KELLY P. SÁNCHEZ MONTES

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR

PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍAVALLEDUPAR-CESAR

2015

Bacillus cereus

Bacilo gram positivo Esporulado Anaerobio facultativo Móvil

El color de las colonias de acuerdo al medio de cultivo utilizado

A).Bacillus cereus en agar MYPB) Bacillus cereus en agar Bacara

Bacillus cereus

FACTORES DE CRECIMIENTO

B. cereus no es capaz de multiplicarse en pH menores de 4.0 se inactiva con acido acético, fórmico y láctico en concentraciones de

0.1M Las esporas de B. cereus han mostrado supervivencia por períodos largos

en alimentos deshidratados. Ej. Poblaciones sin cambios después de 48 semanas en cereales (aw 0,27-0,28)

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FACTORES DE CRECIMIENTO

VALORES

Temperatura óptima 30 -37 °C

Temperatura de crecimiento

5- 55 °C

Temperatura de germinación

5-8°C

PH 4.5 – 9.3

AW 0.95

Concentración de Sal 7.5%

B. cereus produce diversas toxinas

Enterotoxinas (las tres más estudiadas son la hemolisina (HBL), la enterotoxina no hemolítica (NHE) y la citotoxina K

la más conocida es la toxina emética (cereulide) produce fosfolipasas Una misma cepa puede producir toxina hemolítica BL (HBL) o no

hemolítica (NHE) o ambas.

péptido cíclico termoestable Resistente al calor . Esta toxina no pierde su actividad a temperaturas

bajas Es tolerante a pH extremos, pH 2 a pH 11 Es estable a tratamientos con pepsina y tripsina

CARACTERISTICAS PATOGÉNICAS

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INFECCIÓN O INTOXICACIÓN ALIMENTARIA

Produce dos tipos de toxiinfecciones:

La forma emética Es producida por la toxina cereulida o termoestable, es sintetizada en la fase estacionaria de crecimiento. Se obtiene principalmente por el consumo de arroz contaminado.

La forma diarreogénicaEs producida por la toxina diarreogénica o termolábil, que es liberada en la fase logarítmica de crecimiento. Se obtiene principalmente por el consumo de verduras y carnes contaminadas y embutidos contaminados.

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MECANISMO DE ACCIÓN EN EL HOMBRE Dos tipos de enterotoxinas de tres componentes (HBL y NHE),

producidas durante la fase exponencial del crecimiento vegetativo de la bacteria, en el intestino delgado del huésped.

Las células vegetativas no sobreviven en el pH tan bajo del estómago pero las esporas sí. Por lo que se cree que la ruta del síndrome diarreico es la germinación de la espora, el crecimiento y la producción simultánea de la enterotoxina.

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SINTOMAS DE LA GASTROENTERITIS

La enfermedad emética o de corta incubación

1 a 6 después de la ingestión del alimento contaminado

vómitos y cólicos abdominales Ceden 10-24 horas después del

comienzo.La enfermedad diarreogénica o incubación prolongada 8-16 horas luego de la ingestión Diarrea acuosa profusa Náusea Tenesmo Cólicos abdominales

hipogástricos

Ceden de 12-36 horas

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MEDIDAS DE CONTROL PARA Bacillus cereus

Cocinar los alimentos antes de servirlos.

Enfriarlos rápidamente después de preparados.

Calentar los alimentos a una temperatura que inhiba la toxina, almacenarlos a bajas temperaturas para evitar el desarrollo de la bacteria.

Almacenando los alimentos fríos en o debajo de 4 grados C para prevenir la toxina que es producida.

Evitar los alimentos con proteínas que almacenan con arroz cocinado porque esto estimula el crecimiento del bacilo.

Calentar los alimentos a 75 grados C o hasta cocer al vapor caliente.

Prevención de la contaminación cruzada de crudo a los alimentos cocinados (usando áreas separadas de la preparación o esterilizándolas entre los procesos).

Asegurando a manipuladores de alimentos tener la buena higiene personal y entrenamiento de seguridad adecuado del alimento.

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PRINCIPALES ALIMENTOS CONTAMINADOS POR Bacillus cereus

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PROTOCOLO DE AISLAMIENTO DE Bacillus cereus

1. preparación de la muestra Utilizando una técnica aséptica, pesar 50 g de muestra.  Añadir 450 ml agua Butterfield tamponada con fosfato de dilución

(dilución 1:10) y mezclar durante 2 min a alta velocidad (10.000-12.000 rpm). 

Preparar diluciones seriadas de 10 -2 -10 -6 transfiriendo 10ml de muestra homogeneizada (dilución 1:10) a 90 ml de la dilución en

blanco, mezclando bien agitando vigorosamente, y continuando hasta alcanzar la dilución 10 -6 

2. Contenido de B. Cereus Inocular agar Bacara o agar MYP (Manitol- yema de huevo-polimixina)

placas duplicadas con cada dilución de la muestra (incluyendo 1:10) mediante la difusión de 0,1 ml uniformemente sobre la superficie de cada placa de vidrio estéril con la ayuda de un asa de hockey. 

Incubar las placas de 18-24 h a 30 ° C y observar para las colonias rodeadas por zonas claras de precipitado, lo cual indica que se produce lecitinasa. 

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Las colonias de B. cereus  suelen ser de un color rosa-naranja en Bacara o rosa en MYP y pueden llegar a a ser más intenso después de una incubación adicional (ver Fig. 1)

Fig. 1. Las colonias de B. cereus crecido en PAI son de color rosa y lecitinasa positivo, pero otras bacterias no son inhibidas y puede interferir con el aislamiento de B. cereus. Las colonias de B. cereus cultivadas en Bacara son rosa naranja y lecitinasa positivo, pero otros organismos son inhibidos.

Si las reacciones no son claras, incubar las placas para otras 24 h antes de contar las colonias

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3. Recuento de colonias de Bacillus cereusSeleccione placas que contienen un estimado de 15 a 150 rosa-naranja (Bacara) o rosa (MYP), colonias productoras de lecitinasa. Marcar la parte inferior de las placas en zonas con rotulador negro para facilitar el conteo y contar las colonias que son típicos de B. Cereus.

4. Recuento en placa presuntivo de B. Cereus.  Escoja al menos 5 colonias positivas presuntivos del Bacara o placas MYP y

transferir una colonia a BHI con 0,1% de glucosa para los estudios de enterotoxina y una inclinación de agar nutritivo para el almacenamiento. Las colonias típicas cultivadas en Bacara o MYP deben confirmarse con pruebas bioquímicas.

Cálculos Calcular el número de B. Cereus células / g de muestra, con base en el

porcentaje de colonias que son morfológicamente consistente con B. Cereus. 

Por ejemplo, si el recuento medio obtenido con 10 -4 dilución de la muestra fue de 65 y 4 de 5 colonias ensayadas fueron confirmados como B. Cereus, el número de  células B.cereus/g de alimento es 65 × 4/5 × 10 000 × 10 = 5.200.000. (NOTA: Factor de dilución es diez veces superior a la dilución de la muestra porque sólo se usó 0,1 ml).

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5. Confirmación de Bacillus cereus Elija 5 o más colonias rosa eosina, lecitinasa positivo de las placas y la

transferencia de tubos inclinados de agar nutriente agar MYP. Incubar sesgos 24 horas a 30 ° C. Preparar frotis teñidos con Gram de sesgos y examinar microscópicamente. B. Cereus aparecerá bacilos gram positivos en cadenas cortas y largas; las esporas son elipsoidales, y no se hincha el esporangio. 

Transferencia de 3 mm asa de siembra de cultivo de cada aislamiento a 13 tubos × 100 mm que contiene 0,5 ml de agua estéril dilución tamponada con fosfato y la suspensión de cultivo en diluyente con el mezclador Vortex. Use culturas suspendidos incluyendo ATCC 14579 B. cereus y ATCC 64 Brevibacillus laterosporus como controles positivos y negativos, respectivamente, para inocular los siguientes medios de confirmación:

Caldo de glucosa rojo fenol: Inocular 3 ml de caldo con 2 mm de cultivo. Incubar los tubos anaeróbicamente 24 horas a 35 ° C en GasPak jarra anaeróbica. Agitar vigorosamente tubos y observar para el crecimiento, como se indica por el aumento de la turbidez y el color el cambio del rojo al amarillo, lo que indica que el ácido se ha producido anaerobio de la glucosa. Un cambio parcial de color de rojo a naranja / amarillo puede ocurrir, incluso

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Agar tirosina. Inocular toda la superficie del agar tirosina inclinado con 3 mm de cultivo con una asa. Incubar tubos inclinados de 48 horas a 35 ° C. Observar zona clara cerca del crecimiento, lo que indica que la tirosina se ha descompuesto. Examine sesgos negativos para signos evidentes de crecimiento, y se incuba durante un total de 7 días antes de considerar como negativo.

Caldo de lisozima. Inocular 2,5 ml de caldo nutriente que contiene 0,001% lisozima con 2 mm de asada del cultivo. También inocular 2,5 ml de caldo nutriente normal como control positivo. Incubar los tubos de 24 horas a 35 ° C. Examine para el crecimiento en caldo de lisozima y en el control de caldo nutriente. Incubar los tubos negativos para otras 24 h antes de desechar.

Agar MYP. Esta prueba puede omitirse si los medios de la inoculación primaria fue Bacara o resultados de las pruebas eran clara con placas de agar MYP originales y no había interferencias de otros microorganismos. Marcar la parte inferior de una placa en seis secciones iguales con fieltro pluma de marca, y la etiqueta de cada sección con número de muestra. Inocular previamente marcada 4 cm cuadrados área de la placa de agar MYP por la superficie suavemente conmovedor de agar con 2 mm asa de la cultura. Permitir que el inóculo se absorba completamente antes de incubar durante 24 horas a 30 ° C. Compruebe placas para la producción lecitinasa como indica la zona de crecimiento que rodea la precipitación. El Manitol no es fermentado si el crecimiento y el medio circundante es rosa eosina. (Color amarillo indica que el ácido se produce a partir de manitol.). las de B.Cereus colonias suelen ser lecitinasa-positivo y negativo-manitol en agar MYP.

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Registrar los resultados obtenidos con las diferentes pruebas confirmatorias. Tentativamente se identifican como B. Cereus aquellos aislamientos que:

producen grandes bacilos gram-positivos con esporas que no hinchan el esporangio

producir lecitinasa y no fermentar el manitol en agar MYP crecen y producen ácido a partir de glucosa anaeróbicamente Reducen el nitrato a nitrito (unas pocas cepas pueden ser negativos) Producen acetilmetilcarbinol (VP-positivo) Descomponer L-tirosina Crecen en la presencia de 0,001% de lisozima.

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Bacillus cereus y su implicación en la inocuidad de los alimentos. Parte II

Tamara K MartinoI ; Virginia LeyvaII; Yamila PuigIII; Idalmis HernándezIV; Tamara DíazV; Maritza de los ReyesVI; Ailen CamejoV

Revista Cubana de Salud Pública.2010; 36(1)139‐148  

BIBLIOGRAFIAS

Martino, T. K., Leyva, V., Puig, Y., Hernández, I., Díaz, T., Reyes, M. d.. (Enero/marzo de 2010). Bacillus cereus y su implicación en la inocuidad de los alimentos. Parte II. Revista Cubana de Salud Pública, 36(1), 139-148.

Paul, S., y otros. (2008). Konemán Diagnóstico Microbiológico: Texto y Atlas en color (Vol. 6 Edición). Buenos Aires, Argentina: Médica Panamericana.

Portuondo, I. P. (Enero- Marzo de 2012). Bacillus cereus y su papel en las intoxicaciones alimentarias. Revista Cubana de Salud Pública, 38(1), 98-108.

Tallent, S. M., Rhodehamel, E. J., Harmon, S. M., & Bennett, a. R. (2012). Bacteriological Analytical Manual: Bacillus cereus (Edición 8 ed.). Estados Unidos: Administración de Alimentos y Drogas FDA.

Winh, W., Stephen, A., William, J., Koneman, E., Gary, P., Paul, S.,. (2008). Koneman Diagnóstico Microbiológico: Texto y Atlas en color (Vol. 6 Edición). Buenos Aires, Argentina: Médica Panamericana.

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