1990 Villanueva F ores 1991 Nichols 1999

Nichols 200 Seminoff el al 2002

5

Dentro de las investigaciones que se han realizado se encuentran ademÆs los de hÆbitos

alimenticios principalmente de tortuga prieta en Bahía Magdalena Hilbert el al 2000 Nichols

el al 2000a y a lo largo del Golfo de California Seminoff el al 1998 Seminoff el al 2002

migraciones transpacíficas de tortuga caguama Resendiz el al 1998a Resendiz el al 1998b Y

estimaciones de abundancias relativas de distintas especies Caldwell 1962 Olguín Mena 1990

Seminoff el al 2003 Un estudio referente a las características de anidación de tortuga golfinaes el realizado por López Castro 2002 y estudios genØticos efectuados en tortuga gol fina

Briceæo Dueæas 1998 tortuga caguama Bowen el al 1995 y tortuga prieta Nichols el ar

2000b

Los estudios acerca de enfelmedades en tortugas mannas de la Península de Baja

California son prÆcticamente nulos Lo mÆs cercano es un estudio toxicológico referente a las

concentraciones de mercurio en escudos de tOliuga prieta en el Golfo de California Presti el al

1999 y otro efectuado por Gardner el al 2003 en el que detectan concentraciones de residuos

organoclorados en tortugas prietas de Bahía Magdalena Actualmente estÆn en proceso

evaluaciones respecto a contaminantes y metales pesados en tortuga caguama y tortuga prieta

JuÆrez Cerón A Fitzgerald S Com Per1

ademÆs de evaluaciones histopatológicas de

etiologías comunes y evaluaciones del metabolismo oxidativo asociados a la presencia de

tumores en tortuga prieta Cordero Tapia Valdivia JimØnez Como per2

Existen diversos estudios asociados a enfern1edades de etiología herpesviral que afectan a

los quelónidos en distintas partes del planeta Jacobson 1994 los cuales han sido documentados

desde 1975 Rebell el al 1975 Enfermedades respiratorias como la rinitis en tOliugas del

desierto se encuentran entre las mÆs frecuentes Cox el al 1980 Keymer 1978 Lawrence y

Needham 1985 Jacobson el al 1991 AdemÆs variados reportes de glositis estomatitis

encefalitis y enteritis Cooper el al 1988 Heldstab y Bestetti 1989 Muller el al 1990 son

reportados principalmente en la tortuga de Herman

En tortugas marinas la enfermedad respiratoria por herpesvirus LET disease fuØ

descrita en 14 ejemplares de tortuga verde de 15 a 20 meses de edad con signos clínicos

respiratorios presentando bronconeul11onía conjuntivitis purulenta estomatitis necrótica y

I Juårez Cerón J A Filzgerald SL email jjuarez@cibnor mx2CorderoTapiaA ValdiviaJímØnezemaí1 acordero@cíbnor mx CIBNORS c Mar Bermejo No 195 Col Playa Palo de Santa Rita La Paz n cs MØxico

6

traqueitis Jacobson el al 1986 mientras que la Grey Patch Disease GPD ha provocado alta

mortandad en juveniles de tortugas verdes en cautiverio Kleese 1984 no obstante no existen

reportes en vida silvestre para ambas patologías Herbst y Jacobson 1995

Respecto a la fibropapilomatosis las primeras descripciones datan de 1930 en las costas

de Florida afectando primeramente a individuos de tortuga verde de donde se toma la

denominación GTFP Green Turtle fibropapillomatosis Jacobson 1992 Sin embargo

recientemente se han encontrado tortugas caguamas Caretta caretta Lackovich el al 1999

tortugas golfinas Lepidochelys olivacea Aguirre el al 1999 y tortugas carey Erelmochelysimbricala D Amato y Moraes 2000 afectadas con esta condición incrementando su

incidencia drÆsticamente a partir de 1980 Actualmente abarca una distribución mundial

circumtropical que incluye Australia Bahamas Barbados Belice Islas CaimÆn Republica

Dominicana Isla Culebra Culacao Colombia PanamÆ Brasil Puerto Rico Se Croix St

Tomas V cnezuela Islas Vírgenes y MØxico Aguirre 992 Herbst 1994 teniendo los índices

mÆs altos las costas de Florida y lIawai donde aproximadamente el 82 N145 Y el 44

N 58 de tortugas capturadas respectivamente han presentado fibropapilomas Swimmer

2000 Aguirre 1998

En MØxico la presencia de fibropapilomas uØ reportada solo en tortuga golfina cuando

la captura era todavía legal a finales de la dØcada de los ochenta en 1997 mediante un estudio de

observación de tumores durante la quinta arribada de la temporada de anidación en la PlayaEscobilla Oaxaca detectaron un total de 140 hembras anidadoras N 9 201 con uno o mÆs

tumores de diferentes tal11l OS Aguirre 1998 Por otra parte Østa enfermedad aparentemente

no ha afectado a las tortugas verdes y prietas en MØxico Plotkin 1995 finalmente McDonald y

Dutton 990 reportan la presencia de fibropapilomas en un juvenil y dos adultos de tortuga

verde en la Bahía de San Diego California

7

JUSTIFICACIÓN

Las tortugas marinas han sobrevivido a fenómenos naturales que provocaron la extinción

de especies contemporÆneas a ellas en distintas Øpocas No obstante las presiones ejercidas por el

hombre provocaron la drÆstica reducción de sus poblaciones lo cual conllevó a que las especiesexistentes fueran catalogadas dentro de alguna condición de protección especial en tratados de

conservación de alcances regionales e internacionales Anónimo 1994 ApØndice 1 CITES

UICN 1994 Pese a esto œltimo las poblaciones de tortugas marinas continœan siendo

amenazadas por diversas actividades antropogØnicas captura incidental captura ilegalcontaminación el aumento del esfuerzo pesquero en zonas aledaæas a sus sitios de alimentación

anidación y corredores migratorios lo que sin duda ha contrarrestado su recuperación

poblacionaL Al respecto es cl1lcial incrementar esfuerzos para identificar aquellos factores que

puedan estar ejerciendo efcctos deletØreos sobre las poblaciones de tortugas marinas del Pacifico

Oriental

En la Península de Baja California cs evidente que existe escaso conocimiento referente al

estado de salud general que prevalece en las poblaciones de tortugas marinas asimismo de la

presencia de agentes patógenos virulentos Distintas pruebas de diagnosis son utilizadas para

detectar y o monitorear enfennedades clínicas o infecciones que afectaron en el pasado o que

estØn activas en el presente por ello una sola pl1leba de diagnosis debe ser interpretada en el

contexto de un panorama general que incluya la historia de la enfermedad en la población

manifestaciones clínicas lesiones visibles e histopatológicas y los resultados de estudios

paralelos Herbst 2000 El presente estudio pretende obtener la primera información en la

Península de Baja California sobre la incidencia de Herpesvirus estrechamente relacionados con

una de las patologías que actualmente amenazan su sobrevivencia la fibropapilomatosis

mediante detección por PCR de secuencias de ADN del herpesvirus Asimismo valorar la

presencia de otros herpesvirus de un determinado espacio tiempo en Chelonia mydas agassizii

Lepidoclzelys olimcca y Caretla caretta De esta manera el verificar su presencia supondría

extremar medidas de manejo y conservación de estos recursos que ya se ven amenazados por los

factores de riesgo ya mencionados

Se pretende ademÆs con los resultados de este estudio ir conformando una base de datos

a manera de historial clínico y así conelacionarIos mediante anÆlisis subsecuentes

8

principalmente de tipo patológicos para proporcionar un cuadro general referente a la salud

poblacional de estas tres especies de tortugas marinas habitantes en las aguas costeras de la

Península de Baja California

OBJETIVOS

GENERAL

Evaluar la presencIa de Herpesvirus como agentes potenciales asociados a tres

enfennedades en tortugas prietas gol finas y caguamas habitantes en el Golfo de California y

Pacifico oriental de la península de Baja California

ESPECIFIcas

Detenninar la presencia ausencia de secuencias herpesvirales en tejidos u órganos de

tortuga marina vía PCR de un espacio tiempo detenninados

De estar presente determinar la secuencia nucleotídica herpesviral y establecer su grado

de similitud con otros Herpesvirus reportados en las bases de datos

9

`REA DE ESTUDIO

Para el presente estudio se colectaron tejidos y órganos de tortugas marinas de cuatro

zonas ubicadas a lo largo de la Costa de la Península de Baja California Fig 3 las cuales son

Bahía de los `ngeles localizada en la costa este del estado de Baja California entre los

28058 Latitud Norte y los 113033 Longitud Oeste Abarca un Ærea de 60 Km2 caracterizada por

un archipiØlago de 17 islas La profundidad mÆxima en la bahía oscila entre 40 y 50 m La

temperatura del agua fluctÚa entre los 140C y los 31 oC con una temperatura ambiente entre los

120C y los 31 oC Resendiz 2002

Bahía Magdalena localizada en la costa del Pacífico entre los 24015 Y 25020 Latitud

Norte y los 111030 Y 112015 Longitud Oeste Gardner y Nichols 2001 Es una de las lagunas

costeras mÆs grandes en las costas del Pacifico mexicano la cual abarca una Ærea por encima de

los 1000 km2 el promedio de la temperatura del agua oscila entre los l80C y los 31 oc

Punta Abreojos específicamente Estero El Coyote situado en la costa occidental de la

península en los 26048 Latitud Norte y los 113027 Longitud Oeste Consta de una laguna

costera inhabitada cuyo trÆfico humano es escaso La temperatura promedio del agua fluctœa

entre los l80C y los 25 50C Acevedo 1997

Punta San Cristóbal localizada al sur del estado entre los 22056 75 Latitud Norte y

110005 Longitud Oeste Olguín 1990 con una temperatura de entre 140C y 350C

10

la

lb h

Fig 3 Localización del Ærea de estudio lb Bahía de los `ngeles 1 Y

Estero el Coyote 2 le Bahía Magdalena 3 y Punta San Cristóbal 4

Mapas facilitados y modificados de INEGI La Paz Baja California Sur

11

MATERIAL Y MÉTODOS

Trabajo de campo

Para el presente estudio se analizaron muestras de 93 organismos 78 de tortugas prietas

Chelonia mydas agassizii 10 de tortugas golfinas Lepidochelys olivacea y 5 de tortugas

caguamas Cmetta caretta procedentes de las 4 zonas mencionadas La colecta de muestras se

efectuó con el apoyo de monitoreos mensuales realizados por el Grupo Tortuguero de las

Californias en conjunto con CIBNOR y con ayuda de pescadores de las comunidades aledaæas

Colecta de tejidos de organismos vivos

Se obtuvieron 3 muestras de piel de aproximadamente 0 5 cm2 por cada organismo de la

región dorsal del cuello región axilar y región inguinal limpiando previamente con alcohol

absoluto cada zona utilizando una navaja quirœrgica por organismo y removiendo

cuidadosamente la piel con pinzas estØriles cada herida realizada al organismo se lavó y

desinfectó con antisØptico Las muestras se colocaron en distintos viales con etanol frío al 70

previo a los anÆlisis de laboratorio Fitzsimmons etal 2000

Colecta de tejidos y órganos de organismos muertos

Se obtuvieron muestras de hígado mœsculo riæón tracto digestivo 15 a 30 g c u

corazón bazo y membrana nictitante de tortugas varadas y de aquellas que perecieron por pesca

incidental en redes de pescadores de las Æreas de estudio seæaladas Las muestras se envolvieron

en papel aluminio y se colocaron en bolsas de plÆstico cerradas etiquetadas debidamente y

congelÆndolas lo mÆs pronto posible al mismo tiempo se preservaron 0 5 cm3 de cada muestra

en viales con etanol frío al 70

Al momento de la colecta de muestras se realizó una mmUClOsa observación a los

organismos para registrar lesiones o anormalidades que pudieran presentar así como sus datos

específicos talla peso localidad fecha de colecta y en su defecto fecha de muerte

12

Trabajo de laboratorio

Extracción y cuantificación de ADNapartir de tejido

La extracción de ADN se efectuó modificando el protocolo citado por Lu et al 2000

Se colocaron de 03 a 0 5 gr de cada tejido finamente macerado con un mortØro de mano en

viales con buffer lítico de Dodecil Sulfato de Sodio SDS conteniendo 100 mM NaCI 10mM

Tris HCl pH 8 25 mM EDTA pH 8 SDS 0 5 y 0 1 mg ml de proteinasa K manteniendo una

proporción tejido amortiguador de 100 mg 12 mI amortiguador y dejÆndolos reposar de 15 a18

hrs a una temperatura de 500C Se realizaron 2 extracciones suceSIvas de

FenolCloroformo lsoamil alcohol centrifugando a 12000 rp m en cada extracción aæadiendo

finalmente 110 de acetato de amonio a 4 M Y pH 8 al volumen total de la extracción y 2 5 el

volumen de la muestra total de etanol absoluto frío Se incubaron por 24 hrs a 40C para

precipitar el ADN y posteriormente se centrifugaron por 10 I11in a 12000 r p m se extrajo el

etanol con bomba de vacío y se agregó al vial 1 mi de etanol al 70 para centrífugar por 5 mino

Se extrajo el sobrenadante dejando el ADN en el vial y se secó a 300C por 15 mm en

concentrador de vaC˝o Finalmente se resuspendió el ADN en 150 250jl1 de buffer TE lOmM

Tris HCI 1mM EDTA apH 8

La presencia de ADN se verificó mediante electroforesis en geles de agarosa al 1

teæidos con bromuro de etidio 3 t1 x 50 mI de agarosa al 1 Y visualizados con luz UV

Posteriormente se cuantificó el ADN mediante la medición espectro foto mØtrica de la cantidad de

radiación ultravioleta absorbida a longitudes de onda de 260 a 280 nm diluyendo 1 tl de la

extracción de ADN de cada muestra en 1 mI de agua destilada para cada lectura y preparando

stock s de 50 Ll a una concentración de 50ng ADN lI

Detección de secuencias herpesvirales vía PCR purificación y secuenciación

La detección de secuencias herpesvirales entendiendo por detección como la observación

de una banda en el gel teæida con bromuro de etidio la cual migrarÆ al peso molecular del

producto PCR esperado se realizó mediante PCR anidado Fig 4 uti lizando cinco primers

degenerados que amplifican una región altamente conservada del gen de la ADN polimerasa

herpesviral la degeneración de los primers permite las combinaciones posibles para la

codificación de un aminoÆcido aa por ejemplo la Tirosina Y podrÆ ser codificada tanto por

13

5 TAT como por 5 TAC La amplificación se efectuó con ligeras modificaciones al protocolodescrito por VanDevanter elal 1996

Primera amplificación

Se preparó una reacción por muestra con volumen total de 25 1 conteniendo aprox

100 ng de ADN I M de cada Primer 15 2mM de MgCh 200 M de cada

Desoxiribonucleótido Trifosfatado Buffer PCR Ix y 125 U de Taq ADN polimerasa Se

realizaron en total 45 ciclos de amplificación donde cada ciclo consistió de 30s de

desnaturalización a 940C 60s de alineación a 500C y 60s de extensión a noc en

termociclador GeneAmp@ PCR System 2700 Fig 5 Los primers utilizados en esta pnmera

amplificación tomados de VanDevanter elal 1996 fueron

DFA 5 GAYTTYGCNAGYYTNTAYCC 3

ILK 5 TCCTGGACAAGCAGCARNYSGCNMTNAA 3

KGl 5 GTCTTGCTCACCAGNTCNACNCCYTT 3

Donde Y Tirosina Tyr N Asparagina Asn R Arginina Arg S Serina Ser

M Metionina Met A Adenina G Guanina T Timina y e Citosina

DespuØs de completar los ciclos se incubaron las reacciones por 7 min de extensión final

a noc y se preservaron a 40C El producto esperado en esta primera fase es de aprox 880 pares

de bases

Segunda amplificación

La segunda amplificación PCR anidada se llevó a cabo usando 5 1 del producto del

PCR primario como ADN molde en una reacción total de 25 1 bajo las mismas condiciones que

en la primera amplificación Los primers utilizados en esta segunda amplificación fueron

TGV 5 TGT AACTCGGTGTAYGGNTTYACNGGNGT 3

IYG 5 CACAGAGTCCGTRTCNCCRTADAT 3

Donde D `cido aspÆrtico Asp VanDevanter el al 1996

14

CFA IU TGV IYG KGi

Fig 4 Representación esquemÆtIca de la ubIcacIón y dIreccIón de los pnmers degenerados sobre lasecuencia herpesviraL Los Primers DFA ILK Y TGV actÚan como forwards y los primers IYG y KGI

actÚan como reverse Siempre en dirección 5 t 3

Una vez completados los ciclos de amplificación los productos de la PCR se analizaron

en geles de agarosa al 2 como se mencionó anterio1111ente El producto esperado en la segunda

amplificación tendrÆ un rango de variación de 215 a 315 pares de bases

Como control positivo se utilizó ADN de la cepa Rispens CVI 988 RISMAV AC@

NOBILIS@ de Herpesvirus que es un virus atenuado el cual se utiliza como vacuna contra la

enfermedad de Marek Como control negativo se utilizó agua estØril

La presencia de secuencias herpesvirales se determinó mediante el conteo directo de

bandas presentes en gel de agarosa al 2 Para referenciar la talla molecular de los productos

amplificados se utilizó marcador VIII de pesos moleculares para ADN de 0 19 a 1 11 kbp

Roche Molecular Biochemicals Cat No 1336045

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASAPRIMER CICLO SEGUNDO CICLO TERCER CICLO

DQ lll1t rdl iòlt AÜt12l11 1ÒIt lól tal1J1ÓIt DQ IIl1t A it12l111ólt lól tIltu ón DQ lIl1t Al1lIadólt BOCtIltulón

o

45CICLOS

ADN TORTUGASc

I IPRIMHR5 T AQ POUMERASA

I

TRMPERATURA e

50 C

94 C

72 C

o g9 60 g9 60 g9 jO g9 60 g9 60 g9 o g9 60 g9 60 Q9T1llMPO SJJG

Fig 5 Representación bosquejada de los ciclos realizados durante laReacción en Cadena de la Polimerasa

15

Purificación y SecuenC˝ación

Los productos amplificados se purificaron usando el protocolo del kit QIAquick@ para

purificación de productos PCR en gel de agarosa al 2 QIAquick@ Comp Cat No 28180

2002 Se realizaron cortes de las bandas presentes en gel de agarosa colocando los cortes en

distintos viales Se adicionaron 3 volÚmenes de Buffer QG por uno de gel e j 300 1 de Buffer

IOOmg de gel incubÆndolos a 500C por 10 min Una vez disuelta la agarosa se aæadió 1

volumen de isopropanol absoluto por 1 de gel a continuación se colocó la mezcla en una

columna QIAquick con un tubo para microcentrifuga y se centrifugó a 12 000 r p m durante 1

mino El flujo que pasó a travØs de la columna del tubo fue desechado se adicionaron 0 75 mI de

buffer PE y se centrifugó por 1 min retirando de nueva cuenta el flujo del lavado El producto

purificado uØ eluído de la columna hacia un tubo nuevo adicionando 50111 de agua miliQ por

centrifugación durante lmin preservÆndolos a 40C

Para corroborar que los productos amplificados corresponderían a Herpesvirus se

determinó su secuencia nucleotídica a travØs del servicio de secuenciación de Macrogen Inc

http www macrogen com

Finalmente la secuencia obtenida fuØ comparada con otras secuencIas herpesvirales

expuestas en el GENBANK mediante el uso de BLAST 2 07 Basic Local Alignment Search

Tool del Centro Nacional para la Información Biotecnológica NCBI National Center for

Biotechno logy Information httpwww ncbi nlm nih gov

16

RESULTADOS

Descripción General de los tejidosy órganos analizados de tortugas marinas

Se procesaron en total 356 muestras de 93 tortugas marinas provenientes de las 4

localidades mencionadas Tablas 1 y Il 61 fueron organismos capturados para muestreo

marcados y liberados durante los monitoreos realizados por el Grupo Tortuguero de las

Californias los órganos colectados procedieron de 23 organismos que perecieron por pesca

incidental mientras que otras 9 fueron crías que perecieron de diferentes nidos al momento de su

eclosión Tabla 1II

Tabla 1 Tejidos y órganos analizados para cada orgal1lsmo contemplado en el estudio La clavereD d d t rt d 1 d derencIa a a ca a o u rra correspon ea la mes ano y numero s e orgamsmo s

BAHIA DE LOS ANGELES SISTEMA OJO

PIEL MÚSCULO HIGADO RIÑÓN DIGESTIVO CORAZON BAlO PARPADO

Clave x TOIluga EspeCie1706020 I Chelonla 111 X X X X

11080201 Chelonia 111 X

14080202 Chclonia 111 X

14080203 Chelonia 111 X

14080204 Chelonía 111 X

10080202 Cm elta c X

PUNTA SISTEMA OJO

ABREOlOS PIEL MÚSCULO IIIGADO RIÑÓN DIGESTIVO CORAlON BAZO PARPADO

28090203 Chrlonia 111 X X X X X X

300802 O I A 06 Chelonia 111 X

280902 O I A 02 Chelonia 111 X

29090201 A 07 Chclonla 111 X

12100201 03 Chelonla 111 X

07040302 A 38 Chelonia 111 X

BAHIA SISTEMA OJO

MAGDALENA PIEL MÚSCULO HIGADO RIÑÓN DIGESTIVO CORAlON BAZO PARPADO

X0302020 I Chclonla 111 X X

0802020 I Chclonla 111 X X X

1202020 I Chelonla 111 X X X X

1602020 I Chelol1la In X X X

23030203 Cal ella c X X X X X X

2403020 I Cal ella e X X X X X X

2403020 I Caretta e X25030202 Chelonia In X X X X X X

27030202 Carelta c X X X X X X X X

27030201 Chelonia III X X X

2803020 I Chelonia III X X X

28030202 ChclOllla 111 X X X L28030203 Chcloma In X X X X X X

2303020 I Chelonìa In X X X

2004020 I Chelonía 111 X X

11060201 ChclOllla 111 X X X

11060202 Chclonia 111 X X

11060203 Chclonia In X X X X

0608020 I Chelonla 111 X

06080202 Chelonìa In X

07080201 Chelonìa III X X X X

CABO SISTEMA OJO

SAN LUCAS PIEL MÚSCULO 1I1GADO RIÑÓN DIGESTIVO CORAZON BAZO PARPADO

Sil 01 II coidochclvs X X X X X X

SiCOIA0911 0 el las X X

17

Tabla 11 Nœmero de muestras de tejidos y órganos por cada especie de tortuga marina Cada muestra de

piel Axilar Inguinal y `rea dorsal del cuello fuØ considerada de forma separada En total se analizaron356 muestras

DaMa de los Angeles Punta Abreojos DahíâMaldalena Cabo San Lucas

TEJIDOS U Chelollia m Caretta Chelollia mydas Chelollia m Caretta Lepidocl1elysORCANOS agassizii caretta agassizii agassizii caretta Olimcea

Pie x3 Axil

Ingle y dorsal 5 15 I 3 56 168 17 51 4 12 10 30

Mœsculo1 1 10 3 10

HígadoI I 10 3 1

Rii1ónI 3 I I

Sistema

diRestivo 2 I

CorazónI 3 3 1

Bazo3 3

OjoI I 7 3 I

TOTAL DE

MUESTRAS 18 3 173 89 29 44

Tabla 111 Relación por localidad y especie de tortugas marinas muestreadas vivas durante monitoreos yva d d Ira as o muertas por pesca mCI enta

ESPECIELOCALIDAD

Chelollia mydas agassiziii Caretta caretta Lepidochelys olivacea

Bahía de los Angeles 4 vivas Il muerta I viva

Punta Abreojos 55 vivas 1 muerta

Bahía Magdalena 17 muertas 1 viva 3 muertas

Cabos San Lucas 1 adulta muerta 9 crías

18

Las tallas del largo recto del caparazón LRC de las tortugas que se muestrearon

oscilaron entre 70 y 52 cm con una media de 6248 cm para tortuga caguama entre 88 y 42 cm

con una media de 58 0 l cm para tortuga prieta y 61 cm para el organismo adulto de tortuga

gol fina la talla media de 13s crías analizadas fuØ de 42 mm

Por otra parte durante el proceso de la colecta de muestras se observaron dos especimenes

de tortuga prieta 30080201 Y 30080202 procedentes de Punta Abreojos con elongaciones

epidØrmicas de 1 5 a 1 8 cm de diÆmetro situados en las aletas anteriores izquierdas Mediante

anÆlisis histológico se descartó que se trataran de tumores puesto que no presentaban las

características propias de estos tales como una hiperplasia epidØrmica papilar o una proliferación

hiperplasica de la dermis figs 6 y 7 Asimismo mostraron negatividad ante el anÆlisis vía PCR

para detectar presencia herpesviral

I ìhZ l

H

T it

11

10

ìi t 1

rl

ttl ò

rf1 ir

Fig 6 Corte histológico del tejido cutÆneo con elongaciones epidØrmicasde Che onia mydas agasiizii aparentemente sano en comparación con

con lIna con Fr inferior Foto Amaury Cordero

Fig 7

19

AnÆlisis de las Muestras Extracción Amplificación Purificación y Secuenciación

Durante las extracciones de ADN se obtuvieron concentraciones que oscilaron de entre

69 a 95 ng ll de las muestras de hígado mœsculo corazón y tracto digestivo mientras que de las

muestras de piel riæón y ojo membrana nictitante se obtuvieron concentraciones de entre 35 a

63 ng ll Fig 8

MUESTRAS 2 a35 TEJIDOS Y

ORGANOS DE TORTUGAS M

Fig 8 ADN geonómico de tortugas marinas visualizados en geles de agarosa Carril 1Marcador de ADN Los carriles 2 al 17 el 21 22 24 27 Y 28 M muestra correspondena piel de distintas partes del organismo Los carriles 18 a 20 pertenecen a riæón y ojosLos 23 25 Y 26 a corazón del 29 a la 32 a hígadoy del 33 a 35 a mœsculo

Del total de muestras analizadas se amplificaron secuencias herpesvirales Figs 9 y 10 de

piel de 2 aletas anteriores y una posterior de tres tortugas prietas procedentes de Bahía Magdalena

06080201 16020201 Y 25030202 El primer organismo presentó escoriaciones en su caparazón

ademÆs de heridas superficiales de aproximadamente 3 a 5 cm de longitud en sus aletas

anteriores mientras que su plastrón presentaba una forma cóncava característica de tortugas con

malnutrición Los otros dos organismos que fueron positivos al anÆlisis de PCR no presentaron

anomalías físicas visibles

20

MI C HVl HV2 HV3 c

Fig 9 Detección de secuencias herpesvirales por PCR primario en muestras de pielCarril 1 Marcador de peso molecular MM Carril 2 Control Positivo C HVatenuadode la enfermedad de Marek Carriles 3 4 Y 5 HVl HV2 y HV3 muestras positivas Carril 6

Control Negativo C Agua estØril 7 a 20 muestras de Piel tejidos y órganos negativasLos amplicones presentan una talla aprox de 880bp

Fig 10 PCR secundario Productos amplificados a partir del PCR primario Carril 1 marcadorde peso molecular MM Carriles 2 3 Y 4 HV2 HVl y HV3 muestras positivas Carril

5 control positivo C HVatenuado de la enfermedad de Marek Carril 6 control negativoC Agua estØril 7 a 20 muestras de piel tejidos y órganos negativas Los amplicones

presentan una talla de 224bp

0060427 21

Se obtuvieron 50 nglJll del amplicon HV1 purificado Fig 11 en columnas QIAQUICK

El amplicon secuenciado fuØ comparado con otras secuencias herpesvirales del GenBank

mediante el uso del BLAST 2 07 Basic Local Alignment Search Tool para conocer el grado de

similitud con otros herpesvirus

Fig 11 Amplicon purificado de PCR secundario HVl

Banda 1 Marcador de Peso Molecular de ADN

La comparación de las secuencias reveló que la secuencia amplificada de 224 pares de

bases presentó similitud con 163 nucleótidos del Herpesvirus bovino 2 HVB02 Fig 12 Por

otro lado la secuencia de aminoÆcidos deducida mostró una similitud de 75 con el HVB02

Fig 13 Para el Herpesvirus relacionado con la fibropapilomatosis GTHV en tortugas verdes

procedentes de Hawai reveló similitud del 44 siendo la misma para las tortugas verdes

tortugas caguamas y tortugas golfinas procedentes de Florida Finalmente solo fue similar al

herpesvirus causante de la enfennedad de LET en un 27 Fig 14

a

15 30 45

ATC GAA TGG ATT TTG CCG NGC CTA CCG GTC GCT GCT ACG GTC ACC60 75 90

ACC ATA GGG AGG GAC ATG CTC CTT GCC ACG CGC GAC TAC GTC CAC105 120 135

TCG CGG TGG GTC AGC TTT GAC GGC CTC GTG ATG GAC TTT CCG GAG150 165 180

GCG GCC GCA ATC CGG GGC GAG GGA GAG TAC TCC ATG CGC ATC CTG

195 210 224

TeT GNG CTG TNN NNN GTG ANC CGG ANT CCT NTG CTC TGT GNN NN

22

b

HV TM 14 TGCCGNGCCTACCGGTCGCTGCTACGGTCACCACCATAGGGAGGGACATGCTCCTTGCCA 73

HVBo2 14 TGCCGTGCCTACCGGTCGCTGCTACGGTCACCACCATAGGGAGGGACATGCTCCTTGCCA 73

HV TM 74 CGCGCGACTACGTCCACTCGCGGTGGGTCAGCTTTGACGGCCTCGTGATGGACTTTCCGG 133

HVBo2 74 CGCGCGACTACGTCCACTCGCGGTGGGTCAGCTTTGACGGCCTCGTGATGGACTTTCCGG 133

HV TM 134 AGGCGGCCGCAATCCGGGGCGAGGGAGAGTACTCCATGCGCATC 177

HVBo2 134 AGGCGGCCGCAATCCGGGGCGAGGGAGAGTACTCCATGCGCATC 177

Fig 12 a Secuencia de nuc eótidos del segmento del gen de la ADN polimerasa herpesviralamplificada de Chelonia ll agassizií b Alineación de nucleótidos de la secuencia amplificada BV TMcon la secuencia del Berpesvirus bovino 2 HVBo2 No de Acceso GenBank AF03181 O Herpesvirusbovino 2

HVTM 10 ILPXLPVAATVTTIGRDMLLATRDYVHSRWVSFDGLVMDFPEAAAIRGEGEYSMRIL 180

Comparación LP LPVAATVTTIGRDMLLATRDYVHSRWVSFDGLVMDFPEAAAIRGEGEYSMRI

HVBo2 829 LLPCLPVAATVTTIGRDMLLATRDYVHSRWVSFDGLVMDFPEAAAIRGEGEYSMRII 885

Fig 13 Alineación de aminoÆcidos deducidos de la secuencia amplificada HVTM contra la secuencia

de Herpesvirus bovino 2 No de Acceso GenBank AAD55134

a

HVTM 13 LPXLPVAATVTTIGRDMLLATRDYVHSRW VSFDGLVMDFPEAAAI RGEGEYSMRI 177

Comparación LP L VAATVTT GRDMLLATRD H RW F L D PE AA R E R

GTHV 105 LPCLEVAATVTTVGRDMLLATRDFIllTRWGTDFEALLVDAPELAAFRRPESLFGLRV 161

b

HVTM 10 ILPXLPVAATVTTIGRDMLLATRDYVHSRWVSFDGLVMDFPE AAAIRGEGEYSMRI 177

Comparación LPL AA TVTT GR MLL TRDY H RW DFPE S R

HVLET 4 LLPCLEIMTVTTVGRAMLLSTRDYIllERWRDRERFLLDFPEFREHVVSDAPHSLRV 60

Fig 14 a Comparación de aminoÆcidos entre la secuencia amplificada HVTM y Herpesvirusrelacionados con la GTFP en tortugas verdes procedentes de Hawai No Acceso AAC2668 1 Florida

E U AAC26682 tortuga caguama AAC26683 y tortuga golfina AAC26684 siendo la misma

secuencia para las tres especies GTHV mostrando un 44 de similitud b Alineación entre la

secuencia amplificada y la secuencia del Herpesvirus causante de la enfermedad de LET AAM95779 el

cual revela solo un 27 de similitud con el llerpesvirus detectado

23

DISCUSIÓN

La comparación de los aminoÆcidos traducidos de la secuencia amplificada en el presente

estudio obtenida de tortugas prietas Chelonia mydas agassizii 3 8 N 78 de Bahía

Magdalena reveló cercana similitud a una región codificante de la ADN polimerasa de varias

especies de Herpesvirus HV específicamente al Herpesvirus Bovino 2 con el cual compartió

el 75 de similitud de acuerdo a la alineación de BLAST 2 07 mientras que para los HV

conocidos como agentes etiológicos en patologías de tortugas marinas se encontraron similitudes

de 44 entre aminoÆcidos con el GTHV y solo el 27 con el HV causante de la enfermedad de

LET Esto sugiere que la secuencia obtenida en el estudio pudiera ser atribuida a un Herpesviruschelonido no reportado ya que no es similar en proporciones considerables con algœn herpesvirus

conocido Un estudio realizado por Lackovich el al 1999 referente a la asociación de HV con

fibropapilomatosis en tortugas verdes y caguamas de Florida E 0 reveló que sus secuencias

obtenidas fueron homólogas al Herpesvirus bovino l y 2 en un 51 a 52 sin embargo en ese

estudio los HV identificados alinearon en un 95 a 99 con el HV asociado a la GTFP

Diversos estudios han sido realizados utilizando el protocolo desarrollado por

VanDevanter el al 1996 en el que se emplean primers degenerados en un formato de PCR

anidado por medio del cual han identificado JIV en variados organismos Blanchard el al 2001

Lu el al 2000 Une el al 1999 y Une el al 2000 siendo efectiva de la misma manera en la

detección de infecciones en etapas iniciales o en estado de latencia Une el al 2000 Las

investigaciones efectuadas en tortugas marinas al respecto se han enfocado en la identificación

de Alphaherpesvirus causantes de la fibropapilomatosis la cual a pesar de provocar tumores no

considerados malignos Herbst el al 1999 se desarrollan fibromas en órganos internos alterando

su función normal ademÆs de tumores cutÆneos que interfieren con su alimentación locomoción

y visión adecuadas Herbst 1994 Aunque esta enfemledad tiene una distribución mundial

circumtropical desarrollÆndose en Florida Hawai E U Y Australia en proporciones epidØmicas

principalmente en tortugas verdes no ha afectado a las tortugas prietas habitantes en las costas

mexicanas Plotkin 1995 Hess I996 menciona que cuando determinada metapoblación se ve

expuesta ante una enfermedad infecciosa la migración de organismos facilita la proliferación de

la enfermedad en sus poblaciones adyacentes aunado a esto Gog et al 2002 enuncia que en

En este estudio se considera a la tortuga prieta comosubcspecie Chc onia II das agassizii sin embargo su SistemÆtica y Nomenclatura aœn

permanece en controversia se recomienda revisar lasiguiente literatura Karl y Bowen 1998 y Pritehard 1999

24

individuos enfermos el estrØs que provoca su migración incrementa de manera particular

variando la distribución de la enfermedad por grupos migratorios de manera que el efecto del

agente patógeno en una población influirÆ dependiendo del grado de estrØs fisiológico en los

organismos Ahora bien la tortuga verde la tortuga gol fina y la caguama en comparación con la

tortuga prieta ocupan un amplio rango de hÆbitats Climon el al 1995 Avise y Bowen 1994

Parte de estas zonas donde se han detectado las mayores tasas de incidencia de tortugas marinas

afectadas con fibropapilomatosis presentan disturbios ambientales ocasionados por diversas

actividades antropogØnicas la región del Gran Caribe por ejemplo alberga grandes refinerías y se

caracteriza por su variedad de rutas marítimas activas mÆs de 700 000 toneladas de petróleo son

transportadas en la región diariamente Aunado a ello el daæo efectuado por derrames de alto

impacto causados por lavados de depósitos de barcos cisterna produce contaminación crónica

reflejada en la reducción de la biomasa de pastos marinos fuente principal de alimento para la

tortuga verde Keller y Jackson 1993Estudios realizados en Kaneohe Hawai afirman a su vez

que los veliimientos de aguas residuales subtratadas aumentan la concentración de nutrientes lo

cual incrementa la biomasa de algas bentónicas y de fitoplancton en la columna de agua Gibson

y Smith 2000 propiciando el surgimiento de blooms o mareas rojas De esta manera los factores

enunciados podrían predisponer entre muchos otros a estos organismos a condiciones de estrØs

al verse alteradas sus Æreas de alimentación anidación o rutas migratorias

La península de Baja California no estÆ exenta de presentar disturbios ambientales

originados por actividades humanas uno de los mÆs conocidos en la región es el ocasionado por

la empresa salinera ESSA localizada en Guerrero Negro Baja California en el que las

concentraciones de diversos minerales Magnesia mercurio plomo arsØnico hierro plomo

zinc molibdcno manganeso cromo sulfuros y rosfatos se ven incrementadas por la saturación

de salmuera los cuales se consideran tóxicos en los organismos cuando no son esenciales y son

bioacumulados o cuando se encuentran por arriba de su concentración nornlal Cantœ 1999 En

1998 se repOlió mortandad de 94 tOliugas prietas en la laguna Ojo de Liebre en el estado Los

anÆlisis toxicológicos realizados apuntaron hacia el derrame de una elevada concentración salina

y otros minerales lo cual afirman provocaría choque osmótico causando la muerte de los

organismos Anónimo 1998 Sin embargo es mÆs que conocida la problemÆtica referente a la

pesca incidental y el incremento en el esfuerzo pesquero por parte de los lugareæos en las zonas

aledaæas Anónimo 2000 Por otra parte Prcsti el al 1999 menciona que la zona adyacente a

25

Bahía de los `ngeles en Baja California fuØ en antaæo una principal zona de extracción de oro y

mercurio sugiriendo a Østa como origen potencial de contaminación de mercurio en la región

Mediante su estudio se encontraron concentraciones de mercurio en carapachos de tortuga prieta

sin embargo las concentraciones fueron bajas en comparación con Lepidochelys kempii tortuga

lora habitante en el Golfo de MØxico En un estudio semejante Gardner el al 2003 afirma

haber detectado la presencia de residuos organoclorados en tejidos y órganos de tortugas prietas

habitantes en Bahía Magdalena y La Paz B C S pero al igual que el estudio anterior las

concentraciones detectadas en ese estudio fueron bajas atribuyendo esto a que la región no es

industrializada y por tanto las concentraciones de los contaminantes ambientales tienden a ser

mÆs bajos que en regiones mÆs desanolladas industrialmente

A pesar de que Aguirrc el a 1994 no encuentra conelación directa entre

contaminantes y la presencia de FP es importante destacar que es mÆs frecuente observar

tumores en tortugas verdes capturadas cerca de regiones densamente pobladas e industrializadas

que en organismos que habitan regiones donde la población estÆ esparcida Milton y Lutz 2003

la cual es la situación que se puede observar en la península de Baja California pues aœn es

considerada como un ambiente pristino

La principal preocupación que actualmente plantea la FP es que no se ha logrado aislar el

Herpesvims chelonido para conoborar la etiología de Østa enfermedad Como ya se ha

mencionado la FP ha sido asociada a diferentes factores como la inmunosupresión por

contaminantes estrØs fisiológico biotoxinas y vims e incluso pudiera tratarse de una enfermedad

multifactorial al interactuar e influir cualquiera de los factores mencionados durante el desanollo

tumoral Alonso Aguine Como Persl Esto œltimo incrementa la problemÆtica en cuanto a la

identificación de su etiología al quedar incompletos y no poder comprobar los postulados de

Kosh es decir aislar el agente patógeno su inoculación en organismos sanos los cuales deberÆn

desanoIlar la enfermedad y el aislamiento finalmente del patógeno a partir de organismosinoculados

En los reptiles como en los demÆs vertebrados el mantenimiento de la salud estÆ basado

en un alto repertorio de respuestas defensivas contra patógenos y estímulos externos Así una

reducción en los mecanismos de respuesta humoral o celular que median los mecanismos de

defensa conllevarÆ a un estrØs fisiológico e inhibirÆ su capacidad de respuesta ante agentes

lDr Alonso Aguirre Wildlife Laboratories lnc 1401 Duff Drive Suite 600 Fort Collins Colorado 80524 USA

26

infecciosos Aguirre el al 1995 Work el al 2000 Work et al 2001 Bajo este contexto los

Herpesvirus representan un modelo ejemplar al tratarse de entidades ampliamente extendidas en

los vertebrados por su capacidad de permanecer en latencia por largos periodos de tiempo y aun

mÆs por su capacidad de reactivación ante estímulos favorables para su replicación De manera

general la infección por Herpesvirus inicia en la penetración a cØlulas epiteliales en donde

comienza su replicación para posteriormente infectar cØlulas nerviosas y trasladarse a los

ganglios sensoriales en los cuales puede mantenerse en latencia o continuar replieÆndose cuando

lo hace puede llegar a invadir cualquier tejido u órgano Fraser y Valyí Nagy 1993 Curry et

al 2000 menciona que actualmente es poco el conocimiento que se tiene acerca del

mecanismo de transmisión de Herpesvirus en ambientes marinos aunque asegura pueden ser

transmitidos mediante el contacto directo por vectores o por contacto de virus en sedimentos o

suspendidos en la columna de agua mediante su estudio realizado en tortugas verdes pone en

manifiesto que las enfermedades ocasionadas por Herpesvirus pueden mantener su grado de

infectividad por largos periodos en el ambiente marino por lo que las zonas de alta densidad

como las de alimentación y anidación son un reservorio para estos agentes infecciosos

Por otra parte el detectar en una población agentes infecciosos puede ser completamente

incidental a la causa real de una enfennedad no obstante no deja de ser imprescindible su

detección como parte inicial de una evaluación de salud poblacional mÆs aœn al tratarse de

organismos de los cuales se carece de información Los resultados obtenidos en el presente

estudio resaltan mencionada impoliancia dada la preocupación que ha manifestado la FP al

desarrollarse en proporciones epidØmicas

Ya se ha mencionado que los HV estÆn ampliamente distribuidos en gran parte de los

vertebrados de la misma manera se encuentran en invertebrados provocando altos índices de

mortandad Hine el al 1992 Es probable que la extensión y persistencia de los HV en un

ambiente marino dependa de numerosos factores ambientales la composición del agua de mar

estÆ en constante flujo así la estabilidad de los virus es influenciada por la temperatura

corrientes profundidad luz solar y plL El material orgÆnico específicamente las proteínas

pueden incrementar su sobrcvivcncia Lipson y Stotzky 1984 AdemÆs de los componentes

fisicos y químicos los componentes biológicos de una localidad específica puede afectar de

manera positiva o negativa su proliferación Los microbios que producen sustancias antivirales

han sido bien documentados en hÆbitats marinos cuando se encuentran presentes se ha observado

27

una disminución en la cantidad de virus Girones et al 1989 de Østa forma la presencia de

microbios en una localidad contra la ausencia de estos en alguna otra puede explicar la

diferencia de la sobrevivencia de los virus y transmitibilidad de una enfermedad

Por lo anteriormente expuesto es dificil interpretar la presencia de los HV detectados en

los especimenes de Chelonia lIlydas agassizii obtenidos en este estudio los cuales a pesar de no

estar relacionados con el HV chelonido asociado a la FP se desconoce el efecto que pudiera

estar ejerciendo en estos organismos si bien es cierto que pudiera tratarse de llna detección

incidental tambiØn pudiera estar ejerciendo en ellos un efecto deletØreo Por esto œltimo estudios

adicionales son necesarios para poder entender el significado de este tipo de patógenos en

tortugas marinas de la región

Finalmente aunque las muestras analizadas de tortuga golfina y tortuga caguama

resultaron negativas ante la detección de Herpesvirus es necesario continuar monitoreando estas

poblaciones principalmente porque son especies altamente migratorias y porque han sido

afectadas por la fibropapilomatosis

28

CONCLUSIONES

Con ligeras modificaciones el protocolo de Reacción en Cadena de la Polimerasa en

fornlato anidado y los primers diseæados por VanDevanter el al 1996 utilizados en

este estudio para amplificar una región de la ADN Polimerasa herpesviral resultaron

óptimos para la detección de Herpesvims en tortugas marinas de la Península de Baja

California

Se detectó la presencia de Herpesvims con un 75 de similitud al Herpesvirus bovino 2

en tres individuos de Chelol1ia mydas agassizii en Bahía Magdalena Baja California Sur

siendo estos los primeros Herpesvil1ls reportados para esta subespecie

En los individuos analizados de tortugas prietas no se detectó presencia de HV asociados

a enfennedades en tortugas marinas no obstante dada la presencia herpesviral es

necesario realizar estudios adicionales tanto inmunológicos como fisiológicos para

comprender el efecto de estos patógenos en las poblaciones de tortugas marinas habitantes

en la península de Baja California

Se detennina la ausencia de Herpesvims etiológicos de patologías en los individuos

analizados de Lepidochelys olivacea n IO y Caretta caretta n 5 habitantes en la

península Bajacaliforniana no obstante se sugiere un anÆlisis mÆs extenso respecto a estas

especies ya que se han visto afectadas por la fibropapilomatosis en MØxico y Hawai

respectivamente

La infonnación referente a la salud de tortugas marinas de la península de Baja California

es aÚn escasa en base a esto y dado que actualmente siguen siendo afectadas por

diversas actividades humanas es cl1lcial incrementar esfuerzos en la detección de factores

que puedan provocar efectos deletØreos en estos organismos mediante estudios de salud

en todos los Æmbitos de las poblaciones de tortugas marinas residentes en la región de la

península de Baja Cali fomia

29

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