Bacterias Sulfato Reductoras

5/23/2018 Bacterias Sulfato Reductoras

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UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRS

MAESTRA EN CIENCIAS BIOLGICAS Y BIOMDICAS

INSTITUTO DE BIOLOGA MOLECULAR Y BIOTECNOLOGA

INSTITUT DE RECHERCHE POUR LE DEVELOPPEMENT

DISTRIBUCIN DE BACTERIAS SULFATO

REDUCTORAS Y METILMERCURIO ENSEDIMENTOS DE LAGUNAS DEINUNDACIN DEL RO BENI,

AMAZONA BOLIVIANA

TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE MAGSTER EN CIENCIASBIOLGICAS Y BIOMDICAS

POSTULANTE: LIC. SAMANTA RITA SNCHEZ ALARCN

TUTORES: DR. MARC ROULETDRA. VOLGA IIGUEZ

LA PAZ-BOLIVIA2005


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I. ABSTRACT

This study characterized the distribution of sub-groups of Sulfate ReducingBacteria (BSR) in sedimentary profiles of different lagoons (oxbow lakes and

inland lakes) from the basin of the Beni River. This study also determinedphysico-geochemical characteristics (Eh, pH and density), organic carbon,mercury concentrations and distribution (Hg), and methylmercury (MeHg), aswell as rates of methylation (Me203Hg) in the sedimentary interphase. Thesediments were collected in the middle of the humid, dry season, and later eachsample was fractionated each 0.5 cm until a depth of 10 cm per sample corewas reached. Nucleic acids were extracted from each fraction and analyzedusing Polymerase Chain Reaction (PCR) to determine the presence of sub-groups BSR (using the technique of nested PCR) and of the gene for theenzyme Dissimilatory Sulfite Reductase (DSR). BSR are present in all theanalyzed sedimentary profiles. The gene DSR was found in with SRBs in all

sedimentary profiles, thus confirming this reduction pathway in these SRBs.The sub-groups Desulfovibrioand Desulfococcuswere the most common sub-groups found, in contrast to the sub-groups Desulfotomaculum, Desulfobacterand Desulfobulbus,all of which showed variation in the different lagoons as wellas seasonal variation. In each of the studied lagoons, differences wereobserved in the physicochemical factors like pH, Eh, and density of sediments,as well as in the concentration and quality of organic matter. The San Juan(inland lake) is characterized by levels of carbon 10 greater times to the foundones in the oxbow lakes (Salina, La Granja and Ro Viejo). The rate of Me 203Hgfound in the interphase corresponds to a increasing order of the age of theoxbow lakes (0.2% in Salina, 0.6% in La Granja and 12.3% in Ro Viejo), in

contrast to a value of 0.4% in the most organic lagoon (San Juan). Hg andMeHg are found in higher concentrations in the first 3 cm of depth. Hg is presentin concentrations of 60 ng/g to 80 ng/g in the studied lagoons. The percentageof MeHg found in the oxbow lakes was of 0.32% (Salina), 1.6% (La Granja) and0.58% (Ro Viejo), and in the inland lakes (San Juan) of 1.42%. There was notany relation found between the rate of methylation, percentage of MeHg andpercentage of organic carbon. This is likely due to the differentphysicogeochemical conditions that exist in each one of the studied lagoons,since these conditions couldaffect to the rates of methylation and distribution ofMeHg. The diversity of SRBs found in the lagoons suggests the presence of apotentially important sourceof methylation. Future studies will have to evaluateof quantitative form the distribution of SRBs and its correlation with sulphatereduction and the methylation of the Hg.

Keywords: Sulfate Reducing Bacteria; Dissimilatory Sulfite Reductase; mercury; methylmercury


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II. RESUMEN

En este estudio, se caracterizo la distribucin de subgrupos de Bacterias SulfatoReductoras (BSR) en perfiles sedimentarios de diferentes lagunas (mendricas

y de tierra firme) de la cuenca del ro Beni, en los cuales tambin se determinocaractersticas fisicogeoqumicas (Eh, pH y densidad), carbono orgnico,concentraciones y distribucin de mercurio (Hg), metilmercurio (MeHg). Ascomo tasas de metilacin (Me203Hg) en la interfase sedimentaria. Lossedimentos fueron colectados de la parte central en la poca hmeda y seca, yposteriormente fueron fraccionados cada 0.5 cm. hasta una profundidad de 10cm. Los cidos nucleicos fueron extrados de cada fraccin y analizados por laReaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) para analizar la presencia desubgrupos de BSR (PCR anidado) y del gen de la enzima Disimilatoria SulfitoReductasa (DSR). Las BSR estn presentes en todos los perfiles sedimentariosanalizados. Donde tambin se encontr al gen DSR confirmando de esta

manera a microorganismos sulfato reductores. Los subgrupos Desulfovibrio yDesulfococcus fueron los mayoritariamente encontrados en contraste a lossubgrupos Desulfotomaculum, Desulfobacter y Desulfobulbus los cualesmostraron variacin en las diferentes lagunas y en las pocas de estudioanalizadas. En cada una de las lagunas estudiadas se observaron diferenciasen los factores fisicoqumicos como pH, Eh y densidad de los sedimentos ascomo en la concentracin y calidad de materia orgnica. La laguna San Juan secaracterizo por presentar niveles de carbono 10 veces mayores a losencontrados en las lagunas mendricas (Salina, La Granja y Ro Viejo). La tasade Me203Hg encontrada en la interfase esta en orden creciente a la edad de laslagunas mendricas (0.2% en Salina, 0.6% en La Granja y 12.3% en Ro Viejo),

en contraste a un valor de 0.4% en la laguna ms orgnica (San Juan). Lamayor concentracin de Hg y MeHg se encuentran en los primeros 3 cm. deprofundidad. El Hg esta presente en concentraciones de 60 ng/g a 80 ng/g enlas lagunas estudiadas. El porcentaje de MeHg encontrado en las lagunasmendricas fue de 0.32% (Salina), 1.6% (La Granja) y 0.58% (Ro Viejo), y en lalaguna de tierra firme (San Juan) de 1.42%. No se encontr ninguna relacinentre la tasa de metilacin, porcentaje de MeHg y porcentaje de carbonoorgnico, por lo que existira diferentes condiciones fisicogeoqumicas queafectaran a las tasas de metilacin y distribucin de MeHg en cada una de laslagunas estudiadas. La diversidad de BSR encontradas en la laguna sugiere lapresencia de un potencial importante de metilacin por lo que futuros estudiosdebern evaluar de forma cuantitativa la distribucin de BSR y su correlacincon la sulfato reduccin y la metilacin del Hg.

Palabras claves:Bacterias Sulfato Reductoras; Disimilatoria Sulfito Reductasa; mercurio;metilmercurio


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III. ABREVIACIONES

Gen 16S RNAr gen 16S RNA ribosomal

Gen DSR gen Disimilatoria Sulfito ReductasaPCR Reaccin en Cadena de la PolimerasaMeHg metilmercurioHg mercurioEh Potencial de oxido-reduccinBSR Bacterias Sulfato ReductorasDSV DesulfovibrioDCC DesulfococcusDFM DesulfotomaculumDBB DesulfobulbusDSB Desulfobacter

DBM Desulfobacterium


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DEDICATORIAEste trabajo esta dedicado a mis padres(Rodolfo y Rita) y hermanos (Marcelo y Claudia).Muchas gracias por estar siempre a mi lado.


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AGRADECIMIENTO

Primeramente quiero agradecer a mis tutores la Dra. Volga Iiguez y Dr. MarcRoulet por brindarme todo su apoyo y colaboracin en este trabajo.

Asimismo, agradecer el apoyo de las siguientes instituciones, Instituto de BiologaMolecular y Biotecnologa (IBMB), Institut de Recherche Scientifique pour leDveloppement (IRD), Hybam, ATI, ESCD. Asimismo, agradecer al Dr. Jean RemyGuimares.

Tambin agradecer a todas aquellas personas que forman parte del IBMB, graciaspor su apoyo y su amistad. Asimismo, agradecer a mis compaeros de la unidadde microbiologa ambiental (Sonia, Daniela, Karina y Jos).

Agradecer a todos los profesores y compaeros de la Maestra de Ciencias

Biolgicas y Biomdicas Gestin 2002-2003. A los primeros por impartirme unaexcelente enseanza y a los segundos por brindarme su amistad.

Muchas Gracias.

Samanta Rita Snchez Alarcn


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INDICE

1. INTRODUCCION ......................................................................................... 52. MARCO TEORICO....................................................................................... 7

2.1. Geoqumica del mercurio ............................................................................. 72.2. Metilacin del mercurio................................................................................. 92.3. Efectos txicos del mercurio y metilmercurio ............................................. 112.4. Contaminacin del mercurio en suelos y sedimentos de la amazonia ....... 122.5. La Amazona Boliviana............................................................................... 142.6. Contaminacin por mercurio en la amazona boliviana.............................. 142.7. Bacterias Sulfato Reductoras.....................................................................152.8. Metabolismo de las Bacterias Sulfato Reductoras ..................................... 162.9. Clasificacin de las Bacterias Sulfato Reductoras ..................................... 182.9.1. BSR Gram-negativas mesoflicas...............................................................202.9.2. BSR Gram-positivas formadoras de esporas ............................................. 23

2.9 Relacin ecolgica de las bacterias sulfato reductoras.............................. 232.10. Efecto de pH, temperatura y oxigeno en el desarrollo de las bacterias

sulfato reductoras....................................................................................... 242.11. Actividad sulfato reductora .........................................................................252.11.1. Activacin del sulfato y reduccin a bisulfito........................................... 262.11.1.1.Formacin adenilsulfato.......................................................................... 262.11.1.2.Reduccin del adenilsulfato a AMP y Bisulfito ........................................ 262.11.1.3.Reduccin del tiosulfato.......................................................................... 272.11.1.4.Sulfuro de hidrogeno............................................................................... 272.12. Deteccin de microorganimos por mtodos moleculares........................... 282.13. Identificacin de las bacterias sulfato reductoras por tcnicas moleculares28

2.13.1. La sulfito reductasa disimilatoria ............................................................. 292.13.2. El RNAr 16S como un marcador evolutivo.............................................. 293. OBJETIVOS ............................................................................................... 333.1. Objetivo General ........................................................................................ 333.2. Objetivos Especficos ................................................................................. 334. MATERIALES Y METODOS ...................................................................... 344.1. rea de estudio .......................................................................................... 344.2. Colecta de las muestras ............................................................................. 374.3. Medicin de pH y potencial redx .............................................................. 384.4. Medicin de mercurio total y metilmercurio ................................................ 384.5. Analisis de Me203Hg ................................................................................... 39

4.6. Medicin del carbono y nitrgeno organico................................................ 394.7. Extraccin de DNA de sedimentos ............................................................. 394.8. Extraccin y purificacin de DNA de sedimentos ....................................... 404.9. Amplificacin de 16S DNAr y grupos especficos de BSR por PCR y nested-

PCR............................................................................................................ 404.10. Amplificacin de la sulfito reductasa disimilatoria por PCR ....................... 414.11. Porcentaje total de los subgrupos de BSR................................................. 414.12. Cepas de referencia ................................................................................... 42


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5. RESULTADOS ........................................................................................... 435.1. Caractersticas fsicas de los sedimentos................................................... 435.2. Potencial de oxido-reduccin (Eh).............................................................. 445.3. pH............................................................................................................... 455.4. Geoqumica de los sedimentos de las lagunas de inundacin ................... 485.4.1. Geoqumica del MeHg en la interfase agua-sedimento de los centros de las

lagunas....................................................................................................... 485.4.2. Porcentajes de carbono orgnico, nitrogeno y de materia organica.505.4.3. Distribucin de la concentracin de mercurio............................................. 505.4.4. Distribucin del metilmercurio en sedimentos de lagunas.......................... 515.4.5. Relacin entre el MeHg, materia orgnica, porcentaje de agua y Eh......... 525.5. Extraccin de DNA de los sedimentos de las lagunas de inundacin........ 575.6. Deteccin de la bisulfito reductasa disimilatoria (DSR) .............................. 575.7. Amplificacin del gen 16S DNAr ................................................................ 585.8. Deteccin de los subgrupos de BSR mediante PCR anidado.................... 585.8.1. Porcentaje total de BSR en las lagunas de inundacin .............................. 625.8.2. Distribucin de los subgrupos de BSR en las lagunas de estudio.............. 63

5.8.3. Porcentaje vertical de los subgrupos de BSR en las lagunas de estudio.. 675.8.4.Anlisis de porcentaje horizontal de BSR en el perfil en profundidad ....... 696. DISCUSIN ...................................................................................................... 716.1. Extraccin de cidos nucleicos de las muestras sedimentarias..................... 716.2. Consideraciones metodolgicas de la identificacin de subgrupos BSR ....... 726.3. Distribucin de los subgrupos BSR en los sedimentos de las lagunas

mendricas y de tierra firme ....................................................................... 746.3.1. Deteccin de la familia Desulfovibrionaceae............................................... 766.3.2. Deteccin de la familia Desulfobacteriaceae............................................... 766.4. Deteccin de bacterias sulfato reductoras por gen bisulfito reductasa

disimilartoria (DSR) .................................................................................... 78

6.5. Geoqumica del Hg y MeHg en los sedimentos. Tasas de metilacin ydistribucin de Bacterias Sulfato Reductoras ............................................. 786.5.1. Distribucin del Hg en los sedimentos ........................................................ 786.5.2. Tasas de metilacin en la interfase de los sedimentos ............................... 806.5.3. Distribucin MeHg en los sedimentos ......................................................... 836.5.4. Hg, MeHg y distribucin de las BSR en los sedimentos de las lagunas de

inundacin .................................................................................................. 857. CONCLUSIN .................................................................................................. 878. RECOMENDACIONES .................................................................................... 899. BIBLIOGRAFIA .......................................................................................... 90


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INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Transformaciones del mercurio ........................................................................8Figura 2. Ciclo del mercurio en la biosfera ....................................................................10Figura 3. Principales vas de interacciones de las bacterias sulfato reductoras .....16

Figura 4. Formas celulares de las bacterias sulfato reductoras.................................19Figura 5. rbol filogentico de DNAr 16S muestra los linajes de los seissubgrupos de bacterias sulfato reductoras. ...........................................................22

Figura 6. A) Mapa de la estructura secundaria del 16S RNAr. B) Modelo de laimagen tridimensional del 16S RNAr en bacterias. ..............................................31

Figura 7. Mapa de la regin de estudio y puntos de muestreo de las lagunas deinundacin con relacin a la poblacin de Rurrenabaque y al ro Beni. .........36

Figura 8. Centro y zona litoral de las lagunas Pinky, La Granja y Ro Viejo. ...........37Figura 9. Perfiles porcentaje de agua, densidad, potenciales redox y pH en

sedimentos de las lagunas de inundacin. ............................................................47Figura 10. Geoqumica del mercurio en la interfaz aguasedimentos en los centros

de las lagunas.............................................................................................................49Figura 11. Perfiles de las concentraciones de C orgnico, C/N, Hg y MeHg en lossedimentos del centro de las lagunas. ...................................................................53

Figura 12. Perfiles de concentracin de Hg, MeHg y MeHg/C en sedimentos. .......54Figura 13. Relacin entre la fraccin del Hg, MeHg y Corg en los sedimentos de

las lagunas de inundacin. .......................................................................................55Figura 14. Relacin entre la fraccin del Hg, MeHg y porcentaje de agua en

sedimentos en las lagunas de inundacin. ............................................................56Figura 15. (A) Extraccin de DNA de sedimentos de la laguna La Granja.. ............59Figura 16. Amplificacin de 16S DNAr, de grupos especficos de BSR de

eubacteria y del gen DSR de bacterias sulfato reductoras.................................60

Figura 17. Amplificacin de grupos especficos de bacterias sulfato reductoras enmuestras de la laguna La Granja.. ..........................................................................61Figura 18. Porcentaje total de BSR en las lagunas del area de estudio. .................62Figura 19. Distribucin de los subgrupos de BSR en sedimentos de la lagunas

meandricas..................................................................................................................65Figura 20. Distribucin de los subgrupos de BSR en sedimentos de la laguna

Chitiwara y de tierra firme (San Juan y Moa). .......................................................66Figura 21. Porcentaje vertical de los subgrupos de BSR en las laguna del area de

estudio. ........................................................................................................................68Figura 22. Porcentaje horizontal de los subgrupos de BSR en lagunas de

inundacin.. .................................................................................................................70

Figura 23. Extraccin de DNA de sedimentos de diferente estado trofico.. ...........107Figura 24. Extraccin de DNA de sedimentos de las lagunas en estudio. .............107Figura 25. Extraccin de DNA de sedimentos de la laguna Salina.. .......................108Figura 26. Extraccin de DNA de sedimentos de la laguna Pinky. .........................108


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INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Caractersticas del sistema de las lagunas estudiadas en la regin deRurrenabaque .............................................................................................................35

Tabla 2. Secuencias de cebadores utilizados en la reaccin de PCR para lacaracterizacin de bacterias sulfato reductoras ....................................................42Tabla 3. Cepas de referencia ...........................................................................................42Tabla 4. Concentraciones de Hg y MeHg y porcentaje MeHg en............................80Tabla 5. Promedios de las concentraciones de Hg, MeHg y del %MeHg integrados

sobre los cinco primeros centimetros del perfil sedimentario .............................84Tabla 6. Grado de metilacin del mercurio por bacterias sulfato reductoras...........86


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1. INTRODUCCION

La contaminacin por metilmercurio (MeHg) en los ecosistemas naturales es untema preocupante por sus efectos inmediatos sobre el medio ambiente (Roulet etal., 1998; Mauro et al., 2002; Bowles et al., 2003; Hammerschmidt et al., 2004) ypor sus consecuencias en la salud humana (Allen et al., 2002; Budtz-Jorgensen et

al., 2002). Diferentes estudios han demostrado que las bacterias sulfatoreductoras son los principales metiladores en sedimentos de agua dulce(Macalady et al., 2000) y marinos (Devereux et al., 1996; Loseto et al., 2004).Entre los factores que influyen en la produccin del MeHg estara la afiliacinfilogentica de las BSR (King et al., 2001) as como su distribucin espacial ytemporal (Devereux et al., 1996; Siliciano et al., 2002), la biodisponibilidad del Hg+2(Benoit et al., 2001), biodisponibilidad del carbono orgnico (Pak et al., 1998b;Zhou Yi, 2003) y la abundancia de aceptores de electrones tales como el sulfato(Jay et al., 2002).

El mercurio inorgnico tiene la capacidad de formar compuestos orgnicos e,

utilizando como precursor al ion mercrico (Hg+2). Cuando el Hg+2 ingresa al aguase transforma en metilmercurio (MeHg) por una reaccin metablica donde esabsorbido, transmitido y bioacumulado por su naturaleza lipofilica, en los nivelestroficos a este fenmeno se lo conoce como biomagnificacin. La metilacin delmercurio es dependiente de la concentracin y la forma en la que se encuentradistribuido este elemento en el medio ambiente (Roulet et al., 2001). Elmetilmercurio se encuentra en afluentes, sedimentos y tierras de las regionescontaminadas (Schwesig et al., 1999; Rodrguez et al., 2000; Roulet et al., 2001;Matilainen et al., 2001; Loseto et al., 2004).

Investigaciones realizadas en la amazona brasilea indican que los efectos del

metilmercurio en el hombre, aparecen antes de la manifestacin de los sntomasde intoxicacin, con modificaciones del funcionamiento del sistema nervioso, enparticular el sistema motor, visual y sensorial (Lebel et al., 1997; Dolbec et al.,2001). En la amazona boliviana se han realizado pocos estudios sobre lacontaminacin por mercurio (Maurice Bourgoin, 2001) y metilmercurio (Ach,2004). En el 2001 Maurice Bourgoin, reporto que existen diferentesconcentraciones de mercurio en peces y humanos en la cuenca del ro Beni, quereflejaran la contaminacin ambiental y de riesgo para la salud humana en laregin. La contaminacin por Hg se produce de forma natural como por lasactividades antropognicas, como la minera aurfera (originada en 1950) que hanliberado ms de 300 toneladas de mercurio al medio ambiente, sobre todo en la

cabecera del ro Beni (Maurice Bourgoin, 2001).

Las bacterias sulfato reductoras (BSR) son bacterias anaerobias que tienen lahabilidad de usar el sulfato (SO4

-2) como ltimo aceptor de electrones con laproduccin de sulfuro de hidrgeno (H2S), constituyndose en un grupo funcionalimportante en la estructura y actividad del medio ambiente (Wagner et al., 1998;Krekeler et al., 1998; So y Young 1999; Annweiler et al., 2001; Prez-Jimnez etal., 2001).


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Asimismo, son conocidas por su diferenciada habilidad de utilizar dadores deelectrones al hidrogeno, cidos orgnicos pequeos (lactato, acetato ypropionato), cidos orgnicos de cadena larga, hidrocarburos alifticos ycompuestos aromticos (benzoato, fenol y tolueno) (Barton, 1995). Las BSRactan en el estadio terminal de la degradacin de la materia orgnica, la

oxidacin de la materia orgnica a CO2 bajo anaerobiosis y contribuyensignificativamente al ciclo global del carbono y azufre. La iniciacin del proceso dereduccin del sulfato se produce bajo condiciones de un potencial redx reducido,los cuales estaran presentes en suelos inundados (Krekeler et al., 1998). Ensedimentos, la sulfato reduccin ayuda a la mineralizacin de la materia orgnicaa CO2.

La abundancia, la diversidad y rol de las poblaciones microbianas en losecosistemas hasta hace algunos aos ha estado limitada a la informacin obtenidaa travs de los medios de cultivo. El uso de mtodos independientes de losmedios cultivo, sobre todo de la biologa molecular, ha permitido una mejor

comprensin del papel de las comunidades microbianas en el medio ambiente(Weisburg et al., 1991; Voordouw et al., 1996; Borneman y Triplett., 1997; Macrae2000; Cho y Tiedje 2002). As las BSR clasificadas en gneros y especies en baseal anlisis filogentico del gen 16S RNAr (Devereux et al., 1990; Voordouw et al.,1996; Devereux et al., 1996, Daly et al., 2000; Loy et al., 2002) han sidocaracterizadas por su rol en la metilacin en diferentes ecosistemas acuticos deagua dulce, marinos y lacustres.

Con el objetivo de contribuir al conocimiento de los factores y procesos queintervienen en la metilacin del Hg, el presente estudio esta enfocado acaracterizar la distribucin de subgrupos de bacterias sulfato reductoras en

estratos sedimentarios de diferentes lagunas de la llanura de inundacin de lacuenca del ro Beni, en los cuales se analizara tambin las concentraciones de Hg,distribucin del Hg, MeHg, carbono orgnico, tasas de metilacin y caractersticasfisicoqumicas como Eh y pH.


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2. MARCO TEORICO

2.1. Geoqumica del mercurio

El mercurio est disperso en concentraciones variables en los ambientes naturales(Rasmussen et al., 1998; Schwesig et al., 1999; Matilainen et al., 2001; EPA,

2004a). Se presenta en tres estados de oxidacin, Hg0, Hg+, y Hg+2 y comocinabrio (HgS), mineral poco soluble, que se oxida gracias a la aireacin dandolugar a la formacin del in mercurio (Hg2+). El mercurio monovalentegeneralmente esta presente como dmero, +Hg-Hg+(Figura 1).

El mercurio liberado a la atmsfera se encuentra principalmente en forma demercurio metlico (Hgo), precipitando constantemente como Hg+2 en los suelos ycuerpos de agua junto con la lluvia y otras partculas. Cuando precipita pasa a suestado de oxidacin en la atmosfera (forma inica). En el agua, el mercurioingresa a una muy compleja y an no del todo comprendida cadena de reaccionesy trasformaciones qumicas de las cuales la metilacin es una de las ms

importantes (National Research Council, 2000). De la misma forma, elmetilmercurio podra ser demetilado y pasar a formar mercurio inico Hg+2 omercurio elemental Hgo. Este ltimo vuelve a volatilizar y se reiniciara el ciclonuevamente (Figura 2).

El mercurio proviene tanto de fuentes naturales y antropognicas y su utilizacinen muchos productos al igual que su emisin en los procesos de combustin, hanresultado en casos de intoxicamiento en diferentes poblaciones. En los reportesde Agencia de Proteccin Ambiental (EPA) de Estados Unidos en 1999, seidentificaron, como principales emisores de mercurio, a la combustin decombustibles fsiles en plantas de energa y a la combustin de carbn mineral,

liberando aproximadamente 40% de mercurio al ambiente cada ao en losEstados Unidos. Otras fuentes de contaminacin de mercurio son las calderasindustriales con un 10% y la produccin de la clorina con un 5%. La basuramunicipal y la basura mdica eran una fuente importante de contaminacin demercurio, pero gracias a las regulaciones de la EPA estas fuentes decontaminacin ahora son menos importantes (EPA, 2004a).


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Figura 1. Transformaciones del mercurio


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2.2. Metilacin del mercurio

Diferentes estudios han demostrado que las Bacterias Sulafto Reductoras son losprincipales metiladores en sedimentos de agua dulce y marinos (Devereux et al.,1996; Macalady et al., 2000; Loseto et al., 2004). Reportes sobre la metilacin delmercurio por las BSR mencionan que esta reaccin se realiza en condiciones

anaerbicas estrictas (Pak y Bartha, 1998a). Sin embargo, estudios ms recienteshan revelado la existencia de BSR tales como Desulfovibrioy Desulfotomaculumque son aerobias tolerantes. Mas an, se ha determinado que la mayor actividadde las BSR se da en los primeros milmetros de profundidad en los sedimentos yposiblemente en condiciones aerotolerantes. De todas maneras es posible laexistencia de otros grupos importantes en la metilacin del mercurio, en especialen regiones y ecosistemas an poco estudiados (Pak y Bartha, 1998b).

La metilacin del mercurio por parte de las BSR es un proceso an no del todocomprendido. Se tienen algunas pautas sobre como el mercurio inorgnico ingresadentro de las bacterias y es trasformado, existiendo varios posibles mecanismos,

as como ciertas condiciones que estimulan o inhiben la produccin delmetilmercurio. Adems, no todas las BSR son capaces de metilar el mercurio en elmismo grado y capacidad. Asimismo, algunas BSR demetilan el metilmercurio a suforma inorgnica (Choi et al., 1994; King et al., 2000).

Un estudio realizado por Benoit y colaboradores el 2001 con Desulfobulbuspropionicus (1pr3) demostro que la metilacin del mercurio es dependiente de labiodisponibilidad del mercurio, y se ve afectada por la cantidad de sulfuro dehidrogeno presente en el medio, adems, de requerir de ciertas condiciones decrecimiento (Benoit et al., 2001).


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Figura 2. Ciclo del mercurio en la biosfera

La transformacin del mercurio en metilmercurio es producida por intermedio de lacobalamina (B12) (Choi y Bartha, 1993), de tal manera que cuando Desulfovibriodesulfuricans tiene un crecimiento fermentativo y existe una reduccin del sulfato,los rangos de metilmercurio son bajos (Choi et al., 1994). Desulfovibriodesulfuricans metila el mercurio en presencia de tetrahidrofolato (THF) ycobalamina. El carbono empleado en esta va de biometilacin pertenece al C-3del piruvato y es donado al tetrahidrofolato como C-3 a la serina por la serinahidrometiltransferasa. Se cree que el compuesto qumico que proporciona el grupo

metilo es la metilcobalamina y que los compuestos S-adenosilmetionina y N-5-metiltetrahidrofolato no son capaces de donar el grupo metilo al Hg+2, porque steen estos dos compuestos se transfiere como CH3

+, mientras que metilcobalaminatransfiere el grupo metilo como CH3

-, ocurriendo esta transferencia de formaintracelular (Summers y Silver, 1978). El grupo metilo de la metilcobalamina estransferido a los iones mercurio formandose el metilmercurio (Siciliano et al.,2002). Un trabajo realizado por Ekstrom et al. (2003)muestra que la metilacindel mercurio es independiente a la va de acetil-CoA, encontrando cepas BSR que


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oxidan incompletamente acetil-CoA, pero logran metilar el mercurio ametilmercurio (Ekstrom et al., 2003).

Las condiciones que promueven o inhiben la metilacin son diversas y estnestrechamente relacionadas con la inhibicin o estimulacin de las BSR (Jin et al.,1997). En ambientes ricos en sulfato la produccin de sulfuro de hidrogeno inhibe

la metilacin del mercurio, al igual que se inhibe el crecimiento de las BSR. Encambio, la metilacin del mercurio podra verse favorecida en ambientes sinmucho sulfato, si las BSR continan metilando el mercurio con la ayuda de lasbacterias metangenicas sin producir H2S. As un crecimiento sinrgico entre lasBSR y bacterias metangenicas podra crear condiciones favorables para lametilacin del mercurio (Pak y Bartha, 1998).

Aunque se han reportado distintos grupos de organismos capaces de metilarmercurio, se cree que en ambientes acuticos los principales responsables son lasBSR (King et al., 2000; Benoit et al., 2001). Por lo tanto, el conocimiento yfuncionamiento de las comunidades de BSR en estos ambientes es importante

para comprender el proceso de contaminacin en lugares donde los niveles demetilmercurio son elevados.

2.3. Efectos txicos del mercurio y metilmercurio

Los efectos txicos del mercurio y metilmercurio no estn totalmentecomprendidos y menos an las vas precisas de toxicidad. Se cuenta con estudiosque evidencian que el metilmercurio tiene fuertes efectos neurotxicos sobre todoen los fetos y nios en desarrollo afectando al Sistema Nervioso Central (SNC)(Sanfeliu et al., 2001; Allen et al., 2002; Ehrenstein et al., 2002; Limke et al., 2003;

Qu et al., 2003), as como a los riones y al sistema inmunolgico (Pheng et al.,2003). Adems, se tienen datos sobre alteraciones negativas en el sistemacardiovascular (Stern et al., 2001; Budtz-Jorgensen et al., 2002). Tanto elmetilmercurio como el dimetilmercurio (voltil) son sustancias lipoflicas y tienden aconcentrarse en los lpidos celulares. El metilmercurio es 100 veces ms toxicoque el Hg2+ (WHO, 1990).

El metilmercurio es rpidamente transferido al cerebro, gracias a que pasa labarrera hematoenceflica en forma de metilmercurio-L-cisteina. Por lo tanto, elrgano crtico afectado por la toxicidad del metilmercurio es el cerebro y engeneral el Sistema Nervioso Central (SNC) (Yuan et al., 1999). Tanto el cerebro

del adulto como del feto se ven severamente afectados, aunque el cerebro de esteltimo es ms sensible. Los daos ms evidentes son la parlisis, ceguera, retardomental, problemas motores, reduccin del campo visual y otros (Yokoo, et al.,2003). Los efectos txicos del metilmercurio tambin provocan la muerte celular(Sanfeliu, et al., 2001; Allen, et al., 2002; Jrgensen, et al., 2002), pero an noexisten suficientes evidencias sobre este mecanismo. Algunos investigadorestambin consideran que el principal mecanismo de neurotoxicidad delmetilmercurio es la disrupcin de la sntesis de protenas, demostrada in vivoen


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mamferos (Yuan y Atchison, 1997; Nishioku et al., 2000). No obstante, enestudios in vitro se observ un incremento en la produccin de protenasasociadas a una exposicin a bajos niveles de metilmercurio (Miura et al., 1999;Yuan et al., 1999).

La contaminacin por el mercurio al ser humano se da fundamentalmente por dos

vas; la primera es la ingestin de alimentos contaminados con metilmercurio y laotra es la inhalacin de vapores de mercurio (Hgo). La Organizacin Mundial de laSalud (OMS) ha establecido como un nivel de 50ug de mercurio por g de cabellocomo un parmetro que indica un riesgo mnimo de efectos neurotxicos enadultos y 20 ug de mercurio por gramo de cabello para mujeres embarazadas. Noobstante, en el 2003, Yokoo mostr que es posible detectar efectos neurotxicosen adultos con exposicin crnica a niveles de metilmercurio de 0.6ug/g a 14 ug/g(Yokoo et al., 2003).

En la amazona existe informacin limitada sobre los niveles de contaminacin pormercurio. No obstante, se cuenta con datos de diferentes regiones. Un estudio

llevado a cabo por Harada y colaboradores en el 2001, en la regin del roTapajs, encontr que el 32% de la poblacin estudiada sufra de desordenessensoriales que podan asociarse con la contaminacin por metilmercurio. En estamisma regin se han reportado niveles de mercurio en cabellos por encima de losrecomendados por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) y niveles en pecespiscvoros 4 veces superiores a los permitidos (Harada et al., 2001), los mismosque constituyen la principal fuente de exposicin al mercurio en la amazona. Losestudios sobre el contenido de metilmercurio en peces amaznicos han mostradoniveles que frecuentemente superan los 0.5 ug/g de peso fresco, un valor que esconsiderado en muchos pases como estndar y que no debe ser excedido.

De acuerdo con Harada y colaboradores en 2001, el nivel umbral de mercurio enel cabello es de 10 ppm. No obstante, se ha visto efectos neurotxicos en nioscuyas madres presentan menos de 10 ppm en el cabello (Harada et al., 2001).Esta concentracin de mercurio podra estar por debajo de la asociada con daosneurolgicos en adultos, pero es suficiente en el caso de mujeres embarazadas.Estudios realizados por Label et al. (1997) y Dolbec et al. (2001) mostraron queexiste contaminacin de mercurio en los peces de la amazonia brazilea.

2.4. Contaminacin del mercurio en suelos y sedimentos de la amazonia

Estudios realizados por Roulet et al. (1998), encontraron que ms del 97% delmercurio acumulado en las superficies del suelo de la cuenca del Tapajs, es deorigen preantropognico. No obstante, existe evidencia de que la acumulacin demercurio en sedimentos y suelos inundables se ha incrementado en los ltimosaos. Durante mucho tiempo se consider que la actividad de explotacin aurferaera responsable de la contaminacin por mercurio. Sin embargo, recientesestudios destacan a la deforestacin y a la lixiviacin de los suelos como fuentesde contaminacin por mercurio mucho ms importantes que la minera.


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Los suelos del Amazonas tienen entre 500.000 y un milln de aos de antigedady han acumulado mercurio de la atmsfera a lo largo del tiempo. En las ltimasdcadas, diferentes zonas de la Amazona han sido objeto de colonizacin masivasiendo desmontadas grandes extensiones de bosques para la agricultura. Seestima que a fines de los 90 se deforestaron ms de 2.5 millones de hectreas de

la regin amaznica. Al quedar expuesto el suelo contaminado con mercurio, laslluvias arrastran a los contaminantes hacia las redes fluviales distribuyendo elmercurio en la cuenca.

Un anlisis de sedimentos de la amazona central (ro Tapajs, Estado de Par,Brazil) mostr la existencia de un alto contenido de mercurio, constituyndose steen un importante reservorio natural de mercurio para la regin (90-120 ngg -1en losprimeros 20 cm de profundidad) (Roulet et al., 1998a). En el ro Tapajs y en otroscursos de agua de la Amazona, la contaminacin de mercurio es causadaprincipalmente por la deforestacin de la regin. Se observ que a pesar de que laextraccin de minerales estaba contribuyendo a la contaminacin por mercurio

dentro de un radio de 50 Km2de los yacimientos aurferos, sta no era la principalfuente de contaminacin por mercurio (Roulet et al., 1998b).

Un estudio realizado por de Oliveira Santos y colaboradores el 2002 mostr queindependientemente de que el mercurio tenga su origen en la minera o en ladegradacin de los suelos, la contaminacin pasa por la introduccin de stemetal en la cadena trfica, ya que los niveles en suelos y sedimentos estn pordebajo de los niveles de referencia, pero en la biota alcanzan 1.734 ug/g, an enausencia de actividad minera en la zona (de Oliveira Santos et al., 2002).Investigaciones realizadas en la amazonia, consideran que los principales sitios demetilacin del mercurio son las lagunas amaznicas. Asimismos se ha

determinado que las partculas de hierro y aluminio cumplen un rol importante eneste proceso (Guimares et al., 2000a; Roulet et al., 2001; Mauro et al., 2002).

Se conoce poco sobre la biogeoqumica del mercurio (Hg) y el metilmercurio(CH3Hg) en la amazona y en especial en los sedimentos (Roulet et al., 2001). Lametilacin del mercurio es dependiente de la concentracin disponible y tambinde la forma en la que se encuentra el mercurio. Sin embargo, repetidas veces seha demostrado que, incluso con bajas concentraciones en el agua, los niveles decontaminacin en la bita son elevados. Por lo tanto, una pregunta central de estaproblemtica es dnde y por qu ocurre la metilacin del mercurio en estosambientes.

De acuerdo con datos sobre metilacin de mercurio en Norte Amrica y Europa lamayor parte de este proceso se dara en los sedimentos gracias a las condicionesreductoras y anaerobias que favoreceran al desarrollo de las BSR, consideradascomo las principales responsables de la metilacin del mercurio (Loseto et al.,2004). No obstante, estudios realizados en la Amazona muestran que losmayores niveles de metilacin del mercurio se daran en la rizosfera de macrfitas


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flotantes, que habitan principalmente las lagunas y las llanuras de inundacin de lacuenca Amaznica (Mauro et al., 1999).

Investigaciones realizadas por Guimares y colaboradores el 2000, mostraron quelas plantas acuticas y la fauna que en ellas habitan, son factores fundamentalesen la conversin del mercurio en metilmercurio, mostrando que el potencial de

metilacin de mercurio, en distintas macrfitas y distintos lugares, es en promedio28 veces mayor que en sus respectivos sedimentos. En la regin del pantanal lasraces de Eichchornia azureapresentan un potencial promedio de metilacin 59veces mayor al de los sedimentos subyacentes y un potencial mximo demetilacin de 34% (Guimares et al., 2000a). Otras especies como Pistia stratiotesy Eichhornia crassipetambin mostraron importantes potenciales de metilacin delmercurio (Mauro., et al 2002).

2.5. La Amazona Boliv iana

La cuenca amaznica boliviana cubre una superficie de 724000 km2,representando un 66% de la superficie total del pas. Este ecosistema abarca a losdepartamentos de Beni, Pando, y parte de Santa Cruz. Est comprendida por 4subcuencas: ros Beni, Mamor, Itenez y Madera. La cuenca del ro Beni, estconstituida por el ro Beni que a su vez tiene conexin con los ros Madre de Dios,Orthon, Alto Beni, Kaka, Quiquibey, Tuichi, y Madidi. Esta cuenca esta limitada alSur y al Oeste por los relieves de la Cordillera Oriental de los Andes y los Yungasy al Este por el Escudo Brasileo. En esta regin, predominan reas de climashmedos hasta pluviales. Los suelos se encuentran sobre reas de fuertespendientes que estn sometidas a procesos de remocin en masa y de altaerosin.

El ro Beni, tambin conocido como Alto Madera, es el principal afluente del roMadera, el cual es uno de los ros ms grandes del mundo. Recorre gran parte delnorte del departamento del Beni, y en sus riveras se han asentado un gran nmerode poblaciones (Montes, 1997). El carcter mendrico del ro forma a su pasolagunas de baja profundidad que rpidamente se convierten en lagunas eutrficas.Con el tiempo estas lagunas van perdiendo su vnculo con el ro paraposteriormente ser conectadas nuevamente durante la poca de lluvias.

2.6. Contaminacin por mercurio en la amazona bol iviana

La preocupacin por la contaminacin por mercurio en la amazona boliviana,surgi durante el auge de la minera aurfera, que registr un incremento durantela dcada de los aos 80. La actividad aurfera en Bolivia y la contaminacin pormercurio provocada por la misma tiene sus orgenes hace alrededor de 50 aosatrs. Se estima que en Bolivia, desde los aos 50 ms de 300 toneladas demercurio han sido liberadas en el ambiente (Maurice Bourgoin, 2001).


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En la regin de Rurrenabaque en general, las especies piscvoras y carnvorascolectadas en el ro Beni, aguas debajo de Rurrenabaque, estn contaminadas pormercurio con un 72% (Maurice Bourgoin, 2001). En esta rea la poblacin localconsume frecuentemente peces contaminados con mercurio, siendo los niveles demercurio encontrados en el cabello en las poblaciones ribereas de entre 8 a 10ppm (Maurice Bourgoin, 2001).

En un estudio realizado entre 1995 y 1998 se midieron las concentraciones demercurio en cabello humano en la poblacin de Rurrenabaque encontrndoseconcentraciones de mercurio de 1.1 a 13.5 ug/g (Maurice Bourgoin, 2001). Seestableci tambin que el riesgo de exposicin tiende a agravarse, ya que hay unincremento de los niveles de Hg a travs de las generaciones y los niveles mselevados se encontraron en los nios que an estaban siendo alimentados conleche materna (Maurice Bourgoin, 2001).

Un estudio realizado por Acha en el 2004, determino tasas de metilacin delmercurio en la rizsfera de diferentes macrofitas en la regin de Rurrenabaque,

hallandose potenciales de metilacin en Polygonum densiflorum de entre 28% a36% y en Eichhornia crassipesmenores al 2%.

2.7. Bacterias Sulfato Reductoras

Las Bacterias Sulfato Reductoras (BSR) son un grupo parafiltico y fisiolgicomuy diverso que est distribuido en ambientes anaerobios. Se caracterizan por sucapacidad de utilizar a los sulfatos como aceptores finales de electrones en larespiracin anaerobia, reducindolo sin asimilarlo.

En las ltimas dcadas, los procesos metablicos de las BSR han recibidoconsiderable atencin, ya que adems de ser parte fundamental en el ciclo delazufre, las BSR estn involucradas en la precipitacin de metales pesados (Fortnet al., 2000), metilacin del mercurio (King et al., 2000), reduccin del uranio(Chang et al., 2001a), tratamiento de aguas residuales (Garca et al., 2001),produccin y descomposicin de hidrocarburos (Rabus et al., 1996; Annweiler etal., 2001; Kleikemper et al., 2002), descomposicin de materia orgnica(Jorgensen, 1982) e infecciones en humanos (Zinkevich y Beech, 2000;Loubinoux et al., 2002). Estas caractersticas, las sealan como indicadoras decontaminacin y procesos de bioremediacin/descontaminacin en el medioambiente (Maarel et al., 1996). De ello se deduce, que su deteccin y

caracterizacin en ecosistemas naturales resulte muy importante (Figura 3).


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Figura 3. Principales vas de interacciones de las bacterias sulfato reductoras(Barton, 1995).

2.8. Metabolismo de las Bacterias Sulfato Reductoras

Las BSR tienen la capacidad de usar varios compuestos como donadores deelectrones. Ms an, ciertas cepas se desarrollan en ausencia de sulfato y soncapaces de utilizar una sola fuente de carbono como donador y aceptor deelectrones por un proceso llamado dismutacin. Varias cepas de Desulfovibriosedesarrollan con la dismutacin de piruvato, malato, glicerol y dihidroxiacetona(Krumholz et al., 1999) y otras crecen con sulfito o tiosulfato por un mecanismodonde el oxianion de azufre sirve como donador y aceptor de electrones (Lie etal., 1999b).

Asoc iac incon

animales

Tratamientode aguas

Biocorrocin

Produccin dhidrocarburo

Ciclosgeoqumicos

Biorremediacin

Patgenoshumanos

Ciclo denutrientes

Bacterias SulfatoReductoras


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Metablicamente, las BSR estn estrechamente unidas por su capacidad dereducir sulfatos a sulfuro de hidrogeno, siendo sta la principal caracterstica quedefine la inclusin de diversas bacterias y archeas dentro de este grupo (Koizumiet al., 2003). No obstante, el resto de su metabolismo es muy variado y hastaahora poco estudiado y comprendido (Alvarez et al., 2000).

Las rutas metablicas atribuidas a las BSR son muy diversas y van desde lautilizacin de dadores de electrones simples como el etanol, lactato e hidrogenohasta compuestos ms complejos como los hidrocarburos (Jorgensen, 1982;Rabos et al., 1996; Krekeler et al., 1998; Krumholz et al., 1999; Steger et al., 2004;Kaksonen et al., 2004).

Por otro lado, aunque se sabe de la imposibilidad de las BSR para utilizarcarbohidratos, se han encontrado, cepas de Desulfovibrio capaces de utilizarpoliglucosa y nitrocelulosa como fuente de carbono (Petrova et al., 2002).Muchas cepas de BSRs fijan N2 y usan a los aminocidos como fuente de

nitrgeno. Algunas cepas son capaces de crecer con nitrato como aceptor final deelectrones. Desulfovibrio desulfuricans 27774, por ejemplo, utiliza nitrato. Otrascepas de Desulfovibrio reducen nitrato a amonio (Lie et al., 1999a). Muchasespecies de BSR han mostrado ser capaces de reducir Fe+3a magnetita (Fe3O4) osiderita (FeCO2) y U

+4 a uranito (UO2), aunque las BSR no generan energa apartir de estos procesos (Lovley et al., 1992; Chang et al., 2001a).

Asimismo, muchas de las BSR son capaces de crecer con acetato como nicafuente de energa; oxidando el acetato a CO2 y reduciendo el sulfato a sulfuro(Krumholz et al., 1999). Se conoce dos mecanismos para la oxidacin del acetatopor BSR, un ciclo modificado de cidos tricarboxilicos y la va de la acetil-CoA. La

mayor parte de las BSR oxidantes de acetato, no utilizan el ciclo modificado decidos tricarboxilicos, sino ms bien la va de la acetil-CoA para la oxidacin delacetato (Krumholz et al., 1999).

Existen tambin BSR capaces de utilizar hidrogeno molecular (H2), comoDesulfovibrio vulgaris NCIB 8303. Sonne-Hasen y colaboradores en 1999,examinaron la cintica del sulfato e hidrogeno en las BSR termoflicas,encontrando cepas de BSR nuevas capaces de realizar este proceso metabolico(Sonne-Hansen et al., 1999). Steger y colaboradores, el 2002, descubrieron genesde Desulfovibrio sp. relacionados con la respiracin de sulfato durante elmetabolismo de hidrogeno y lactato (Steger et al., 2002).

Asimismo, las BSR estn relacionadas con las bacterias sulfito reductasas,produciendo efectos en la inhibicin de la sulfidogenesis, mostrando la habilidaddel Desulfitobacterium spp en utilizar sulfonatos alifticos como aceptoresterminales de electrones para su desarrollo (Lie et al., 1999b). Harms ycolaboradores en 1999 observaron la oxidacin anaerbica de o-xyleno, m-xylenoy homlogos alkilbencenos por BSR (Harms et al., 1999). So y Young en 1999


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determinaron que las BSR tienen la capacidad de degradar alcanosanaerobicamente (So y Young, 1999).

2.9. Clasificacin de las Bacterias Sulfato Reductoras

La sistemtica de las BSR, desde la descripcin de Spirillum desulfuricans porBeijerinck en 1895, hasta el establecimiento del genero Desulfovibriopor Kluyveren 1936 y Desulfotomaculum por Campbell en 1965, es un reflejo de losproblemas que los taxonomistas fueron confrontando en las primeras seis dcadasdel siglo pasado.

Como se ve en la figura 4, las caractersticas celulares de BSR son semejantes aotras bacterias, variando las caractersticas morfolgicas de las clulas desdebastoncillos a cocos.

Existen tres grupos bsicos celulares de BSR: Eubacterias Gram-negativas,

Gram-positivas y Archeas. Las BSR suelen dividirse en BSR Gram-negativasmesoflicas, BSR Gram-positivas formadoras de esporas, BSR bacteriastermoflicas y BSR arqueas termoflicas (Barton, 1995).

Los principales subgrupos de BSR son: subgrupo 1, Desulfotomaculum (DFM);subgrupo 2, Desulfobulbus (DBB); subgrupo 3, Desulfobacterium (DBM);subgrupo 4, Desulfobacter (DSB); subgrupo 5, Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina (DCC-DNM-DSS); y subgrupo 6, Desulfovibrio-Desulfomicrobium(DSV-DMB) (Daly et al., 2000; Castro et al., 2000).


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Desulfovibrio(10um) Desulfobacter (10 um)

(Reichenbecher y Schink, 1997) (Rabus et al., 1996)

Desulfococcus(1 um) Desulfobulbus(10 um)

(Drzyzga et al., 1996) (Finster et al., 1998)

Desulfotomaculum(1um) Desulfobacterium(10 um)

(Newman et al., 1997) (Van Der Maarel et al., 1996)

Figura 4. Formas celulares de las bacterias sulfato reductoras.


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2.9.1. BSR Gram-negativas mesoflicas

La mayora de las BSR son Gram-negativas, compuestas por dos lneasfilogenticas lejanamente relacionadas (Manz et al., 1998), la primera determoflicas y la segunda de mesoflicas. En cada lnea se ha encontrado grandiversidad filogentica (Daly et al., 2000). Las mesoflicas, de acuerdo a la

comparacin de secuencias de RNAr 16S, son representantes de la subdivisindelta de proteobacterias, dentro de la que se han identificado dos familias (Castroet al., 2000). La primera familia es Desulfovibrionaceaeque incluye a los gnerosDesulfovibrio y Desulfomicrobium (Figura 5), aunque otros dos gneros podranser incorporados dentro la misma (Desulfohalobium y Desulfonatronum). Lasegunda familia es Desulfobacteriaceae, compuesta por Desulfobacter,Desulfobacterium, Desulfonema, Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfobulbus(Figura 5).

2.9.1.1. Desulfovibrionaceae

El gnero Desulfovibrio es el ms antiguo y el ms diverso, sus clulas tienenformas ms o menos curvadas y frecuentemente presentan motilidad(Reichenbecher y Schink, 1997). Una de las caractersticas ms importantes essu capacidad para tolerar oxigeno y en algunos casos, incluso consumirlo(Zinkevich y Beech, 2000; Loubinoux et al., 2002). El gnero se encuentra desdeambientes salinos hasta sedimentos de agua dulce y es selectivamente aislado enmedio que contienen H2y CO2, acetato, lactato o etanol, aunque tambin crecencon otros substratos orgnicos como el piruvato, malato, lactato y fumarato(Widdel y Bak, 1991; Voordouw, 1995; Luca et al., 2001; Steger et al., 2002).

El gnero Desulfomicrobium considerado tambin dentro de este grupo es muysimilar a Desulfovibrio, en cuanto a sus caractersticas fisiolgicas, tiene forma debastoncillo y carece de desulfoviridin.

2.9.1.2. Desulfobacteriaceae

La familia Desulfobacteriaceaees un grupo que no esta del todo definido, ya quese requieren ms datos de secuencias y caractersticas fisiolgicas de cada unode los grupos que la componen. De hecho, muchos gneros con caracteristicasdiferentes se encuentran en la familia (Widdel y Bak, 1991).

La mayora de las especies del gnero Desulfobulbus, son de forma ovalada,mvil o no mvil (Finster et al., 1998). El substrato caracterstico de este grupo esel propionato, aunque utiliza otros donadores de electrones como lactato, etanol oH2. La oxidacin del propionato a acetato es incompleta, lo que abre la posibilidadde una estrecha relacin entre este gnero con otras BSR que utilizan el acetato.Crece en medios de agua dulce, semisalina y salina y se ha reportado que


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Desulfobulbus propionicus (1pr3) realiza la metilacin del mercurio en cultivospuros (Widdel y Bak, 1991; Benoit et al., 2001).

El gnero Desulfobacter comprende principalmente bacterias de forma ovalada(Rabus et al., 1996), con forma semejante a las de Desulfovibrio con y sinmovilidad (la motilidad se pierde generalmente despus del aislamiento). La

caracterstica ms sobresaliente de este gnero es su capacidad para utilizaracetato de forma completa y ms efectiva que el resto de las BSR mesoflicas.

Aparentemente, este gnero no tiene la capacidad de desarrollarse en presenciade oxgeno y la mayor parte de sus especies han sido detectadas en ambientessalinos. Se ha identificado al gnero Desulfobacter, como uno de los principalesmetiladores de mercurio en medios que contienen lactato y acetato (Widdel y Bak,1991; King et al., 2000).

El gnero Desulfobacterium es un grupo nutricionalmente verstil, con formassemejantes a bastoncillos de forma oval o casi esfrica (Van Der Maarel et al.,1996), presenta capacidades especiales en cuanto a degradacin de compuestos

orgnicos, como la descomposicin de hidrocarburos. Las especies de estegnero son fundamentalmente marinas y requieren elevadas concentraciones decloruro de sodio. Al igual que Desulfobacter, Desulfobacteriumes potencialmenteimportante para la metilacin del mercurio y no tolera condiciones aerobias(Widdel y Bak, 1991; King et al., 2000).

Los gneros Desulfococcus y Desulfosarcina estn filogenticamente ynutricionalmente relacionados y presentan formas de bastoncillo a ovaladas. Sonconocidos por su versatilidad nutricional (Drzyzga, et al., 1996). Algunas cepashan sido aisladas de medios contaminados por hidrocarburos. Desulfococcus hasido aislado de sedimentos de aguas dulces y tambin se desarrolla en medios

salinos; mientras que Desulfosarcina es primordialmente marino. Desulfococcuses uno de los gneros ms importantes en cuanto a la metilacin del mercurio,tercero despus de Desufomicrobiumy Desulfobacter (Widdel y Bak, 1991; King etal., 2000).

Desulfococcus est definido por su caracteristica filamentosa y por su lentareduccin de sulfato. Este gnero ha sido detectado en la quimioclina, entre elambiente aerobio y anaerobio, por lo que podra tener la capacidad de tolerar loxigeno (Widdel y Bak, 1991).


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Figura 5. rbol filogentico de DNAr 16S muestra los linajes de los seissubgrupos de bacterias sulfato reductoras. Los subgrupos de bacterias sulfatoreductoras estn marcados como G1-G6 (Daly et al., 2000).


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2.9.2. BSR Gram-positivas formadoras de esporas

Este grupo esta fundamentalmente constituido por el gnero Desulfotomaculum(Figura 5), el cual es aparentemente homogneo morfolgica y metablicamente(Newman et al., 1997). Desulfotomaculum es capaz de utilizar anilina, etanol,nicotinato, fenol, acetato, acetona, esterato, succinato, catecol y indol (Widdel y

Bak, 1991). Su capacidad para formar esporas le permite sobrevivir mejor queotras BSR a la desecacin y oxidacin del medio ambiente y subsistir en una granvariedad de medios. Se han encontrado abundantes miembros de este gnero ensuelos de cultivos de arroz. De hecho, la mayora de los miembros de este gnerohan sido aislados de ambientes de sedimentos de agua dulce (Stubner y Meuser,2000; Smit et al., 2001).

2.9 Relacin ecolg ica de las bacterias sul fato reductoras

Los microorganismos juegan un rol en las vas de asimilacin-desasimilacin y

procesos de oxidacin-reduccin del ciclo del azufre. La reduccin desasimilatoriade compuestos de azufre es un paso esencial en la biologa del ciclo del azufre yse debe mayormente a la fosforilacin del sulfato a sulfuro (Heidelberg et al.,2004). En este contexto, las BSR producen una gran cantidad de sulfuro y laoxidacin les permite la generacin de energa por fototrpismo yquimiolitotrpismo.

Las relaciones ecolgicas de las BSR han sido poco estudiadas y seguramentean se desconocen la funcin de la mayor parte de ellas. Quiz los aspectos msestudiados de este grupo son su importancia ecolgica dentro del ciclo del azufrey dentro del ciclo de los metales pesados. Un resumen de los procesos que se

atribuyen a las BSR se presenta en la figura 3.

Entre las interacciones ms importantes de las BSR, en lo referente al presenteestudio, est la relacin simbitica con las bacterias metangenas, quefavorecera la metilacin del mercurio. Desulfovibrio desulfuricans LS y ND-132oxidan lactato de forma incompleta produciendo CO2, acetato y reduciendoequivalentemente al SO4

-2 (Jay et al., 2002). Por su parte, las bacteriasmetanognicas remueven H2 y acetato, permitiendo que Desulfovibriodesulfuricansutilice lactato incluso en ausencia de sulfatos (Pak y Bartha, 1998).No obstante, en otros casos, las BSR compiten con las metangenicas, por lafermentacin de productos como acetato e hidrgeno con concentraciones de

sulfato pequeas; y las BSR superan a las bacterias metangenicas (Santegoedset al., 1999; Hoeler et al., 2001; Orphan et al., 2001).

La diversidad de ambientes donde las BSR son detectadas se hace cada vez msgrande y las limitantes para el desarrollo de los miembros de este grupo parecenhaber sido sobreestimadas (Hoeler et al., 2001). No obstante, algunas limitantesimportantes podran ser el potencial redx, el oxgeno gaseoso, la temperatura y elpH (Stefanie et al., 1998). Estos factores limitan la disponibilidad de sulfato. A pH


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bajo, el cido actico es un fuerte inhibidor, pero a pH cido el sulfuro dehidrgeno se mantiene como un inhibidor de consideracin.

2.10. Efecto de pH, temperatura y oxigeno en el desarrol lo de lasbacterias sulfato reductoras

Las BSR crecen mejor bajo condiciones ligeramente alcalinas en un rango de pHde 7.0-7.8 con tolerancia en un rango de pH de 5.5-9.0 (Barton, 1995). Laalcalinizacin y acidificacin de las aguas en plantas industriales fue utilizadacomo mtodo de inhibicin de BSR. Sin embargo, la reduccin del sulfato fueobservada en ambientes altamente cidos (pH valores alrededor de 2.5 a 4.5) endrenajes de minas cidas y turberas de aguas cidas (Fortn et al., 1996; Garciaet al., 2001). Especies como Desulfovibrioy Desulfotomaculumfueron aisladas enaguas de minas cidas con valores de pH por debajo de 5.5 (Knoblauch et al.,1999; Fortn et al., 2000).

Por otro lado, la dependencia de la temperatura para la reduccin de sulfato ensedimentos es variable (MacGregor et al., 2001). En un estudio realizado en elrtico, se aislaron BSR psicrofilas en muestras de sedimentos (Mai y Barker, 1996;Knoblauch et al., 1999). Mientras que Teske en 1998, determino que las BSRmesofilicas crecen mucho mejor entre los 28 y 38 C (Teske et al., 1998), lastermofilicas aisladas de ambientes geotermales tienen una temperatura optima decrecimiento que esta entre 54 a 70C (Isaksen y Jorgensen, 1996; Sonne-Hansenet al., 1999; Larsen et al., 2001).

En general, las BSR han sido consideradas, en primera instancia, comoanaerobias estrictas. No obstante, hay pruebas suficientes para afirmar que al

menos gran parte de ellas seran anaerobias tolerantes. A diferencia de otrasbacterias anaerobias obligadas, las BSR son capaces de desarrollarse en unlimitado metabolismo del oxgeno. Barton y Tomei en 1995, sugieren que latolerancia podra deberse a la presencia de catalasas y superoxidasas. Ambasenzimas fueron encontradas en D. vulgaris por Hatchikian en 1977 (Barton yTomei, 1995; Sass et al., 2002).

La resistencia al oxgeno tambin podra deberse a que las BSR crean unambiente anaerobio a su alrededor gracias a la produccin de sulfuro dehidrogeno que atrapa a las molculas de oxigeno. Desulfovibrio vulgarisreduce eloxgeno a agua y la mayor parte de esta reduccin se produce en el periplasma.

La reduccin del oxgeno ocurre con mayor eficiencia que la del sulfato e inclusoque en muchas respiraciones aerbicas por lo que su papel defensivo resultaevidente (Okabe et al., 1999; Bade et al., 2000; Sigalevich y Cohen, 2000; Ito etal., 2002b).

Krekeler et al. (1998) han observado la capacidad de las BSR en asociacin acianobacterias de desarrollarse en presencia de oxigeno tanto en condicionesoxicas en el da, como en condiciones anoxicas por la noche, usando diferentes


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sustratos como hidrogeno, lactato y etanol, mostrando tambin que el sulfato noes metabolizado con el oxigeno.

En ecosistemas aerobios, bacterias heterotrficas producen una completamineralizacin de la materia orgnica a CO2. La degradacin anaerbica de lamateria orgnica es ms compleja, requiriendo la intervencin de diferentes

grupos de microorganismos (Maarel et al., 1996). Cada grupo microbiano funcionaen la cadena alimentara donde el metabolismo y producto final de un grupo essustrato de otro, existiendo cuatro diferentes grupos trficos de bacteriasinvolucrados en la descomposicin activa de la materia orgnica.

2.11. Act ividad sul fato reductora

En el mundo microbiano, las BSR son las nicas que tienen la habilidad de utilizarel sulfato inorgnico como un aceptor terminal de electrones. Este proceso derespiracin, ocurre bajo condiciones anaerobias, y genera compuestos de alta

energa para reacciones biosintticas implicadas en el desarrollo y mantenimientode estas bacterias. Las reacciones de reduccin del sulfato inorgnico a sulfuroorgnico o inorgnico y la subsiguiente oxidacin de sulfuro a sulfato, sonconocidas dentro el ciclo biolgico del azufre. Este ciclo consiste de una parteasimilatoria y una parte desasimilatoria (Heidelberg et al., 2004). Muchos denuestros conocimientos del proceso de reduccin de sulfato vienen de estudiosrealizados en especies de los gneros de Desulfovibrio, Desulfotomaculum,Desulfococcus, Desulfobacterium, Desulfobacter yDesulfobulbus.

El metabolismo de asimilacin y desasimilacin difiere marcadamente. En elmetabolismo asimilativo, solamente se reduce el compuesto SO4

-2, para satisfacer

las necesidades para el desarrollo. Los tomos reducidos terminan dentro delmaterial celular en forma de macromolculas (cisteina, cistina, y metionina). En elmetabolismo de desasimilacin, estos compuestos son utilizados como aceptoresde electrones produciendo energa y el producto reducido (H2S), se elimina alambiente.

Un mecanismo comn de disminucin de la toxicidad del sulfuro en el ambiente essu combinacin con hierro, que origina la formacin del sulfuro ferroso (FeS) elcual es un compuesto insoluble. El color negro de muchos ambientes naturalesdonde se efecta la reduccin de sulfatos se debe a la acumulacin de FeS. Lapresencia de BSR con alta actividad metablica es revelada por este color y por el

olor caracteristico del H2S.

La reduccin del sulfato es un proceso de degradacin terminal en ambientesanaerbicos. En ambientes con agua dulce, la concentracin de sulfatos esusualmente baja, en rangos de alrededor de 10 a 200 nmoles por litro (Li et al.,1999). En agua de mar, la concentracin de sulfato tiene un promedio de 28nmoles por litro.


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2.11.1. Activacin del sulfato y reduccin a bisulfi to

2.11.1.1. Formacin adenilsulfato

La reduccin de SO4-2

a sulfuro de hidrgeno, se produce por la reduccin de 8electrones, que se originan bioqumicamente a travs de varias etapas

intermedias. El in sulfato es bastante estable y no es utilizado sin antes seractivado. Su activacin se da por medio de una molcula de ATP. La enzima queinterviene en este paso es la ATP sulfurilasa que cataliza la fijacin del in sulfatoa un fosfato del ATP, llevando a la formacin de adenosina fosfosulfato (APS). Enla reduccin desasimilativa del sulfato, el in sulfato de APS se reducedirectamente a sulfito (SO3

-2), siendo ste el primer producto de la reduccin delsulfato (Ecuacin 1). Una vez que se forma el sulfito (SO3

-2), la reduccinsubsiguiente se efecta ms fcilmente, siendo el sulfuro (S -2) el segundoproducto de reduccin del sulfato (Ecuacin 2).

ATP + SO4-2+2H+ AMP + SO3

-2 + H2O (1)

SO3-2+6H+ S-2+ 3H2O (2)

Las Bacterias Sulfato Reductoras llevan a cabo el proceso de transporte deelectrones a travs de los citocromos. El citocromo de las BSR es de un nico tipollamado citocromo C3. Este citocromo, no se encuentra en organismos que utilizanotros aceptores de electrones. Otros portadores de electrones en esta cadenatransportadora incluyen ferredoxina y flavodoxina. En este transporte deelectrones, el hidrgeno proveniente directamente del ambiente o por medio deelectrones donados de compuestos orgnicos, est en estrecha asociacin con elcitocromo C3.

Debido al acomodamiento espacial de los componentes del transporte deelectrones en la membrana, cuando los tomos del H2 se oxidan, los protones (H+)

permanecen fuera de la membrana, en tanto los electrones son transferidos atravs de la membrana. De esta forma, se establece una fuerza motriz protnica lacual se utiliza para la sntesis de ATP. En el citoplasma los electrones se utilizanen la reduccin del APS (Heidelberg et al., 2004).

2.11.1.2. Reduccin del adenilsulfato a AMP y Bisulfito

La reduccin de APS a AMP y bisulfito es catalizada por la enzima APS reductasa.

Esta enzima tiene un flavn-adenin-dinucletido (FAD). El mecanismo de reduccinde APS ocurre por la formacin de un sulfito unido al FAD en la posicin 5-N deisoaloxacina (Ecuacin 3, 4 y 5).

E-FAD + electrn reducido E-FADH2+ Electrn oxidado (3)E-FADH2+ APS E-FADH2(SO3

-2) + AMP (4)E-FADH2 (SO3

-2) E-FAD + SO3-2 (5)


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2e- 2e- 2e-

3SO3-2 S3O6

-2 S2O3-2 + SO3

-2 S-2+ SO3-2 (6)

El bisulfito es reducido al producto final H2S por el sistema sulfito reductasa. Sin

embargo, dos posibles vas son propuestas. La primera propone que existe unareduccin directa de los seis electrones de sulfito a H2S y la segunda propone laformacin de dos intermediarios: el tritionato (S3O6

-2) y tiosulfato (S2O3-2)

(Ecuacin 6). La deteccin del tritionato y el tiosulfato fue realizada por Kobayashien 1969 en V. vulgaris encontrando dos fracciones, una que reduce el sulfito atritionato y tiosulfato y la segunda que reduce estos compuestos a sulfuro dehidrogeno. La enzima que interviene en este mecanismo es la bisulfito reductasa(BR) (Barton, 1995; Heidelberg, 2004).

2.11.1.3. Reduccin del tiosulfato

En la reduccin del tiosulfato a sulfuro esta involucrada la tiosulfato reductasa.Esta enzima fue purificada de Desulfovibrio vulgaris 8303, Desulfovibrio vulgarismiyazaki, Desulfovibrio gigas, Desulfotomaculum nigrificans. La tiosulfatoreductasa del Desulfotomaculum nigrificanscontiene FAD como coenzima. Estaenzima reduce el tiosulfato a sulfuro y sulfito y en todos los casos utilizametilviolagen como un donador de electrones (Ecuacin 7). Los compuestos queinhiben esta enzima contiene el grupo sulfidrilo, por otra parte los iones frricosestimulan a la actividad de esta enzima en Desulfovibrio gigas (Barton, 1995;Heidelberg, 2004).

2e-

S-SO3-2 S-2 + SO3

-2 (7)

2.11.1.4. Sulfuro de hidrogeno

El principal gas voltil del azufre es el cido sulfhdrico. Esta sustancia se formafundamentalmente por la reduccin bacteriana de sulfato. La forma en que elsulfuro esta presente en un ambiente depende del pH, debido al siguienteequilibrio: A pH bsico, la forma dominante es el sulfuro (S-2), a pH neutropredomina el sulfidrilo (HS-) y a pH cido, la especie ms abundante es el sulfuro

de hidrogeno (H2S). Tanto el sulfidrilo (HS-

) como el sulfuro (S-2

) son muyhidrosolubles, pero el H2S no lo es, aunque se volatiliza fcilmente. Como el HS-

es una sustancia toxica para muchos organismos, la formacin de HS- porreduccin de sulfatos es potencialmente perjudicial.


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2.12. Deteccin de microorganimos por mtodos moleculares

El avance de tcnicas moleculares ha brindado nuevas y mejores alternativas parala deteccin e identificacin de microorganismos de muestras ambientales (Kuskeet al., 1997; Hurt et al., 2001; Joulian et al., 2001). A partir de ello, se ha generadogran inters en descubrir la diversidad microbiana de ambientes poco explorados y

reevaluarla en otros ms conocidos. El inters en este tema esta basado en laimportancia evolutiva, ecolgica y econmica de los microorganismos que graciasa las nuevas tcnicas moleculares empieza a ser analizada. Observaciones demuchos trabajos, muestran que la mayora de las bacterias de los ambientesnaturales no han podido ser cultivadas mediante las tcnicas tradicionales yconsiguientemente existira todo un universo microbiano por descubrir ycomprender (Borneman y Triplett 1997; Rooney-Varga et al., 1997).

La aplicacin de mtodos moleculares para determinar la distribucin de lasbacterias en el ambiente tiene la ventaja de proporcionar informacin directa sobrela estructura de la comunidad. La identificacin errnea mediante estos mtodos

es usualmente causada por falta de secuencias de parientes cercanos en la basede datos y es mucho menor que la ocasionada por mtodos tradicionales deidentificacin. Segn Martn-Laurent (2001), los mtodos moleculares permitendiferenciar los suelos de acuerdo a sus comunidades bacterianas y el monitoreode diferencias en la comunidad microbiana en respuesta al estrs (Martn-Laurentet al., 2001). De acuerdo a los mismos autores, el uso de mtodos estndar deextraccin de DNA y PCR podra proporcionar un mayor y ms completoentendimiento de la composicin y diversidad de las comunidades microbianasdistribuidas en el medio ambiente.

Adicionalmente, los estudios moleculares, especialmente aquellos basados en

mtodos filogenticos, ofrecen la posibilidad de investigar las dinmicas depoblaciones bacterianas de grupos filogenticos especficos, que frecuentementecomparten caractersticas fisiolgicas comunes (Ito et al., 2002; Cho y Tiedje,2002).

2.13. Identificacin de las bacterias sul fato reductoras por tcnicasmoleculares

La identificacin de las BSR sobre la base de sondas y cebadores de DNA o RNAhan sido usada en diferentes trabajos, ya sea mediante la amplificacin del gen

que codifica la enzima sulfito reductasa desasimilatoria (dsr AB) o el gen DNAr16S (Steuber et al., 1995; Wagner et al., 1998; Minz et al., 1999; Larsen et al.,2001).


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2.13.1. La sulf ito reductasa disimilator ia

La sulfito reductasa disimilatoria (DSR) muestra una estructura terciariacompuesta de dos subunidades proteicas llamadas dsrA y dsrB, organizadas endos grupos, formando un tetrmero con un siroheme en el dominio dsrA y dosgrupos prostticos Fe-S en ambos dominios (Steuber et al.,1995).

Larsen y colaboradores (2001) observaron que el grupo de genes enThermodesulforhabdus norvegica se ordenan en seis marcos de lectura abierta(ORCs): dsrD-dsrA-dsrB-dsrN-dsrC-fdx. La mayor parte de la protenaensamblada corresponde a las subunidades dsrA y dsrB, con pesos de 49kD y43kD respectivamente, mientras que las subunidades dsrD, dsrC y dsrN sonmucho ms livianas (aproximadamente entre 13kD) y intervienen en la reduccinde sulfito a sulfuro (Larsen et al., 2001).

Se estima que el origen de la enzima DSR data de hace aproximadamente 2800millones de aos y que la divergencia entre dominios ocurri aproximadamente

hace 3100 millones de aos. La funcin metablica de la DSR en el ciclo global deazufre es muy importante y se conoce la secuencia completa de las subunidades

A y B de al menos un gnero de cada divisin microbiana donde esta presente lareduccin del sulfato (Minz et al., 1999), por lo que fue posible realizar anlisiscomparativos del ordenamiento filogentico de las BSR, basados en secuenciasde RNAr 16S y de la DSR (Joulian et al., 2001). Muchos trabajos muestran queexisten suficientes evidencias en el anlisis filogentico comparativo de la DSR yel RNAr 16S para suponer que la habilidad de reducir sulfato fue transmitidamediante un proceso de transferencia horizontal antes o durante la divergencia delos dominios Arquea y Bacteria y posteriormente entre grupos bacterianos grampositivos y BSR termofilicas (Wagner et al., 1995; Cottrell y Cary, 1999; Prez-

Jimnez et al., 2001).

2.13.2. El RNAr 16S como un marcador evolut ivo

Algunas macromolculas celulares sirven como marcadores evolutivos. Ladistancia evolutiva entre dos especies se mide por diferencias en la secuencia denucletidos o de aminocidos de macromolculas homologas que se encuentranen ellas. Las diferencias en la secuencia de una molcula en particular esproporcional al nmero de mutaciones estables fijadas en el DNA de losorganismos que divergieron a partir de un ancestro comn.

Sin embargo, para determinar interrelaciones evolutivas verdaderas esindispensable seleccionar la molcula correcta para estudios de composicin. Estoes importante por diferentes razones. Primero, la molcula debe seruniversalmente distribuida entre el grupo seleccionado para el estudio. Segundo,debe ser funcionalmente homloga en cada organismo, ya que no se comparanlas secuencias de aminocidos o las de nucletidos de cidos nucleicos defuncin diferente, Tercero, debe tener la capacidad de alinear apropiadamente las


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dos molculas a fin de identificar regiones de homologa y heterogeneidadfinalmente, la secuencia de la molcula escogida debe cambiar a una velocidadconmensurada con la distancia evolutiva a la que se mide. Cuanto ms amplia seala distancia filogentica, ms lenta debe ser la velocidad a la cual cambie lasecuencia.

Debido a la antigedad del proceso de la sntesis de protenas, los RNAribosmicos son excelentes molculas para distinguir las interacciones evolutivasentre las bacterias. Los RNA ribosmicos (RNAr) son molculas antiguas,funcionalmente constantes, distribuidas en forma universal y moderadamente bienconservadas a travs de amplias distancias filogenticas (Weisburg et al., 1991;Head et al., 1998). Son tambin fcilmente purificadas a partir de los organismos,an sin el uso de procedimientos de clonacin (Weinbauer, 2002). Existen tresmolculas de RNAr en los procariotas, 5S, 16S y 23S. Los RNA de mayor tamao16S y 23S (aproximadamente 1500 y 3000 nucletidos respectivamente)contienen varias secuencias que estn muy bien conservadas, as como regionesvariables, las cuales sirven como excelentes marcadores filogenticos.

El RNA ribosomal (RNAr) est presente en los tres dominios filognicos y de ahque se mencione que es universal. Debido a que el RNAr 16S est en todas entodas las bacterias y archeas (Voordouw et al., 1996; Koizumi et al., 2003), estsecuencia ha sido estudiada como marcador molecular (Figura 6)(Devereux et al.,1990; Macrae, 2000) en estudios filogenticos de procariotes y hoy en da elRNAr 16S es ampliamente utilizado para establecer relaciones filogenticas. Lasecuencia del gen de RNAr 16S es muy conservada, pero lo suficientementegrande y variable como para que las diferencias entre secuencias permitanconstruir la filogenia de los organismos (Ravenschlag et al., 2001; Loy et al.,2002).

Generalmente, los trabajos con RNAr 16S apoyan trabajos previos basados en elcultivo de organismos, a partir de los cuales se crean bases de datos con las quese establecen las relaciones filogenticas. De hecho, el anlisis basado en RNAres posible gracias a una creciente base de datos Ribosomal Datadase Project(RPD) y otras como la Oligonucleotide Probe Database (OPD) (Loy et al., 2002).Hoy en da, se cuenta con un gran nmero de secuencias disponibles, queadems estn respaldadas por bacterias cultivadas que estn bien caracterizadas.

Sin embargo, despus de ms de una dcada de su aplicacin han surgidocrticas en su utilizacin. An as, la secuencia del RNAr 16S sigue siendo una de

las mas utilizada para la identificacin y caracterizacin filogentica de losmicroorganismos. Es as, que estudios basados en esta molcula o su genpermitieron detectar un gran nmero de microorganismos no cultivados. Ms an,incluso sirvi para establecer su papel ecolgico (Rooney-Varga et al., 1997; Kselet al., 1999).


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Figura 6. A) Mapa de la estructura secundaria del 16S RNAr. B) Modelo de laimagen tridimensional del 16S RNAr en bacterias.

3

B

5


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La clasificacin natural de las SRB basada principalmente en la secuenciacincomparativa del RNAr 16S ha sido establecida, y ha servido de fundamento paravarios estudios (Edgcomb et al., 1999). Muchas de las caractersticas msinteresantes de las SRB han sido descubiertas a travs de estudios filogenticos,como la reduccin de sulfato, metilacin del mercurio y uranio o el papel patgeno

de las BSR (Devereux et al., 1996; King et al., 2000; Zinkevich y Beech, 2000;Chang et al., 2001a), descubrindose tambin la estructura comunitaria y laactividad de las BSR en diferentes ambientes (Daly et al., 2000; Ravenschlag etal., 2000).

Actualmente, las BSR son estudiadas dentro de la ecologa microbiana y labiotecnologa industrial (Santegoeds et al., 1999; Scheid et al., 2001). No obstante,el desarrollo de estos dos campos se ve restringido por la falta de un sistema deidentificacin confiable. La identificacin de bacterias aisladas de muestrasnaturales por mtodos convencionales de comparacin fenotpica por lo generales complicada.

La utilizacin de las tcnicas moleculares en microbiologa ambiental esrelativamente reciente (Leff et al., 1995; Macrae, 2000; Tonolla et al., 2000; Cho yTiedje, 2002). Un estudio en suelos de la Amazona, encontr que todas lassecuencias de RNAr 16S encontradas eran nuevas y un 19% de ellas estndistantes de las secuencias conocidas, las cuales que podran formar partenuevos reinos (Borneman y Triplett, 1997). Tales observaciones permiten suponerla existencia de un alto grado de diversidad microbiana an por descubrir, enparticular en regiones como la Amazona Boliviana, donde hasta el momento no sehan realizado estudios.


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3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo General

Caracterizar las lagunas de la cuenca del Ro Beni (regin de

Rurrenabaque) en cuanto a distribucin de los subgrupos de BacteriasSulfato Reductoras, produccin de metilmercurio, distribucin de mercurio,metilmercurio y materia orgnica en perfiles sedimentarios.

3.2. Objetivos Especficos

Caracterizar la diversidad de los subgrupos de Bacterias SulfatoReductoras a lo largo del perfil sedimentario de las lagunas estudiadas enbase a mtodos moleculares.

Determinar la variacin estacional y espacial de los subgrupos de BacteriasSulfato Reductoras a lo largo de los estratos sedimentarios.

Caracterizar los perfiles sedimentarios en funcin a los factoresfisicoqumicos (pH, Eh, densidad).

Determinar la produccin de metilmercurio en la parte central de laslagunas de la zona de estudio.

Determinar la distribucin de mercurio, metilmercurio y calidad de materiaorgnica en las lagunas de estudio.


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4. MATERIALES Y METODOS

4.1. rea de estudio

Para el estudio se han considerado 7 lagunas; 5 lagunas de origen mendrico

(lagunas Oxbow en forma de frjol) y dos lagunas de tierra firme de origenprobablemente tectnico, las cuales fueron seleccionadas por sus caractersticasgeofsicas, ecolgicas y qumicas (Figura 7).Las lagunas meandricas (Pinky, Salina, La Granja, Ri Viejo y Chutiwara) tienenedades diferentes. La laguna ms joven tiene 6 aos y la ms vieja mucho msde 40 aos. La interpretacin de los datos satelitales han permitido establecer lasecuencia de edad de las 5 lagunas: Pinky


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Tabla 1. Caractersticas del sistema de las lagunas estudiadas en la regin deRurrenabaque

apoca hmeda, MarzobEpoca seca, SeptiembrecNo Determinado, NDdParticulas en suspensin, SPMeConcentracin de carbono, DOC

Lagunas Edad Tipo deaguas

SO4-2mg/L

SPMdmg/L

DOCemg/L

Color sedime

MeandrosPinkyb 6 aos blancas 3.1-24.9 130 1.8-5.3 caf

Salinasab 12 aos blancas 2.9-26.7 40-80 2.3-8.0 cafLa Granjaab > 40 aos blancas 2.5-26.6 35-50 3.8-25.7 cafRo Viejoab >> 40 aos blancas 1.8-11.7 6-10 5.6-11.1 pardoChitiwarab >> 40 aos negras 0.04-0.07 8 2.2-11.0 gris

Tierra firmeSan Juanab NDc negras 0.00-0.06 2-5 3.4-16.3 negro

Moab NDc blancas 1.2-10.9 15-25 2.3-10.1 caf


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Figura 7. Mapa de la regin de estudio y puntos de muestreo de las lagunas deinundacin con relacin a la poblacin de Rurrenabaque y al ro Beni.

N


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Figura 8. Centro y zona litoral de las lagunas Pinky, La Granja y Ro Viejo.

Estas lagunas presentan diferentes grados de eutrofizacin por lacolonizacin de macrfitas situadas en sus contornos.

En las lagunas Salina y Pinky se observa poca presencia de macrfitas ensus alrededores. La laguna Ro Viejo presenta mayor cantidad de macrfitas ensu superficie (Figura 8), seguida de las lagunas Chitiwara y La Granja.

Las lagunas San Juan y Moa presentaron una distribucin diferente de lasmacrfitas, ocupando una gran extencin en los bordes.

4.2. Colecta de las muestras

Las muestras se obtuvieron de los sedimentos de la parte central de laslagunas en la zona de muestreo para el anlisis geoqumico y microbiologco. Lacolecta de los sedimentos se realiz en dos diferentes pocas del ao 2003. En elmes Marzo (poca hmeda); los sitios de muestreo se colectaron de cuatrolagunas: Salina, La Granja, Ro Viejo y San Juan y en el mes de Septiembre(poca seca) se muestrearon siete lagunas: Pinky, Salina, La Granja, Ro Viejo,Chitiwara, Moa y San Juan (Figura 7).

Cada punto de muestreo fue tomado manualmente con un saca testigo

equipado de (WaterMark) tubos de policarbonato de 7.5 cm. de dimetro por 30cm. de alto a lo largo de 10 cm. de profundidad. Los estratos de los sedimentosfueron separados cada medio centmetro.


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4.3. Medicin de pH y potencial redx

Los perfiles de potencial redx (Eh) y pH fueron determinados en el mismolugar de muestreo en un gradiente vertical a intervalos de 0.5 cm. hasta unaprofundidad de 10 cm. Inicialmente se realizo las mediciones del perfil de Eh decada cilindro mediante microsondas de platino con una referencia de (Ag/AgCl2) y

un Eh-metro Consort calibrado con una solucin patrn de +220 mV.

Luego los cilindros fueron colocados en una cmara porttil y fueroncortados manualmente. Cada submuestra de 0.5 cm. de espesor fue colectada entubos de plstico estriles y posteriormente se realizo la medicin de pH con unpH-metro Consort calibrado con soluciones estandar (pH 4 y pH 7). Lassubmuestras fueron saturadas con nitrgeno y fueron inmediatamente refrigeradasa -15 C hasta su posterior anlisis en el laboratorio.

4.4. Medicin de mercurio total y metilmercurio

El anlisis del mercurio total (Hgt) en las muestras de la poca hmeda serealizo a partir de un peso seco de 0.1-0.2 g de sedimento, el cual fue digerido conuna mezcla de cido ntrico concentrado y cido clorhdrico 6 N. El anlisis de Hgtotal fue realizado por espectrofotmetro fluorescente de vapor atmico (CVAFS)usando una modificacin del mtodo de Bloom y Fitzgerald (1988) (Roulet et al.,1998).

La medicin de metilmercurio en los sedimentos se realizo a partir de 500mg de sedimentos, los cuales fueron mezclados con una solucin de CuSO4 al25% en HCl 6 N. La solucin cida de MeHgCl fue removida con tres lavados

de 2 mL de tolueno. Los extractos fueron evaporizados a un volumen final de 0.1 a0.5 mL y 50 uL y los extractos concentrados fueron inyectados en una columna decromatografa con una mezcla de la fase cida lipidica libre (FFAP) al 10%(peso/peso) en una malla de 80-100 Supelco Chromosorb W-AW.

El Metilmercurio fue eluido a 140 C y transportado con gas Argn (60mlmin-1) en la columna de cromatografia. Posteriormente, el Metilmercurio fuedescompuesto en Hg0 y colocado en un tubo de cuarzo a 500 C y detectadofinalmente en un espectrofotmetro atmico fluorescente. Este mtodo fuedesarrollado por Gage (1961). Este mtodo tiene una eficiencia de reconocer alMeHg en un 95.5% (Roulet et al., 2000).

Las mediciones se realizaron en el laboratorio Chaire de Recherche enEnvironnement HQ/CRSNG/UQAM en Montral, Canada.


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4.5. Analis is de Me203Hg

La Interfase agua-sedimento al fondo de cada laguna esta constituido de unsedimento fino en suspensin entre el sedimento y la columna de agua. Estematerial fue recuperado con una jeringa de la superficie de los testigos colectadosy fue incubada, bajo condiciones anaerobias, con cloruro de mercurio

radiactivamente marcado (203HgCl2). La incubacin fue interrumpida con la adicinde HCl (4 mol/L, 1 ml) y posterior adicin de NaBr (3 mol/L, 4 ml) en 11% deH2SO4 y CuSO4 (0.5 mol/L, 1 ml). Luego, la suspensin fue mezclada ycentrifugada 8000 rpm por 1 min. La solucin se conserv a -18 C para laposterior extraccin del Me203Hg en el laboratorio de trazadores, Instituto deBiofsica (Universidad Federal de Ro de Janeiro) por el Dr. J. Guimares. Losresultados son expresados como el porcentaje total del 203Hg que fue convertidoen Me203Hg.

4.6. Medicin del carbono y n itrgeno organico

Se realizo la acidificacin de las muestras de sedimentos con cidoclorhdrico (HCl) 2 N, para el anlisis del carbono organico (C) y el nitrgenoorganico (N) usando el detector elemental de Carlo-Erba (Roulet et al., 2000).

4.7. Extraccin de DNA de sedimentos

500 mg de sedimento fueron mezclados con 810 uL de buffer de lisis (100mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM Na2EDTA (pH 8.0), 100 mM de fosfato de sodio (pH 8.0),1,5 M de NaCl y 1% de bromuro de hexadecil-trimetil aminio (CTAB) y 6 uL de

Bacterias Sulfato Reductoras

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