Bach. Milagros Sara Asqui Barrionuevo Bach. Melanea ...

UNIVERSIDAD PRIVADA AUTÓNOMA DEL SUR

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

TESIS

“EFECTO ANTIBACTERIANO DE EXTRACTO ETANÓLICO DE LAS

VAINAS DE Caesalpinia Spinosa (Molina) Kutze (TARA) SOBRE

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Y Escherichia coli ATCC 25922,

AREQUIPA-2019”

PRESENTADA POR:

Bach. Milagros Sara Asqui Barrionuevo

Bach. Melanea Calcina Vanegas

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE

QUÍMICO FARMACÉUTICO

ASESOR:

Mg. Q.F. Ruth Elena Gárate de Dávila

AREQUIPA – PERÚ

2020

UNIVERSIDAD PRIVADA AUTÓNOMA DEL SUR

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

TESIS

“EFECTO ANTIBACTERIANO DE EXTRACTO ETANÓLICO DE LAS

VAINAS DE Caesalpinia Spinosa (Molina) Kutze (TARA) SOBRE

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Y Escherichia coli ATCC 25922,

AREQUIPA-2019”

PRESENTADA POR:

Bach. Milagros Sara Asqui Barrionuevo

Bach. Melanea Calcina Vanegas

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO FARMACÉUTICO

APROBADO POR:

PRESIDENTE DEL JURADO Mg. Elvis Gilmar Gonzales Condori

PRIMER MIEMBRO DEL JURADO Mg. Betty Salazar Pinto

SEGUNDO MIEMBRO DEL JURADO Mg. Antonieta Salome Calizaya Chiri

I

DEDICATORIA

A Dios, por haberme permitido llegar hasta este punto, quien como guía estuvo

presente en el caminar de mi vida, bendiciéndome y dándome fuerzas para continuar

con mis metas trazadas sin desfallecer.

A mis padres, por el trabajo y su sacrificio en todos estos años. con apoyo

incondicional, amor y confianza que permitieron lograr culminar mi carrera profesional.

A mis hermanos por su apoyo incondicional, durante todo este proceso, por estar

conmigo en todo momento gracias. A toda mi familia porque con sus oraciones,

consejos y palabras de aliento hicieron de mi una mejor persona y de una u otra forma

me acompañan en todos mis sueños y metas.

En especial a mi amado hijo Sebastián David quien fue el motor y motivo que me

impulso para lograr una meta soñada y ser un ejemplo a seguir.

II

AGRADECIMIENTO

Agradezco a Dios por guiarme en mi camino brindándome paciencia y sabiduría

para culminar con éxito mis metas propuestas.

A mis padres quienes se esforzaron para darme todo su apoyo.

Agradecemos a nuestra asesora Mg. Q.F. Ruth Elena Gárate de Dávila por

brindarnos su paciencia y tiempo.

Y por supuesto a mi querida Universidad y a todas las autoridades, por permitirme

concluir con una etapa de mi vida, gracias por la paciencia, orientación y guiarme

en el desarrollo de esta investigación.

III

RESUMEN

El Perú al ser considerado un país megadiverso tiene especies vegetales con

beneficios terapéuticos aprovechados por la medicina tradicional, sin embargo, los

estudios aún no se dan abasto para determinar científicamente las propiedades

terapéuticas de todas las especies vegetales, por ello la presente investigación tuvo

por objetivo principal determinar el efecto antibacteriano del extracto etanólico de las

vainas de Caesalpinia spinosa (Tara) para ello en primer lugar se prepararon extractos

etanólicos por el método de extracción por Soxhlet, encontrando en el extracto

presencia de taninos gálicos o hidrolizables.

Por otro lado, la concentración mínima inhibitoria (CMI) del extracto etanólico de vainas

de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus

aureus ATCC 25923 fueron de 1.562 mg/mL (0.16%) para ambas cepas y la

Concentración Mínima Bactericida (CMB) sobre Escherichia coli ATCC 25922 fue de

12.50 mg/L (1.25 %) y para Staphylococcus aureus ATCC 25923 no se encontró efecto

bactericida.

Finalmente, la evaluación de la sensibilidad antibacteriana de los extractos sobre

Escherichia coli ATCC 25922 fue de sensibilidad intermedia a concentraciones de 80

y 100 % del extracto y resistente a concentraciones menores de 80 %. Para

Staphylococcus aureus ATCC 25923 fue sensible a la concentración del 100 % del

extracto, de sensibilidad intermedia para concentraciones de 40, 60 y 80 % y resistente

a concentraciones menores de 40 %.

Palabras clave. Extracto etanólico, Tara, Escherichia coli, Staphylococcus aureus,

CMI, CMB.

IV

ABSTRACT

Peru being considered a megadiverse country has plant species with therapeutic

benefits exploited by traditional medicine, however, the studies are not yet available to

scientifically determine the therapeutic properties of all plant species, so the present

research was aimed at main determine the antibacterial effect of the ethanolic extract

of the pods of Caesalpinia spinosa (Tara) for this, firstly, ethanolic extracts were

prepared by the Soxhlet extraction method, finding in the extract the presence of gallic

or hydrolysable tannins.

On the other hand, the minimum inhibitory concentration (MIC) of the ethanol extract

of Caesalpinia spinosa (Tara) pods on Escherichia coli ATCC 25922 and

Staphylococcus aureus ATCC 25923 were 1,562 mg / mL (0.16%) for both strains and

the Minimum Bactericidal Concentration (CMB) on Escherichia coli ATCC 25922 was

12.50 mg / L (1.25%) and for Staphylococcus aureus ATCC 25923 no bactericidal effect

was found.

Finally, the valuation of the antibacterial sensitivity of the extracts on Escherichia coli

ATCC 25922 was of intermediate sensitivity at concentrations of 80 and 100% of the

extract and resistant to concentrations less than 80%. For Staphylococcus aureus

ATCC 25923 it was sensitive to the concentration of 100% of the extract, intermediate

sensitivity for concentrations of 40, 60 and 80% and resistant to concentrations less

than 40%.

Keywords. Ethanolic extract, Tara, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, CIM,

CBM.

V

ÍNDICE DE CONTENIDO

DEDICATORIA ....................................................................................................................... I

AGRADECIMIENTO .............................................................................................................. II

RESUMEN ............................................................................................................................ III

ABSTRACT .......................................................................................................................... IV

ÍNDICE DE CONTENIDO ...................................................................................................... V

ÍNDICE DE TABLAS .............................................................................................................. X

ÍNDICE DE FIGURAS .......................................................................................................... XII

ÍNDICE DE ANEXOS ........................................................................................................ XIII

TABLA DE ABREVIATURAS .................................................................................. XIV

INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 1

CAPÍTULO I ......................................................................................................................... 2

EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN ................................................................................. 2

1.1. Descripción de la realidad problemática ....................................................................... 2

1.2. Formulación del problema ............................................................................................ 3

1.2.1. Problema principal ........................................................................................................ 3

1.2.2. Problemas secundarios ................................................................................................ 3

1.3. Objetivos de la investigación ........................................................................................ 4

1.3.1. Objetivo general ........................................................................................................... 4

1.3.2. Objetivos específicos .................................................................................................... 4

1.4. Justificación del estudio ................................................................................................ 5

VI

CAPÍTULO II ................................................................................................................... 6

MARCO TEÓRICO ............................................................................................................... 6

2.1. Antecedentes investigativos ......................................................................................... 6

2.1.1. A nivel internacional ................................................................................................... 6

2.1.2. A nivel nacional ........................................................................................................... 7

2.1.3. A nivel local .................................................................................................................. 8

2.2. Base teórica ............................................................................................................... 10

2.2.1. Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara) ................................................................. 10

A. Descripción ................................................................................................................ 10

B. Principales usos de la tara .......................................................................................... 11

C. Composición química de la tara ................................................................................. 11

2.2.2. Metabolitos secundarios ............................................................................................. 13

a. Terpenos .................................................................................................................... 13

b. Taninos ....................................................................................................................... 13

c. Flavonoides ............................................................................................................... 13

d. Alcaloides ................................................................................................................... 14

2.2.3. Extractos vegetales .................................................................................................... 14

2.2.4. Escherichia coli ........................................................................................................... 16

2.2.5. Staphylococcus aureus ............................................................................................... 17

2.2.6. Efecto antibacteriano ................................................................................................. 18

2.3. Hipótesis .................................................................................................................... 21

2.3.1. Hipótesis general ........................................................................................................ 21

2.3.2. Hipótesis Especificas .................................................................................................. 21

2.4. Variables .................................................................................................................... 22

2.4.1. Identificación de variables ........................................................................................... 22

2.4.2. Definición conceptual de variables .............................................................................. 22

2.4.3. Definición Operacional de Variable ............................................................................ 22

2.5. Operacionalización de variables ................................................................................. 23

VII

CAPÍTULO III ..................................................................................................................... 24

METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN ......................................................................... 24

3.1. Tipo y nivel de investigación ....................................................................................... 24

3.1.1. Nivel y nivel de investigación ...................................................................................... 24

3.1.2. Tipos de Investigación ................................................................................................ 24

3.1.3. Diseño de la investigación .......................................................................................... 24

3.2. Descripción del ámbito de la Investigación ................................................................. 24

3.2.1. Ubicación espacial ...................................................................................................... 24

3.2.2. Ubicación temporal ..................................................................................................... 24

3.3. Población, muestra y muestreo ................................................................................... 24

3.4. Unidades de Estudio ................................................................................................... 24

3.5. Técnicas e Instrumentos para la recolección de datos ................................................ 25

3.6. Obtención del extracto seco de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara) ................ 27

3.7. Identificación de Taninos ............................................................................................ 27

3.8. Identificación de flavonoides ....................................................................................... 27

3.9. Evaluación de la Actividad Antibacteriana .................................................................. 28

3.9.1. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) ..................................... 28

3.9.2. Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB) .................................. 28

3.9.3. Determinación de la sensibilidad antibacteriana por dilución en discos (Kirby Bauer) . 30

VIII

CAPÍTULO IV ..................................................................................................................... 31

RESULTADOS .................................................................................................................... 31

4.1. Recolección e identificación de vainas de Tara .......................................................... 31

4.2. Extracto etanólico de vainas de Tara .......................................................................... 31

4.3. Identificación de taninos en el extracto etanólico de Tara ........................................... 32

4.4. Identificación de flavonoides por la prueba de Shinoda .............................................. 33

4.5. Evaluación de la actividad antibacteriana del extracto de Tara frente a Escherichia coli

ATCC 25922 ........................................................................................................................ 33

4.5.1. Concentración mínima inhibitoria (CMI) del extracto etanólico de vainas tara frente a

Escherichia coli ATCC 25922 .............................................................................................. 33

4.5.2. Concentración mínima bactericida (CBM) del extracto etanólico de vainas Tara frente a


4.5.3. Determinación de la sensibilidad bacteriana del extracto etanólico de vainas de Tara

comparada con ciprofloxacino y gentamicina frente a Escherichia coli ATCC 25922. .......... 37

4.6. Evaluación de la actividad antibacteriana del extracto de Tara frente a Staphylococcus

aureus ATCC 25923 ........................................................................................................... 42

4.6.1. Concentración mínima inhibitoria (CMI) del extracto de Tara frente a Staphylococcus

aureus ATCC 25923 ............................................................................................................ 42

4.6.2. Concentración mínima bactericida (CMB) del extracto etanólico de vainas Tara frente a

Staphylococcus aureus ATCC 25923 .................................................................................. 44

4.6.3. Determinación de la sensibilidad bacteriana del extracto etanólico de vainas de Tara

comparada con ciprofloxacino y gentamicina frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923. ..

................................................................................................................................... 45

IX

CAPÍTULO V ................................................................................................................... 50

DISCUSIÓN .................................................................................................................... 50

CONCLUSIONES ........................................................................................................... 53

RECOMENDACIÓN ........................................................................................................ 54

BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................... 55

ANEXOS ......................................................................................................................... 60

X

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Análisis proximal de las vainas de Tara ................................................................. 12

Tabla 2. Operacionalización de variables ............................................................................. 23

Tabla 3. Obtención de la microdilución en caldo para la determinación de CMI. ........ 29

Tabla 4. Identificación y tipificación de Vainas de Tara recolectadas ................................... 31

Tabla 5. Interpretación de la medición de los halos de inhibición ......................................... 33

Tabla 6. Resultados de la determinación de concentración mínima inhibitoria (CMI) de

extractos etanólicos de vainas de Tara frente a Escherichia coli ATCC 25922 .................... 36

Tabla 7. Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto etanólico de vainas de Tara

frente a Escherichia coli ATCC 25922 ................................................................................. 37

Tabla 8. Sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones del extracto del

extracto etanólico de vainas de Tara ................................................................................... 38

Tabla 9. Análisis de varianza para la sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a

concentraciones del extracto etanólico de vainas de Tara ................................................... 39

Tabla 10. Test de Tukey de la comparación de la sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922

a concentraciones del extracto de vainas de Tara ............................................................... 40

Tabla 11. Resultados de la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de

extracto de vainas de Tara frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 ........................... 43

Tabla 12. Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto etanólico de vainas de Tara

frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 ..................................................................... 45

Tabla 13. Resultados de la determinación de la sensibilidad de Staphylococcus aureus

ATCC 25923 a concentraciones de los extractos etanólicos de vainas de Tara ................... 46

Tabla 14. Análisis de varianza de la determinación de la sensibilidad de Staphylococcus aureus

ATCC 25923 a concentraciones del extracto etanólico de vainas de Tara ........................... 47

XI

Tabla 15. Test de Tukey de la determinación de la sensibilidad de Staphylococcus aureus

ATCC 25923 a concentraciones del extracto etanólico de vainas de Tara ........................... 48

XII

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Árbol de tara ......................................................................................................... 10

Figura 2. Estructura química de tara ................................................................................... 13

Figura 3. Equipo Soxhlet ...................................................................................................... 15

Figura 4. Esquema terapéutico de infecciones provocadas por Escherichia coli .................. 17

Figura 5 Esquema terapéutico de infecciones provocadas por Staphylococcus aureus ....... 18

Figura 6. Vainas de Tara recolectadas y desecadas a 40 °C ............................................... 26

Figura 7. Pulverización de las vainas de Tara ...................................................................... 27

Figura 8. Preparación del ensayo de sensibilidad antibacteriana por el método de Kirby Bauer

................................................................................................................................... 30

Figura 9. Preparación del extracto etanólico de vainas de Tara ........................................... 32

Figura 10. Presencia de taninos en el extracto etanólico de las vainas de Tara ................... 32

Figura 11. Concentración mínima inhibitoria (CMI) de extractos etanólicos de vainas de Tara

frente a Escherichia coli ATCC 25922 ................................................................................. 34

Figura 12. Concentración Mínima Bactericida (CMB) de extracto de vainas de Tara frente a


Figura 13. Diagrama de cajas y bigotes de la evaluación de la sensibilidad de Escherichia

coli ATCC 25922 a concentraciones del extracto de vainas de Tara .................................... 41

Figura 14. Concentración mínima inhibitoria (CMI) de extractos etanólicos de vainas de Tara


Figura 15. Siembra en placa para determinar la CMB del extracto etanólico de vainas de Tara


Figura 16. Diagrama de cajas y bigotes de la evaluación de la sensibilidad de Staphylococcus

aureus ATCC 25923 a concentraciones del extracto etanólico de vainas de Tara ............... 49

XIII

ÍNDICE DE ANEXOS .......................................................................................................... 60

Anexo 1. Identificación taxonómica de las vainas de Tara ................................................... 61

Anexo 2. Matriz Operacional ................................................................................................ 62

Anexo 3. Evidencias del trabajo en laboratorio .................................................................... 63

XIV

TABLA DE ABREVIATURAS

OMS Organización Mundial De La Salud

ATCC American Type Culture Collection

NCCLS National Committee For Clinical Laboratory Standars

CMI Concentración Mínima Inhibitoria

CMB Concentración Mínima Bactericida

EDA Enfermedades Diarreicas Agudas

IRA Infecciones Respiratorias Agudas

UFC Unidad Formadas de Colonias

HUSA Herbarium Areqvipense

1

INTRODUCCIÓN

La Tara es una especie nativa del Perú y está ampliamente distribuida en

América Latina (1). Las vainas de tara se muelen y se usan como materia prima

para la extracción de varios compuestos que tienen aplicaciones en la industria

cosmética, médica, química y farmacéutica (2,3). Además, se ha informado que

sus extractos tienen actividades antitumorales, antimicrobianas y antioxidantes

(4,5,6). Las plantas vasculares contienen taninos que son metabolitos

secundarios, los cuales desarrollan funciones relacionadas con la defensa de las

plantas. Los taninos se clasifican en dos grupos principales: taninos hidrolizables

(TH) y taninos condensados (TC). En los HT, un carbohidrato (generalmente α-

glucosa) se esterifica parcial o totalmente con moléculas fenólicas como el ácido

gálico (que da galotaninos) o el ácido elágico (que da elagitaninos) (7).

Por otro lado, los TC son flavonoides oligoméricos comúnmente catequina o

epicatequina (8). Aunque la composición de la vaina de tara aún no se ha

establecido claramente, posee propiedades beneficiosas por la presencia de TH

(9). Entre ellos, el ácido tánico es bien conocido por su capacidad para inducir

efectos beneficiosos sobre la salud humana a través de la expresión de algunas

actividades biológicas (10). Estudios recientes han reportado otras propiedades

de los taninos que los hacen adecuados para su uso como agente astringente,

para eliminar parásitos y como antipiréticos (11). Además, se ha documentado

su capacidad para reducir el colesterol sérico y los triglicéridos, y para suprimir

la lipogénesis estimulada por insulina (12,13,14).

Por lo expuesto, en la presente investigación se estudió el efecto antibacteriano

del extracto de vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara) sobre

Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC 25922.

2

CAPÍTULO I

EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

1.1. Descripción de la realidad problemática

En los últimos años existe un creciente interés en cuanto a la medicina

tradicional como parte esencial de la cultura de los pueblos donde por muchos

siglos y generaciones se ha dado importancia a la medicina tradicional, según la

organización mundial de la salud (OMS), casi el 60 % de los habitantes de la

tierra confían en ella para resolver sus principales necesidades de salud (15).

Así mismo, el uso de plantas medicinales ha sufrido un incremento, mucho más

en los países en vías de desarrollo como nuestro país y sobre todo nuestra

región Arequipa, donde existe infinidad de plantas medicinales, así mismo se

han realizado diversas investigaciones que han permitido establecer la presencia

de sustancias a base de aceites esenciales en muchas de estas, los cuales son

el producto final del metabolismo secundario de las plantas aromáticas (16).

El uso de aceites esenciales es una buena opción económica de los países en

vía de desarrollo, ya que no pueden asumir el elevado costo de los productos

farmacéuticos convencionales y por ende tienden a abandonar el tratamiento (2).

Los microorganismos patógenos como la Staphylococcus aureus, se adquiere

por contagio directo. Sin embargo, no en todos los individuos se desarrolla la

enfermedad, aunque estén infectados, pero actúan como portadores sanos para

otros en los que si se desencadena la enfermedad (17).

Estas bacterias son responsables de una gran parte de muertes por

Enfermedades Diarreicas Agudas (EDA), Infecciones Respiratorias Agudas

(IRA) que equivale al 75 % de los brotes de intoxicación estafilocócica en los

países desarrollados, el 29 % a nivel nacional y 15 % en nuestra región, siendo

nuestra región el segundo la más afectada por esta bacteria. Sin embargo, el

aumento de la disponibilidad de agentes antimicrobianos para el tratamiento de

estas enfermedades infecciosas en hospitales y en la comunidad ha producido

la aparición de resistencia de estos patógenos a los antimicrobianos, lo que

constituye una preocupación para la salud pública (15).

3

1.2. Formulación del problema

1.2.1. Problema principal

¿Cuál es el efecto antibacteriano del extracto de Caesalpinia spinosa (Molina)

Kutze (Tara) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC

25922?

1.2.2. Problemas Secundarios

¿Cuál es el resultado de identificar flavonoides y taninos presentes en el

extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara)?

¿Cuál es la Concentración mínima inhibitoria (CMI) del extracto etanólico de

vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara) sobre Staphylococcus

aureus ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC 25922?

¿Cuál es la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto etanólico

de vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara) sobre Staphylococcus

aureus ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC 25922?

¿Cuál es la Sensibilidad antibacteriana del extracto etanolico de vainas de

Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara) sobre Staphylococcus aureus ATCC

25923 y Escherichia coli ATCC 25922?

4

1.3. Objetivos

1.3.1. Objetivo general

Determinar el efecto antibacteriano del extracto de Caesalpinia spinosa (Molina)


25922.

1.3.2. Objetivos Específicos

Identificar flavonoides y taninos presentes en el extracto etanólico de vainas

de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara).

Determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) del extracto etanólico de


aureus ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC 25922.

Determinar la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto etanólico

de vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara) sobre Staphylococcus


Evaluar la Sensibilidad antibacteriana del extracto etanólico de vainas de

Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara) sobre Staphylococcus aureus

ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC 25922.

5

1.4. Justificación

La presente investigación tiene importancia al conocimiento científico sobre la

existencia de plantas medicinales que aportará propiedades antibacterianas, las

cuales podrían ser alternativas de prevención y tratamiento de las infecciones,

sobre todo las producidas por la bacteria Staphylococcus aureus de la familia de

los Streptococcus Gram positivo, lo cual es considerado un problema de salud

muy grande en todo el mundo (18), con gran potencial para causar múltiples

infecciones en el ser humano (19).

Staphylococcus aureus es considerada la más virulenta, responsable de un

amplio espectro de enfermedades, que van desde infecciones de la piel y tejidos

blandos hasta infecciones graves que amenazan la vida, aunque forma parte de

la flora normal del humano, aproximadamente entre 25 y 50 % de la población

sana está colonizada por esta bacteria, constituyendo un riesgo por su

diseminación (19).

Staphylococcus aureus posee características particulares de virulencia y

resistencia contra los antibióticos, por lo que los más afectados por esta infección

son los niños y los ancianos en un 60 % (20).

Este microorganismo ya mencionado ha causado resistencia bacteriana por el

alto costo de los fármacos y por la larga duración del tratamiento, motivo por el

cual los pacientes tienden a abandonar el tratamiento (21).

Por lo expuesto, en el presente trabajo de investigación se busca evaluar el

efecto antibacteriano del extracto de vainas de Caesalpinia spinosa (Molina)


25922, ya que se sabe que las vainas, flores y tallos de muchas especies

vegetales fueron utilizadas para combatir enfermedades respiratorias y

digestivas de origen infeccioso por lo que podría ayudar a prevenir y tratar las

enfermedades, (21).

6

CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

2.1. Antecedentes investigativos

2.1.1. A nivel internacional

López. E. en su trabajo de investigación ´´Efecto antimicrobiano in vitro del

aceite esencial de orégano (Origanum vulgare) sobre cepas certificadas de

Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Universidad Tecnica De

Ambato. Ecuador´´ (22), evaluó concentraciones al 30 %, 60 % y 90 % de aceite

esencial de orégano y tween 80. Determinó la Concentración Mínima Inhibitoria,

para la cepa Escherichia coli, y para la cepa Staphylococcus aureus, obteniendo

resultados, donde la cepa Escherichia coli al 30 % presentó formación de

colonias en todos los tiempos establecidos, mientras que al 60 % y 90% no

existió crecimiento bacteriano; por otro lado, para la cepa Staphylococcus

aureus, no existió crecimiento bacteriano en ninguna de las tres

concentraciones. En cuanto a los halos de sensibilidad en la cepa Escherichia

coli obtuvó como valor mínimo un diámetro de 13.01 mm al 30 % y un valor

máximo de 17.62 mm al 60 % respectivamente; por otro lado, en la cepa

Staphylococcus aureus se obtuvo un valor mínimo de 13.25 mm a una

concentración de 30 % y un valor máximo de 25 mm al 90 % (22).

Morocho M. en su investigación ´´Efecto antimicrobiano in vitro del aceite

esencial de eucalipto (Eucalyptus spp.) sobre cepas certificadas de

Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Universidad Técnica De

Ambato. Ecuador´´ (23), evaluó el efecto antimicrobiano del aceite esencial de

Eucalipto (Eucalyptus spp.) sobre cepas certificadas de Escherichia coli

ATCC25922 y Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC292113; y trabajó

con tres diluciones del aceite de eucalipto 30 %, 60 % y 90 % con etanol al 98

%. El autor obtuvo como resultado para Escherichia coli un halo mínimo de 10.25

mm al 30 % y un diámetro máximo de 10.95 mm al 90 % mientras que para la

cepa Staphylococcus aureus subsp. aureus se obtuvo como valor mínimo de

10.95 mm al 30 % y un valor máximo de 14.45 mm al 60 % de dilución (23).

7

2.1.2. A nivel nacional

Paz S. en su trabajo de experimentación sobre el “Efecto antimicrobiano in

vitro del extracto acuoso de Solanum tuberosum (papa fermentada) sobre

Escherichia coli y Staphylococcus aureus Universidad Cesar Vallejo.

Trujillo” (24), determinó el efecto antimicrobiano in vitro del extracto acuoso de

Solanum tuberosum “Papa fermentada” sobre Escherichia coli y Stapylococcus

aureus. obtuvo tres concentraciones de extracto acuoso Solanum tuberosum al

25 %, 50 % y 100 % y dos cepas Escherichia coli y Staphylococcus aureus, cada

una con su grupo control, sulfametoxazol + trimetropin para la primera y oxacilina

para la segunda; para el análisis de los promedios y desviaciones estándar de

los halos de inhibición. Así también la autora obtuvo como resultado que el efecto

antimicrobiano in vitro del extracto acuoso de Solanum al 25 %, 50 %, 100 % fue

cero mm comparados al del sulfametoxazol + trimetropin sobre Escherichia coli

que fue 29.9 mm y de la oxacilina sobre Staphylococcus aureus que fue 17.7 mm

(24).

Aguilar A, Villalobos E. en su trabajo de investigación sobre “Efecto

antibacteriano de tocosh fresco de Zea mays frente a cepas d

Staphylococcus aureus, Bacillus cereus y Escherichia coli. Universidad

San Pedro Chimbote” (25), obtuvieron un extracto acuoso de Zea mays,

mediante las técnicas de percolación, filtración y concentración en rotavapor. Los

investigadores realizaron los cultivos bacterianos en agar Mueller Hinton

mediante el método de Kirby-Bauer. La marcha fitoquímica lo realizarón

mediante el método de Olga Lock. Los resultados obtenidos en esta

investigación fueron: Escherichia coli fue sumamente sensible frente al

sultfametoxazol/ trimetroprim (35.6250 ± 1.30247 mm) y a los extractos al 25, 50

y 100 % (27.8750 ± 0.83452; 30.1250 ± 0.99103 y 31.1250 ± 0.99103 mm

respectivamente). Bacillus cereus fue sumamente sensible frente al

ciprofloxacino (28.6250 ± 1.30247 mm) y muy sensible frente a los extractos al

25, 50 y 100 % (16.7500 ± 0.88641; 18.0000 ± 1.19523 y 19.6250 ± 1.40789 mm

respectivamente). Staphylococcus aureus fue sumamente sensible al extracto al

25, 50, 100 % y a ceftriaxona (30.1250 ± 0.64087; 32.5000 ± 0.75593; 34.6250

± 1.59799 y 27.5000 ± 0.53452 mm respectivamente) (25).

8

Rodriguez J, Segura, A. en su trabajo de investigación sobre “Efecto in

vitro del aceite esencial de las hojas de Lippia alba (pampa orégano) frente

a Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Universidad Nacional de

Trujillo” (26), tuvieron como objetivo determinar el efecto in vitro del aceite

esencial de las hojas de Lippia alba frente a Escherichia coli y Staphylococcus

aureus, extrajeron el aceite esencial mediante el método de destilación por

arrastre de vapor de agua. Para la determinación de la Concentración Mínima

Inhibitoria (CMI) utilizaron el método de macrodilución en caldo Brain Heart

Infusión (BHI), posteriormente agregaron las concentraciones del aceite esencial

diluido en polisorbato 80 y se agregó la suspensión bacteriana incubándose a

37°C por 48 horas. Obtuvieron como resultado la Concentración Mínima

Inhibitoria (CMI) del aceite esencial de Lippia alba frente a Escherichia coli de

2.5 µL/mL, y la CMI del aceite esencial de Lippia alba frente a Staphylococcus

aureus de 3 uL/mL. En la determinación de Concentración Mínima Bactericida

(CMB) se utilizaron el método de difusión de agar en placa, colocando en las

placas petri agar Mueller-Hinton obteniendo asi la CMB del aceite esencial de

Lippia alba frente a Escherichia coli de 2.5 µL/mL, y la CMB del aceite esencial

de Lippia alba frente a Staphylococcus aureus de 3 uL/mL (26).

2.1.3. A nivel local

Medina M. en su trabajo de experimentación sobre “Determinación del

efecto antimicrobiano in vitro del extracto de Equisetum giganteum l. (cola

de caballo) sobre el crecimiento de Staphylococus aureus, Escherichia coli

y Candida albicans. Universidad Catolica Santa Maria Arequipa” (27),

procedió a realizar las extracciones, mediante el método de percolación, se

trabajó con tres componentes solubles, hexano (disolvente no polar), acetato de

etilo, (disolvente polar aprótico) y un solvente hidroalcohólico (disolvente proticó).

La autora obtuvo el extracto hidroalcohólico con un mayor porcentaje de

rendimiento de 46.8 %, en cuanto a la identificación de componentes

secundarios, se identificó la presencia de alcaloides, terpenos, flavonoides y

taninos por cromatografía. Las concentraciones inhibitorias mínimas (CMI)

obtenidas para Staphylococcus aureus, fue de 3.5 mg/mL, para Escherichia coli

15 mg/mL y para Candida albicans 3 mg/mL. Así mismo la concentración mínima

bactericida (CMB) obtenida para Staphylococcus aureus fue, 4.5 mg/mL, para

Escherichia coli 25 mg/mL y para Candida albicans fue de 4 mg/mL (27).

9

Espinoza A, La Fuente K. en su trabajo de investigación sobre “Efecto

antimicrobiano, in vitro del extracto de Curcuma longa l. (palillo) sobre

cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans.

Universidad Catolica Santa Maria Arequipa” (28), evaluaron el efecto

antimicrobiano in vitro de la Curcuma longa L. (palillo) sobre cepas de

Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans. fueron obtenidas

en diferentes Centros de Salud de la ciudad de Arequipa como: Hospital

Edmundo Escomel EsSalud, Hospital Regional Honorio Delgado Espinoza y

Hospital Goyeneche, se llegaron a recolectar 3 cepas de cada microorganismo

por hospital, obtuvieron un total de 27 cepas clínicas. El efecto antimicrobiano de

la Curcuma longa L. (palillo) fue evaluado por el método de dilución en tubo,

obteniendo como resultado para la concentración mínima inhibitoria (CMI) de

(3.83 ± 0.25) mg/mL para las cepas clínicas de Staphylococcus aureus (31.11 ±

3.33) mg/mL para las cepas clínicas de Escherichia coli y (27.78 ± 2.64) mg/mL

para las cepas clínicas de Candida albicans, para la concentración mínima

bactericida (CMB) se obtuvo como resultado un valor de (5.00 ± 0.00) mg/mL

para las cepas clínicas de Staphylococcus aureus, (41.11 ± 3.33) mg/mL para

las cepas clínicas de Escherichia coli y para la concentración mínima fungicida

(CMF) se obtuvo un valor de (27.78 ± 2.64) mg/mL para las cepas clínicas

Candida albicans (28).

10

2.2. Base Teórica

2.2.1. Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara)

A. Descripción La Tara (Caesalpinia spinosa) (Molina) Kutze es un árbol de leguminosas

originarias de América del Sur, con vainas de color rojo o amarillo claro de 8 a

10 cm de largo. Se puede encontrar en la región de Venezuela, Colombia,

Ecuador, Perú, Bolivia, hasta el norte de Chile. La Tara crece de forma natural

en la costa peruana y la región andina a altitudes de 1000 a 2900 m sobre el

nivel del mar (2). Perú es considerado el productor mundial más importante de

tara con más del 80% de la producción mundial (29).

Figura 1. Árbol de Tara

Fuente. Elaboración propia. foto tomada en la madrugada febrero de

2019.

11

B. Principales usos de la tara

A la Tara se le atribuye diferentes propiedades farmacológicas, así como, la

infusión de las vainas maduras se utiliza para la amigdalitis en forma de

gárgaras, la infusión de las hojas se utiliza para la estomatitis. También se usa

para las infecciones vaginales y micóticas, para el lavado de ojos inflamados,

para el dolor de estómago y diarreas, para el reumatismo y resfriado, para curar

úlceras, como cicatrizante, entre otros. En la cosmética se utiliza para la evitar la

caída del cabello, como tinte y para la elaboración de champús y bronceadores;

también se usa como biocida contra piojos y otros insectos (30).

Las infusiones de tara han sido utilizadas tradicionalmente por la medicina

popular peruana para tratar las amígdalas inflamadas, la fiebre, el resfriado y el

dolor de estómago (31). Las vainas de tara molidas concentran un alto contenido

de taninos, la cuales se utilizan en la fabricación de muebles de cuero, plásticos

y adhesivos, como clarificador de vino, como sustituto de malta, como fuente

para obtener el ácido gálico antioxidante utilizado en la industria petrolera (2).

Los taninos de Tara también se emplean como componente de medicamentos

gastroenterológicos para curar úlceras y ayudar a la cicatrización. Se han

atribuido propiedades astringentes, antiinflamatorias, antifúngicas,

antibacterianas, antisépticas y antidiarreicas a los taninos de tara (32).

C. Composición química de la Tara

La Tara se divide en tres partes siendo estas: la semilla la cual corresponde entre

el 30-40 % en peso la vaina molida 40-50 % y los restos de la fibra los cuales

están entre los 15-25 % en peso del fruto. En la semilla de la tara tenemos la

composición siguiente (33).

12

Tabla 1. Análisis proximal de las vainas de Tara

Composición Porcentaje

Humedad 11.70 %

Proteínas 7.17 %

Cenizas 6.24 %

Fibra Bruta 5.30 %

Extracto etéreo 2.01 %

Carbohidratos 67.58 %

Fuente. Cruz (33).

Las vainas de Tara son una buena fuente para producir ácido tánico, galotánico

y gálico Las vainas de Tara contienen galotaninos se componen principalmente

de ésteres de poligaloilo de ácido quínico (34).

La hidrólisis completa que implica la ruptura de los enlaces depsido y éster

produce ácidos quínico y gálico. Los taninos presentes en otros miembros del

grupo de taninos hidrolizables contienen una hexosa galvanizada o elagoilada.

Por medio de una hidrólisis parcial o completa, es factible obtener ácido gálico o

taninos restantes de los taninos de tara (34).

Otro estudio encontró seis nuevos diterpenos de cassane, isoneocaesalpin H,

caespinosin A, caespinosin B, y caespinosins C – E que se aislaron de ramas y

hojas de Tara (Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (35).

13

Figura 2. Diterpenos de cassane, isoneocaesalpin H (1), caespinosin A

(2), caespinosin B (3), y caespinosins C – E (4-6) aislados de la Tara.

Fuente. He et al (35).

2.2.2. Metabolitos Secundarios

a. Terpenos

Los terpenos, o terpenoides, constituyen el grupo más numeroso de metabolitos

secundarios. La ruta biosintética de estos compuestos da lugar tanto a

metabolitos primarios como secundarios de gran importancia para el crecimiento

y supervivencia de las plantas. Suelen ser insolubles en agua y derivan todos

ellos de la unión de unidades de isopreno (36).

b. Taninos

Los taninos son compuestos fenólicos poliméricos que se unen a proteínas

desnaturalizándolas. Existen dos categorías: Taninos condensados son

polímeros de unidades de flavonoides unidas por enlaces C-C. Taninos

hidrolizables son polímeros heterogéneos que contienen ácidos fenólicos (36).

c. Flavonoides

los flavonoides en su estructura contienen 15 carbonos ordenados en dos anillos

aromáticos unidos por un puente de tres carbonos. los flavonoides poseen en su

mayoría propiedades y actividades antiinflamatorias, antioxidante, antialérgicos,

hepatoprotectora, antitrombótica, antiviral y anticarcinogénica. Las antocianinas

pertenecen a los flavonoides sin embargo son estudiadas por separado. Cada

14

flavonoide se encuentra en forma de glicósidos (glucosa, galactosa, xilosa y

arabinosa;) que están unidos como una misma aglicona en diferentes partes y

presentando con mayor posición el número de glicósidos conocido (36).

d. Alcaloides.

Los alcaloides son una gran familia de más de 15.000 metabolitos secundarios

que tienen en común tres características: son solubles en agua, contienen al

menos un átomo de nitrógeno en la molécula, y exhiben actividad biológica. La

mayoría son heterocíclicos, aunque algunos son compuestos nitrogenados

alifáticos (no cíclicos). En humanos, los alcaloides generan respuestas

fisiológicas y psicológicas la mayoría de ellas consecuencia de su interacción

con neurotransmisores. A dosis altas, casi todos los alcaloides son muy tóxicos.

Sin embargo, a dosis bajas tienen un alto valor terapéutico como relajante

muscular, tranquilizante, antitusivos o analgésicos (36).

2.2.3. Extractos vegetales

La extracción es un método por la cual se obtienen los principios activos del

material vegetal, de una manera más concentrada; los componentes solubles

contenidos debidamente preparados, se disuelven en uno o más solventes o

líquidos extractores formando así un extracto crudo o total, el cual va a tener la

mayor cantidad de principio activos, pigmentos vegetales y metabolitos

secundarios. Se pueden clasificar en: (37).

Infusión: Consiste en someter la materia vegetal en contacto con el solvente

a una temperatura igual a la de ebullición del agua por cinco minutos (37).

Decocción o Cocimiento: Consiste en llevar la materia vegetal más menstruo

a la temperatura de ebullición del agua, manteniendo esta temperatura durante

un período de 15 a 30 minutos (37).

Maceración: Consiste en poner en contacto prolongado durante cierto tiempo

la materia vegetal con el menstruo, en el cual el menstruo actúa simultáneamente

sobre todas las proporciones de la droga, circulando a través en todas las

direcciones y sentidos y disolviendo sus principios activos hasta producirse una

concentración en equilibrio con la del contenido celular. Este tipo de extracto se

protege de la luz, para evitar posibles reacciones y debe agitarse continuamente,

15

el tiempo de maceración va entre cuatro y diez días, cuanto mayor sea la relación

entre el líquido extractivo y la droga, más favorable será el rendimiento (37).

Digestión: Es un tipo de maceración que se da a una temperatura suave de

50 o 60° C”. Al aumentar medianamente la temperatura se consigue un mayor

rendimiento de la extracción, haciendo que el solvente pueda ingresar más

rápidamente al interior de las células y así extraer los principios activos (37).

Lixiviación o Percolación: Es el método oficial de extracción, descrito en la

Farmacopea Americana, USP XXX. Consiste en que el menstruo atraviese la

masa de materia vegetal pulverizada en un solo sentido, alcanzando

concentraciones crecientes de tal modo que el equilibrio entre el solvente dentro

y fuera del marco nunca se alcanza, por lo que la droga bañada siempre por

nuevas proporciones de menstruo acaba por ceder todos sus componentes

solubles de manera progresiva. Este tipo de extracción se realiza en recipientes

cilíndricos o cónicos (percoladores), que poseen dispositivos de carga y

descarga, lográndose una extracción total de los principios activos (37).

Soxhlet: Este método de extracción es una técnica basada en la separación

sólido-líquido, en continuo, empleando un disolvente, con posterior evaporación

de éste y pesada final del residuo. Se usa para la determinación del contenido

graso en muestras de diferente naturaleza (37).

Figura 3. Equipo Soxhlet

Fuente. Elaboración propia

16

2.2.4. Escherichia coli

A. Morfología

Se trata de un bacilo Gram negativo, perteneciente a la familia

Enterobacteriaceae no esporulado, aerobio y anaerobio facultativo. Fermenta

glucosa, es oxidasa negativa y reduce los nitratos a nitritos. Presenta movilidad

por flagelos perítricos. Junto con las demás enterobacterias comparte con las

demás bacterias gramnegativas características típicas (citoplasma, ribosomas,

membrana celular, pared con su membrana externa y apéndices como flagelos

y pili). La membrana interna o citoplasmática la constituye una bicapa

fosfolipídica. La pared está formada por un peptidoglicano más delgado que el

de las bacterias grampositivas, y una membrana externa que contiene proteínas

purinas reguladoras de la permeabilidad, y el típico lipopolisacárido de los

gramnegativos, formado por una estructura lipídica interna –lípido A o endotoxina

causante del shock séptico-, una zona intermedia mucho más pequeña con un

número limitado de 5 a 7 azúcares y una parte externa constituida por el

polisacárido con capacidad antigénica –antígeno somático-. Entre la membrana

interna y la externa, a ambos lados del peptidoglicano, se encuentra el espacio

periplásmico (38).

En agar Mac Conkey forma colonias planas, secas, rosadas con un área

circundante de color rosa más oscuro compuesto por sales precipitadas (38).

B. Patogenicidad

Escherichia coli es el miembro más frecuente e importante del género

Escherichia Forma parte de la flora intestinal normal de animales y humanos.

Cada gramo de heces humanas contiene hasta 108 microorganismos

Escherichia coli. Este microorganismo se asocia a múltiples enfermedades,

incluida la gastroenteritis e infecciones extraintestinales, como las urinarias

(ITU), meningitis y sepsis (38).

17

Figura 4. Esquema terapéutico de infecciones provocadas por Escherichia coli (39)

2.2.5. Staphylococcus aureus

A. Morfología

Es un microorganismo Gram positivo (+) de forma esférica, de aproximadamente

1μm de diámetro. Tiende a agruparse en forma de racimos. Su pared celular se

encuentra peptidoglicano asociado a ácidos teicoicos mediante el aminoácido L-

lisina. Produce catalasa, enzima que desdobla el agua oxigenada. En agar

pueden formar colonias de color amarillo dorado y pueden ser betahemolíticas.

Su característica más importante es la fermentación de varios azúcares, entre

los que destaca el manitol, para producir ácido láctico, lo que le diferencia de los

demás estafilococos. Resiste altas concentraciones de sal, por lo que el medio

Chapman (agar manitol salado) es útil para su aislamiento e identificación (38).

18

B. Patogenicidad

Staphylococcus aureus coloniza alrededor del 30 % de las personas,

encontrándose principalmente en la nariz y la zona nasofaríngea, piel y genitales

externos y rara vez en el colon y la vagina. Se puede encontrar el medio

hospitalario, tanto en enfermos como en personal sanitario, aumenta de manera

importante el porcentaje de colonización, al igual que en diabéticos, pacientes

sometidos a diálisis crónica y drogodependientes (38).

Figura 5. Esquema Terapéutico Para Infeccione Provocadas Por Staphylococcus

Aureus (39)

2.2.6. Efecto antibacteriano

A. Método de macrodilución en tubos: Es utilizado para determinar la

concentración mínima bactericida (CMB) y la concentración mínima inhibitoria

(CMI) (40).

La CMI es definida como la concentración más baja de sustancia que puede

inhibir el crecimiento visible de un microorganismo después de incubar por 24

horas y la (CMB) se define como la concentración más baja que puede prevenir

el crecimiento de un organismo después de subcultivar en un medio libre del

compuesto evaluado (40).

Es un método estandarizado de dilución en caldo, que se utiliza para medir

cuantitativamente la actividad in vitro de un antimicrobiano frente a un cultivo

19

bacteriano. Estos métodos se basan en la preparación de una serie de tubos o

placas con caldo o agar, los cuales se les agrega el antibiótico en distintas

concentraciones. Luego se inoculan cada uno de los tubos o placas con una

suspensión estandarizada del microorganismo en estudio. Las pruebas se

examinan después de incubar a 35 ± 2 ºC y se determina la concentración

mínima inhibitoria (CMI) del antimicrobiano frente al microorganismo (41).

B. Método de difusión: Este método de difusión en disco o en pozo fue

estandarizado por Kirby -Bauer y colaboradores y es actualmente recomendado

por el Subcomité de Ensayos de Susceptibilidad de NCCLS, de Estados Unidos

(42).

Se basa en la relación entre la concentración de la sustancia necesaria para

inhibir una cepa bacteriana y el halo de inhibición de crecimiento en la superficie

de una placa de agar con un medio de cultivo adecuado y sembrado

homogéneamente con la bacteria a ensayar y sobre la cual se ha depositado un

disco de papel filtro de 6 mm de diámetro, o se ha sembrado en pozo impregnado

con una cantidad conocida de la sustancia (40).

La lectura se interpreta como sensible (S), intermedia (I), resistente (R) según

las categorías establecidas por el NCCLS. La concentración de bacterias usada

para el estudio de susceptibilidad en el laboratorio ha sido estandarizada en

1x108 unidades formadoras de colonias (UFC)/mL, lo cual equivale a un patrón

de 0.5 en la escala de Mac Farland. Es recomendable tomar el inoculo de cultivos

en la fase exponencial de crecimiento y siempre tomar 4 o 5 colonias de un

cultivo puro para evitar seleccionar variantes atípicas (42).

Los medios de cultivo más utilizados son el agar Mueller Hinton, Agar Triptona

Soja y Agar Nutritivo ya que sus componentes facilitan el crecimiento de

diferentes cepas bacterianas y mayor difusión de las muestras (40).

C. Antibiograma

El antibiograma es la prueba microbiológica de susceptibilidad in vitro que se

lleva a cabo para conocer el comportamiento de un microorganismo frente a

determinados antibióticos, cuyos resultados se expresan en términos de

20

"sensibilidad" y "resistencia". La selección de antimicrobianos en el estudio de

susceptibilidad in vitro tiene como objetivo disponer de un adecuado apoyo en la

elección de las terapias antimicrobianas, al igual que promover su uso racional

(43).

La interpretación del antibiograma presenta las siguientes características:

Establecer la probabilidad de éxito o fracaso terapéutico que de un

antibacteriano frente a los microorganismos causantes de infección estudiados

en el antibiograma.

Utilizar criterios en función del conocimiento microbiológico, para definir una

correlación entre el antibiograma y el éxito terapéutico.

Realizar un análisis fenotípico de los resultados de sensibilidad según los

mecanismos de resistencia y expresión bacteriana.

Realizar la detección de la resistencia y la predicción del fracaso terapéutico

(43).

21

2.3. Hipótesis

2.3.1. Hipótesis general

Dado que existe antecedente del uso de la Tara como antibacteriano; es

probable que, la Tara presente efecto antibacteriano sobre Staphylococcus


2.3.2. Hipótesis Especificas

Es probable identificar flavonoides y taninos presentes en el extracto etanólico

de vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara)

Es probable determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) del extracto

etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara) sobre

Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC 25922.

Es probable determinar la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del

extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara)

sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC 25922.

Es probable evaluar la Sensibilidad antibacteriana del extracto etanólico de



22

2.4. Variables

2.4.1. Identificación de Variables

Variable independiente: Extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa

(Tara)

Variable dependiente: Actividad antibacteriana Staphylococcus aureus

ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC 25922

2.4.2. Definición conceptual de variables

Variable independiente: Extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa

(Molina) Kutze (Tara)

Extracto etanólico obtenido de vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze

(Tara) conocida popularmente con el nombre de “Tara”.

Variable dependiente: Actividad antibacteriana Staphylococcus aureus ATCC

25923 y Escherichia coli ATCC 25922

Actividad antibacteriana que desarrolla un agente externo sobre el crecimiento

microbiano (44).

2.4.3. Definición Operacional de Variable

Variable independiente: Extracto etanólico de Caesalpinia spinosa (Molina)

Kutze (Tara)

Gramos de extracto vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara)

obtenido por el método de extracción por Percolación.

Variable dependiente: Actividad antibacteriana Staphylococcus aureus ATCC

25923 y Escherichia coli ATCC 25922 o Actividad antibacteriana evaluada por

la determinación de la concentración mínima inhibitoria, concentración mínima

bactericida y por el método del antibiograma midiendo los halos de inhibición.

23

2.5. Operacionalización de variables

Tabla 2. Operacionalización de variables

VARIABLES INDICADOR SUB INDICADOR

Variable Independiente Extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze

(Tara)

Extracto etanólico de vainas de

Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze

(Tara)

%

Variable Dependiente

Actividad antibacteriana sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC

25922

Concentración mínima inhibitoria

µL/mL

Concentración mínima bactericida

µL/mL

Sensibilidad antibacteriana

Halo de inhibición (mm) medidos con

un vernier

Fuente: Elaboración propia

24

CAPÍTULO III

METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN

3.1. Tipo y nivel de investigación

3.1.1. Nivel de la Investigación

Descriptivo

3.1.2. Tipo de Investigación

Según manipulación de variables: Experimental

Según número de mediciones: Transversal

Según la temporalidad: Prospectivo

Enfoque: Cuantitativo

Por el propósito o finalidad: Aplicada

Paradigma: Positivista

3.1.3. Diseño de la investigación

Experimental

3.2. Descripción del ámbito de la Investigación

3.2.1. Ubicación espacial

El presente trabajo se realizó en los laboratorios de la Universidad Privada

Autónoma del Sur ubicada en la región, provincia y departamento de

Arequipa.

3.2.2. Ubicación temporal

La presente investigación fue desarrollada en el periodo de febrero a

diciembre del 2019

3.3. Población, muestra y muestreo

Muestreo: No probabilístico

3.4. Unidades de Estudio

Para el desarrollo del presente proyecto obtendrán vainas de Tara del

distrito de Uchumayo de la ciudad de Arequipa.

Criterios de Inclusión: vainas de Tara seca.

Criterios de exclusión: tallos y resto de la planta de Tara.

25

3.5. Técnicas e Instrumentos para la recolección de datos

3.5.1. Materiales y Reactivos

A. Materiales

Capilares de vidrio

Embudos de vidrio

Fiola de 25 y 50 mL

Matraces de vidrio 100, 500 y 1000 mL.

Pera de decantación de 250 mL

Placas Petri de vidrio de 60 mm x 15 mm y 100 mm x 15 mm

Pipetas de 1 mL, 2 mL 5 ml y 10 mL

Probeta graduada de: 50 y 100 mL

Tubos de ensayo

Varillas de vidrio

Vasos de precipitado: 50, 100, 250 mL

Asa de Digralsky

Autoclave

Balanza analítica

Cocina eléctrica

Estufa

Refrigeradora

Asa de Kohle

Espátulas

Frascos estériles color ámbar

Gasas estériles y Algodón.

Gradilla de metal para tubos de ensayo

Micropipeta graduada

Papel Aluminio

Papel filtro rápido

Papel Kraft

Pinzas

Pulverizador

Soporte universal

26

B. Reactivos

Agar manitol salado

Agar Mueller Hinton

Caldo peptonado

3.5.2. Material Biológico

Cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC 25922

vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara)

3.5.3. Recolección, almacenamiento e identificación vainas de Caesalpinia

spinosa (Molina) Kutze (Tara)

El material biológico fue recolectado en Distrito de Uchumayo y se sometió a un

lavado con agua destilada para evitar una probable degradación enzimática,

posteriormente, será desecada en una estufa a 40 °C para ser finalmente

cubiertas con papel Kraft en los laboratorios de la Universidad Privada Autónoma

del Sur ubicada en la ciudad de Arequipa, donde fueron almacenadas en

ausencia de luz, para luego ser identificadas en el área de biología de la

Universidad Nacional de San Agustín.

Figura 6. Vainas de Tara recolectadas y desecadas a 40 °C Fuente. Elaboración propia foto tomada en laboratorio de UPADS.

27

3.6. Obtención del extracto seco de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze

(Tara)

Para la obtención del extracto etanólico de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze

(Tara) se pesaron 20 g de vainas pulverizadas (Figura 5) y se empaquetó en un

cartucho de extracción y se llevó a la cámara de extracción de un equipo Soxhlet

donde se procede a extraer los metabolitos secundarios con 150 mL de etanol

de 96° (45).

Figura 7. Pulverización de las vainas de Tara Fuente. Elaboración propia foto tomada en laboratorio

3.7. Identificación de Taninos

En un tubo de ensayo se adicionó 20 gotas de cloruro férrico al 5 %, 20 gotas de

extracto etanólico de vainas de Tara, así los taninos hidrolizables o gálicos dan

coloración azul negruzco y los taninos condensados, Dan coloración verde a

marrón (36).

3.8. Identificación de flavonoides

La prueba de shinoda es una prueba cualitativa que tiene mejor solubilidad en

medio alcohólico, que se caracteriza por dar positivo con una variación de color

depende del tipo de estructura donde algunos que cuenta con un núcleo

benzopirona esta prueba da un color rojizo donde libera el dióxido de carbono.

La identificación de flavonoides se realizó por el método de Shinoda el cual

consiste en adicionar a 1 mL de extracto 1 mL de etanol, gotas de HCl en

presencia de magnesio metálico (36).

28

3.9. Evaluación de la Actividad antibacteriana

3.9.1. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)

A. Preparación de la solución madre del extracto etanólico de la tara

Se tomaron 500 mg del extracto seco y se disolvieron en etanol hasta completar

1000 μL, de este modo se obtuvo una solución de concentración de 500 mg/mL

(40).

B. Preparación del inoculo

Se preparó un inoculo de microorganismos en 5 mL del caldo peptonado con una

concentración de 108 UFC/mL. La turbidez del medio fue semejante a la del tubo

N°5 de la escala de Mac Farland, la cual equivale, a una concentración de 108

UFC/mL.

C. Preparación de diluciones

En 8 tubos de ensayo estériles se prepararon 8 extractos de C. spinosa para

evaluar la Concentración Mínima Inhibitoria para lo cual, en el Tubo 1 se añadió

100 μL de la solución madre de 500 mg/mL luego se adicionaron 900 μL de caldo

peptonado siendo esta solución de concentración de 50 mg/mL, posteriormente

de esta solución se tomaron 500 μL y se fue llevada al Tubo 2 al cual se le añadió

500 μL de caldo peptonado llegando a tener una concentración del 25 mg/mL,

luego, de este tubo se tomaron 500 μL que fueron llevados a el Tubo 3, luego

se le añadió a este ultimo 500 μL de caldo peptonado logrando obtener una

concentración de 12.5 mg/mL y así sucesivamente hasta llegar al Tubo 8 de 0.39

mg/mL del que se tomaron 500 μL y se desecharon. A todas estas soluciones se

les añadió posteriormente 500 μL de caldo peptonado logrando concentraciones

de extracto en estudio de 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.562, 0.781, 0.39 y 0.195

mg/mL. Otros 2 tubos (Tubo 9 y Tubo 10) correspondieron al blanco y el control

positivo. Todos los tubos se incubaron a 37 °C por 24 horas para la interpretación

de los datos (Tabla 4) (40).

3.9.2. Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB)

Una vez realizado el ensayo para determinar la Concentración Mínima Inhibitoria

se procedió a inocular 100 μL de los Tubos a placas que contenían agar manitol

salado para los ensayos con S. aureus y Mueller Hinton para E. coli. Todas las

placas se incubaron a 37 °C por 24 horas para la interpretación de los datos (27).

29

Tabla 3. Obtención de la microdilución en caldo para la determinación de CMI.

TUBOS

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 (+) T10 (-)

Solución madre (500 μl/ml) 100 500 500 500 500 500 500 500 _ 500

Caldo peptonado (μl) 900 500 500 500 500 500 500 500 500 _

Concentración inicial 50 25 12.5 6.25 3.125 1.562 0.78 0.39 _

Inóculo (μl) 500 500 500 500 500 500 500 500 500 _

Volumen final (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.5

Concentración final (μl/ml) 25 12.5 6.25 3.125 1.562 0.781 0.39 0.195 _ 500

Fuente: Elaboración propia

30

3.9.3. Determinación de la sensibilidad antibacteriana por dilución en

Discos (Kirby – Bauer)

A. Preparación de los discos

Se elaboron discos de papel filtro Whatman de aproximadamente 6 mm de

diámetro, los cuales deben esterilizarse en la autoclave por 15 minutos a 121°C.

A dichos discos con la ayuda de una micropipeta se les impregna con las

diferentes concentraciones del extracto (100.00, 80.00, 60.00, 40.00, 20.00,

10.00, 5.00, 2.50, 1.25, 0.63 y 0.31 %) (42).

B. Determinación de la sensibilidad antibacteriana

Se debe preparar placas con agar selectivo para cada microorganismo,

enseguida inocular 100 μL del inóculo bacteriano de 108 UFC/mL, luego colocar

los discos impregnados con los cuales extraídos con etanol. Finalmente se

incubaron a 37°C por 24 horas para medir los halos de inhibición con la ayuda

de un Vernier y además se emplearon antibióticos como ciprofloxacino,

gentamicina y ceftriaxona como estándares (42).

Figura 8. Preparación del ensayo de sensibilidad antibacteriana por el método de Kirby Bauer

Fuente. Elaboración propia foto tomada en laboratorio

31

CAPÍTULO IV

RESULTADOS

4.1. Recolección e identificación de vainas de Tara

Las vainas de Tara recolectadas fueron llevadas al Herbarium Areqvipense

(HUSA) de la Universidad Nacional de San Agustín de Arequipa donde fueron

identificadas como Caesalpinia Spinosa Tara como se observa en la Tabla 4.

Tabla 4. Identificación y tipificación de Vainas de Tara recolectadas

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsidae

Subclase Rosidae

Orden Fabales

Familia Fabaceae

Subfamilia Caesalpinideae

Género Caesalpinia

Especie Caesalpinia Spinosa (Molina) Kutze “Tara”

Fuente: Herbarium Areqvipense (HUSA) de la Universidad Nacional de

San Agustín de Arequipa (anexo n°1)

4.2. Extracto etanólico de vainas de Tara

Los extractos se prepararon mediante la extracción por Soxhlet usando como

solvente 250 mL de etanol de 96 °, tomando como muestra 20 g de planta (Figura

9), una vez obtenido el extracto seco fueron llevados a sequedad a baño maría

a 70 °C (45).

32

Figura 9. Preparación del extracto etanólico de vainas de Tara Fuente. Elaboración propia foto tomada en el laboratorio de UPADS.

4.3. Identificación de taninos en el extracto etanólico de Tara

En la Figura 10 se observó que el extracto etanólico de Tara (tubo derecho) a un

color azul oscuro cuando reacciona con la solución etanólica del cloruro férrico

al 5 % dando un color azul negruzco característico de tanino gálicos o

hidrolizables. (46).

Figura 10. Presencia de taninos en el extracto etanólico de las vainas de Tara


33

4.4. Identificación de flavonoides por la prueba de Shinoda

No se encontró presencia de flavonoides en el extracto etanólico de las vainas

de Tara al no dar positivo al someter el extracto con etanol, HCl y magnesio

metálico (46).

Tabla 5. Interpretación de la medición de los halos de inhibición

Halo de inhibición Interpretación

30-35 mm Altamente Sensible

20-30 mm Sensible

15-20 mm Intermedio

Menor de 15 mm Resistente


4.5. Evaluación de la actividad antibacteriana del extracto de Tara frente

a Escherichia coli ATCC 25922

Se evaluó la actividad antibacteriana frente a Escherichia coli ATCC 25922

desarrollando en primer lugar la Concentración Mínima Inhibitoria,

posteriormente la Concentración Mínima Bactericida y finalmente la Sensibilidad

usando discos de inhibición que fueron colocados en cada tubo los resultados

se exponen. (Tabla n°7).

4.5.1. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto etanólico de

vainas Tara frente a Escherichia coli ATCC 25922

La CMI se determinó por el método de microdilución en caldo estudiando

concentraciones de 0.195, 0.390, 0.781, 1.562, 3.125, 6.25, 12.5 y 25 µL/mL de

extracto etanólico de vainas de Tara. El procedimiento se detalla en el apartado

3.9.1.C y los resultados se observan en la Figura 11.

34

Figura 11. Concentración mínima inhibitoria (CMI) de extractos etanólicos

de vainas de Tara frente a Escherichia coli ATCC 25922


En la Tabla 6 se observan los resultados obtenidos luego de las 24 horas de

incubación, encontrándose que a partir del Tubo 6 se encuentra crecimiento de

Escherichia coli ATCC 25922 manifestado por la presencia de turbidez al

observar de la parte superior del tubo, así la CMI del extracto etanólico de vainas

de Tara es de 1.562 mg/mL o 0.16 % siendo esta concentración capaz de inhibir

el crecimiento de Escherichia coli ATCC 25922.

4.5.2. Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto etanólico de

vainas Tara frente a Escherichia coli ATCC 25922

La evaluación de la CMB realizada por el método de siembra en placa con agar

Mueller-Hinton expuesta en el apartado 3.9.2 de los tubos del 1, 2, 3, 4, 5 y 6 dio

como resultado crecimiento positivo en toda la placa como se muestra en la

Figura 12.

35

Figura 12. Concentración Mínima Bactericida de extracto de vainas de

Tara frente a Escherichia coli ATCC 25922


36

Tabla 6. Resultados de la determinación de concentración mínima inhibitoria (CMI) de extractos etanólicos de vainas de Tara

frente a Escherichia coli ATCC 25922

Descripción

TUBOS

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 (+) T10 (-)

Concentración final (μl/ml) 25.0 12.5 6.25 3.125 1.562 0.781 0.39 0.195 0.00 500

Concentración porcentual (%) 2.50 1.25 0.63 0.31 0.16 0.08 0.04 0.02 0.00 50

Escherichia coli atcc 25922 Ensayo 1 - - - - - + + + + -



Donde: (+) crecimiento bacteriano positivo; (-) crecimiento bacteriano negativo


37

En la Tabla 7 y Figura 12 se observa que en las placas 4, 5 y 6 presentan

crecimiento de Escherichia coli ATCC 25922, por lo cual, la CMB del extracto

frente a Escherichia coli ATCC 25922 es de 12.50 mg/mL o 1.25 %.

Tabla 7. Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto etanólico de

vainas de Tara frente a Escherichia coli ATCC 25922

Descripción

Placas

T2 T3 T4 T5 T6

Concentración Final (μl/ml) 25.0 12.5 6.25 3.125 1.562

Concentración Porcentual (%) 2.50 1.25 0.63 0.31 0.16

Staphylococcus aureus Ensayo 1 - - + + +





4.5.3. Determinación de la sensibilidad bacteriana del extracto etanólico de

vainas de Tara comparada con ciprofloxacino y gentamicina frente a

Escherichia coli ATCC 25922.

La sensibilidad bacteriana realizada por el método de Kirby-Bauer impregnando

en discos de 6 mm con concentraciones de los extractos etanólicos de vainas de

Tara frente a Escherichia coli ATCC 25922 de 0.31, 0.63, 1.25, 2.50, 5.00, 10.00,

20.00, 40.00, 60.00, 80.00 y 100.00 % dieron como resultado halos de inhibición

promedio 7.2, 6.9, 6.9, 7.8, 7.2, 8.8, 9.7, 10.2, 11.0, 15.3 y 17.1 mm

respectivamente. Además, el ciprofloxacino y gentamicina presentaron halos de

inhibición de 43.6 respectivamente 42.9 mm. En cambio, el disco impregnado

con etanol solamente no presento halo de inhibición.

38

Tabla 8. Sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones

del extracto etanólico de vainas de Tara

Concentración Halos de inhibición (mm)

Evaluación

(%) E1 E2 E3 Promedio

100% 17.9 16.9 16.5 17.1 I

80% 14.1 15.9 15.9 15.3 I

60% 10.9 10.9 11.1 11.0 R

40% 10.1 10.3 10.1 10.2 R

20% 9.9 9.8 9.3 9.7 R

10% 9.9 7.2 9.3 8.8 R

5% 7.8 6.8 6.9 7.2 R

2.50% 7.9 7.9 7.5 7.8 R

1.25% 6.9 7.7 6.1 6.9 R

0.63% 7.4 7.2 6.1 6.9 R

0.31% 7.1 7.9 6.7 7.2 R

Ciprofloxacino 43.6 43.4 43.8 43.6 AS

Gentamicina 42.9 43.1 42.7 42.9 AS

Etanol 6.0 6.0 6.0 6.0 NE

Donde: NE =No hay efecto, AS= Altamente sensible, S =sensible, I =

intermedio y R = resistente.


39

La comparación de los efectos antibacterianos de los extractos de vainas de Tara

frente a Escherichia coli ATCC 25922 se realizó mediante un análisis de varianza

ANOVA (Tabla 10), que dio como resultado un valor crítico F menor al valor de

F experimental (Fc:2.09<Fexp:1187.1), por lo cual, se concluye que al menos un

grupo es diferente al 95 % de confianza.

Tabla 9. Análisis de varianza para la sensibilidad de Escherichia coli ATCC

25922 a concentraciones del extracto etanólico de vainas de Tara

Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

GL Promedio

de los cuadrados

F Probabilidad Valor crítico para F

Entre grupos 6261.35 13 481.64 1187.1 8.7x10-35 2.09

Dentro de

los grupos 11.36 28 0.41

Total 6272.71 41

* Fc:2.09<Fexp:1187.1; p<0.05: (al menos un grupo difiere al 95 % de confianza)


Para confirmar se realizó el test de Tukey y los resultados se observan en la

Tabla 10. En la cual se concluye al 95 % de confianza que los halos de inhibición

obtenidos con ciprofloxacino y gentamicina no presentan diferencia significativa,

al igual que las concentraciones de los extractos de 80 y 100 %, también se

observa que, se presentan diversas agrupaciones en cuando a los efectos de la

siguiente manera, no existe diferencia significativa entre concentraciones de (20,

40 y 60 %), (10, 20 y 40 %), (0.31, 2.5 y 10), además, tampoco hay diferencia

significativa entre las concentraciones de extracto de 0.63, 1.25, 0.31, 5 % en

comparación con el blanco concluyéndose que Escherichia coli ATCC 25922 no

presenta sensibilidad frente a estas últimas concentraciones.

40

Tabla 10. Test de Tukey de la comparación de la sensibilidad de

Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones del extracto de vainas de

Tara

FACTOR N PROMEDIO GRUPO

Ciprofloxacino 3 43.6 A

Gentamicina 3 42.9 A

100% 3 17.1 B

80% 3 15.3 B

60% 3 11.0 C

40% 3 10.2 C D

20% 3 9.7 C D

10% 3 8.8 D E

2.50% 3 7.8 E F

0.31% 3 7.2 E F G

5% 3 7.2 F G

1.25% 3 6.9 F G

0.63% 3 6.9 F G

Etanol 3 6.0 G

Fuente. Elaboración propia adaptado de Minitab 17

Además, en la Figura 13 se presenta el diagrama de cajas y bigotes donde se

observa con claridad la superioridad antibacteriana de ciprofloxacino y

gentamicina a los extractos estudiados

41

Figura 13. Diagrama de cajas y bigotes de la evaluación de la sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a

concentraciones del extracto de vainas de Tara


Concentraciones Del Extracto De Vainas De Tara

42

4.6. Evaluación de la actividad antibacteriana del extracto de Tara frente

a Staphylococcus aureus ATCC 25923

Se evaluó la actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus ATCC

25923 desarrollando en primer lugar la Concentración Mínima Inhibitoria,

posteriormente la Concentración Mínima Bactericida y finalmente la Sensibilidad

usando discos de inhibición y los resultados se exponen a continuación.

4.6.1. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto de Tara frente a

Staphylococcus aureus ATCC 25923

La CMI se determinó por el método de microdilución en caldo estudiando

concentraciones de 0.195, 0.390, 0.781, 1.562, 3.125, 6.25, 12.5 y 25 µL/mL de

extracto etanólico de vainas de Tara. El procedimiento se detalla en el apartado

3.9.1.C y los resultados se observan en la Figura 12.

Figura 14. Concentración mínima inhibitoria (CMI) de extractos etanólicos

de vainas de Tara frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923


En la Tabla 11 se observan los resultados obtenidos luego de las 24 horas de

incubación, encontrándose que a partir del Tubo 6 se encuentra crecimiento de

Staphylococcus aureus ATCC 25923 manifestado por la presencia de turbidez al

observar de la parte superior del tubo, así la CMI del extracto etanólico de vainas

de Tara es de 1.562 mg/mL o 0.16 % siendo esta concentración capaz de inhibir

el crecimiento de Staphylococcus aureus ATCC 25923.

43

Tabla 11. Resultados de la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de extracto de vainas de Tara

frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923

Descripción

Tubos

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 (+) T10 (-)

Concentración final (μl/ml) 25 12.5 6.25 3.125 1.562 0.781 0.39 0.195 0 500

Concentración porcentual (%) 2.50 1.25 0.63 0.31 0.16 0.08 0.04 0.02 0 50

Staphylococcus aureus atcc 25923 Ensayo 1 - - - - - + + + + -





44

4.6.2. Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto etanólico de

vainas Tara frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923

La evaluación de la CMB realizada por el método de siembra en placa con agar

Mueller Hinton expuesta en el apartado 3.9.2 de los tubos del 1, 2, 3, 4, 5 y 6 dio

como resultado crecimiento positivo en todas las placas como se muestra en la

Figura 15.

Figura 15. Siembra en placa para determinar la CMB del extracto

etanólico de vainas de Tara frente a Staphylococcus aureus ATCC

25923


En la Tabla 12 y Figura 15 se observa que en las placas 1, 2, 3, 4, 5 y 6 presentan

crecimiento de Staphylococcus aureus ATCC 25923, por lo cual, el extracto

etanólico de vainas de Tara no presenta efecto bactericida frente a

Staphylococcus aureus ATCC 25923.

45

Tabla 12. Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto etanólico

de vainas de Tara frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923

Descripción Placas

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Concentración final (mg/ml) 25 12.5 6.25 3.125 1.562 0.781

Concentración porcentual (%) 2.50 1.25 0.63 0.31 0.16 0.08

Staphylococcus aureus atcc 25923 Ensayo 1 + + + + + +



Donde :(+) crecimiento bacteriano positivo; (-) crecimiento bacteriano negativo


4.6.3. Determinación de la sensibilidad bacteriana del extracto etanólico de

vainas de Tara comparada con ceftriaxona frente a Staphylococcus

aureus ATCC 25923.

La sensibilidad bacteriana realizada por el método de Kirby-Bauer impregnando

en discos de 6 mm con concentraciones de los extractos etanólicos de vainas de

tara frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 de 0.31, 0.63, 1.25, 2.50, 5.00,

10.00, 20.00, 40.00, 60.00, 80.00 y 100.00 % dieron como resultado halos de

inhibición promedio 6.1, 6.8, 9.4, 6.7, 6.9, 9.1, 8.9, 16.9, 14.7, 16.1 y 21.2 mm

respectivamente. Además, la ceftriaxona presentó un halo de inhibición de 41.3

mm. En cambio, el disco impregnado con etanol solamente no presentó halo de

inhibición.

46

Tabla 13. Resultados de la determinación de la sensibilidad de

Staphylococcus aureus ATCC 25923 a concentraciones de los extractos

etanólicos de vainas de Tara

Concentración Halos de inhibición (mm)

Evaluación

(%) E1 E2 E3 Promedio

100% 19.9 21.9 21.2 21.0 S

80% 19.8 15.6 16.1 17.2 I

60% 15.8 17.7 14.7 16.1 I

40% 15.6 14.4 16.9 15.6 I

20% 18.2 13.7 8.9 13.6 R

10% 8.8 10.2 9.1 9.4 R

5% 6.1 6.7 6.9 6.6 R

2.50% 6.7 6.1 6.7 6.5 R

1.25% 6.6 7.7 9.4 7.9 R

0.63% 6.1 6.9 6.8 6.6 R

0.31% 6.7 6.1 6.1 6.3 R

Ceftriaxona 41.1 39.9 41.3 40.8

AS

Etanol 6.0 6.0 6.0 6.0 NE

Donde: NE= No hay efecto, AS= Altamente sensible, S= sensible, I=

intermedio y R= resistente.


47

La comparación de los efectos antibacterianos de los extractos de vainas de Tara

frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 se realizó mediante un análisis de

varianza ANOVA (Tabla 14), que dio como resultado un valor crítico F menor al

valor de F experimental (Fc:2.15 <Fexp:103), por lo cual, se concluye que al

menos un grupo es diferente al 95 % de confianza.

Tabla 14. Análisis de varianza de la determinación de la sensibilidad de

Staphylococcus aureus ATCC 25923 a concentraciones del extracto etanólico de

vainas de Tara

Origen de las variaciones

Suma de cuadrados

GL Promedio

de los cuadrados

F Probabilidad Valor crítico para F

Entre grupos 3375.6359 12 281.302991 103.01 9.3577E-19 2.15

Dentro de los grupos

71 26 2.73076923

Total 3446.6359 38 3446.6359

* Fc:2.15<Fexp:103; p<0.05: (al menos un grupo difiere al 95 % de confianza)

Para confirmar se realizó el test de Tukey y los resultados se observan en la

Tabla 15. En la cual se concluye al 95 % de confianza que los halos de inhibición

obtenidos con ceftriaxona difiere significativamente de todos los grupos, no

presentan diferencia significativa, por otro lado, las concentraciones de los

extractos de 80 y 100 % no presentan diferencia significativa, también se observa

que, se presentan diversas agrupaciones en cuando a los efectos de la siguiente

manera, no existe diferencia significativa entre concentraciones de (20, 40, 60 y

80 %) y (10 y 20 %), además, tampoco hay diferencia significativa entre las

concentraciones de extracto de 0.31, 0.63, 1.25, 5 y 10 % en comparación con

el blanco concluyéndose que Staphylococcus aureus ATCC 25923 no presenta

sensibilidad frente a estas últimas concentraciones.

48

Tabla 15. Test de Tukey de la determinación de la sensibilidad de

Staphylococcus aureus ATCC 25923 a concentraciones del extracto

etanólico de vainas de Tara

FACTOR N PROMEDIO GRUPO

Ceftriaxona 3 40.8 A

100% 3 21.0 B

80% 3 17.2 B C

60% 3 16.1 C

40% 3 15.6 C

20% 3 13.6 C D

10% 3 9.4 D E

1.25% 3 7.9 E

0.63% 3 6.6 E

5% 3 6.6 E

2.50% 3 6.5 E

0.31% 3 6.3 E

Etanol 3 0.00 E

Fuente. Elaboración propia adaptado de MINITAB 16

Además, en la Figura 14 se presenta el diagrama de cajas y bigotes donde se

observa con claridad la superioridad antibacteriana de ceftriaxona a los extractos

estudiados

49

Figura 16. Diagrama de cajas y bigotes de la evaluación de la sensibilidad de Staphylococcus aureus ATCC 25923 a

concentraciones del extracto etanólico de vainas de Tara

Fuente. Elaboración propia.

Concentraciones de extracto etanólico de la vaina de tara

50

CAPÍTULO V

DISCUSIÓN

En la presente investigación se estudió el efecto antibacteriano del extracto

etanólico de las vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze El estudio se

fundamentó en que Martel (47), indica que es una planta ampliamente utilizada

en la industria y la medicina popular, y se caracteriza por contener grandes

cantidades de taninos en sus vainas, además de la presencia

predominantemente de monoterpenos en el aceite esencial de la hoja, además

que reporta que los compuestos detectados pueden estar relacionados con la

actividad antimicrobiana y antioxidante de los extractos de C. spinosa (47). En la

presente investigación se realizó la identificación de taninos presentes en el

extracto de las vainas de Tara encontrando presencia de taninos gálicos o

hidrolizables al dar una coloración azul oscura en presencia de cloruro férrico

(47).

Nuestros resultados fueron: en La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del

extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara) sobre

Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923 fue de

1.562 mg/mL (0.16%) para ambas cepas y La Concentración Mínima Bactericida

(CMB) del extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze

(Tara) sobre Escherichia coli ATCC 25922 fue de 12.50 mg/L (1.25 %) y para

Staphylococcus aureus ATCC 25923 no se encontró efecto bactericida también

en la valuación de la Sensibilidad antibacteriana del extracto etanólico de vainas

de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara) sobre Escherichia coli ATCC 25922

fue de sensibilidad intermedia a concentraciones de 80 y 100 % del extracto

etanólico de vainas de tara y resistente a concentraciones menores de 80 %.

Para Staphylococcus aureus ATCC 25923 fue sensible a la concentración del

100 % del extracto etanólico de vainas de tara y sensibilidad intermedia para

concentraciones de 40, 60 y 80 % y resistente a concentraciones menores de

40%.

Así también, Chambi (48), evaluó el potencial antioxidante de los extractos de

vaina de tara ricos en galotaninos sometidos a hidrólisis química, el investigador

obtuvo una capacidad antioxidante alcanzando valores de 25.9, 23.8 y 8.8 μmol

51

equivalente de trolox/mg medido por los métodos ABTS, FRAP y ORAC (48).

Este alcance de Chambi justificaría las propiedades terapéuticas de la Tara ya

que durante años se viene relacionando directamente a la actividad antioxidante

con los distintos efectos terapéuticos reportados de múltiples especies

vegetales.

En cuanto a los taninos hidrolizables se consideran uno de los antioxidantes más

potentes de origen vegetal (49). Los taninos hidrolizables, además eliminan los

radicales libres dentro del cuerpo al neutralizarlos antes de que ocurra el daño

celular (50). Por lo tanto, la actividad antimutagénica y anticancerígena in vitro

del ácido tánico ya ha sido reportado (51,52). Así mismo, Aguilar (53), indica que

los galotaninos obtenidos de extractos de vaina (EV) de tara reportan actividad

antioxidante, actividad antimicrobiana (AA) y concentración mínima inhibitoria

(CMI). Los resultados de AA y CMI mostraron que EV ejerció la mayor actividad

inhibitoria contra Staphylococcus aureus, seguido de Pseudomonas fluorescens

(53). En la presente investigación se encontró actividad antibacteriana contra

Staphylococcus aureus los cual corrobora a los resultados obtenidos por Aguilar.

Por otro lado, Zárate (54), evaluó el efecto antibacteriano in vitro del extracto

acuoso de C. spinosa, sobre cepas de Streptococcus pyogenes y Escherichia

coli aisladas del Hospital Regional Docente de Trujillo, donde investigaron 80

muestras de orina de pacientes con infección de vías urinarias por Escherichia

coli y 80 muestras de adultos con faringoamigdalitis por Streptococcus pyogenes,

en esa investigación se aplicó a las cepas aisladas el extracto acuoso de

Caesalpinia spinosa, para observar el efecto antibacteriano in vitro para dichas

cepas. Zarate demostró que el efecto antibacteriano in vitro del extracto acuoso

de Caesalpinia spinosa comparado con amoxicilina presenta una alta

sensibilidad, y comparado con Cotrimoxazol presentó el mismo efecto. Y en

cepas de Escherichia coli, haciendo una comparación con el extracto acuoso de

Caesalpinia spinosa con gentamicina presentó el mismo efecto in vitro, pero

menor efecto frente a Ciprofloxacino (54). En la presente investigación también

se encontró efecto antibacteriano de el extracto etanólico de vainas de C.

spinosa dando resultados menores a gentamicina y ciprofloxacino al igual que la

investigación de Zárate.

52

Otro estudio de Huarino (55), con el objetivo de determinar el efecto

antibacteriano in vitro de diferentes concentraciones del extracto alcohólico de la

Caesalpinia. spinosa mediante el método de difusión en placa usó la flora mixta

salival, en diferentes soluciones de 6,25, 12,5, 25, 50 y 75 mg/mL y compararlas

con los controles positivo Clorhexidina 0.12 % y Alcohol 70º. El investigador

determinó que el efecto antibacteriano sobre flora mixta salival muestra una

mayor actividad directamente proporcional a su concentración. Al realizar el

análisis del extracto mediante el tamizaje fitoquímico se encontró alta presencia

de taninos, flavonoides, esteroides, triterpenos y saponinas. De los resultados

obtenidos concluyeron que se ha evidenciado el efecto antibacteriano sobre la

flora mixta salival (55). En la presente investigación también se corroboraron los

resultados de Huarino; sin embargo, en el extracto obtenido en la presente tesis

solo se encontraron taninos gálicos o hidrolizables que tuvieron actividad

antibacteriana frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

Finalmente, Kondo (56), aisló cuatro moléculas de ácido quínico de las vainas

secas de Tara (Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze). Estos compuestos

intensificaron la susceptibilidad de Staphylococcus aureus resistente a meticilina

(MRSA) a oxacilina. El éster metílico del ácido 3,4,5-tri-O-galloilquínico fue el

compuesto más eficaz obtenidos por los investigadores (56). Los resultados

encontrados en la presente investigación podrían deberse a la presencia de este

éster metílico o a la presencia de tanino gálicos; sin embargo, se encontró

diferencias e inconsistencias en los diversos estudios realizados con la misma

especie en cuanto a su composición y su efectividad antibacteriana lo cual podría

deberse a las condiciones geográficas y los cambios de clima y por ende afectar

también el efecto antibacteriano reportado.

53

CONCLUSIONES

Primera: Se determinó que el extracto etanólico de vainas de Caesalpinia

spinosa (Molina) Kutze (Tara) tiene efecto antibacteriano sobre Escherichia coli

ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923.

Segunda: No se encontró presencia de flavonoides en el extracto etanólico de

vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara) presenta en su composición

taninos gálicos o hidrolizables.

Tercera: La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto etanólico de

vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara) sobre Escherichia coli

ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923 fue de 1.562 mg/mL (0.16%)

para ambas cepas.

Cuarta: La Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto etanólico de


ATCC 25922 fue de 12.50 mg/L (1.25 %) y para Staphylococcus aureus ATCC

25923 no se encontró efecto bactericida.

Quinta: La valuación de la Sensibilidad antibacteriana del extracto etanólico de


ATCC 25922 fue de sensibilidad intermedia a concentraciones de 80 y 100 % del

extracto etanólico de vainas de tara y resistente a concentraciones menores de

80 %. Para Staphylococcus aureus ATCC 25923 fue sensible a la concentración

del 100 % del extracto etanólico de vainas de tara y sensibilidad intermedia para

concentraciones de 40, 60 y 80 % y resistente a concentraciones menores de 40

%.

54

RECOMENDACIONES

Estudiar la actividad antibacteriana de la Tara frente a otras cepas de

microorganismos para que esta planta sea más utilizada en la fitoterapia.

Comparar la actividad antibacteriana de la Tara en cuanto a los tipos de

extracción y solventes.

Estudiar el efecto antimicrobiano y antibacteriano en diferentes

concentraciones del aceite de vainas de Tara para poder evaluar el efecto.

Hacer farmacocinética y biodisponibilidad de los extractos etanólicos y del

aceite de las vainas de Tara.

55

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60

ANEXOS

61

Anexo 1 Identificación taxonómica de las vainas de Tara

62

Anexo 2: Matriz Operacional

Título

Planteam

iento del

problema

Hipótesis (Hi) Objetivos Variables Indicadores Valor Metodología

“E

FE

CT

O A

NT

IBA

CT

ER

IAN

O D

EL

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AC

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coli

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CC

25

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2?

Hipótesis general Objetivo General: VARIABLE

DEPENDIENTE

Concentraci

ón mínima

inhibitoria

Concentraci

ón mínima

bactericida

Sensibilidad

antibacterian

a

Nivel: Experimental

Dado que existen antecedentes del uso de la Tara como

antibacteriano es probable que el extracto etanólico de las vainas

de la tara presente efecto antibacteriano del extracto de

Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara) sobre Staphylococcus


Determinar el efecto antibacteriano del extracto etanólico

de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara) sobre

Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Escherichia coli

ATCC 25922.

Actividad antibacteriana

sobre el Staphylococcus

aureus ATCC 25923 y

sobre Escherichia coli

ATCC 25922

µL/mL

µL/mL

Halo de

inhibición (mm)

medidos con un

vernier

TIPO: Cuantitativo

Hipótesis secundarias Objetivos Específicos: .

NIVEL:

Es probable identificar flavonoides y taninos presentes en el extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara)

Es probable determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI del extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC 25922.

Es probable determinar la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC 25922

Es probable evaluar la Sensibilidad antibacteriana del extracto

etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa (Molina) Kutze (Tara)

sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Escherichia coli

ATCC 25922

Identificar flavonoides y taninos presentes en el extracto

etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa (Tara)

Determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) del

extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa

(Tara) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 y

Escherichia coli ATCC 25922.

Determinar la Concentración Mínima Bactericida (CMB)

del extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa

(Tara) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 y

Escherichia coli ATCC 25922

Evaluar la Sensibilidad antibacteriana del extracto

etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa (Tara) sobre

Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Escherichia coli

ATCC 25922

Descriptivo Comparativo

Transversal

Prospectivo

MUESTRA.

vainas de Tara

VARIABLE

INDEPENDIENTE Extracto

Extracto

%

Extracto etanólico de vainas

de Caesalpinia spinosa

(Tara)

63

Anexo 3 evidencias del trabajo en laboratorio

A: recolección de vainas de tara; B: separación de semilla de las vainas; C: trituración; D: cartucho de

papel filtro.

Fuente: elaboración propia

Fotos tomadas durante el desarrollo de la presente investigación

A B

C D

64

E: Extracción con equipo soxhlet; F: preparación de agar en placa Petri; G: sembrado de la sepa de s.

áureus; H: siembra de inóculos.



E F

G H

65

I: crecimiento de Halos de Inhibición J: halos de inhibición K: medición de halos de Inhibición



I

J K

Bach. Milagros Sara Asqui Barrionuevo Bach. Melanea ...

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