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Bi o l o g í a Celular Laboratorio: Metabolismo Producción de ATP: Laboratorio: Metabolismo Producción de ATP: 1. Respiración Celular Prof. Diana Cárdenas Caro INTRODUCCIÓN Para funcionar, los seres vivos deben obtener energía mediante la degradación de moléculas de nutrimentos producidas por los fotosintetizadores. La respiración celular incluye varias rutas metabólicas que degradan carbohidratos y otros metabolitos, con la formación simultánea de ATP. La glucosa es una molécula de alto contenido energético y las rutas de la respiración celular permiten que la energía contenida en esta molécula, se libere lentamente para la producción gradual de ATP. La oxidación de la glucosa por separación de átomos de hidrógeno incluye cuatro etapas. La glucólisis en el citoplasma produce ácido pirúvico, el cual entra en las mitocondrias si hay oxígeno disponible. La glucólisis tiene lugar fuera de las mitocondrias, en el citoplasma y no requiere la presencia de oxígeno, por consiguiente es anaeróbica. Las siguientes etapas de la respiración celular, tienen lugar en las mitocondrias, donde el oxígeno es el aceptor final de electrones, por lo tanto es aeróbica. Una vez dentro de la mitocondria, ocurre la reacción preparatoria y el ciclo de Krebs. Posteriormente, en la membrana mitocondrial, la cadena de transporte de electrones acepta los electrones liberados de los productos de desdoblamiento de la glucosa. Éstos producen un total de 36 a 38 moléculas de ATP dependiendo del tipo de célula. Algunas formas de respiración son anaerobias. Ocurren en ausencia de oxígeno, ya que no lo utilizan como receptor final de electrones. Las bacterias anaerobias que viven en los intestinos de ciertos animales herbívoros y en otros ambientes anaerobios, pueden utilizar moléculas inorgánicas, tales como nitratos y sulfatos como aceptores de electrones. Otros organismos llevan a cabo la fermentación que también ocurre en forma anaeróbica. En la fermentación, el ácido pirúvico, producto final de la glucólisis, es reducido por el NADH a cualquier alcohol y CO 2 o ácio láctico, dependiendo de las enzimas particulares del organismo. Las levaduras son hongos unicelulares que llevan a cabo la fermentación alcohólica cuando no hay oxígeno. Los animales, el hombre, ciertas bacterias y hongos, llevan a cabo la fermentación acidoláctica. Otras bacterias realizan fermentación y producen compuestos químicos de importancia industrial como el isopropanol, ácido butírico, ácido propiónico y ácido acético. OBJETIVOS • Reconocer el proceso de respiración celular, a través del cual, los organismos producen energía en forma de ATP para sus funciones celulares.
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INTRODUCCIÓN Para funcionar, los seres vivos deben obtener energía mediante la degradación de moléculas de nutrimentos producidas por los fotosintetizadores. La respiración celular incluye varias rutas metabólicas que degradan carbohidratos y otros metabolitos, con la formación simultánea de ATP. La glucosa es una molécula de alto contenido energético y las rutas de la respiración celular permiten que la energía contenida en esta molécula, se libere lentamente para la producción gradual de ATP. La oxidación de la glucosa por separación de átomos de hidrógeno incluye cuatro etapas. La glucólisis en el citoplasma produce ácido pirúvico, el cual entra en las mitocondrias si hay oxígeno disponible. La glucólisis tiene lugar fuera de las mitocondrias, en el citoplasma y no requiere la presencia de oxígeno, por consiguiente es anaeróbica. Las siguientes etapas de la respiración celular, tienen lugar en las mitocondrias, donde el oxígeno es el aceptor final de electrones, por lo tanto es aeróbica. Una vez dentro de la mitocondria, ocurre la reacción preparatoria y el ciclo de Krebs. Posteriormente, en la membrana mitocondrial, la cadena de transporte de electrones acepta los electrones liberados de los productos de desdoblamiento de la glucosa. Éstos producen un total de 36 a 38 moléculas de ATP dependiendo del tipo de célula. Algunas formas de respiración son anaerobias. Ocurren en ausencia de oxígeno, ya que no lo utilizan como receptor final de electrones. Las bacterias anaerobias que viven en los intestinos de ciertos animales herbívoros y en otros ambientes anaerobios, pueden utilizar moléculas inorgánicas, tales como nitratos y sulfatos como aceptores de electrones. Otros organismos llevan a cabo la fermentación que también ocurre en forma anaeróbica. En la fermentación, el ácido pirúvico, producto final de la glucólisis, es reducido por el NADH a cualquier alcohol y CO2 o ácio láctico, dependiendo de las enzimas particulares del organismo. Las levaduras son hongos unicelulares que llevan a cabo la fermentación alcohólica cuando no hay oxígeno. Los animales, el hombre, ciertas bacterias y hongos, llevan a cabo la fermentación acidoláctica. Otras bacterias realizan fermentación y producen compuestos químicos de importancia industrial como el isopropanol, ácido butírico, ácido propiónico y ácido acético. OBJETIVOS • Reconocer el proceso de respiración celular, a través del cual, los organismos producen energía en forma de ATP para sus funciones celulares.
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• Identificar cuáles organismos realizan respiración celular aeróbica o anaeróbica, así como reconocer los organismos que pueden realizar los dos procesos cuando encuentran ciertas condiciones ambientales. • Diferenciar entre los procesos de respiración celular aeróbica y anaeróbica, sus sustratos, etapas y productos.
MATERIALES Materiales que debe llevar el estudiante Materiales que se encuentran en el
laboratorio • Bata de laboratorio, guantes desechables, gorro, tapabocas, • Cuaderno de laboratorio y guía de laboratorio • Un sobre pequeño de levadura de panadería • Dos frascos de compota, limpios y sin etiquetas • Dos motas de algodón • 6 semillas de fríjol • Marcador vidriográfico • Portaobjetos y cubreobjetos
Caldos de cultivo para la levadura Tubos tapa rosca con agua destilada estéril Pipetas estériles Viales estériles con tapón de caucho Safranina y Cristal Violeta Lugol Solución salina Aceite de inmersión Asa bacteriológica redonda Frasco lavador con agua destilada Mecheros de alcohol Pipeta Pasteur
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METODOLOGÍA
I. RESPIRACIÓN AERÓBICA EN CÉLULAS DE LEVADURA (Saccharomyces cerevisiae) Respiración ceular aeróbica (producción de biomasa). La célula necesita energía para crecer y multiplicarse. En la glucólisis se degrada una molécula de glucosa (compuesta por 6 carbonos) hasta dos moléculas de piruvato (compuesta por 3 carbonos). Este proceso se da a través de 10 reacciones, catalizadas por 10 enzimas diferentes y en condiciones aeróbicas el piruvato se convierte a dos moléculas de acetil-CoA que luego ingresa al ciclo de Krebs y se degrada a CO2 + H2O. Siguiendo esta vía, donde el aceptor final es el oxígeno, se obtendrán 36 ó 38 ATP (González et al., 2007). La energía de la degradación de glucosa es guardada en los enlaces fosfato de alta energía del ATP. En las mitocondrias se desarrollan distintas reacciones bioquímicas catabólicas que liberan importantes cantidades de energía, la cual se almacena en forma de ATP y es usada para mantener la actividad celular. En los organismos aeróbicos más del 90% del ATP proviene de las mitocondrias, el resto se forma en la glucólisis anaeróbica. El ATP es una molécula relativamente simple, formada por una ribosa, una adenina y tres fosfatos. Cuando el ATP se hidroliza a ADP y fosfato, se liberan aproximadamente 7.500 calorías por mol. La fosforilación oxidativa es la culminación del metabolismo productor de energía en los organismos aeróbicos. Todos los pasos oxidativos en la degradación de glúcidos, grasas y aminoácidos convergen en esta etapa de la respiración celular en la que la energía de oxidación impulsa la síntesis de ATP, el cuales será usado por la célula como fuente de energía para las funciones normales de la célula, como la proliferación, el crecimiento y metabolismo. II. METABOLISMO FERMENTATIVO EN CÉLULAS DE LEVADURA (Saccharomyces cerevisiae) Fermentación alcohólica. La fermentación alcohólica en mostos azucarados se origina por el metabolismo anaerobio de Saccharomyces cerevisiae, que forma etanol y CO2 como productos principales, a través de la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas. Las enzimas involucradas en este proceso, metabolizan los azúcares (glucosa) que se convierten en etanol y CO2. La producción de etanol es un proceso bioquímico desencadenado desde el momento en que el microorganismo entra en contacto con ciertas moléculas de azúcares fermentables, estando éstos en una concentración tan alta que permite la entrada a través de la membrana celular. El disacárido sacarosa se encuentra en mayor concentración con relación a los monosacáridos glucosa y fructosa en materias primas como la melaza y otros jugos o mostos, por lo que el microorganismo debe tener la capacidad de producir la
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enzima sacarasa o invertasa que es la encargada de hidrolizar la molécula de sacarosa en glucosa y fructosa. Procedimiento: Adicionar la levadura liofilizada (0,1 g) a un tubo que contiene 10 mL de agua destilada estéril. Agitar muy bien para obtener una suspensión celular. • Respiración celular aeróbica (producción de células o biomasa): Tomar 5 mL de esta suspensión celular e inocularla (adicionarla) en un frasco de cultivo que contiene 25 mL de caldo de cultivo azucarado (melaza, fosfato tricálcico y úrea). Este cultivo se lleva a crecimiento en agitación orbital en zaranda (120 rpm) para suminitrar oxígeno y homogenizar el caldo con las células durante 2 hr. • Fermentación alcohólica: Se toman otros 5 mL de esta suspensión celular e inocularla (adicionarla) en el otro frasco de cultivo que contiene 25 mL de caldo de cultivo azucarado (con la misma composición del anterior). Este cultivo se lleva a crecimiento en condición estática (sin agitación) para no suministrar oxígeno, a una temperatura de 32+/-2°C durante 2 hr. Resultados: Población celular. Una vez inoculado el caldo de cultivo, agitar bien y tomar una muestra de 5 mL en un vial vacío estéril (frasco pequeño con tapón de caucho). A esta muestra, se le realiza una tinción con lugol y observación en el microscopio. Se cuenta el número de células de levadura en dos campos visuales y se obtiene un promedio de la población celular. Después de 24 hr, los cultivos se retiran de la zaranda (agitador) y de la incubadora se toma una muestra de 5 mL en viales vacíos estériles (frasco pequeño con tapón de caucho). A cada muestra, se le realiza una tinción con lugol y observación en el microscopio. Se cuenta el número de células de levadura en dos campos visuales y se obtiene un promedio de la población celular. Tinción con lugol: Tome con un gotero o con una pipeta Pasteur una alícuota del vial que contiene la muestra y colóquela en una gota de Lugol sobre el portaobjetos. Luego coloque el cubreobjetos. Recuerde los pasos que se siguen para una precisa observación en el microscopio. Se utilizarán primero los objetivos de menor aumento con el fin de centrar la preparación y determinar la zona de mejor visualización. Después se cambia a los de mayor aumento hasta llegar al más conveniente (10x ó 40x).
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Ahora sí, observar la muestra. Realice los dibujos de su observación al microscopio con el aumento más conveniente. Producción de CO2. Examine los tubos de Durham que se encuentran dentro de los frascos de cultivos para determinar si tienen burbuja que indica la presencia de CO2. Producción de alcohol. Agite suavemente el cultivo y para detectar el olor producido en cada uno de los caldos celulares (gas carbónico / alcohol). Adicionalmente, se determinará la presencia de alcohol en los caldos de cultivo. En un tubo de ensayo se coloca 1 mL del caldo de cultivo, 2 mL de agua y 4 mL de solución de iodo iodurada (Lugol). Luego se añade solución de hidróxido de sodio (10 % p/v). Gota a gota hasta que desaparece el color del lugol y queda amarillo. A veces precipita enseguida. Si no lo hace calentar a baño María a 60°C durante dos minutos y dejar enfriar. Observaciones. Se observa la aparición de un precipitado blanco amarillento, de fórmula CHI3. Análisis: Compare la población celular de levadura al inicio del proceso y la obtenida luego de 24 hr en cada cultivo. Compare el olor característico en cada proceso: respiración celular aeróbica y fermentación alcohólica, alcohol y la presencia de burbujas como característica de la producción de CO2. Utilizando el siguiente esquema (Figura 1), explique el metabolismo de respiración celular ocurrido para la multiplicación celular que permite la producción de biomasa de levaduras cuando se suministra oxígeno y la fermentación alcohólica que produce etanol cuando no se suministra oxígeno.
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Figura 1. Célula de levadura para expresar el proceso de respiración correspondiente a cada metabolismo
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III. RESPIRACIÓN AERÓBICA EN CÉLULAS DE SEMILLA DE FRÍJOL (Phaseolus vulgaris) Las células de la mayoría de las semillas son secas y para que ocurra la germinación se deben hidratar. Si se dispone de agua, la semilla absorbe el agua, p r o c e s o conocido como imbibición. Para que ocurra la germinación de la semilla, el embrión reasume el crecimiento y la actividad metabólica, rompiendo su letargo, lo cual activa la respiración celular, que se encontraba en una actividad muy lenta (Mader, 2007). La respiración en las semillas embebidas ha sido diferenciada en cuatro etapas. La primera es un rápido aumento de la respiración, ya las mitocondrias son activadas y la replicación mitocondrial se estimula, llevando al inicio de la glucólisis, seguida por el ciclo de Krebs y la cadena transportadora de electrones en las mitocondrias. Se cree que el sustrato de partida es principalmente la glucosa (Courtis, 2013). Para iniciar el crecimiento del embrión las reservas de la semilla se movilizan, convertidas de la forma insoluble (almidón) a la soluble (glucosa). Durante la germinación, se producen enzimas como amilasas y maltasas las que romperán el endosperma amiláceo para liberar glucosa (Courtis, 2013). Las semillas tienen un endosperma de almidones grande que debe transformarse en azúcares simples (glucosa) a fin de proporcionar la glucosa que se metabolizará en energía (ATP) necesaria para el crecimiento (Mader, 2007). Las enzimas degradan las reservas de la semilla y ponen a disposición del embrión no sólo los nutrientes, sino también energía generada por la degradación de las macromoléculas. Es así como los carbohidratos insolubles (almidón) son degradados por hidrolasas a monosacáridos solubles, como la glucosa, fructosa. Los triglicéridos, principales lípidos de reserva de muchas leguminosas, son degradados a glicerol y ácidos grasos. Las proteínas de reserva son hidrolizadas a aminoácidos por proteinasas (Courtis, 2013). Procedimiento: Colocar en dos frascos de compota una mota de algodón bien humedecido. Sobre el algodón, colocar 2 semilas de fríjol bien mojadas. Dejar los frascos en fotoperíodo para observar el proceso de imbibición y germinación. Observación de amiloplastos que contienen almidón en la semilla. Con un bisturí partir una semilla del fríjol y hacer un corte muy fino del endospermo. Adicionar una gota de lugol en un portaobjetos, sobre ella colocar el fragmento de la semilla y luego el cubreobjetos. Observe inmediatamente en el microscopio hasta llegar al objetivo de 40x. Realice los dibujos de su observación al microscopio con el aumento más conveniente.
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Resultados: Tomar registro fotográfico de los cambios que ocurren día a día hasta la emergencia de la plántula de fríjol. Análisis: Utilizando el siguiente esquema (Figura 2), explique el metabolismo de respiración celular ocurrido para que pueda ocurrir la germinación de una semilla. DISCUSIONES A partir de sus observaciones elabore un mapa conceptual donde organice los procesos que ocurren en la respiración celular aeróbica (levaduras y semillas de fríjol), fermentación, los sustratos y productos bioquímicos, número de células o desarrollo del organismo. CONCLUSIONES Redacte mínimo tres conclusiones del trabajo que se hizo en el laboratorio. Deben ser personales. BIBLIOGRAFÍA En construcción http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/mitocondr ia.html Gonzales, G.F., Gonzales, C., Espinosa, D., Rojas, C. 2007. Sobre expresión de genes de las enzimas de la vía glicolítica en células cancerígenas. Acta Med Per, 24(3): 187-197.
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Figura 2. Célula vegetal para expresar el proceso de respiración celular aeróbica que permitirá la germinación
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