2.0 PRINCIPIO ANALITICO:2.1. Los antgenos son estructuras de la membrana eritrocitaria y su funcin posiblemente sea exclusivamente relacionada con procesos fisiolgicos. Adems son inmunognicos, pues complican grandemente la prctica de la transfusin y son el fundamento de la enfermedad hemoltica transplacentara del recin nacido. 2.2. Tambin, debido a que siguen las leyes mendelianas de la herencia, se han mostrado de gran utilidad en el campo de la gentica humana, antropologa y medicina forense. 2.3. En la determinacin habitual del tipo sanguneo de una persona, las pruebas se hace para el eritrocito y para el tipo de suero. Esta ltima prueba se considera que es una confirmacin del tipo celular o grupo inverso.2.4. Los antgenos de superficie celulares ABO se demuestran in vitro por la glutinacin de los eritrocitos con uno o ms de los tres principales sueros tipificados: anti-A, anti-B, y anti-AB. Estos antgenos se encuentran tambin en estado soluble en la saliva y otras secreciones como glucoprotenas y en el plasma como glucol-pidos. 2.5. En la membrna del eritrocito, un esfingolpido vinculado a cuatro azcares, el ltimo de los cuales es la D-galactosa, representa un substrato durante la eritropoyesis para la accin de un producto-gen H, y que bajo la accin de la enzima fucosiltransferasa, la fucosa se aade al resto terminal galactosil en la unin -(1-2) formando el antgeno H, un material que reacciona enrgicamente con el anti-H. Que es el nico antgeno del grupo sanguneo tipo O. 2.6. Los individuos con genotipo A, producen una enzima adicional, una galactosanil transferasa que aade en la posicin 3 un -N-acetil-D-galactosamina al resto terminal galactosil de un material H que se produce previamente. 2.7. Aquellos individuos con gen B producen otra enzima, una galactosil-transferasa. Esta enzima aade en la formacin del antgeno B, tambien en la posicin 3, un resto -D-galactosil al resto terminal galactosil del material H. De este modo el material H es un substrato para las enzimas que son elaboradas por los genes A y B que convierten casi todo el material H en antgenos A y B, originando los grupos sanguneos A y B.2.8. El factor Rho (D) aglutingeno del Rh , es un antgeno de frecuencia elevada y altamente antignico, su anticuerpo correspondiente es el ms activo a temperatura fisiolgica y suele atravesar normalmente la placenta. Por lo que, resulta fcilmente susceptible los antgenos Rho fetales a los anticuerpos maternos. 2.9. El antgeno Rh es determinado por un complejo en dos locus en los genes; uno corresponde al antgeno D y el otro al antgeno C c (pequea) y E e (pequea). La mayora de las personas Rh positivo, tienen ambos genes D y CE/ce. Los individuos Rh negativos slo tiene el gen para CE/ce.1.0. REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA3.1. Sangre venosa o arterial sin anticoagulante (tubo tapn rojo), en cantidad de 5 a 7 ml. Para obtener suero. 3.2. Tambin se puede realizar en muestras anticoaguladas, pero se limita a slo realizar el grupo directo.3.3. Las muestras debern estar perfectamente bien identificadas.3.4. En el caso de muestras peditricas cuando la muestra es poca o anticoagulada se realizar el grupo directo.3.5. Criterios para Muestras Inaceptables: Muestras no identificadas, muestras insuficientes.4.0. EQUIPO E INSTRUMENTOS4.1. Tubos de ensaye de 12x75 4.2. Pipetas Pasteur.4.3. Centrfuga SERO-FUGE.4.4. Lavador de clulas DAC II de Baxter.4.5. Bao Mara a 37C.5.0. REACTIVOS5.1. Reactivo Anti-A (monoclonal) 10 ml. 5.2. Reactivo Anti-B (monoclonal) 10 ml. 5.3. Reactivo Anti-AB (monoclonal) 10 ml. 5.4. Reactivo Anti-D (monoclonal) 10 ml. 5.5. Reactivo Rh Control (humano y bovino) 10 ml. 5.6. Reactivo con Clulas tipo A1 10 ml. Preparacin comercial al 3-5%. Confirmacin en suero de grupo ABO5.7. Reactivo con Clulas tipo A2 10 ml. Preparacin comercial al 3-5%. Confirmacin en suero de grupo ABO5.8. Reactivo con Clulas tipo B 10 ml. Preparacin comercial al 3-5%. Confirmacin en suero de grupo ABO5.9. Reactivo con Clulas tipo O 10 ml. Preparacin comercial al 3-5%. Confirmacin en suero de grupo ABOEn caso de realizar la determinacin confirmatoria de Rho negativo (prueba Du)5.10. Suero de Antiglobulina humana (poliespecfico o monoespecfico) suero de Coombs 10 ml. 5.11. Eritrocitos sensibilizados IgG (Clulas control Coombs) 5.12. Solucin salina isotnica (0.9%) 6.0. CALIBRADORES7.0.CONTROL DE CALIDAD7.1. Control de Calidad Interno 7.2. Evaluacin Externa de la Calidad.7.2.1.Procedimiento. Refirase al procedimiento Evaluacin Externa de la Calidad del CAP.7.2.2 Frecuencia : Cuatro veces al ao.8.0.PROCEDIMIENTO8.1. Centrifugar la sangre total para separar el suero y paquete globular. 8.1. Preparar una suspensin de eritrocitos del paciente al 2-5% con solucin salina isotnica. 8.2. Para realizar el grupo sanguneo directo e inverso, se utilizan 10 tubos y se marcarn de la siguiente forma: Anti-A, Anti-AB, Anti-B, Control, Clulas A1, Clulas A2, Clulas B, Clulas O, Anti-D , y Control Rho. 8.3. Colocar 1 gota de cada reactivo al tubo correspondiente, excepto tubo control.8.4. Se agrega 1 gota de la suspensin de eritrocitos del paciente a los tubos: Anti-A, Anti-AB, Anti-B, Control, Anti-D y Control Rho. Todos corresponden a la determinacin del grupo sanguneo directo.8.5. Se agrega 2 gotas de suero del paciente a cada tubo marcado como: Clulas A1, Clulas A2, Clulas B ,Clulas O y el tubo marcado como Control.8.6. Todos los tubos se centrifugan a 3400 r.p.m. durante 30 seg. (centrfuga SERO-FUGE). 8.7. Examinar los tubos a travs de movimientos finos con la mano hasta despegar el botn eritrocitario, y observar macroscpicamente la presencia de aglutinacin ( reportandolo en cruces: +, 2+, 3+, 4+segn su intensidad ) o la no aglutinacin con el signo (-). 8.8. Reporte de Resultados de la siguiente forma:IDENTIFICACION DEL ANTIANTIANTIAUTOG.R.G.R.G.R.G.R.ANTICONTROLRESULTADO

PACIENTEAABBOA1A2BORh(D)Rh(D)

4+4+----4+-4+-A Positivo

4+4+4+-----4+-AB Positivo

-4+4+-4+4+--4+-B Positivo

----4+4+4+-4+-O Positivo

4+4+----4+---A Negativo

4+4+4+-------AB Negativo

-4+4+-4+4+----B Negativo

----4+4+4+---O Negativo

8.9. En caso de que Anti-Rh(D) sea negativo, se realiza la verificacin (prueba Du) y se realiza por duplicado.8.10.Se incuban todos los tubos Anti-Rh(D) y Control Rh(D) a 37C en bao Mara por 15 minutos.8.11. Posteriormente, los tubos se centrifugan a 3400 r.p.m. durante 30 seg. (SERO-FUGE).8.12.Nuevamente se examinan los tubos a travs de movimientos finos con la mano hasta despegar el botn eritrocitario y observar macroscpicamente la presencia de aglutinacin ( reportandolo en cruces: +, 2+, 3+, 4+ segn su intensidad ) o la no aglutinacin con el signo (-).8.13.Se realiza un lavado a tres veces a los tubos a travs del lavador de clulas DAC II de Baxter. En forma manual se puede realizar estos lavados, y consiste en agregar sol. Salina a los tubos y resuspender los eritrocitos, centrifugar a 3400 r.p.m. por 60 seg . y decantar el sobrenadante, estos en tres ocasiones.8.14.Agregar 2 gotas de suero de antiglobulina humana (suero de Coombs) a cada tubo y centrifugar nuevamente 8.15.Se examinan los tubos a travs de movimientos finos con la mano hasta despegar el botn eritrocitario y observar macroscpicamente la presencia de aglutinacin ( reportandolo en cruces: +, 2+, 3+, 4+ segn su intensidad ) o la no aglutinacin con el signo (-). Siendo verdaderamente negativa.8.16.En aquellos casos negativos ( no aglutinacin ), se tiene que verificar la actividad del suero al agregar 1 gota de clulas control Coombs al tubo, y centrifugar a 3400 r.p.m. durante 30 seg. Finalmente, se examina la presencia de aglutinacin, dando validez a la prueba. En caso contrario se invalida la prueba Si hasta ste punto la prueba sigue siendo negativa (no aglutinacin), entonces el Rh es negativo. 9.0.REPORTE DE RESULTADOSSistema ABO Grupo Directo (eritrocitos del paciente) ResultadoAnti-A Anti-AB Anti-B Autotestigo 4+ 4+ - - Grupo A 4+ 4+ 4+ - Grupo AB - 4+ 4+ - Grupo B - - - - Grupo O Grupo Inverso (suero del paciente) ResultadoClulas A1 Clulas A2 Clulas B Clulas O - - 4+ - Grupo A - - - - Grupo AB 4+ 4+ - - Grupo B 4+ 4+ 4+ - Grupo OSistema Rh(D) Anti-Rh Control Rh Resultado 4+ - Positivo - - NegativoPrueba Du (verificacin del Rh negativo) Por duplicado Anti- Rh Control Rh Anti-Rh Control Rh ResultadoCentrifugacin rpida: - - - - Incubacin a 37C : - - - - * Suero de Coombs : - - - - * Clulas control: + + + + Negativo * NOTA: En caso de obtener un resultado positivo en cualquiera de estos pasos, se detiene la prueba y se reporta como : Rh positivo. Cualquier resultado que tenga el autotestigo positivo, no debe reportarse hasta que se hagan los procedimientos adicionales necesarios para identificar correctamente el grupo sanguneo. 10.0. SEGURIDAD11.0. OTROS 11.1. DISCREPANCIAS EN EL GRUPO ABO DIRECTO E INVERSO Las principales causas de discrepancias entre el grupo directo e inverso, son principalmente error en la tcnica o por algunas enfermedades (leucemias) que puede contribuir a esto.Otra causa posible es una dbil o ausente reaccin del antgeno en los reactivos, o dbil o ausente reaccin de los anticuerpos. O por una inesplicable reaccin del antgeno o del anticuerpo. 11.2. SOLUCION DE DISCREPANCIAS ENTRE GRUPOS SANGUINEOS. Las discrepancias deben solucionarse antes de poder dar un resultado. Si se trata de una unidad de sangre, no debe usarse hasta que se haya resuelto la discrepancia, si se trata de un paciente puede ser necesario utilizar paquete globular de grupo O del Rh apropiado mientras se resuelve el problema. Generalmente las discrepancias se deben a errores tcnicos, propiedades intrnsecas de los eritrocitos, o propiedades intrnsecas del suero. 11.3. Errores Tcnicos: 1) Identificacin incorrecta de la muestra, registro incorrecto. 2) No se aadio a los tubos suero del paciente o antisueros, puede causar falsas negativas. 3) Contaminacin de los suero hemoclasificadores .4) Relacin eritrocito/suero inadecuada ( suspensin menor del 2% mayor del 5%, suero del paciente insuficiente o en exceso), puede originar falsos positivos o negativos . 5) Sobrecentrifugacin.6) Calentamiento de la reaccin a ms de la temperatura ambiente. Puede dar falsos negativos. 7) Vidriera sucia, puede causar falsos negativos. 11.4. Problemas en el eritrocito:1) Roleuaux propiciado por hiperprotenemia o hiperfibrinogenemia, principalmente cuando los eritrocitos estn suspendidos en el propio suero. Gelatina de Wharton en muestras de recin nacido tomadas del cordn umbilical. 2) Transfusin reciente, o el paciente es transplantado de mdula sea y el donador no era del mismo grupo ABO. 3) Antgenos A o B expresados dbilmente, ya sea por genotipo, o bien por leucemia. 5) Actividad B-like adquirida habitualmente por accin de gram(-). 6) Altas concentraciones de substancia A o B solubles, que inhiben al anticuerpo hemoclasificador antes de interactuar con el eritrocito. Se presenta cuando la suspensin se hace con el propio suero. 11.5 Problemas en el suero: 1) Hiperprotenemia o hiperfibrinogenemia que favorece roleaux o poliaglutinacin. 2) El paciente recibi Dextrn, o material de contraste, o algunos frmacos. 3) Anticuerpos irregulares que pueden reaccionar con antgenos en las clulas hemoclasificadoras. Los ms frecuentes son: auto anti-I, anti-A1 en personas A2 o A2B. Con menor frecuencia anti-H, ya que las clulas A1 y B tienen relativamente poca cantidad de substancia H. 4) Recin nacidos: habitualmente no se hace grupo inverso ya que no han formado anticuerpos. En ocasiones pueden tener anticuerpos IgG maternos. 5) En los ancianos hay disminucin en los niveles de anticuerpos. 6) Anticuerpos contra substancias contenidas en reactivos, medios de suspensin o conservadores. 7) Niveles bajos de anticuerpos por inmunodeficiencias. 8) Hemodilucin por plasmafresis o transfusin de perfluorocarbono. 9) Transplante de mdula sea con danodor de diferente grupo ABO. 11.6 Solucin de Discrepancias entre grupos directo e inverso. Procedimientos preliminares: 1) Repita la prueba siguiendo estrictamente la tcnica descrita, usando reactivos que hayan sido validados por el control de calidad diario, y poniendo cuidado en la observacin e interpretacin de los resultados. 2) Tomar nueva muestra, con esto se resuelve el problema de identificacin o contaminacin de la muestra.11.7 Grupos Dbiles: 1) Incube 30 min. a temperatura ambiente y a 4C, centrifugue y observe aglutinacin. Si esto no resuelve la discrepancia, entonces : a) Hacer una adsorcin con los eritrocitos del paciente y sueros hemoclasificadores, despus hacer una elucin y probar con clulas A y B. b) Hacer grupo en saliva. 11.8. Eritrocitos con Coombs directo positivo: Hacer una elucin suave (30 minutos a 45C con agitacin). Verificar que ha habido despegamiento con un nuevo Coombs. Si no fue suficiente incubar durante 60 min. 12.0. BIBLIOGRAFAFundamentals of immunohematology Theory and technique. Mary Louise Turgeon, Ed. Lea Febiger, Philadelphia, London. 1989. Pag: 95-125, 126-134.Hemattology . Williams . 5 Edicin, Ed. International . Pag: 1608-1610.Encuentro de Inmunohematologa y Medicina Transfusional. Junio 12-14, 1998, Houston, Tex. USA. Pag:22.13.0. ANEXOS y/o APNDICES13.1.Los eritrocitos de la mayoria de los individuos normales, son de tipo A, B, AB O. Excepto en alguno individuos raros donde el fenotipo es Oh (Bombay) que carecen del sistema ABO.13.2.La sustancia H precursor del grupo A y B, se encuentra en todos los eritrocitos, Sin embargo, los individuos del grupo A y grupo B, tienen menor cantidad de sustancia H que los individuos del grupo O.13.3. Estos antgenos son expresados en mas tipos celulares, la compatibilidad ABO es de consideracin importante en el transplante de rganos slidos.