Benigno Coello - Comunicación oral breve...

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Índice

Aplicación de la espectroscopia Raman al diagnóstico de la caries dental Coello B., López-Álvarez M., Rodríguez-Domínguez M., Serra J. y González P. 5

Geles de fibrina y células madre mesenquimales para regeneración de cartílago Gato-Calvo L., Lourés-Fraga E., Núñez-Amboage J.L., Blanco-García F.J. y Burguera E. 6

Plataformas magnéticas derivadas de nanotubos de carbono con aplicaciones biomédicas y biotecnológicas González-Domínguez E., Comesaña-Hermo M., Pérez-Lorenzo M. y Correa-Duarte M. 7

Scaffolds marinos basados en alginato y apatita para regeneración de lesiones osteocondrales López-Senra E., López-Álvarez M., Rodríguez-Valencia C., Serra J. y González P. 8

Estudio de los efectos del tratamiento con fármacos de acción lenta en la artrosis en el conejo como modelo experimental Permuy M., Guede D., López-Peña M., Muñoz F., Caeiro J.R. y González-Cantalapiedra A. 9

Diferenciación condrogénica de células madre mesenquimales derivadas de pacientes artrósicos en biomateriales de ácido poli(L)láctico puro o recubierto con quitosano Álvarez-Martínez M.C., Silva-Magalhães J.C y Blanco-García F.J. 10

Evaluación de la capacidad osteogénica y antibacteriana de recubrimientos de HA enriquecidos en F, Cu y Zn Hidalgo-Robatto B.M.., Azevedo A. S., López-Senra E., Rodríguez-Valencia C., López-Álvarez M., Serra J., Azevedo N. F. y González P. 11

Producción de biomateriales a partir de residuos de origen marino Vázquez J.A., Sotelo C.G. y Pérez-Martín R.I. 12

Chondronanonet Rodríguez-Pereira C., Silva-Magalhães J.C y Blanco-García F.J. 13

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Mejora de la actividad fotocatalítica mediante la utilización de arquitecturas híbridas derivadas TiO2 y nanopartículas de oro. Sousa-Castillo A., Comesaña-Hermo M., Pérez-Lorenzo M. y Correa-Duarte M. 14

Marine sponge collagen in tissue engineering and regenerative medicine Diogo G. S., Cerqueira M.T., Silva T.H., Marques A.P., Moreira-Silva J. and Reis R.L. 15

Síntesis de cápsulas plasmónicas para detección de contaminantes emergentes. Pérez-Piñeiro J., Rodríguez-Lorenzo L, Pérez-Lorenzo M. y Correa-Duarte M. 16

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Aplicación de la espectroscopia Raman al diagnóstico de la caries dental

Coello B., López-Álvarez M., Rodríguez-Domínguez M., Serra J. y González P.

Grupo Nuevos Materiales, Departamento Física Aplicada, Escuela de Ingeniería Industrial, Instituto de Investigación Biomédica (IBI), Universidad de Vigo, 36310 Vigo

Resumen

Las metodologías utilizadas actualmente para el diagnóstico de la caries dental (inspección visual, inspección táctil, exploración radiográfica, transiluminación, fluorescencia y conductividad eléctrica) presentan cierta falta de sensibilidad y especificidad, especialmente en procesos incipientes. La espectroscopia Raman presenta potencialidad como herramienta de diagnóstico pues es una técnica no invasiva basada en la excitación mediante láser del tejido diana. Se presenta un caso clínico de una caries incipiente, difícil de detectar con la metodología diagnóstica convencional actual, que crece hasta convertirse en una caries cavitaria profunda, tras un año de evolución. Se llevó a cabo una investigación con el objetivo de demostrar la fiabilidad de la espectroscopia Raman como herramienta de diagnóstico cuantitativa de la caries dental.

Se evaluaron piezas dentales humanas sanas y afectadas por caries mediante espectroscopia Raman usando un equipo FT-Raman Bruker RFS 100 acoplado a un láser de Nd-YAG (1064nm).

Se propusieron dos índices cuantitativos de mineralización dental, MIb (Índice de mineralización flexión) y MIs (Índice de mineralización tensión), en los cuales se relaciona la parte orgánica e inorgánica del tejido. Esta metodología se aplicó con éxito en casos de estudio donde se diagnosticó caries en piezas sin evidencias externas de la misma. Se presenta un caso clínico de una caries localizada en la cara palatina de un premolar superior indetectable mediante exploración radiográfica (utilizando un análisis de líneas de densidad de las radiografías digitales obtenidas mediante escáner DIGORA fmx), pero perfectamente diagnosticable mediante espectroscopia Raman.

Se demostró la fiabilidad de la espectroscopia Raman como una potencial herramienta clínica para el diagnóstico cuantitativo de la desmineralización dental mediante inspección externa.

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Geles de fibrina y células madre mesenquimales para regeneración de cartílago

Gato-Calvo L., Lourés-Fraga E., Núñez-Amboage J.L., Blanco-García F.J. y Burguera E.

Grupo de Bioingeniería Tisular y Terapia Celular (GBTTC-CHUAC). Servicio de Reumatología. Instituto de Investigación Biomédica de A Coruña. Complejo Hospitalario Universitario de A Coruña (CHUAC). Sergas. Universidad de A Coruña 15006, A Coruña

Centro de Investigación Biomédica en Red en Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina (CIBER-BBN), España.

Resumen

Enfermedades como la artrosis o lesiones provocadas por traumatismos resultan en la pérdida del cartílago articular.

Este tejido tiene una capacidad de regeneración muy limitada. Actualmente ninguna de las terapias disponibles consigue su regeneración. La Ingeniería de Tejidos (IT), que utiliza soportes tridimensionales, células y factores de crecimiento, constituye una alternativa prometedora para reconstruir los tejidos dañados, cuando se identifican los elementos adecuados. Los geles de fibrina son biomateriales 3D autólogos, que se obtienen de plasma rico en plaquetas. En este trabajo se investiga la fabricación de geles de fibrina que contienen células madre mesenquimales (MSC) de médula ósea (BM) como producto de ingeniería tisular para la regeneración de cartílago. Las células se obtuvieron de tejido de pacientes con artrosis. Se prepararon geles con a) diferentes densidades celulares o b) diferentes densidades de plaquetas, que se mantuvieron en cultivo durante 30 días.

Se valoró la viabilidad celular utilizando el reactivo alamarBlue® y el grado de diferenciación condrogénica mediante tinciones histoquímicas, inmunohistoquímicas y cuantificación relativa de la expresión de genes relevantes por qRT-PCR. Los resultados obtenidos indicaron que las células son viables en el scaffold durante todo el experimento (hasta 30 días), y la incipiente formación de colágeno tipo II, de glucosaminoglicanos y de proteoglicanos característicos de la matriz extracelular cartilaginosa confirma el potencial de esta combinación de biomaterial y células como estrategia para la regeneración de cartílago.

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Plataformas magnéticas derivadas de nanotubos de carbono con aplicaciones biomédicas y biotecnológicas.

González-Domínguez E., Comesaña-Hermo M., Pérez-Lorenzo M. y Correa-Duarte M.

TeamNanoTech, Departamento de Química Física, Centro de Investigaciones Biomédicas (CINBIO), Instituto de Investigación Biomédica (IBI), Universidade de Vigo, 36310 Vigo.

Resumen

El desarrollo de estrategias de liberación intracelular de fármacos con un alto grado de control se ha postulado en los últimos años como una vía de investigación con un enorme potencial. En este marco, el presente trabajo se ha orientado al diseño y síntesis de un inyector nanométrico consistente en nanotubos de carbono biofuncionalizados estabilizados a través de un soporte coloidal con propiedades magnéticas. Los resultados preliminares tras la aplicación de estos nanotransportadores en medios celulares apuntan a una eficiente liberación de las biomoléculas ancladas a los nanotubos. Además de su bioactividad, se ha demostrado que estos inyectores presentan una baja toxicidad, no repercutiendo en procesos celulares clave tales como la mitosis. Todas estas características hacen de estas arquitecturas una alternativa prometedora a los sistemas de liberación de fármacos más tradicionales.

Desde un punto de vista biotecnológico, los estudios realizados demuestran que enzimas inmovilizadas en estas mismas plataformas magnéticas muestran una excelente estabilidad operacional en condiciones extremas de acidez y temperatura. La conservación de las propiedades catalíticas de las enzimas junto con la gran capacidad de carga y fácil recuperación de estas configuraciones confiere gran interés a estas estrategias desde una perspectiva industrial.

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Scaffolds marinos basados en alginato y apatita para regeneración de lesiones osteocondrales

López-Senra E., López-Álvarez M., Rodríguez-Valencia C., Serra J. y González P.

Grupo Nuevos Materiales, Departamento Física Aplicada, Escuela de Ingeniería Industrial, Instituto de Investigación Biomédica (IBI), Universidad de Vigo, 36310 Vigo

Resumen

La creciente demanda en biomateriales para reparación y/o reemplazo de tejidos biológicos como es el caso del tejido óseo, cartilaginoso u osteocondral, ha impulsado la necesidad de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas. En este sentido, la fabricación de estructuras porosas basadas en la combinación de distintos polímeros con materiales cerámicos está siendo ampliamente investigada. Concretamente, el alginato ha demostrado ser un hidrogel de gran interés para aplicaciones relativas a la regeneración de cartílago y, por otra parte, las propiedades bioactivas de la hidroxiapatita son ampliamente requeridas para la regeneración de hueso.

El presente trabajo pretende combinar alginato con hidroxiapatita, ambos de origen marino, para promover scaffolds para su aplicación en lesiones osteocondrales favoreciendo la regeneración de cartílago y hueso subcondral y, al mismo tiempo, con optimizadas propiedades mecánicas.

Se obtuvieron scaffolds basados en la combinación de alginato de sodio con hidroxiapatita obtenida de diente de tiburón (Prionace glauca), en tres proporciones de alginato:HA, 30:70, 50:50 y 70:30. Con el fin de evaluar y caracterizar su morfología fueron observadas mediante Microscopía Electrónica de Barrido y analizadas mediante Espectroscopia Electrónica Dispersiva.

Los resultados obtenidos mostraron la viabilidad para obtener scaffolds basados en diferentes proporciones de alginato con hidroxiapatita, con una estructura porosa homogénea de la HA dentro de la matriz en todas las proporciones y con composición elemental controlada. Estos resultados preliminares permiten continuar con la evaluación de estas estructuras mediante ensayos de estabilidad y bioactividad que se encuentran en curso.

Agradecimientos: UE-FP7/REGPOT-2012-2013.1-316265BIOCAPS, Xunta de Galicia-FEDER GRC2013-008/ R2014/033 Rede Galega de Biomateriais, CACTI/UVigo.

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Estudio de los efectos del tratamiento con fármacos de acción lenta en la artrosis en el conejo como modelo experimental

Permuy M., Guede D., López-Peña M., Muñoz F., Caeiro J.R. y González-Cantalapiedra A.

Grupo de Cirugía, Radiología y ecografía Experimental Veterinaria, Departamento de Ciencias Clínicas Veterinarias, Facultad de Veterinaria, Universidad de Santiago de Compostela, 27002 Lugo.

Resumen

La artrosis es una enfermedad articular crónica de elevada prevalencia tanto en el hombre como en los animales, caracterizada por la aparición de dolor e incapacidad funcional al mismo tiempo que se producen cambios degenerativos en todos los tejidos de la articulación afectada. En la actualidad no existe ningún fármaco ni terapia que reduzca los síntomas de la enfermedad al mismo tiempo que frene o revierta la degeneración tisular.

Los fármacos de acción lenta son un grupo heterogéneo de compuestos que por su naturaleza o modo de acción podrían tener efecto como tratamiento de esta patología.

En el presente estudio se estudiaron los efectos del tratamiento con diversos compuestos de este grupo evaluando los cambios en el cartílago, el hueso subcondral y la membrana sinovial de la rodilla utilizando el conejo como modelo experimental y evaluando dichos tejidos mediante histología cualitativa, histomorfometría y microtomografía computerizada.

Los animales fueron sometidos a la desestabilización quirúrgica de una de sus rodillas (mediante sección del ligamento cruzado anterior y meniscectomía parcial) y posteriormente se dividieron en grupos que recibieron el tratamiento con los compuestos (sulfato de glucosamina, condroitin sulfato, ácido hialurónico, diacereina y risedronato así como un grupo tratado con placebo) y tras 8 semanas se evaluaron los tejidos antes mencionados.

El modelo indujo cambios artrósicos en la rodilla afectada y todos los fármacos mostraron en mayor o menor medida cierto efecto sobre la degeneración articular no mostrando ninguno una clara ventaja respecto a los otros.

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Diferenciación condrogénica de células madre mesenquimales derivadas de pacientes artrósicos en biomateriales de ácido

poli(L)láctico puro o recubierto con quitosano

Álvarez-Martínez M.C., Silva-Magalhães J.C y Blanco-García F.J.

Grupo de Bioingeniería Tisular y Terapia Celular (GBTTC-CHUAC). Servicio de Reumatología. Instituto de Investigación Biomédica de A Coruña. Complejo Hospitalario Universitario de A Coruña (CHUAC). Sergas. Universidad de A Coruña 15006, A Coruña

Centro de Investigación Biomédica en Red en Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina (CIBER-BBN), España.

Resumen

El cartílago articular tiene una capacidad pobre de auto-reparación y regeneración, lo que contribuye a su degradación asociada a la artrosis (OA). La medicina regenerativa tiene un gran potencial como alternativa al reemplazo de la articulación para tratar a los pacientes con OA.

Analizar el efecto de las propiedades fisicoquímicas de soportes tridimensionales de ácido poli(L)láctico (PLLA) puro o recubiertos con quitosano en forma gel o fibra en la diferenciación condrogénica de células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (BM-MSCs) de pacientes artrósicos.

Las BM-MSCs se sembraron en soportes de PLLA puro o recubiertos con quitosano en un medio de diferenciación condrogénica definido durante 7, 14 y 30 días. En cada tiempo se analizó la expresión de marcadores de cartílago de interés a nivel molecular mediante RT-PCR, y de proteínas mediante inmunohistoquímica. La calidad de la matriz extracelular sintetizada se analizó mediante tinción histológica.

El PLLA puro promueve la diferenciación condrogénica y la formación de una matriz extracelular rica en proteoglicanos y moléculas específicas de zona como la lubricina y la proteína de capa intermedia del cartílago. La incorporación de quitosano en forma gel provoca un retraso en el proceso de condrogénesis tanto a nivel proteico como molecular, mientras un recubrimiento del tipo fibra acelera el proceso de hipertrofia.

La diferenciación condrogénica de las BM-MSCs puede estar influenciada por la composición y estructura de los soportes de PLLA puro o recubiertos con quitosano, teniendo un mayor efecto la primera.

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Evaluación de la capacidad osteogénica y antibacteriana de recubrimientos de HA enriquecidos en F, Cu y Zn

Hidalgo-Robatto B.M.1., Azevedo A. S.2, López-Senra E.1, Rodríguez-Valencia C.1, López-Álvarez M.1, Serra J.1, Azevedo N. F.2 y González P.1

1Grupo Nuevos Materiales, Departamento Física Aplicada, Escuela de Ingeniería Industrial, Instituto de Investigación Biomédica (IBI), Universidad de Vigo, 36310 Vigo 2LEPABE (Laboratory for Process Engineering, Environment, Biotechnology and Energy), Facultad de Ingeniería, Universidade do Porto, 4200-465 Porto (Portugal).

Resumen

Dentro del ámbito de la cirugía ortopédica y de los implantes metálicos existe un interés creciente en el desarrollo de nuevos materiales basados en fosfatos cálcicos (CaP) para mejorar la osteointegración de las prótesis actuales. Por otra parte, estos implantes metálicos favorecen, en muchos casos, la colonización bacteriana lo que conlleva riesgo de infecciones postquirúrgicas y puede llevar al fracaso de la prótesis. Distintos estudios han demostrado que el flúor, el cobre y el zinc presentan propiedades antibacterianas. El presente trabajo propone el recubrimiento de biomateriales metálicos con fosfato cálcico enriquecido en flúor, cobre o zinc para favorecer la osteointegración y, al mismo tiempo, promover un efecto inhibidor de la colonización bacteriana.

Por tanto, se fabricaron recubrimientos de CaP enriquecidos en cobre y zinc al 2.5% respectivamente y en flúor al 2% sobre sustratos de Ti6Al4V y acero inoxidable mediante la técnica de depósito por láser pulsado. Se evaluó la biocompatibilidad mediante ensayos de citotoxicidad, proliferación y actividad osteogénica utilizando la línea de pre-osteoblastos MC3T3-E1. Para el estudio de las propiedades antibacterianas se utilizaron las cepas Staphylococcus aureus y Escherichia coli con pruebas de biofilm a 24 horas, recuento de unidades formadoras de colonia (CFUs) y biomasa total.

Los resultados obtenidos probaron la viabilidad in vitro para obtener recubrimientos biocompatibles que promuevan al mismo tiempo la estimulación de la actividad osteogénica y un ligero efecto inhibitorio de la colonización bacteriana.

Agradecimientos: UE-FP7/REGPOT-2012-2013.1-316265BIOCAPS, Xunta de Galicia-FEDER (Axudas predoutorais, GRC2013-008 y R2014/033), Programa IACOBUS, CACTI/UVigo

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Producción de biomateriales a partir de residuos de origen marino

Vázquez J.A., Sotelo C.G. y Pérez-Martín R.I.

Grupo de Reciclado y Valorización de Residuos (REVAL), Departamento de Biotecnología y Acuicultura, Instituto de Investigaciones Marinas (IIM-CSIC), 36208 Vigo.

Resumen

Tanto el sector pesquero como la industria conservera y la de transformación de productos marinos producen una enorme cantidad de subproductos y aguas residuales que generan serios problema de gestión y de contaminación ambiental. Muchos de estos materiales son una importante fuente de compuestos de amplia utilización e interés en diferentes ámbitos (alimentario, cosmético, clínico, etc.).

En nuestro instituto se han venido desarrollando, en los últimos tiempos, un conjunto de procesos respetuosos con el medio ambiente encaminados a la recuperación de tales compuestos. Combinando diferentes estrategias y operatorias (enzimáticas, fermentativas, químicas, etc.) se ha optimizado y escalado la producción de varios biomateriales: colágeno, ácido hialurónico, condroitín sulfato, quitosano, etc.

En muchos casos estos biomateriales han sido recuperados de diferentes orígenes (p.e, especies de pescado) y se han seleccionado las condiciones de proceso (producción “a la carta”) para dar lugar a un amplio catálogo de propiedades fisicoquímicas (diferentes patrones de sulfatación, grados de desacetilación, durezas, pesos moleculares, etc.) que los pueden convertir en idóneos para aplicaciones específicas que requieran de tales características.

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Chondronanonet

Rodríguez-Pereira C., Silva-Magalhães J.C y Blanco-García F.J.

Grupo de Bioingeniería Tisular y Terapia Celular (GBTTC-CHUAC). Servicio de Reumatología. Instituto de Investigación Biomédica de A Coruña. Complejo Hospitalario Universitario de A Coruña (CHUAC). Sergas. Universidad de A Coruña 15006, A Coruña

Centro de Investigación Biomédica en Red en Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina (CIBER-BBN), España.

Resumen

Osteoarthritis (OA) is characterized by the articular cartilage degeneration, causing pain and loss of ability of the patients. Cartilage is a tissue that has no capacity of regeneration, what leaves us the necessity of developing new regenerative solutions for the treatment of the conditions that affect it. Due to their characteristics mesenchymal stem cells (MSC) are potential candidates for cell therapy strategies for cartilage regeneration. During development, mesenchymal progenitors differentiate into chondrocytes through a sequence of events that initiate with mesenchymal cell condensation leading to a marked decrease of the intercellular space, and the occurrence of a large number of cell interconnections of the gap junction (GJ) type. Connexin 43 (Cx43) is a protein that forms GJ channels and mediates cell-to-cell interactions during limb growth. Moreover, it has been reported that primary animal chondrocytes and superficial zone chondrocytes of adult human cartilage both express functional, voltage-gated Cx43, and that OA patients have a loss of the usual ordered distribution of Cxs. In this work we have analysed the expression of Cx43 in mesenchymal stem cells derived from OA patients seeded under different systems (scaffold vs 3D conventional) after the induction of chondrogenic differentiation in order to evaluate the influence of the microarchitecture formed on the cell to cell interactions.

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Mejora de la actividad fotocatalítica mediante la utilización de arquitecturas híbridas derivadas TiO2 y nanopartículas de oro.

Sousa-Castillo A., Comesaña-Hermo M., Pérez-Lorenzo M. y Correa-Duarte M.

TeamNanoTech, Departamento de Química Física, Centro de Investigaciones Biomédicas (CINBIO), Instituto de Investigación Biomédica (IBI), Universidade de Vigo, 36310 Vigo.

Resumen

Los efluentes de la industria textil presentan un gran impacto sobre el medio ambiente, debido a los grandes volúmenes de agua residual generados con un alto contenido de materia orgánica y una fuerte coloración. A causa de la gran estabilidad de los colorantes, los procesos convencionales para el tratamiento de este tipo de aguas tales como adsorción, floculación y procesos de lodos activados no son eficientes para la decoloración de tales efluentes. Esto es debido a su baja eficiencia o la posible formación de contaminantes secundaria que a su vez pueden ser tóxicos para el medio ambiente.

La fotocatálisis heterogénea se presenta como una alternativa para la degradación de contaminantes orgánicos, generalmente a través de la utilización de óxidos semiconductores, que a través de la radiación solar pueden llevar a cabo su degradación dando lugar a moléculas tales como CO2 y H2O.

En este trabajo se presenta la síntesis y el estudio de híbridos de nanopartículas de oro de diferente tamaño y morfología con dióxido de titanio sobre esferas de sílice. Los resultados muestran que una elección adecuada de la morfología puede mejorar notablemente la fotodegradación gracias a la modificación de la banda plasmónica, la cual puede llegar abarcar gran parte del espectro visible.

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Marine sponge collagen in tissue engineering and regenerative medicine

Diogo G. S., Cerqueira M.T., Silva T.H., Marques A.P., Moreira-Silva J. and Reis R.L.

3B´s Research Group, Department of Polymer Engineering, University of Minho. Avepark - Parque de Ciencia e Tecnologia, 4805-017 Barco - GMR, Portugal

Resumen

According to the reports taken from MedMarket Diligence there are 22 million cases of worldwide wound prevalence. Despite the great investigation and the large amount of products already available in the market for wound healing application, these are not so efficient for more severe wounds. Wounds are especially problematic when no reepithelization occurs, wounds remain open and skin regeneration does not occur. In this sense, type IV collagen as a native component of basement membrane can be used to enhance the regeneration process, since it supports the growth of the responsible cells by the reepithelization process. However, the current sources available to obtain this collagen are scarce and expensive. In the present work, we propose the production of marine-sponge type IV collagen stable and non-toxic membranes to overcome these drawbacks.

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Síntesis de cápsulas plasmónicas para detección de contaminantes emergentes.

Pérez-Piñeiro J., Rodríguez-Lorenzo L, Pérez-Lorenzo M. y Correa-Duarte M.

TeamNanoTech, Departamento de Química Física, Centro de Investigaciones Biomédicas (CINBIO), Instituto de Investigación Biomédica (IBI), Universidade de Vigo, 36310 Vigo.

Resumen

El problema de los contaminantes emergentes ha adquirido gran importancia en los últimos años debido a que las actuales depuradoras de aguas no están preparadas para eliminar completamente este tipo de contaminantes de las aguas residuales.

Estos contaminantes son de gran preocupación ya que tienen una distribución global, persistencia medioambiental, son bioacumulables y potencialmente dañinos debido a ello es de vital importancia su detección temprana y su eliminación.

En este trabajo, se han diseñado y sintetizado nanocápsulas mesoporosas con nanopartículas de oro en el interior para la detección del contaminante emergente trimetoprima, uno de los principales agentes antibacterianos de la industria farmacéutica. Los resultados muestran que la trimetoprima entra en el interior de las cápsulas, difundiendo a través de los poros de la sílice mesoporosa, quedando confinada en el interior debido a la afinidad con la superficie de las nanopartículas de oro.

La presencia de las nanopartículas metálicas hace posible que las cápsulas sean un soporte ópticamente activo en espectroscopía Raman aumentada por superficie (SERS). Así el agrupamiento de las nanopartículas metálicas en el interior de las nanocápsulas provocará la formación de “hot spots” puntos donde el campo electromagnético es fuertemente aumentado provocando un gran crecimiento de la señal Raman.

De esta manera se ha llegado a detectar el contaminante emergente, trimetoprima, de una forma selectiva y alcanzando un límite de detección de 3ppm.