B UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA · 2012. 8. 14. ·...

BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

ASIGNATURA : BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIA MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

ELABORARON: M.C. MARIA DEL ROCIO VILLA GONZALEZ MVZ. ERICK CECILIO FERNANDEZ MENESES.

M.C. CARLOS GERARDO CASTILLO SOSA

OTOÑO 2012 Tecamachalco, Pue .

Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas

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CONTENIDO Pag

I. Plan institucional de desarrollo de la Facultad de Medicina

Veterinaria y Zootecnia 1

II. Introducción 2 III. Ubicación de la asignatura en el mapa curricular 3

IV. Nivel de desempeño 4 V. Mapa del sistema de practicas 5

VI. Practicas generales de seguridad, reglamentos y

procedimientos generales 6

Practica 1: Conocimiento, manejo del material y aparatos del laboratorio 10

Práctica 2: Tinción de Gram 15 Práctica 3: Tinción de Bacterias Ácido alcohol Resistente 24 Práctica 4: Tinción de cápsula 28 Práctica 5: Tinción de esporas 33

Practica 6: Esterilización y Desinfección 37 Práctica 7: Preparación de medios de cultivo 44

Práctica 8: Siembra en medios de Cultivo 53 Práctica 9: Metabolismo Bacteriano 62 Práctica 10: Morfología celular 68 Práctica 11: Susceptibilidad a Quimioterapéuticos 76

Práctica 12: Toma y Envío de Muestras 81 Práctica 13: Diagnóstico Bacteriológico 90

VII. Bibliografía 91


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I. PLAN INSTITUCIONAL DE DESARROLLO DE LA FACULTAD

DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

MISIÓN

Formar Médicos Veterinarios Zootecnistas que coadyuven a la sustentabilidad de

los sistemas de producción, bienestar, salud animal y salud pública, con un

enfoque integral, innovador y humanista basado en el desarrollo de conocimientos,

habilidades, actitudes y valores adquiridos con base en las necesidades del

contexto en el que se desarrolla.

VISIÓN

Ser un programa educativo acreditado y reconocido que de respuesta a las

necesidades del entorno regional, nacional e internacional. Tener una planta

académica con postgrado, especializada o certificada, líneas de investigación

pertinentes, intercambios que fortalezcan la movilidad estudiantil y docente,

además de contar con infraestructura y tecnología de punta. El programa será

ampliamente aceptado y reconocido socialmente, evidencia dada por la

aceptación de los egresados en el ámbito laboral, y su inserción en procesos de

desarrollo comunitario.


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II. INTRODUCCION

El presente Manual de Prácticas de Bacteriología surge como una

necesidad de contar con un material didáctico que sirva de apoyo para el

estudiante de la licenciatura en Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Benemérita

Universidad Autónoma de Puebla y pretende ser una guía práctica en su Trabajo

de Laboratorio, cabe mencionar que las prácticas aquí propuestas fueron

revisadas, analizadas, modificadas y adaptadas a las condiciones que exige

nuestro programa de estudios y a la infraestructura propia de nuestra Universidad.

En este Manual se han diseñado una serie de prácticas, las cuales serán

realizadas en el transcurso del cuatrimestre y obedeciendo al programa de

estudios vigente de la materia en la Unidad Académica, que abarcan desde la

morfología bacteriana hasta las pruebas bioquímicas características que permiten

dar un diagnóstico confirmativo, vinculando así la Teoría con la Práctica.

Queremos puntualizar que cualquier material didáctico por sí solo no

representa un medio eficaz para la adquisición, comprensión y aplicación de los

conocimientos, sino que mucho depende de la forma, el orden y la disciplina con el

que sea manejado. Entonces invitamos a ALUMNOS-PROFESOR DE LA

MATERIA, PROFESOR DE LABORATORIO Y TODOS LOS QUE LABORAN EN

ESTE DEPARTAMENTO a que con juntemos nuestros esfuerzos para que este

Manual cumpla con el objetivo para el cual fue creado.

Esperamos que después de haber trabajado con este manual realicemos

las críticas constructivas pertinentes que permitan mejorarlo.

PONGAMOS NUESTRO MAYOR ESFUERZO PARA QUE TODOS CONJUNTEMOS UN MISMO OBJETIVO “TRABAJO”


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III. UBICACIÓN DE LA ASIGNATURA EN EL MAPA

CURRICULAR. DEJAR UNA HOJA EN BLANCO Y

NOSOTROS (SECRETARIA ACADÉMICA LA INCLUYE)

No CODIGO NOMBRE DE LA ASIGNATURA

Periodo Escolar

HT/HP por periodo

HT/HP por semana

Total de Créditos por

área Requisitos

NIVEL BÁSICO

2) Área de: Básicas

1 MVZM-001 Biología Celular Veterinaria 80 5 5 SR

2 MVZM-002 Etología y Manejo Animal 80 5 5 SR

3 MVZM-003 Anatomía Veterinaria Comparada 80 5 5 SR

4 MVZM-004 Metodología de la Investigación Veterinaria 32 2 2 SR

5 MVZM-005 Fisiología Aplicada Veterinaria 80 5 5 SR

6 MVZM-006 Bioquímica Aplicada Veterinaria 64 4 4 SR

7 MVZM-007 Morfología Veterinaria 80 5 5 Anatomía

Veterinaria Comparada

8 MVZM-008 Inmunología Veterinaria 64 4 4 SR

9 MVZM-009 Biología Tisular Veterinaria 80 5 5 SR

10 MVZM-010 Bacteriología y Micología Veterinaria 80 5 5 SR

11 MVZM-011 Parasitología Veterinaria 80 5 5 SR

12 MVZM-012 Virología Veterinaria 64 4 4 SR

13 MVZM-013 Farmacología y Toxicología Veterinaria 80 5 5 SR

14 MVZM-014 Bioestadística Veterinaria 64 4 4 SR

15 MVZM-015 Endocrinología de la Reproducción Veterinaria 64 4 4 SR


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IV. NIVEL DE DESEMPEÑO

NIVEL 1 • Se realizan funciones rutinarias de baja complejidad.

• Se reciben instrucciones.

• Se requiere de baja autonomía

NIVEL 2 • Se realizan un conjunto significativo de actividades de trabajo,

variadas y aplicadas en diversos contextos.

• Algunas actividades son complejas y no rutinarias.

• Presenta un bajo grado de responsabilidad y autonomía en las

decisiones.

• A menudo requiere de colaboración con otros y trabajo en

equipo.

NIVEL 3 • Se requiere un importante nivel de toma de decisiones.

• Tiene bajo su responsabilidad recursos materiales con los que

opera su área, así como control de recursos financieros para

adquisición de insumos.

NIVEL 4 • Se desarrollan un conjunto de actividades de naturaleza

diversa, en las que se tiene que mostrar creatividad y recursos

para conciliar intereses.

• Se debe tener habilidad para motivar y dirigir grupos de trabajo.

NIVEL 5 • Se desarrollan un conjunto de actividades de naturaleza

diversa, en las que se tiene que mostrar un alto nivel de

creatividad, así como buscar y lograr la cooperación entre

grupos e individuos que participan en la implantación de un

problema de magnitud institucional.


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V. MAPA DEL SISTEMA DE PRÁCTICAS

Tema Práctica Ámbito de desarrollo Semana

UNIDAD I GENERALIDADES

• CONOCIMIENTO Y MANEJO DEL MATERIAL Laboratorio 3

UNIDAD II MORFOLOGÍA Y TAXONOMÍA.

• TINCION DE GRAM • TINCION DE BACTERIAS

ACIDO ALCOHOL RESISTENTE

• TINCION DE DE CAPSULA • TINCION DE ESPORAS

Laboratorio 4 y 5

UNIDAD III NUTRICION Y CARACTERISTICAS DE CRECIMIENTO

• PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

• SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO

• MORFOLOGIA COLONIAL • METABOLISMO

BACTERIANO

Laboratorio

7 , 8 y 9

UNIDAD V

ACCION DE LOS

AGENTES

ANTIMICROBIANOS

• SUSCEPTIBILIDAD A QUIMIOTERAPEUTICOS

Laboratorio 10

UNIDAD VI.

ESTERILIZACIÓN Y

DESINFECCIÓN

• ESTERILIZACON Y DESINFECCION

Laboratorio 6

UNIDAD VIII. COLECCIÓN Y ENVIO DE MUESTRAS.

• TOMA Y ENVIO DE MUESTRAS

Laboratorio Y Posta Zootécnica

11

UNIDAD IX.

GÉNEROS

BACTERIANOS Y

MICÓTICOS DE

INTERÉS

VETERINARIO

• DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO

Laboratorio

12


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VI. PRACTICAS GENERALES DE SEGURIDAD, REGLAMENTOS

Y PROCEDIMIENTOS GENERALES

REGLAMENTO INTERNO PARA LOS PARTICIPANTES

1. Se prohíbe estrictamente la entrada al laboratorio sin bata.

2. Portar el protocolo de la práctica y conocer el tema así como el procedimiento

de la misma.

3. No se permitirá la entrada 10 minutos después de iniciada la práctica.

4. El equipo que no traiga material que se solicitó para la práctica, NO la podrá

realizar.

5. Una vez iniciada la practica, no se permitirá la salida del laboratorio.

6. Se prohíbe ingerir alimentos, fumar y hacer desorden.

7. Se prohíbe usar teléfono celular durante la práctica.

8. Solamente se prestara material con vale y credencial de la Facultad.

9. Todos los integrantes de cada equipo de trabajo, se harán responsables del

material que se les entregue para la práctica.

10. Todo material deteriorado o destruido por descuido o intransigencia, deberá

ser reemplazado a la mayor brevedad posible (durante el periodo escolar que

se este cursando), de lo contrario se le suspenderá el desarrollo a prácticas

en el Laboratorio hasta su reposición.

11. Al término de la práctica, se deberá dejar el material y la mesa limpia para que

sea devuelto el vale y la credencial de préstamo de material.

12. El reporte de la práctica se entregará 8 días después de su realización.

13. Cada práctica, será realizada en hora y fecha preestablecida, salvo previo

aviso para su suspensión.

14. No se repondrán prácticas.

15. No ingresar a personas ajenas al grupo y a la práctica.

16. Toda actividad y actitud estará sujeta a evaluación por parte del profesor y/o

personal de apoyo académico.


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17. De no apegarse a las disposiciones y reglas del presente reglamento puede

ser motivo de sanción. El incumplimiento y la reincidencia puede ser motivo de

expulsión temporal o definitiva del laboratorio.

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO 1. El alumno ingresará al laboratorio con bata, la cual deberá ser blanca y de

manga larga. Es indispensable portar la bata abotonada y guardar el

comportamiento apropiado durante la estancia.

2. El alumno se familiarizará con los sitios en donde se encuentran localizadas las

regaderas, extinguidores, botes de basura.

3. En ningún momento se permitirá la aplicación de cosméticos, fumar, ingerir

alimentos o ambos dentro del laboratorio.

4. Limpiar con desinfectante las mesas de trabajo antes y después de cada

práctica, así también durante la práctica si se ha derramado un reactivo o

muestra biológica.

5. Para evitar quemaduras se deberán apagar mecheros, planchas calientes o

ambos, cuando éstos no se utilicen. Así también se deberán emplear gradillas

o pinzas para sostener o transportar tubos calientes.

6. Mantener las sustancias químicas inflamables alejadas del fuego, planchas

calientes o ambos.

7. No deberá olfatear, probar reactivos o ambos, o las soluciones, no se debe

mirar nunca el interior de un tubo de ensaye que se esté calentando, ni apuntar

hacia alguna persona porque el contenido podría proyectarse en cualquier

momento. La misma precaución debe tomarse cuando se mezclan reactivos o

se agiten vigorosamente los tubos.

8. Utilizar gafas de seguridad cuando se manejen ácidos, hielo seco o sustancias

desconocidas.

9. Utilizar pipetores o perillas de goma para la medición de los líquidos corrosivos,

ácidos, bases, sustancias volátiles, venenos, entre otros. No aspirar con la

boca.


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10. Evitar agregar agua sobre ácidos para evitar quemaduras por proyección. Para

diluir cualquier ácido, se vierte el ácido sobre el agua y NUNCA agua sobre

ácido. Emplear baño de hielo o baño de agua fría para preparar diluciones

diluidas de ácidos.

11. Mantener los frascos de reactivos tapados para evitar derrames.

12. Lavarse las manos con agua y jabón antes de salir del laboratorio.

13. Reportar inmediatamente el profesor del laboratorio cualquier accidente o

lesión que suceda para que se tomen las medidas apropiadas.

ACCIONES QUE SE DEBEN TOMAR EN CASO DE ACCIDENTE 1. En caso de que exista contacto de ácidos o bases con la piel, ojo o boca, se

recomienda enjuagar el área con abundante agua con el propósito de disminuir

su acción por dilución, para ello existen en el laboratorio las tarjas, regaderas y

lavaojos.

2. En caso de ingestión de corrosivos, NUNCA provocar vómito. Si existe

ingestión de ácidos hacer beber inmediatamente una solución de bicarbonato

de sodio (dos cucharadas soperas en dos vasos de agua); en caso de

soluciones cáusticas (hidróxido de sodio p potasio), ingerir una cucharada de

vinagre o 25 ml. De jugo de limón en agua.

3. Si existe derramamiento de un ácido, neutralizar agregar bicarbonato de sodio

y en caso de bases agregar ácido acético (vinagre). NUNCA tratar de adicionar

agua. Emplear bata, guantes y gafas durante la limpieza.

4. Al ingerir otras sustancias químicas, hacer vomitar a la persona accidentada,

vigilar que exista una ventilación adecuada y mantener las vías aéreas

permeables mientras se traslada al hospital.

5. En caso necesario llamar a los teléfonos de emergencia 066.


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RECOMENDACIONES PARA TENER ÉXITO EN LAS PRÁCTICAS 1. El alumno leerá la práctica completa y la discutirá con el profesor entes de la

realización de la misma.

2. Los útiles y aspectos personales deberán ser colocados en el lugar indicado.

3. El asa bacteriológica deberá estar estéril antes y después de la práctica.

4. Antes de preparar las mezclas de reacción, etiquetará apropiadamente cada

uno de los tubos con marcador indeleble.

5. Por ningún motivo alterará el orden de adición de reactivos de la práctica.

6. Utilizar agua destilada en todos los experimentos en los que se solicite agregar

agua.

7. Mantener los frascos de reactivos tapados, para evitar contaminación,

evaporación de los mismos o ambos.

8. Utilizar solo la cantidad requerida de reactivos para evitar el desperdicio de los

mismos.

9. Evitar regresar excedentes de reactivos al frasco de donde se extrajo el mismo.


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PRÁCTICA No. 1

CONOCIMIENTO DEL MATERIAL DEL LABORATORIO Y MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA

No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS

En equipos de 3 a 4 alumnos.

PROPOSITOS ESPECIFICOS:

• El alumno conocerá el material básico y su empleo e n el laboratorio de bacteriología.

• Conocerá las medidas de seguridad que se deben de g uardar al trabajar en un laboratorio de bacteriología, para e vitar accidentes.

INTRODUCCIÓN

El éxito de los procedimientos de laboratorio para proporcionar datos que

conduzcan al diagnóstico exacto de una enfermedad depende de muchos

factores. Los tres mas importantes son: 1) selección y conservación de un número

adecuado de muestras tomadas asépticamente de los sitios anatómicos más

convenientes durante el estadio adecuado de la enfermedad, para el aislamiento o

demostración del o de los patógenos, 2) toma de muestras de suero sanguíneo al

tiempo en que el título de anticuerpos es adecuado para el diagnóstico y 3). el

conocimiento y la habilidad de los laboratoristas quienes deben seleccionar los

procedimientos adecuados por su experiencia en enfermedades similares bajo

sospecha y el poderlos aplicar con las precauciones y controles adecuados.

Los laboratoristas deberán tener plena confianza en sus equipos. medios de

cultivo, cultivos celulares, animales de laboratorio y embriones de pollo, así como

en sus reactivos, soluciones, antígenos, antisueros y colorantes.

Para que esta confianza sea permanente, es necesario que se ejerza un estricto

control de calidad y de esterilidad microbiológica Además el laboratorio como

institución deberá actualizar frecuentemente a su personal, mantener un inventario


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fácilmente disponible de materiales y probar regularmente todo el equipo. El viejo

adagio “Lo que bien comienza bien acaba” se aplica perfectamente al trabajo de

laboratorio. Sin embargo, el precio que hay que pagar por el éxi to es una

constante preparación y atención a los pequeños det alles.

Existen muchas trampas, en la que caen los incautos. Se pueden obtener

resultados falsos e inútiles si los materiales y equipos no han sido esterilizados

adecuadamente. Los cultivos celulares y de microorganismos, pueden inhibirse o

destruirse si la cristalería, los tapones y los medios de cultivo se contaminan con

detergentes o restos de compuestos tóxicos; las placas y los efectos citopáticos

observados en los cultivos celulares pueden deberse a las infecciones latentes

que pueden reactivarse, los cultivos puros se pueden contaminar y en los pases

subsecuentes se pueden perder por el crecimiento de los microorganismos

contaminantes, cuando los antisueros para diagnóstico se preparan en animales

que no han sido convenientemente probados, pueden contener anticuerpos contra

otros antígenos que no fueron inoculados y dar reacciones que resultan en

diagnósticos equivocados.

Cuando se hacen tinciones pueden aparecer artificios que se confunden

con bacterias, hongos o cuerpos de inclusión.

Verdaderos desastres ocurren por accidentes o por d escuido en las

medidas de seguridad en el laboratorio de bacteriol ogía, así pues, se pueden

infectar los propios laboratoristas, se pueden escapar los agentes infecciosos e

infectar a los animales de la vecindad y las enfermedades se pueden diseminar

por medio de productos biológicos contaminados. Otro desastre potencial puede

ocurrir por la incapacidad de reconocer o sospechar de una enfermedad exótica a

tiempo para evitar su diseminación. Para el clínico de campo y el laboratorista, una

historia clínica adecuada y la información acerca de las enfermedades que afectan

a la población animal bajo estudio, son de gran ayuda en la evaluación primaria de

la enfermedad que se trata de diagnosticar.


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MEDIDAS DE SEGURIDAD

Todos los laboratorios de microbiología deben extremar las precauciones al

trabajar con agentes infecciosos para evitar una o más de las siguientes

eventualidades:

1) infección accidental o contaminación cruzada dentro del laboratorio que

nulificaría o confundiría los resultados experimentales.

2) contaminación o diseminación de la infección a granjas adyacentes,

comunidades o zonas amplias

3) infección del personal del laboratorio; y

4) difusión de la infección a través de la liberación de productos biológicos.

Probablemente todos los laboratorios de microbiología han sufrido

contaminación cruzada, ya sea como contaminaciones mezcladas en los cultivos

bacterianos, o como infecciones indeseadas o mixtas en animales y cultivos

celulares. Los reajustes para corregir estas faltas son muy costosos y causan

pérdidas de tiempo.

Centraremos nuestra atención a las medidas de seguridad que se aplican en un

laboratorio por las necesidades presentes.

⇒ La desinfección de las mesas o área de laboratorio pueden incluir todas o

algunas de las medidas siguientes, de acuerdo al agente infeccioso involucrado:

1. Lavado con agua corriente para desechar excretas, restos de alimento y polvo;

2. Cepillado de toda el área con solución detergente;

3. Enjuague del detergente;

4. Aplicación de aerosoles de un desinfectante adecuado para el germen o

inundación del piso con desinfectante si se considera necesario;

5. Desinfección y desalojo de objetos innecesarios;

6. Enjuague del desinfectante

En el caso de agentes infecciosos de gran peligro para la salud humana, se puede

iniciar el procedimiento con la esterilización gaseosa. El vapor de formaldehído es

un desinfectante económico y práctico que puede usarse en habitaciones y

gabinetes cerrados.


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⇒ Las manipulaciones de las agujas para inoculación, las asas bacteriológicas, las

pipetas, las jeringas, las centrífugas, producen partículas de aerosoles cargadas

con virus y bacterias que pueden ser inhaladas e infectarte, por lo que antes y

después de su uso deben de ser esterilizadas. Por lo que se recomiendan las

siguientes técnicas generales para todos los microorganismos.

Mantener el área de trabajo limpia y ordenada y que ofrezca protección si hay

derrames o goteo de microorganismos.

Desinfectar el área de trabajo y desinfectar o esterilizar todos los equipos que

entraron en contacto con microorganismos o que potencialmente están

contaminados. Es una buena práctica al volver a esterilizar los objetos que

estuvieron en el área de trabajo, aun cuando no se hayan utilizado, antes de

colocarlos en el área de materiales estériles.

Etiquetar claramente todas las preparaciones. El material que se va a congelar

deberá guardarse en envases que resistan la congelación y descongelación ya

que es difícil desinfectar los congeladores.

Siempre que sea posible, los tubos o matraces que contengan material infeccioso

deberán ser trasladados de tal forma que el fondo descanse sobre la palma de la

mano.

El traslado de material infeccioso hacia las áreas de depósito deberá ser con

mucho cuidado.

Utilizar bata y guantes de hule cuando se manipule material infeccioso.

Desinfectar todas las partes expuestas al final de la operación.

Evitar pipetear directamente con la boca cualquier material infeccioso o tóxico. Se

usarán sólo pipetas con tapón de algodón. Nunca soplar líquidos contaminados

que queden como remanentes en las pipetas.

Antes de centrifugar, revisar los tubos para detectar cualquier fisura en ellos.

Utilizar únicamente jeringas que sellen sobre la cabeza de la aguja.

P A R T I C U L A R I D A D E S

∗ La bata será la vestimenta de protección que utilizarás en éste laboratorio


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∗ Desinfectarás cada día de práctica la cubierta de las mesas.

El espacio físico y todo lo utilizado durante la práctica lo dejarán LIMPIO (en el

caso de cultivos bacterianos los depositarás en el área de material y medios

contaminados) y ORDENADO.

Con el propósito de evitar accidentes en este Labor atorio todo alumno que

conscientemente o por negligencia no acate la norma tividad estipulada será

sancionado con la suspensión de la entrada al mismo .

CRITERIOS DE EVALUACION:

ACTITUD SI NO Participación en la practica Puntualidad Presentación (Bata blanca manga larga)

Responsabilidad Buen manejo del equipo y material

Buen lenguaje OBSERVACIONES:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ RECOMENDACIONES:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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PRÁCTICA No. 2

TINCIÓN DE GRAM

RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA




• El alumno realizará la técnica de tinción de Gram c on la

modificación de Reed.

• Diferenciará las bacterias Gram positivas de las Gr am negativas.

• Explicará las diferencias estructurales de las bact erias Gram

positivas y Gram negativas.

INTRODUCCIÓN

En 1884 el médico Danés, Christian Gram, desarrolló un método de tinción

que lleva su nombre y que es de valiosa utilidad en cualquier Laboratorio de

Bacteriología. La técnica, además de revelar detalles referentes a la forma y

agrupación bacterianas como cualquier otra técnica de tinción, permite clasificar a

las bacterias en dos grandes grupos: GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS.

Las paredes celulares, de ambas poseen una capa basal de peptidoglicano

responsable de la rigidez característica de la pared. Sin embargo, existen

diferencias estructurales en lo que respecta a las capas más externas. Así en las

Gram Negativas, existe una membrana externa cuya constitución química es

similar a la de cualquier otra membrana biológica (fosfolípidos y proteínas) pero

que posee además un alto contenido de lipopolisacáridos (endotoxina).

Durante el proceso de tinción, tanto las bacterias Gram positivas como las

Gram negativas, toman el colorante primario. Sin embargo al aplicar el agente

decolorante, la pared de las bacterias Gram positivas sufren una deshidratación


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que impide la salida del colorante. En el caso de las bacterias Gram negativas, el

agente decolorante destruye la membrana externa, incrementando así su

permeabilidad, lo cual permite la salida del colorante primario.

Al aplicar el colorante de contraste, este no puede penetrar fácilmente en

las bacterias Gram positivas debido a la deshidratación de su pared; además de

que estas bacterias quedaron previamente teñidas con el colorante primario. Por

el contrario las bacterias GRAM (-) se tiñen fácilmente con el colorante de

contraste. El resultado final es que las bacterias Gram (+) se tiñen de color violeta

y las Gram (-) de rojo.

La tinción de Gram es aplicada en forma universal como primer paso en la

identificación de las bacterias. Desafortunadamente existen algunos grupos

bacterianos en los cuales la tinción de Gram no es de utilidad taxonómica, por

ejemplo: las espiroquetas, los micoplasmas, las micobacterias, las clamidias y las

riquetsias.

El método de la tinción de Gram ha sufrido varias modificaciones y algunas

de estas son incluso mejores que el método original.

Los objetivos principales para modificar la tinción han sido:

1. Obtener un colorante primario más estable que el original, ya que este se

deteriora rápidamente.

2. Reducir el tiempo requerido para completar la técnica.

En esta práctica se utilizará la técnica de tinción de Gram modificada por

Reed, la cual cumple con los objetivos antes señalados.

MATERIAL. Laminillas

Lápiz graso

Asa bacteriológica (Asa)

Microscopio

Mechero Bunsen

Aceite de Inmersión

Cultivo de bacterias en medio líquido y sólido

Agua destilada

Colorantes para la tinción de Gram.


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PREPARACIÓN DE UN FROTIS FIJO PARA TINCIÓN.

Antes de teñir, se debe “fijar” el material que se va a observar. Los

portaobjetos o laminillas que se empleen para realizar las extensiones deben estar

limpios y bien marcados para su identificación y para la delimitación del área en

que hay que colocar la muestra, el portaobjetos puede dividirse en varias

secciones con un lápiz graso y colocar varias extensiones en una misma laminilla,

a condición de que todas se vayan a teñir de la misma manera.

PROCEDIMIENTO:

• La técnica para realiza el frotis bacteriano es variable, si el cultivo se encuentra

en medio sólido se procederá a colocar una gota de agua destilada en el

portaobjetos y con el asa se tomará una asada del cultivo, se mezclará bien. Si

el cultivo se encuentra en medio líquido, tomar con el asa una pequeña gota de

este cultivo, colocarlo en el portaobjetos y se extiende.

• Al extender la gota sobre el portaobjetos formar una capa fina, frotis demasiado

gruesos NO SIRVEN.

• Secar los portaobjetos al aire o manteniéndolos sobre la llama del mechero de

Bunsen.

• Cuando se haya secado el frotis, pase el portaobjetos tres veces por la llama

del mechero con la cepa hacia arriba, teniendo cuidado de no aplicar el calor en

forma excesiva ya que estropearía la morfología normal y la estructura de los

microorganismos que se van a teñir. (Ver la figura 2)

No es el único método de fijación, pero este será el utilizado en el transcurso de

estas prácticas.

NOTA: Es importante recordar que la fijación por calor puede no matar las

bacterias, por lo que todas las laminillas deben de ser tratadas con el respeto y

precaución inherentes a todo objeto presuntamente patógeno.

Existen algunas variantes que pueden afectar los resultados de la tinción de Gram,

por ejemplo:

a) Las bacterias en los cultivos viejos (más de 24 Horas de incubación) liberan

enzimas por auto lisis. Estas atacan a la pared celular de las bacterias y


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modifican sus propiedades estructurales, propiciando que las bacterias Gram

positivas se tiñan de rojo. Esta misma situación se puede presentar al observar

frotis directo de los tejidos de animales infectados.

b) Una decoloración excesiva puede ocasionar que las bacterias Gram positivas

se tiñan de rojo.

c) Una decoloración deficiente puede ocasionar que las bacterias Gram (-) se

tiñan de violeta.

d) Los frotis gruesos pueden teñirse irregularmente.


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Fig. 2 Preparación de un frotis “fijo” para tinción.

Medio sólido Medio líquido


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1 Cubre el frotis con la solución de

cristal violeta (colorante primario).

Cubrir el área del frotis, una o dos

gotas son suficientes. Agregar una

cantidad igual de la solución de

bicarbonato de sodio, la cual

alcaliniza y acelera la tinción de las

células. Deja actuar esta mezcla

por 15 segundos

Lava con agua corriente (de la llave) a

chorro de agua. Sacude la laminilla para

eliminar las gotas gruesas de agua.

2 Aplicar la solución de Iodo (Lugol,

mordente) y déjala actuar durante

15 segundos

Lava con agua corriente de la llave.

Sacude el frotis

Procedimiento para la técnica de GRAM


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3 Aplicar el Alcohol-Acetona (Agente

decolorante) durante 3 a 5

segundos

Lava nuevamente con agua de la llave.

Sacude la laminilla

4 Agrega la Fucsina básica

(colorante de contraste) y déjala

actuar durante 15 segundos.

Lava con agua corriente de la llave

Seca el frotis por presión con una toalla

absorbente o al aire, y observa al

microscopio con el objetivo de inmersión

(100X)

¡RECUERDA!, las bacterias Gram (+)

las Gram (-) de rojo

se tiñen de color violeta mientras que

.


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PRUEBA DE HIDRÓXIDO DE POTASIO (KOH) AL 3%

La prueba de KOH al 3% nos permite ratificar los resultados de la tinción de Gram.

Esta prueba consiste en colocar sobre una laminilla una gota de KOH al 3% y con

el asa hacer en ella una suspensión de colonias de la bacteria problema,

mezclando con movimientos giratorios durante 1 a 3 minutos. Si al separar el asa

de la mezcla se forma una hebra viscosa, esto indica que se trata de bacterias

Gram (-). Si la hebra no se forma, se trata entonces de bacterias Gram (+). (Ver la

siguiente figura)

⇒ Gram Negativas; al separar el

asa de la mezcla queda entre

ellas una hebra viscosa dentro

de los 60 segundos a 3 minutos.

⇒ Gram positivas no existe dicha

viscosidad

Anota tus observaciones tomando en cuenta lo siguiente:

1) ¿Cuál fue la reacción al método de Gram de cada uno de los

microorganismos con que trabajaste?

2) ¿Qué morfología presentaban?

3) ¿Cuál es la utilidad diagnostica de la técnica de Gram?

4) Comparar los tamaños de diferentes bacterias entre sí y con las

levaduras.

5) Identificar las formas y agrupaciones de las bacterias

6) Dibuja y colorea tus observaciones


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PRÁCTICA No. 3

TINCIÓN PARA BACTERIAS ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTES

(B A A R)





• Realizará la técnica de tinción de Zielhl-Neelsen p ara teñir frotis fijos

a partir de cultivos bacterianos.

• Distinguirá las bacterias ácido-alcohol resistentes de las no ácido-

alcohol resistentes.

• Conocerá las características estructurales de la pa red celular de las

bacterias ácido alcohol resistentes.

INTRODUCCIÓN: Las bacterias ácido alcohol resistentes forman un grupo de

microorganismos se definen con base en sus propiedades tintoriales. Son

relativamente impermeables a los colorantes básicos, pero una vez teñidos

retienen el colorante con tenacidad, resistiendo la decoloración con solventes

orgánicos acidificados (por ejemplo alcohol-ácido).

La ácido-alcohol resistencia está determinada por la composición de la pared

celular, la cual además de contener peptidoglicano está constituída por un alto

porcentaje de glucolípidos hidrofóbicos. Un componente importante de estos, son

los ácidos micólicos. La presencia de estas capas hidrofóbicas previenen la

penetración de soluciones acuosas, siendo esta la causa por la cual estos

microorganismos no pueden teñirse con los métodos convencionales (tinción de

Gram).


- 25 -Pag -

Uno de los métodos de tinción mas comúnmente usados para demostrar la

ácido-alcohol resistencia es el método de Ziehl-Neelsen. En este método la

penetración del colorante primario se facilita debido a que este se encuentra

disuelto en fenol ya que es aplicado en presencia de calor.

Una vez que el colorante penetra a la célula bacteriana, este se combina

con las mismas estructuras con las que se combina en cualquier otra bacteria

(ácidos nucleicos, proteínas, etc.) y además reacciona con ácidos micólicos libres,

lo cual hace que la pared celular se vuelva aun más hidrofóbica.

Con la tinción de Ziehl-Neelsen tanto las bacterias ácido-alcohol resistentes

como las no ácido-alcohol resistentes se tiñen con el colorante primario. Sin

embargo, al aplicar el agente decolorante, compuesto por una mezcla de alcohol-

ácido, este no solubiliza los lípidos de la pared de las bacterias ácido-alcohol

resistentes se decoloran fácilmente, por lo que se vuelven a teñir al aplicar el

colorante de contraste. El grupo de bacterias ácido-alcohol resistentes está

representado principalmente por el género Mycobacterium. Algunas especies de

este género juegan un papel muy importante como agentes etiológicos de la

tuberculosis y otras enfermedades crónicas granulomatosas tanto en el hombre

como en los animales.

En el análisis de un frotis de material clínico sospechoso de contener

bacilos tuberculosos, el hallazgo de un solo bacilo ácido- alcohol resistente puede

tener valor diagnóstico, ya que en la mayoría de los casos no son abundantes. Sin

embargo, la interpretación del hallazgo de un solo bacilo ácido-alcohol resistente

debe hacerse con cautela y con base en la historia clínica y otras pruebas de

laboratorio, ya que la presencia de especies saprofitas de Mycobacterium podría

conducir a un diagnóstico falso. Por otra parte, existen algunas especies de

Corynebacterium y Nocardia que ocasionalmente pueden comportarse como

bacterias ácido-alcohol resistente.

MATERIAL.

� Laminillas

� Lápiz graso

� Asa bacteriológica (Asa)


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� Microscopio

� Platina caliente

� Trozos de papel filtro

� Aceite de Inmersión

� Cultivo de bacterias

� Agua destilada

� Colorantes para la tinción de Ziehl-Neelsen.

PROCEDIMIENTO:

Utilizando una laminilla, prepara un frotis fijo (ya se te indicó el

procedimiento anteriormente) a partir del cultivo que vas a trabajar.

Tíñelos siguiendo la técnica de Ziehl-Neelsen, que a continuación será

descrita.

TÉCNICA DE LA TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN.

a) Coloca un trozo de papel absorbente sobre el frotis, de tal manera que cubra

solo el frotis y no toda la laminilla.

b) Humedece el papel con la Fucsina Fenicada (colorante primario). El frotis no

deberá secarse, así que añade continuamente colorante para evitar esto.

c) Permite la emisión de vapores durante 5 minutos. Retira el frotis de la platina,

quítale el papel, déjalo enfriar y lava con agua corriente de la llave.

d) Decolora con el Alcohol-Ácido, permitiéndole actuar durante 2 minutos. Es

importante realizar la decoloración perfectamente, ya que de no ser así se

corre el riesgo de observar reacciones falsas positivas.

Lava con agua corriente de la llave.

e) Contrasta con azul de metileno de Loeffler durante un minuto.

Lava con agua corriente de la llave, seca y observa al microscopio con el objetivo

de inmersión.

RECUERDA: Los microorganismos ácido -Alcohol-Resistentes se tiñen de color

ROJO. Los no ácido-Alcohol-Resistentes de color AZUL.

Anota tus observaciones tomando en cuenta lo siguiente:


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1. Escribe la composición química de la pared celular de bacterias Gram

positivas, negativas y ácido alcohol resistentes.

2. ¿En que tipo de muestras clínicas es recomendable realizar frotis

directos y teñirlos mediante la técnica de Ziehl- Neelsen?

3. Dibuja y colorea tus observaciones.

4. ¿Cuál de las dos cepas bacterianas resultó ser ácido alcohol

resistente?






- 28 -Pag -

PRÁCTICA No. 4

TINCIÓN PARA ESPORAS





• Realizará La técnica de tinción de Schaeffer y Fult on para teñir frotis

fijos a partir de cultivos bacterianos.

• Mencionará las principales características estructu rales de la

espora bacteriana, así como su función.

• Distinguirá y clasificará a las esporas bacterianas por su

localización en la célula bacteriana.

INTRODUCCIÓN:

La espora bacteriana es una estructura altamente deshidratada y rígida,

que es formada por algunos géneros bacterianos. Los géneros bacterianos de

interés en Medicina Veterinaria que son capaces de esporular son Bacillus y

Clostridium. Estos responden de manera diferente al efecto que las condiciones

ambientales tienen sobre la formación de la espora. Por ejemplo; el B. anthracis,

microorganismo aerobio estricto, solamente puede formar esporas en condiciones

de aerobiosis, de manera similar, los bacilos del género Clostridium anaerobios,

no forman esporas en aerobiosis.

La esporulación es un mecanismo especializado cuya función es encerrar

un genoma en un vehículo aislante que le permita la germinación posterior en un

medio adecuado. Las esporas bacterianas mantienen un estado de criptobiosis o

vida latente, con escasa actividad metabólica.


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Así mismo, muestran una marcada resistencia al calor, a la desecación, a la

congelación, a diversos agentes químicos y radiaciones.

La espora bacteriana está compuesta por seis capas de afuera hacia

adentro:

a) Exosporium

b) Capa

c) Corteza

d) Pared

e) Membrana interna

f) Centro (Protoplasma)

La capa está constituida por proteínas parecidas a la queratina, las cuales vuelven

impermeable a la espora y la protegen de la acción de substancias químicas. El

centro contiene dipicolinato de calcio, el cual aunado al alto estado de

deshidratación del protoplasma, es responsable de la marcada resistencia que

muestra la espora al calor y a la desecación.

Las esporas son estructuras ovales o esféricas que pueden encontrarse

tanto intracelularmente, como fuera de la bacteria (célula vegetativa). Por su

localización dentro de la célula pueden ser centrales, subterminales o terminales

(como lo representa la Fig. 4) y presentan además variación en su tamaño. Estas

características son de utilidad taxonómica para la identificación de algunas

especies de los géneros capaces de esporular.

En una preparación teñida con la técnica de Gram las esporas aparecen

como cuerpos refringentes sin teñir. Para teñirlas se utiliza la tinción de Schaeffer

y Fulton en la que es necesario aplicar calor para forzar la entrada del colorante

primario (verde de malaquita) y una ves que este ha penetrado, al lavar la

preparación y agregar un colorante de contraste (safranina), las células

vegetativas se tiñen de rojo y la espora permanece teñida de VERDE.


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MATERIAL.

� Laminillas � Lápiz graso � Asa bacteriológica (Asa) � Microscopio � Platina caliente � Mechero � Aceite de Inmersión � Cultivo de bacterias esporuladas � Agua destilada � Colorantes para la tinción de esporas

PROCEDIMIENTO:

Prepara dos frotis fijos a partir del cultivo que tienes en la mesa de trabajo. Uno de

los frotis será teñido utilizando la tinción de Gram y el otro será teñido con el

método de Schaeffer y Fulton como se describe a continuación:

a) Coloca un trozo de papel absorbente sobre el frotis, de tal manera que

cubra solo el frotis y no toda la laminilla.

b) Aplica Fulton A (verde malaquita) y calienta en la platina, hasta la emisión

de vapores, durante un minuto (recuerda que el colorante no debe

Fig. 4 tipos de esporas bacterianas: terminal, subterminal, central, esférica y oval


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evaporarse, por lo tanto a añadirás continuamente colorante para evitar

esto).

c) Lava con agua corriente de la llave.

d) Contrasta con Fulton B (safranina) durante 15 segundos.

e) Lava con agua corriente de la llave, seca y observa al microscopio con el

objetivo de inmersión (100X).

f) El método de tinción de Schaeffer y Fulton puede practicarse en frío,

permitiendo actuar al Fulton A durante 10 minutos.

RECUERDA: Con la tinción de Gram las esporas se observan como cuerpos

refringentes SIN TEÑIR, mientras que con el método de Schaeffer y Fulton las

esporas se observan de color VERDE y las formas vegetativas se ven ROJAS.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué diferencias encontraste entre el frotis teñido por el método de

Gram y el frotis teñido por el método de Schaeffer y Fulton?

2. ¿Qué posición tenía la espora dentro del cuerpo bacteriano y qué

forma tenía ésta?

3. ¿Cuál es la importancia de las esporas bacterianas?

4. ¿Cuando se forman las esporas bacterianas?




Buen lenguaje


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OBSERVACIONES:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ RECOMENDACIONES:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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PRÁCTICA No. 5

TINCIÓN DE CÁPSULAS





• El alumno realizará las técnicas de tinción de Mane val y tinta china

para poner de manifiesto la presencia de cápsula ba cteriana.

• Distinguirá la presencia de cápsula en un frotis te ñido con la técnica

de Maneval y con Tinta China.

• Describirá la composición química y función de la c ápsula

bacteriana.

INTRODUCCIÓN: Muchas bacterias están rodeadas por compuestos químicos superficiales

que se tiñes con mucha dificultad y que ha sido denominada cápsula. La mayoría

de las cápsulas bacterianas están constituidas químicamente por polisacáridos,

aunque en el género Bacillus consiste en un polipéptido del ácido D-Glutámico.

La cápsula desempeña un papel importante en la virulencia de algunas

bacterias patógenas, ya que les confiere propiedades antifagocíticas que

interfieren con los mecanismos de defensa del organismo.

El grosor de la cápsula varía no solo de una especie de microorganismos a

otra, sino que también entre las diferentes cepas de la misma especie y

dependiendo de la fase de la curva de crecimiento en que se encuentra el cultivo.

El diámetro de la cápsula puede ser varias veces mayor al diámetro del cuerpo

celular, como en el caso de Streptococcus pneumoniae y Klebsiella pneumoniae.

Por el contrario, en otras bacterias su diámetro puede ser mucho menor,


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poniéndose de manifiesto solamente mediante procesos bioquímicos y serológicos

como en el caso de algunas cepas de Pasteurella spp.

Las bacterias con cápsula, en los medios de cultivo, forman colonias lisas y

mucoides mientras que las bacterias no capsuladas producen colonias rugosas.

Las cápsulas bacterianas no pueden observarse en frotis teñidos con las

técnicas usuales porque son incapaces de retener el colorante y porque los

procesos de fijación al calor y lavado las disuelven. Por lo tanto l mejor método

para observarlas es el de las tinciones negativas.

La Fig. 5 nos pone de manifiesto la presencia de cápsula bacteriana

mediante la tinción negativa con tinta china.

Fig. 5 Demostración de cápsula bacteriana, utilizando el método de Tinta

China.

Los siguientes ejemplos son géneros bacterianos y m icóticos que pueden

presentar cápsula.

a) Klebsiella b) Pasteurella c) Bacillus d) Escherichia e) Yersinia

a) Streptococcus b) Haemophilus c) Neisseria d) Moraxella e) Cryptococcus

Frotis grueso Frotis delgado


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• MATERIAL.

� Laminillas � Cubreobjetos � Lápiz graso � Asa bacteriológica (Asa) � Microscopio � Mechero de Bunsen � Aceite de Inmersión � Pulque � Tinta China filtrada � Colorantes para la tinción de Maneval

PROCEDIMIENTO:

Determina la presencia de cápsula bacteriana utilizando el pulque que has

traído, con los métodos de tinción negativa que a continuación se describen:

TINCIÓN NEGATIVA CON EL MÉTODO DE MANEVAL MODIFICADO.

Coloca una gota de Maneval A (Rojo Congo) en una laminilla.

Toma un poco de pulque y mézclalo con la gota de Maneval A, haciendo

movimientos giratorios con el asa.

Extiende la suspensión de manera que quede una película delgada.

Deja secar la preparación a temperatura ambiente. NO FIJES EL FROTIS AL

CALOR.

Cubre la preparación con Maneval B (Fucsina ácida) y deja que actúe durante un

minuto. Lava suavemente con agua corriente de la llave y seca el frotis mediante

un ligero contacto con una toalla de papel. Observa al microscopio Con el objetivo

de inmersión.

Las cápsulas se observan como halos incoloros. El espacio intercelular se observa

de un color oscuro y las células bacterianas de color rojo.

TINCIÓN NEGATIVA CON TINTA CHINA.

En una laminilla coloca una gota de tinta china y una gota de pulque, suspéndelo

homogéneamente.

Coloca un cubreobjetos sobre la suspensión y observa al microscopio.


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La cápsula se observa como un halo incoloro alrededor de los microorganismos,

gracias al contraste proporcionado por la coloración negra tanto del espacio

intercelular como de las células microbianas

Cuestionario

Anota tus observaciones tomando en consideración lo siguiente:

1) ¿Por qué este tipo de preparaciones no deben fijarse al calor?

2) ¿Cuál de los dos métodos puso mejor de manifiesto la cápsula bacteriana?

3) Comparar el grosor de la cápsula con el diámetro de la célula.

4) Relacionar el tamaño de la cápsula con la viscosidad del medio.

5) ¿Cuál es la función de la cápsula en una infección bacteriana?






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PRÁCTICA No. 6

MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN





• El alumno explicará el proceso de esterilización me diante el método

de calor seco y calor húmedo.

• El alumno aplicará los conocimientos teóricos selec cionando el o

los métodos de esterilización mas adecuados para es terilizar cada

uno de los materiales que se le presentan.

INTRODUCCIÓN: La esterilización es un proceso que destruye todo tipo de vida en el material o

sustancia de que se trate. Esto puede realizarse por métodos físicos o químicos.

MÉTODOS FÍSICOS.

Dentro de los métodos físicos de esterilización pueden mencionarse:

Calor Húmedo Ebullición A 100 ºC por 10-15 minutos.

Vapor a presión (autoclave)

A 121 ºC a 15 lb. de presión por 15 minutos.

I.- CALOR Calor seco Flameado

Incineración

Aire caliente (Horno Pasteur)

A 160-170 ºC, de 60-120 minutos

II. FILTRACIÓN Filtros de columna

Filtros de membrana Con poros de 0.8, 0.6, 0.45, 0.2 y 0.1 µm de diámetro.


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III. RADIACIÓN Radiaciones ionizantes Rayos α β,γ y X

Radiaciones no

ionizantes

Rayos ultravioleta e infrarrojos.

A continuación se describirán cada uno de estos métodos.

I. CALOR.

El efecto esterilizante del calor se debe a que se desnaturaliza (coagula) las

proteínas. El factor que más influye cuando s esteriliza por éste método es la

presencia o ausencia de humedad, ya que es ésta la que determina la temperatura

exacta a la que mueren los microorganismos. En términos generales, la

esterilización por calor húmedo es más eficaz.

Ebullición: Por este proceso las formas vegetativas de la mayoría de las bacterias

mueren en 10-15 minutos a una temperatura de 90-100 ºC. Sin embargo, las

bacterias esporuladas requieren de mayor tiempo de exposición. La ebullición

puede utilizarse para esterilizar material de cristalería, instrumental de cirugía,

jeringas, recipientes, etc.

Vapor a Presión. La esterilización por medio de vapor a presión se realiza en un

recipiente herméticamente cerrado (autoclave) (ver figura 6) en el que se produce

presión de vapor de agua, lo cual permite lograr temperaturas mayores a las que

se obtienen en la ebullición. Durante este procedimiento es importante una

completa evacuación del aire del recipiente, ya que la temperatura de la mezcla de

Aire-Vapor es más baja que la del vapor puro. A este proceso de eliminación del

aire se le denomina “purga del autoclave” y se realiza a través de una válvula de

escape que puede variar de acuerdo con las especificaciones del modelo de

autoclave que se utilice.

Las autoclaves deben de tener un manómetro que indique la presión interna. La

presión que debe alcanzarse es de 15 libras /1.1 Kg/cm2), y a esta presión la

temperatura alcanzada es de 121 ºC. Para lograr un efecto esterilizante deben

mantenerse la presión y temperatura mencionada durante 15 minutos por lo


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menos, debiendo aumentarse el tiempo cuando el volumen de material es grande.

Después de este periodo, el autoclave debe dejarse enfriar hasta que la presión

en el manómetro marque cero libras.

El autoclave es de utilidad para destruir tanto formas vegetativas como

esporas bacterianas presentes en substancias termoestables, material de cirugía

y curación, ropa, material de cristalería, filtros, etc.

Flameado. Consiste en la aplicación directa de la flama sobre el material a

esterilizar. El material puede calentarse al rojo blanco o sumergirse en alcohol y

pasarlo por la flama para que éste se consuma. Es utilizado para asas

microbiológicas, espátulas, pinzas, tijeras, etc. La Fig. 6 muestra el flameado como

método de esterilización.

Incineración. Es la forma más eficaz y rápida para la destrucción de hisopos

contaminados, material de curación, muestras de desecho, así como cadáveres de

animales infectados.

Aire caliente. La esterilización por medio de aire caliente se realiza en una cámara

(horno Pasteur) (Ver figura 6) que puede compararse con un horno doméstico. En

el debe alcanzarse una temperatura mínima de 160 ºC durante l Hr. por lo menos.

Es un requisito indispensable que el aire caliente circule para que cada objeto a

esterilizar alcance la temperatura deseada y ésta destruya a todos los

microorganismos tanto esporulados como no esporulados. El Horno Pasteur es

ampliamente usado en la esterilización de material de cristalería y material de

cirugía. NO ES RECOMENDABLE para substancias líquidas, algodón, telas y

plásticos, ya que estos materiales tienden a deteriorarse por deshidratación a

inclusive pueden carbonizarse.

II. FILTRACIÓN.

Es la remoción mecánica de los microorganismos presentes en una substancia

líquida. Para esto se utiliza un tamiz con poros de un diámetro de menor tamaño al

de los microorganismos que se desean remover. Los filtros, deben ser

esterilizados previamente a su uso y generalmente en el autoclave.

La filtración es particularmente útil para la esterilización de soluciones de

antibióticos y líquidos termolábiles.


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III. RADIACIONES

De las radiaciones que se utilizan con fines de esterilización existen dos grupos:

a) Ionizante (alta energía)

b) No ionizantes (baja energía)

Radiaciones ionizantes: este tipo de radiaciones son de corta longitud de onda y

actúan ionizando moléculas a su paso. Son altamente letales a su efecto sobre al

ADN. Ejemplo de este tipo de radiaciones son los rayos alfa ( α ), beta ( β ),

gamma ( γ ) y equis ( X ).

Radiaciones no ionizantes: Dentro de esta categoría se incluyen los rayos

infrarrojos y los rayos ultravioleta. Los primeros son de longitud de onda más larga

que la luz visible y se absorben en forma de calor. Su acción esterilizante se debe

a la desnaturalización de proteínas generada por el calor.

Los rayos ultravioleta tienen una longitud de onda más corta que la luz visible y

provocan la muerte de los microorganismos debido a que al ser absorbidos

ocasionan “lesiones” en el ADN y en algunas proteínas de la célula microbiana.

Las radiaciones, tanto ionizantes como no ionizantes, se utilizan para esterilizar

recintos cerrados, materiales plásticos, materias primas para alimentos de

animales, papel, hojas delgadas de metal y algodón, entre otros.

MÉTODOS QUÍMICOS.

Los métodos químicos par esterilización utilizan agentes como el óxido de etileno

y l formaldehído, ambos son gases y se les usa para esterilizar recintos cerrados

como quirófanos, laboratorios, incubadoras y nacedoras. El óxido de etileno es

también utilizado en la esterilización de materiales sólidos termolábiles (materiales

plásticos).

Desinfección.

La desinfección involucra agentes químicos que generalmente no tienen efecto

esterilizante, aunque destruyen virtualmente todos los microorganismos

patógenos. Solo algunos desinfectantes pueden tener efecto esterilizante cuando

se usan apropiadamente, tal es el caso del formaldehído, el fenol, el

glutaraldehído, el óxido de etileno, el peróxido de hidrógeno y el ácido paracético.


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Hay desinfectantes que, debido a que no produce daño celular, pueden aplicarse

sobre superficies corporales. A estos desinfectantes se les conoce como

antisépticos, por ejemplo el alcohol etílico, el iodo, la tintura de benzalconio, el

cloruro de benzalconio, el mercurocromo, etc.

Los desinfectantes pueden clasificarse según su mecanismo de acción en:

Ejemplo: 1. Detergentes

catiónicos Cloruro de benzalconio

2. Alcoholes Alcohol etílico 3. Fenoles Fenol 4. Halógenos Cloro, Iodo 5. Agentes alquilantes Formaldehído, óxido de etileno 6. Agentes oxidantes Peróxido de hidrógeno, ácido paracético 7. Colorantes Violeta de genciana, azul de metileno 8. Metales pesados Soluciones de cobre, plata y mercurio.

Fig. 6 Equipo que puede ser utilizado para la esterilización de materiales.

Aire caliente

Horno Pasteur

Flameado

Autoclave

Flameado Vapor a presión


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MATERIAL:

Autoclave Horno Pasteur Jeringas Hisopos contaminados Cultivos bacterianos en medio sólido y líquido Asa microbiológica Espátulas Alcohol Tijeras Guantes de latex Cajas de Petri Tubos de ensaye Pipetas Hisopos Mortero

PROCEDIMIETOS:

1. En tu mesa de trabajo encontrarás material para esterilizar, observa,

clasifica y selecciona el método a utilizar para la esterilización de dicho

material.

2. Espera la explicación del profesor sobre algunas particularidades

previas a la aplicación del método de esterilización.

CUESTIONARIO

1. Con base en su bibliografía y el trabajo realizado, indicar si aplicó los

métodos de esterilización adecuados para el material y medios de cultivo que

preparó

2 Indicar si el proceso de esterilización aplicado a los medios de cultivo fue

eficiente.

3 Comparar la eficacia del calor seco y del calor húmedo como medios de

esterilización.

4 Comparar la resistencia al calor de las células vegetativas de las bacterias

con la de las esporas bacterianas.


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5 ¿Qué clase de materiales se esterilizan por lo general por filtración?

6 ¿En que se fundamenta la esterilización por tindalización?






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PRÁCTICA No. 7

CLASIFICACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO





• Conocerá la importancia del cultivo de bacterias “ in vitro ”.

• Enunciará la utilidad práctica de los medios según sus

características físicas.

• Preparará y clasificará los medios de cultivo probl ema.

INTRODUCCIÓN: Para realizar el estudio de los microorganismos es necesarios recuperarlos

del habitad natural donde se encuentran y hacer que proliferen en medios

artificiales que proporcionen sus requerimientos nutricionales, a este

procedimiento se conoce como cultivo “in vitro”.

La proliferación de bacterias es el resultado de una interacción compleja de

diferentes sustancias alimenticias y principios activos en la cual intervienen

factores físicos como la temperatura, el pH, el factor redox.

Para su crecimiento todos los microorganismos requieren agua, además

deben estar presentes en forma utilizable el carbono, oxígeno, nitrógeno,

hidrógeno, calcio, fósforo y el fierro, muchos microorganismos dependen además

de oligoelementos como el magnesio, molibdeno, zinc, cobre.

Los microorganismos exigentes tienen necesidad además de factores de

crecimiento como aminoácidos, vitaminas, purinas u otras sustancias que no

pueden sintetizar ellos mismos.

El carbono se necesita en la mayor parte de las veces en forma e

compuestos orgánicos, que luego sirven como fuente de energía, el oxígeno se

toma principalmente de la atmósfera, las necesidades de hidrógeno se cubren con

compuestos orgánicos y, en casos particulares, también a partir de compuestos


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inorgánicos. El nitrógeno proviene de sales en forma de nitratos, nitritos o

compuestos amónicos, o de componentes más complejos como aminoácidos,

peptonas o proteínas. Los otros elementos se toman principalmente de sales.

Los medios de cultivo sintéticos están compuestos de una serie de

substancias químicas definidas exactamente, los medios de cultivo complejos

contienen diferentes extractos, hidrolizados u otros aditivos.

CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DE LOS MEDIOS

a) Medios líquidos Son medios que no contienen agar (agente solidificante),

son envasados en tubos, botellas y matraces.

b) Medios semisólidos Son medios que contienen 0.5 a 0.75% de agar. Son

envasados en tubo.

c) Medios sólidos Existen dos tipos, los que contienen 1.5% de agar y los

que contienen 3 a 7% de agar llamados medios duros.

Pueden envasarse en cajas de Petri, botellas o tubos.

El agar-agar es un extracto seco gelificante, obtenido de algunas especies

de algas rojas, particularmente de los géneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaida y

Adanthopeltis.

En el medio de cultivo pueden estar presentes colorantes e indicadores

cuyo cambio de color será característico para un determinado intervalo de pH.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

Como es lógico suponer no todos los medios de cultivo son utilizados para

el aislamiento de todas las cepas bacterianas, utilizados para el aislamiento de

todas las cepas bacterianas, en ocasiones no solo son aptos para el aislamiento

de microorganismos en general, sino que además poseen la capacidad de inhibir a

algunos y favorecer el desarrollo de otros.

Basados en el propósito para el cual son fabricados los medios de cultivo se

pueden clasificar de la siguiente manera:

MEDIOS DE CULTIVO BÁSICOS.


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Son medios simples que contienen en general los nutrientes esenciales para

promover el desarrollo de microorganismos poco exigentes nutricionalmente.

Reciben también el nombre de medios generales y pueden ser utilizados en

análisis cuantitativos, para muestreo de medio ambiente, superficies y para

conservar cepas.

Ejemplos: Caldo nutritivo, caldo tioglicolato, caldo triptosa, agar nutritivo. Agar

soya tripticasa.

MEDIOS ENRIQUECIDOS.

Son medios que se suplen con factores de crecimiento para el desarrollo de

bacterias y hongos de requerimientos nutricionales exigentes. Estos medios

generalmente contienen uno o más de los siguientes ingredientes: sangre, suero,

líquido ascítico, huevo, carne, vitaminas y aminoácidos específicos, entre otros.

Ejemplos: Agar sangre, agar Sabouraud con ácido nicotínico, agar Lowestein-

Jensen, caldo infusión cerebro corazón.

MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO.

Son muy utilizados, sobre todo en cultivos entéricos, estos medios se utilizan para

aumentar la propagación de ciertos organismos sin favorecer a otros. Son muy

eficaces en el aislamiento de Salmonella a partir de heces.

Ejemplos: Caldo selenito de sodio, caldo selenito y cistina, caldo tetrationato,

caldo-sal-colistina, agar sangre + levadura de cerveza, agar yema de huevo con

leche.

MEDIOS SELECTIVOS.

Son muy utilizados cuando se trabaja con muestras que provienen de áreas del

cuerpo que poseen una flora normal abundante (faringe, boca, piel nariz, vagina,

etc.). En estos se incorporan substancias inhibidoras de la propagación de un

grupo de bacterias, pero permiten en cambio el crecimiento de otros grupos. Así

para el cultivo entérico, los medios usados de modo habitual contienen ciertos

colorantes e ingredientes que inhiben los organismos Gram positivos y permiten la

propagación de los bacilos entéricos Gram negativos.


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Ejemplos: Agar verde brillante (VB), agar Salmonella Shigella (SS), que son

medios selectivos para Salmonella, agar Mac Conkey (Mac C), agar ENDO y agar

Eosina azul de metileno (EMB), que son selectivos para enterobacterias, agar

manitol sal (MSA), agar Staphylococcus 110 y Chapman Stone, selectivos para

Staphylococcus.

MEDIOS DIFERENCIALES.

Este tipo de medios, debido a los componentes químicos e indicadores que

contienen, permiten identificar con cierta facilidad algunos géneros o especies

bacterianas, por el aspecto característico que toman sus colonias. Muchos medios

selectivos son también diferenciales.

Ejemplos: Agar verde brillante, agar Salmonella-Shigella, agar Mac Conkey, agar

ENDO, agar eosina azul de metileno. Estos permiten diferenciar enterobacterias

fermentadoras de la lactosa (coliformes) de las no fermentadoras de la lactosa (no

coliformes).

MEDIOS PARA EL ESTUDIO DE CARBOHIDRATOS.

En los medios de cultivo, los carbohidratos y glucósidos son muy utilizados como

fuente de energía por las bacterias, y particularmente para diferenciar géneros e

identificar especies se utiliza generalmente agua peptonada como base para el

estudio de los azúcares, las soluciones de carbohidratos empleados para estas

pruebas, deben esterilizarse por filtración, ya que al calentarse los azúcares sufren

varios fenómenos, como la formación de productos de oxidación y reaccionar con

algunos otros componentes de los medios de cultivo como aminoácidos.

Ejemplos: Medio basal OF de Hugh y Leifson, medio para MR-VP y todos aquellos

en los cuales se pruebe algún azúcar en particular (agua peptonada + glucosa,

manitol, sucrosa, sorbitol, galactosa, etc.).

MEDIOS DE TRANSPORTE.

Son medios utilizados en el envío de muestras de laboratorio, algunos contienen

sustancias reductoras, o nutrientes que permiten a los microorganismos

conservarse viables hasta llegar al laboratorio.

Ejemplos: Medio de transporte de Stuart, caldo tioglicolato, medio de Carry-Blair.

MATERIAL: Diferentes medios de cultivo sintéticos


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Matraces Erlenmeyer Mechero Espátulas Cajas de Petri Autoclave Balanza granataria Papel aluminio Tubos de ensaye

PROCEDIMIENTO:

Los fundamentos de preparación, distribución y esterilización de los medios

de cultivo son esencialmente iguales, utilizando las formas deshidratadas o bien

añadiendo los distintos ingredientes por separado.

Casi todos los medios de cultivo utilizables se encuentran en el comercio en

forma deshidratada y se determina simplemente la cantidad necesaria de polvo,

según las instrucciones y se añade al agua destilada necesaria. Es importante

utilizar un frasco o matraz Erlenmeyer lo suficientemente grande para que se

pueda remover o agitar bien para disolver el medio.

Una vez preparado el medio, se distribuyen recipientes adecuados mientras

están todavía calientes, los métodos de distribución de los medios disueltos en

cajas de Petri, tubos o frascos, dependen del tipo de medio y de la finalidad de su

empleo.

PREPARACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO Y SU DISTRIBUCIÓN CAJAS DE

PETRI. Ver Fig. 7

Fig. 7 Preparación de un medio de cultivo. Material necesario para la

reconstrucción de los medios de cultivo.


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Pesar la cantidad requerida del medio

deshidratado utilizando un papel o papel

aluminio, evitando con éste pérdidas del

polvo sobre la balanza.

El medio se añade a una pequeña cantidad

de agua destilada o desmineralizada, fría y

se distribuye uniformemente por agitación,

enseguida añadir la cantidad restante de

agua y se homogeniza.

Se deja reposar la solución durante 10 a 15

minutos a temperatura ambiente, para que el

agar pueda hincharse. Para disolver

completamente los medios deben calentarse

a más de 95ºC.


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Los medios de cultivo clarificados, se

esterilizan en autoclave utilizando la forma

convencional de 121ºC por 15´ y a 15 lb de

presión, estas constantes van a depender

del tipo de medio a esterilizar.

El medio agarificado, todavía líquido se

vierte en las cajas de Petri. El volumen es

variable y depende del tamaño de las cajas;

se recomienda 15 a 20 ml para las cajas de

31/2 plg. y de 20 a 35 ml para las cajas de 4

plg.

Si aparecen burbujas de aire en las cajas, se

eliminan pasando la llama del mechero de

Bunsen por la superficie. Las cajas se pasan

por una prueba de esterilidad que consiste

en incubarlas por 24 horas a 37 ºC.

Una vez transcurrido el tiempo de

incubación, las cajas y los tubos son

revisados. Aquellos que muestren

contaminación se desechan; por el contrario,

los libres de contaminación se refrigeran

entre 4-15 ºC hasta su utilización.

NOTA:

Para preparar las cajas de Petri, se tendrán que esterilizar primero y a

continuación se llenan con el medio, hasta una altura de 3 mm. Hay que dejar


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enfriar el medio a unos 50-55 ºC con el objetivo de prevenir la condensación de

humedad en las paredes del recipiente.

1.- En tu mesa encontrarás diferentes medios de cultivo deshidratados

(comerciales).

2.- Clasifícalos de acuerdo a su uso.

3.- Lee las instrucciones de cada uno de los medios.

4.- Procede a prepararlos según las indicaciones de cada uno de ellos y con base

al procedimiento antes mencionado; tu profesor te revisara los cálculos

matemáticos que realizaste.

CUESTIONARIO:

1. Menciona la clasificación de los medios de cultivo según sus características

físicas.

2. De acuerdo a la composición química. menciona la clasificación de los medios de cultivo

3. Menciona dos ejemplos de medios selectivos y de transporte.

4. Por que es importante saber que medio de cultivo utilizar para la siembra de

bacterias y la siembra de hongos.

5. Que puntos debes de seguir para la preparación de un medio de cultivo.

6. Una vez preparados los medios en que tipo de recipientes se pueden distribuir y por que.




Buen lenguaje


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OBSERVACIONES:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ RECOMENDACIONES:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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PRACTICA No. 8

SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO





• El alumno aplicará las técnicas de sembrado en medi os de cultivo

líquidos, semisólidos y sólidos.

INTRODUCCCION

La mayoría de las bacterias pueden multiplicarse formando colonias visibles en

medios de cultivo artificiales, los cuales, una vez preparados y listos para ser

inoculados con bacterias, pueden tener varias presentaciones en cuanto a su

consistencia, la cual está determinada por la concentración de agar presente en el

medio o la ausencia del mismo. El instrumento más utilizado para la inoculación

(sembrado) de bacterias es el asa bacteriológica, la cual puede ser de alambre de

platino, nicromo u otro material parecido el cual se inserta en un mango. Existen

en el mercado asas microbiológicas calibradas para tomar un volumen constante

de inóculo, las más utilizadas con este fin son las de 0.01 y 0.001 ml, las cuales

son utilizadas para el análisis bacteriológico cuantitativo de agua y orina sin diluir.

El sembrado de cada uno de los medios de cultivo, se realiza de manera diferente

de acuerdo al fin que se persigue, el aislamiento de las bacterias de las muestras

remitidas al laboratorio, se realiza casi siempre por sembrado en la superficie de

una placa de agar en líneas paralelas por medio de un asa este procedimiento

asegura la suficiente dilución, permitiendo el desarrollo de colonias aisladas que

pueden emplearse para la obtención de “ cultivos puros”, en los que se puede

realizar la identificación.

A partir del inóculo se realizan una serie de estrías como lo muestra la Fig.

8., donde se explica el procedimiento para el sembrado de medio sólido en caja


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de Petri. Es indispensable que se emplee una técnica adecuada para la siembra

ya que la mayor parte de estas colonias aisladas serán “cultivos puros”.

- Con un asa esterilizada, se colocan dos

asadas del material cerca del borde de la

placa y se realiza una estría inicial

- Se esteriliza es asa en la llama del mechero

y se deja enfriar.

- Después, se emplea el asa para distribuir la

muestra en la placa en estrías, presionando

ligeramente sin romper el agar.

- Recordar que el asa de inoculación deberá

esterilizarse entre cada cambio de estría

utilizando la flama del mechero de Bunsen.


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Fig. 8 Procedimiento para el “sembrado” en medio sólido.

- A partir del extremo de la primera estría

se realiza una segunda y así sucesivamente

hasta completar las cuatro estrías.

- Al concluir el sembrado en la placa, esterilizamos

nuevamente el asa, evitando con esto, posibles

contaminaciones a otros medios.

- Aspecto final de la placa sembrada, utilizando la

técnica descrita anteriormente.

Las placas una vez inoculadas se incuban en posición invertida con los medios

hacia arriba a 37 C y se examinan a intervalos de 24-48 horas. Después de que la

placa ha sido incubada y para la obtención de cultivos puros, cualquier colonia

bien aislada es removida con un asa, pero tal vez sea más conveniente emplear el

asa recta sobre todo si las colonias están muy juntas. La colonia es suspendida en


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un medio líquido, o bien sembrada directamente en otra caja conteniendo algún

medio específico dependiendo del agente que se sospeche.

Para cierto tipo de muestras, por ejemplo, las de orina o sangre, se coloca una

cantidad determinada de la muestra en una placa de Petri estéril y se vierta

encima del agar derretido (enfriado a 50 C), luego se hace rotar la placa para

mezclar minuciosamente el material con el medio. Una vez que se haya

solidificado a temperatura ambiente de invierte la placa, se incuba a 37 y se

examinan las colonias, esta técnica ofrece la ventaja de dar una determinación

cuantitativa de las bacterias. Si las muestra están muy contaminadas, es

necesario realizar una dilución.

El resembrado de las colonias obtenidas en el aislamiento primario, asegura la

purificación de las diversas cepas bacterianas y por lo tanto, la obtención de “

cultivos puros”.

INOCULACIÓN DE TUBOS CON AGAR INCLINADO.

Los cultivos en una superficie de agar inclinado, se realizan con frecuencia para

mantener las cepas puras y para efectuar ciertos estudios bioquímicos.

La inoculación, se realiza a partir de una colonia aislada, tomada de una placa

con el asa, se traslada el inóculo a la superficie del medio que se siembra

enteramente por estrías (Ver Fig. 9), a veces es necesario practicar una incisión

en la superficie del agar, por ejemplo en el agar TSI para organismos entéricos, la

incisión nunca llega hasta el fondo.

La Fig. 10 nos muestra diferentes tipos de crecimiento sobre agar inclinado

Fig. 9 “Sembrado” en agar inclinado


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1 2 3 4 5 6

1.ARBORECENTE2. DIFUSO3. ESPINOSO4. RIZOIDE5.ARROSARIADO6.- PILIFORME

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1.ARBORECENTE2. DIFUSO3. ESPINOSO4. RIZOIDE5.ARROSARIADO6.- PILIFORME

Fig. 10 Diferentes tipos de crecimiento sobre agar inclinado

INOCULACIÓN DE TUBOS CON MEDIO SÓLIDO HORIZONTAL.

La inoculación de algún medio sólido presentado en tubo de ensayo con

superficie horizontal, se realiza utilizando es asa recta. El método de sembrado

consiste en quitar la tapa con el dedo meñique, flamear la boca del tubo e inocular

por picadura evitando llegar hasta el fondo del medio ( Ver Fig. 11).

Fig. 11 Inoculación de un medio sólido por picadura.


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INOCULACIÓN DE MEDIOS SEMISÓLIDOS.

Los medios semisólidos se emplean para los estudios de movilidad (medio de

SIM), carbohidratos (medio basal OF) o bioquímicos (gelatina) se inoculan

utilizando un alambre recto, tratando de que la incisión no llegue al fondo del tubo.

(Ver Fig. 12)

Fig. 12 “Sembrado” por picadura de un medio semisólido


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MATERIAL:

Medios de cultivo líquidos (Caldo nutritivo).

Medios de cultivo sólido.

Asa.

Mechero.

Cepas bacterianas.

Portaobjetos.

Juego de colorantes para la tinción de Gram.

INOCULACIÓN EN MEDIOS LÍQUIDOS

La inoculación de los caldos de cultivo, se

efectúa con asa recta, a partir de la muestra

u otros cultivos, agitándola dentro del medio

como lo muestra la Fig. 13.

El crecimiento en estos medios se manifiesta

de tres formas:

1. enturbiamiento, una opacidad más o

menos densa

2. Formación de velo: pequeña masa de

células que flota en la parte superior del

cultivo,

3. Sedimento: deposito celular que

permanece en la parte inferior del

cultivo.

Fig. 13 “Sembrado en medios líquidos

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