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REVISIÓN BIBLIOGRÁFICARev. Otorrinolaringol. Cir. Cabeza Cuello 2007; 67: 61-72

Biofilms bacterianos

Bacterial biofilms

Julio Nazar C.

INTRODUCCIÓN

Las bacterias existen en la Naturaleza bajo dosformas o estados: a) bacterias planctónicas, delibre flotación, y b) bacterias biofilm, en coloniasde microorganismos sésiles. Desde los tiempos deKoch, bacteriólogos y clínicos se han abocado alestudio de los gérmenes planctónicos, librementesuspendidos, y descritos en base a sus caracterís-ticas de desarrollo en medios de cultivos adecua-dos.

Esto se ha debido, entre otras razones, alhecho que la investigación de los biofilmsbacterianos es singularmente más difícil que aqué-lla respecto a las bacterias planctónicas. Desafor-tunadamente, este enfoque centrado en eldesarrollo de estas últimas en cultivos de laborato-rio, una condición que tiene escasa relación conlos ambientes microbianos verdaderos, ha limitadola comprensión respecto a las interacciones entrebacterias y huéspedes1,2.

Tan sólo una muy pequeña fracción de lasbacterias se halla en forma planctónica o de libreflotación, y las bacterias biofilm son diferentes a lasplanctónicas. Se postula que el 99% de todas lascélulas bacterianas existen en calidad de biofilms, ytan sólo 1% vive en estado planctónico3-5.

La adhesión bacteriana a superficies ha sidoreconocida por varias décadas. Ya por los años ’70,los microbiólogos plantearon que, probablemente,la mayor parte de las bacterias en la Naturalezaexistía en estado de biofilm. Sin embargo, laterapia de la mayoría de las infecciones humanascontinúa aún basada en el estudio de las minorita-

rias bacterias planctónicas libre flotantes. Losbiofilms se crean cuando las bacterias libre flotan-tes perciben una superficie, se adhieren a ella y, acontinuación, elaboran señales químicas para co-ordinar diferenciación y formación de estructura,incluyendo el desarrollo de una cubierta polisa-cárida protectora6.

Los gérmenes pueden crear condiciones paraformar biofilms casi en cualquier ambiente líquido.La interfase sólido-líquida entre una superficie y unmedio acuoso (vgr: agua, sangre) proporciona unentorno ideal para la fijación y crecimiento demicroorganismos7. Por consiguiente, los biofilmsson ubicuos en la Naturaleza y se encuentranprácticamente en todo cuerpo natural de agua en elmundo8.

Es así como cotidianamente debemos convivircon ellos: el limo o película que recubre un jarrónen el que se ha tenido flores, el material resbaladizoque tapiza las piedras de los lechos de los ríos, loscascos de los barcos o la superficie interna de unatubería. Otro ejemplo cotidiano de biofilm lo cons-tituye la placa dental. Diariamente debemos com-batir la película de bacterias que cubre la superficiedental para evitar el desarrollo excesivo demicroorganismos que puede provocar un deteriorodel esmalte2,9.

Los biofilms bacterianos representan una anti-gua estrategia de supervivencia procariótica. Estodebido a que las bacterias logran ventajas signifi-cativas al proporcionarles los biofilms protecciónfrente a fluctuaciones medioambientales de hume-dad, temperatura y pH, al igual que concentrandonutrientes y facilitando la eliminación de desechos.

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Registros efectuados en fósiles revelan queprocariotes han estado viviendo en biofilms pormás de tres billones de años10.

La capacidad de formar biofilm no parecerestringirse a ningún grupo específico demicroorganismos y, en la actualidad, se consideraque bajo condiciones ambientales adecuadas lainmensa mayoría de las bacterias, independientede la especie, puede existir dentro de biofilmsadheridos a superficies en una interfase sólido/líquida, incluyendo organismos importantes en en-fermedades otorrinolaringológicas, tales como Paeruginosa, H influenzae, S pneumoniae, Klebsiellay S aureus2,8-11. Esta adhesión a una superficiehúmeda, ya sea inerte o viviente, es de carácterirreversible, esto es, el biofilm no logra ser removi-do mediante lavado suave1,3-5,9,10,12,13.

DEFINICIÓN E HISTORIA

En 2002, Donlan efectuó una descripción amplia-mente aceptada de un biofilm, estableciendo quees “una comunidad microbiana sésil, caracterizadapor células que están adheridas irreversiblemente aun substrato o interfase, o unas con otras, encerra-das en una matriz de sustancias poliméricasextracelulares que ellas han producido, y exhibenun fenotipo alterado en relación con la tasa decrecimiento y trascripción génica”1.

Van Leeuwenhoek, utilizando sus simples mi-croscopios de luz, fue el primero en describir, en elsiglo XVII, la presencia de microorganismos adhe-ridos a superficies dentales, a raíz de lo cual se lereconoce como el descubridor de los biofilmsbacterianos1. Esta línea de investigación resurgiórecién en los ’70, cuando Characklis14 procedió aestudiar légamos microbianos en sistemas deaguas industriales logrando demostrar su tenaci-dad y resistencia a diferentes desinfectantes, entreellos, el cloro. Posteriormente, Costerton y cols15

describieron la presencia de comunidadesbacterianas embebidas en matriz glucoproteicaunidas a superficies en contacto con el agua,postulando que los biofilms podrían ser la explica-ción para los mecanismos por los cuales los

gérmenes se adhieren a superficies vivientes einertes.

Sin embargo, se debió esperar el advenimientodel microscopio electrónico para lograr un examendetallado de los biofilms. Éste permitió la fotomi-croscopía de alta resolución a aumentos significa-tivamente mayores respecto al microscopio de luz.En las últimas dos décadas gran parte del trabajorealizado para la descripción de biofilms se habasado en la microscopía electrónica de barrido.Mediante ésta se procedió a examinar biofilms enfiltros en plantas de tratamiento de aguas servidas,encontrándose que estaban compuestos por unamultiplicidad de gérmenes16. Usando tinción espe-cífica, se logró demostrar que el material de lamatriz que engloba a las bacterias en estosbiofilms era polisacárido1.

Recientemente, dos grandes avances hanincrementado substancialmente la comprensión delos biofilms: (a) la utilización del microscopio láserconfocal, que ha permitido caracterizar la ultraes-tructura del biofilm, y (b) la investigación de losgenes involucrados en la adhesión celular y laformación de biofilm1.

COMPOSICIÓN Y ARQUITECTURA

Toda comunidad microbiana desarrollada enbiofilm es única en su género, aunque algunosatributos estructurales pueden, generalmente, serconsiderados universales. El término biofilm es, encierto modo, un nombre inapropiado, puesto quelos biofilms no constituyen un depósito superficialde una monocapa continua1.

Los biofilms están estructurados principalmen-te por grandes colonias de bacterias sésiles incrus-tadas en una matriz polimérica extracelular oglicocálix. Las células bacterianas, que componenel 15%-20% del volumen, no se dividen al interiorde los biofilms, lo cual podría atribuirse al hecho deadoptar un fenotipo alterado, diferente al de lasmismas bacterias en estado de libre flotación8.

La matriz es muy hidratada debido a queincorpora grandes cantidades de agua dentro de suestructura, llegando este elemento a representar

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hasta el 97% de ésta1. Además de agua y gérme-nes, la matriz está formada por exopolisacáridos(EPS), los que constituyen su componente funda-mental, producidos por los propios microorganis-mos integrantes. En menor cantidad se encuentranotras macromoléculas como proteínas, ácidosnucleicos, y diversos productos que proceden de lalisis bacteriana. El conjunto de polisacáridos, áci-dos nucleicos y proteínas se conocen bajo elnombre de substancias poliméricas extracelulares(SPE). En la matriz también puede hallarse mate-riales no bacterianos, tales como cristales de salesminerales, partículas de corrosión y/o de sedimen-to, o componentes sanguíneos, según sea elmedioambiente en el cual se desarrolla el biofilm.Además, los EPS pueden estar asociados coniones metálicos y cationes bivalentes. Pueden te-ner carga neutra o carga polianiónica, según el tipode exopolisacárido, lo que les permitiría interactuarcon distintos antimicrobianos, de forma tal queestos pueden quedar atrapados en la matriz sincapacidad para actuar sobre las bacterias10.

La producción de EPS es influida por la calidadnutricional del medioambiente. Se ha observado queun incremento en la concentración de nutrientes estácorrelacionado con un aumento en el número decélulas bacterianas adheridas. Además, una disponibili-dad excesiva de carbono y/o limitación de nitrógeno,potasio o fosfato promueve la síntesis de EPS1,2,9,17.

La arquitectura de la matriz no es sólida. Lasbacterias biofilm viven en torreones celulares que seextienden en forma tridimensional desde la superfi-cie a la cual están adheridas. Estos torreones estáncompuestos por microcolonias de diferentes célulasbacterianas, tanto aeróbicas como anaeróbicas,englobadas por exopolisacáridos, y separadas unasde otras por espacios intersticiales huecos, llama-dos canales de agua, que permiten el flujo de líquidoy actúan como un sistema circulatorio primitivo parael transporte y difusión de nutrientes y oxígeno a lasbacterias ubicadas en su interior, incluso aquéllassituadas en las zonas más profundas del biofilm.Asimismo, constituyen un mecanismo para la remo-ción de productos de desecho metabólico1,18.

La existencia de estos canales de agua noimpide, sin embargo, que dentro del biofilm se

encuentren ambientes en los que la concentraciónde nutrientes, pH u oxígeno es diferente. Se gene-ra, de esta manera, una gradiente de tensión de pHy de oxígeno, siendo metabólicamente más activaslas áreas superficiales respecto a las más profun-das. En estas últimas, las bacterias deben adaptar-se a una disponibilidad reducida de oxígeno7,9,18.

La formación y estructura de un biofilm depen-de de las características del substrato al cual seune y a otros aspectos del medio ambiente. Así, losbiofilms en una superficie mucosa son fisiológica-mente diferentes de aquellos formados en superfi-cies inertes. Se ha acuñado el término “biofilm demucosa” para describir aquellos que son caracte-rísticos en mucosas. Estos, aunque estrechamenterelacionados con los encontrados en superficiesinertes, no son idénticos en cuanto a su expresióngénica ni en la naturaleza de sus microambientes.Los biofilms de mucosas son modulados por larespuesta inflamatoria del huésped y, además, porproteínas y células del huésped que contribuyen asu composición10.

ETAPAS EN EL CICLO VITAL

La biología de los biofilms se centra en su ciclovital e interacciones con el medio ambiente. El ciclovital es un proceso dinámico que puede ser dividi-do en 3 partes: adhesión, crecimiento y separacióno desprendimiento.

Durante la primera fase, el substrato tiene queser adecuado para la adsorción reversible y, final-mente, la adhesión irreversible de la bacteria a lasuperficie. Las bacterias, una vez percibida unasuperficie, proceden a formar una unión activa víaapéndices, como fimbrias, flagelos o pili. Mediantemicroscopía electrónica se ha descrito que lasbacterias adheridas se encuentran conectadas a lasuperficie por medio de finas fibrillas poliméricasextracelulares. Las fimbrias, probablemente luegode superar la barrera de repulsión electroestáticainicial que existe entre el germen y el sustrato,contribuyen a la adhesión bacteriana1,4.

La motilidad, otorgada por flagelos, ayudaría a labacteria a alcanzar la superficie en las etapas inicia-

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les de la adhesión, siendo su función principalvencer las fuerzas de repulsión más que actuarcomo adherente. Sin embargo, la motilidad nopareciera ser un requisito esencial, puesto quebacterias Gram positivas inmóviles, comoestafilococos, estreptococos y micobacterias, tam-bién poseen la capacidad de formar biofilm. En elcaso de las bacterias Gram positivas se ha descrito,en esta primera etapa, la participación de proteínasde superficie6,9.

La adhesión de bacterias a una superficie ocu-rrirá más fácilmente en aquéllas más ásperas, máshidrofóbicas, y recubiertas por “films condicio-nantes”. Se ha descrito que la colonizaciónmicrobiana parece incrementar a medida que au-menta la aspereza de la superficie. Esto seríadebido a que están reducidas las fuerzas de desli-zamiento, y el área de superficie se torna mayor2.Los films condicionantes, compuestos habitual-mente por polímeros, cubren inevitable y rápida-mente la superficie de cualquier material que seencuentre en contacto con un líquido, y constitu-yen requisito indispensable para una ulterior adhe-sión microbiana. Un buen ejemplo en el hombrepuede ser el film conocido como “película adquiri-da”, que se desarrolla en superficies del esmaltedental. Este film consta de albúminas, lisozimas,glicoproteínas, fosfoproteínas, y lípidos. Las bacte-rias de la cavidad oral colonizan, al cabo de algunashoras, aquellas superficies condicionadas por estapelícula2.

Las propiedades físico-químicas de la superfi-cie también pueden ejercer una fuerte influencia enel grado y extensión de la adhesión. Se ha encon-trado que los gérmenes se adhieren más rápida-mente a superficies hidrofóbicas, no polarizadas,como lo es el teflón y otros plásticos, en compara-ción con materiales hidrofílicos, como vidrio ometales. Aparentemente se produciría algún tipode interacción hidrofóbica entre la superficie celu-lar y la del sustrato que permitirían a la bacteriasuperar las activas fuerzas de rechazo a ciertadistancia de la superficie del sustrato, y lograradherirse irreversiblemente1.

En la adhesión bacteriana pueden también in-fluir variaciones en la velocidad de flujo, tempera-

tura del agua, y concentración de nutrientes. Se haencontrado que un incremento en la concentraciónde diversos cationes (sodio, calcio, hierro) afecta laadhesión de Pseudomonas spp a superficies devidrio19.

Durante la segunda fase o de crecimiento, labacteria, una vez adherida, comienza a dividirse ylas células hijas se extienden alrededor del sitio deunión, formando una microcolonia, similar al pro-ceso de formación de colonias en placas de agar. Amedida que las células se dividen y colonizan lasuperficie, las bacterias comienzan a elaborar unexopolisacárido que constituye la matriz delbiofilm, y éste comienza a desplegarse en unaformación tridimensional, generando estructurassimilares a setas5,9.

La composición del exopolisacárido es diferen-te para cada bacteria: alginato, en P aeruginosa;celulosa, en S typhimurium; exopolisacárido ricoen glucosa y galactosa en V. cholerae; poli-N-acetil-glucosamina, en S aureus, etc. Además,estudios recientes señalan que, incluso una mismabacteria, dependiendo de las condiciones ambien-tales en las que se encuentre, puede producirdiferentes exopolisacáridos9.

Finalmente, en la tercera etapa, luego que elbiofilm ha alcanzado la madurez, algunas células, yasea aisladamente o en conglomerados bacterianos,se liberan de la matriz para poder colonizar nuevassuperficies, cerrando el proceso de formación ydesarrollo del biofilm. El desprendimiento puede serresultado de fuerzas externas al biofilm o de proce-sos activos inducidos por éste10.

Los tres principales mecanismos para generarel desprendimiento serían: (a). erosión o desliza-miento: remoción continua de pequeñas partes delbiofilm; (b) separación: remoción rápida y masiva;y (c) abrasión: liberación por colisión de partículasdel líquido circundante con el biofilm. La separa-ción es menos frecuente que la erosión, y se piensaderivaría de depleción de nutrientes u oxígeno alinterior del biofilm. Se observa preferentemente enbiofilms más voluminosos, que se han desarrolla-do en medioambientes otrora ricos en nutrientes.La separación proporcionaría un mecanismo paraque las bacterias migren desde zonas densamente

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colonizadas a áreas que podrían favorecer mejor sudesarrollo, logrando así formar nuevos biofilms ensitios distantes. Un ejemplo es la sepsis recurrenteen un paciente con un catéter infectado1,6.

La forma en que se produce la dispersión afecta-ría, aparentemente, las características fenotípicas delos gérmenes. Los conglomerados desprendidosdesde el biofilm conservarían, probablemente, ciertascaracterísticas de éste, tales como la resistenciaantimicrobiana. En cambio, las células bacterianasliberadas aisladamente podrían rápidamente volver asu fenotipo planctónico, tornándose nuevamente sus-ceptibles a las defensas del huésped y a losantimicrobianos1.

QUORUM SENSING

Un avance importante en la comprensión de losbiofilms ocurrió a comienzos de los ’90 con eldescubrimiento de proteínas responsables del me-canismo de quorum sensing o de auto-inducción.En los años siguientes se produjo una profusapublicación de nuevos conocimientos acerca de lagenética de señalización célula-a-célula ytranslocación coordinada de genes responsablesde factores de defensa y virulencia6,9.

La unión de los microorganismos a una superfi-cie y ulterior formación de un biofilm necesita quelas bacterias se cercioren que han efectuado contac-to. Para lograrlo requieren de señales químicascoordinadas que les permitan comunicarse entreellas. El desarrollo de interacciones célula-a-célulase facilita por la estrecha proximidad existente entrelas bacterias biofilm. Esta interrelación, vía mensaje-ros de pequeñas moléculas, denominada quorumsensing, beneficia a la bacteria al permitirle sentir lapresencia de microorganismos vecinos, determinarla densidad de la población existente y responder aeventuales condiciones cambiantes. El procesoquorum-sensing funciona debido a que cada bacte-ria que se une a una superficie produce una molécu-la señal “yo estoy aquí”, de manera tal que mientrasmás bacterias se unen, se incrementa la concentra-ción local de esta señal. Una vez logrado esto, seinducen diferentes fenómenos en la bacteria, para

finalmente gatillarse la diferenciación biofilm. Suobjetivo es coordinar determinados comportamien-tos o acciones entre microorganismos del mismogénero, de acuerdo a su número. A menos que estépresente un número adecuado de célulasbacterianas en la vecindad, los costos de la produc-ción de un biofilm para una bacteria individualsuperan los beneficios1,3-5,10,20-22.

Los gérmenes que utilizan quorum sensingelaboran y secretan moléculas señalizadoras, lla-mados auto-inductores. Las principales moléculasempleadas para comunicarse con las demás bacte-rias son las acil-homoserina-lactonas, que predo-minan en bacterias Gram negativas, mientras queoligopéptidos modificados prevalecen en gérme-nes Gram positivos. Las bacterias también poseenun receptor que puede detectar específicamente elauto-inductor respectivo. Cuando éste se une alreceptor, activa la trascripción de determinadosgenes, incluyendo aquellos para la síntesis delinductor2,23.

Los primeros microorganismos en quienes seobservó quorum sensing fueron especies deMyxobacterias y Streptomyces. Sin embargo, elejemplo más conocido es la regulación de laproducción de luz en el Vibrio fischeri, una bacteriabioluminiscente que vive como un simbionte en elórgano generador de luz del calamar hawaiano.Cuando el V fischeri se encuentra en estadoplanctónico, el auto-inductor está en baja concen-tración y, de este modo, carece de luminiscencia.En cambio, en el órgano luminoso del calamarestán muy concentrados (sobre 1011 células/ml),induciéndose la trascripción enzimática ygenerándose bioluminiscencia.

El estudio de esta relación simbiótica comenzóa revelar algunos de los misterios de señalescélula-a-célula. En el V fischeri se identificaron dossistemas quorum-sensing: luxl y luxR. Estos siste-mas de señalización se han encontrado en casitodas las bacterias Gram negativas, y moléculasmensajeras célula-a-célula han sido detectados enmás de 30 especies de bacterias Gram positivas.Los sistemas lux se han estudiado extensamenteen Pseudomonas spp y Escherichia coli, y se lesconsidera necesarios para la maduración del

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biofilm y activación de numerosos genes de facto-res de virulencia1,12.

Davies21 demostró que en la formación debiofilm en P aeruginosa están implicados dossistemas diferentes de señalización célula-a-célula:lasR-lasI y rhlR-rhlI. Una vez conseguida unadensidad suficiente de población, estas señalesalcanzan las concentraciones requeridas para acti-var los genes implicados en la diferenciación delbiofilm. Mutantes incapaces de elaborar ambasseñales producen biofilms notoriamente más del-gados y sin su arquitectura típica. Además, puedenser removidos mucho más fácilmente de superfi-cies mediante uso de surfactantes. La adición delactona homoserina al medio que contiene losbiofilms mutantes da origen a biofilms similares alos de bacterias no mutantes1.

INTERCAMBIO GÉNICO

En los últimos años diversos grupos de investiga-dores han orientado sus esfuerzos intentandoidentificar tanto los genes responsables de la tran-sición biofilm/planctónica, al igual que aquellosque están expresados únicamente en biofilms yque son indispensables para mantener su particu-lar estructura. Las bacterias biofilms poseen unaexpresión génica diferente respecto a sus contra-partes planctónicas, originando bacteriasfenotípicamente distintas respecto a aquéllas. Seha encontrado que hasta el 30% de los genespuede expresarse de manera diferente entre lamisma bacteria desarrollada en condicionesplanctónicas o en un biofilm3-5,8,9.

Los biofilms hospedan un medioambiente muydinámico, donde se intercambia material genético talcomo plásmidos (ácido desoxirribonucleico extra-cromosómico), enzimas y otras moléculas3-5. Estu-dios recientes postulan que la matriz de biofilms de Paeruginosa contienen ácido desoxirribonucleicocomo constituyente principal. Estos estudios, combi-nados con otros que muestran una tasa de transfe-rencia génica, mediada por plásmidos, enormementeincrementada entre bacterias biofilms, sugieren quela redistribución de genes entre éstas es un proceso

continuo con importantes consecuencias en su adap-tación evolutiva10.

Se ha planteado que cepas bacterianas deimportancia clínica unidas a plásmidos desarrollanbiofilms más fácilmente. Se ha observado, ade-más, que cepas portadoras de plásmidos transfie-ren éstos a organismos receptores, generando laformación de biofilm. Sin plásmidos asociados,estos mismos gérmenes producen únicamentemicrocolonias de escaso desarrollo. Debido a quelos plásmidos pueden codificar resistencia a múlti-ples antimicrobianos, la asociación biofilm propor-ciona también un mecanismo para selección eincremento de la resistencia bacteriana a losantibióticos1,3-5.

RESISTENCIA BACTERIANA

Las bacterias biofilm presentan una organizaciónestructural que las hace resistentes a los mecanis-mos de defensa del huésped. Los biofilms, revesti-dos con SPE y conteniendo múltiples microcoloniasbacterianas en su interior, se convierten en estructu-ras demasiado grandes como para ser fagocitadas,reduciendo la accesibilidad del sistema inmune a lasbacterias. Por añadidura, el biofilm provee de unabarrera física que aumenta la resistencia depatógenos a las defensas del huésped, comoopsonización, lisis por complemento, y fago-citosis10.

En rigor, los biofilms provocan respuestas inmu-nes celular y humoral, demostradas por la identifica-ción de citoquinas liberadas por leucocitosexpuestos a biofilm. Sin embargo, debido a suaislamiento del entorno por la matriz y su reducidoestado metabólico, esta respuesta sistémica es muypequeña1.

Otra ventaja, extremadamente importante desdeel punto de vista clínico, es que las bacteriasbiofilms son muy resistentes a los antibióticos,siendo capaces de sobrevivir frente a concentracio-nes antibióticas miles de veces mayor respecto a lasbacterias planctónicas. Por ejemplo, una cepa deKlebsiella pneumoniae en estado planctónico tieneuna concentración inhibitoria mínima de 2 µg/ml a la

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ampicilina. Esta misma cepa, al crecer como biofilm,exhibe 66% de sobrevida luego de terapia con5.000 µg/ml de ampicilina7,8,11,24.

Para intentar explicar esta resistencia se hanplanteado diversas hipótesis:(a) Penetración lenta o incompleta del antibiótico

en el biofilm: Se debería a que la matriz deexopolisacáridos constituye una barrera impi-diendo este ingreso. Si bien estudios in vitromuestran que algunos antibióticos logran in-gresar con cierta facilidad, debido a que noexistiría una barrera genérica a su difusión através de la matriz, se postula que si el antibió-tico logra ser desactivado en ésta por acción depolímeros extracelulares, puede tener tan sólouna difusión limitada dentro del biofilm10,24.

(b) Causas metabólicas: Una baja actividad meta-bólica de las bacterias biofilm por limitación deoxígeno y nutrientes puede causar que ingre-sen en un estado de lentificación o cese de sumitosis, especialmente aquéllas situadas másprofundamente, con lo cual dejan de ser sus-ceptibles a los antimicrobianos. Además, se hadescrito la formación de nichos anaeróbicos enzonas profundas de biofilms debido a consumocompleto del oxígeno en las capas superficia-les. Algunos antibióticos, vgr: aminoglicósidos,son comprobadamente menos eficaces contrala misma bacteria en condiciones anaeróbicasque aeróbicas. Finalmente, una eventual acu-mulación de productos ácidos en el biofilmpuede conducir a diferencias significativas depH entre el exterior y el interior de éste,interfiriendo con la acción del antibiótico10,24.

(c) Cambios genéticos: Se producirían modifica-ciones en la fisiología de las bacterias biofilm yaparición de genes específicos, producto decambios genéticos, que potenciarían mecanis-mos de resistencia a múltiples antibióticos.Según diversos investigadores, esta resistenciase debería principalmente a modificaciones fe-notípicas en las bacterias biofilm, las que se-rían de tipo protectoras, especialmente algenerar cese de la mitosis2,3,6,8-10. No obstan-te existir un respaldo mayoritario a esta hipóte-sis, Stewart y Costerton24 expresan sus dudas

al respecto, señalando que cuando las bacte-rias son dispersadas desde un biofilm, confrecuencia se tornan rápidamente susceptiblesa antibióticos, lo que sugeriría que tal resisten-cia no sería adquirida vía mutaciones o elemen-tos genéticamente movibles.

(d) Formación de esporas: Esta hipótesis planteala posibilidad de génesis de una subpoblaciónde bacterias biofilm con un estado fenotípicomuy especial y altamente protegido, con unadiferenciación símil esporas. Este planteamien-to es apoyado por investigaciones que mues-tran resistencia en biofilms recientementeformados, aun cuando estos son demasiadodelgados para constituir una barrera a la pene-tración de agentes antimicrobianos24.

Es preciso tener presente que los antibióticosutilizados rutinariamente en clínica han sido selec-cionados por su actividad frente a bacteriasplanctónicas. Lo anterior debido a que los estudiosde sensibilidad o antibiogramas que se realizanhabitualmente están diseñados para medir la sus-ceptibilidad de la bacteria crecida de formaplanctónica, sin tener en cuenta que los resultadosobtenidos pueden no extrapolarse a esa mismabacteria cuando lo hace en el interior de un biofilm.Las mismas propiedades que hacen a las bacteriasbiofilms resistentes a antibióticos y al sistemainmune, también las tornan difíciles de cultivar invitro. Incluso, su estado metabólico dentro delbiofilm puede imposibilitar por completo su culti-vo9,10.

BIOFILMS E INFECCIONES

Las enfermedades infecciosas durante el siglopasado eran causadas por bacterias dotadas demecanismos patogénicos específicos: difteria, tu-berculosis, cólera, coqueluche, etc. Losantibióticos y vacunas desarrollados para estosgérmenes lograron una notable eficacia en sucontrol. En la actualidad estas bacterias han sidodesplazadas del primer plano por microorga-nismos ubicuos, capaces de producir infecciones

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de tipo crónico, que responden pobremente a lostratamientos antibióticos y no pueden prevenirsemediante inmunización. Diversas publicaciones re-cientes señalan que, por lo menos, el 65% detodos los procesos infecciosos bacterianos huma-nos podrían involucrar biofilms3-5,7,9,22.

En los últimos 10 años, debido a su prevalenciaabrumadora, los biofilms han sido reconocidosprogresivamente como factores importantes en lapatogenia de muchas infecciones humanas persis-tentes, incluyendo placa dental, caries, infecciónperiodontal, neumonía por Pseudomona enfibrosis quística, cistitis crónica, endocarditisbacteriana, osteomielitis, y prostatitis crónica.También se ha demostrado que una variedad dedispositivos médicos implantables pueden portarbiofilms, provocando infecciones asociadas, desta-cando la sepsis por catéteres endovenosos yarteriales. Además se han descrito en catéteresurinarios, sigmoidoscopios, y lentes de contacto.Constituyen, también, un problema serio en válvu-las cardíacas artificiales, marcapasos y prótesisortopédicas las cuales, una vez infectadas, generaninfecciones excepcionalmente difíciles de resolvermediante antibióticos1,3,6,8,10,12,25.

Desde los años ’70 se ha documentado la acumu-lación bacteriana en tubos endotraqueales en unida-des de Cuidado Intensivo. La presencia de biofilmsGram negativos en estos tubos ha sido relacionadacon neumonía intrahospitalaria, presumiblemente pordiseminación mecánica durante la aspiración26,27. Unreciente estudio, usando microscopía láser confocal,logró identificar biofilms bacterianos en 10 de 11tubos de traqueostomía pediátricos6.

La naturaleza de la placa dental comenzó aadquirir gran importancia a partir de los mediadosde los ’60, poniéndose énfasis en los factorescontribuyentes a la diversidad de ecosistemas,incluyendo pH, potencial de oxido-reducción yrequerimientos nutricionales2.

Intentando explicar la progresión de la enfer-medad dental se ha propuesto una hipótesis deplaca inespecífica y otra, de placa específica. Se-gún la primera, la enfermedad periodontal sería elresultado de la elaboración de productos nocivospor toda la flora microbiana de la placa. Así, una

gran acumulación de placa produciría cantidadesimportantes de substancias perjudiciales, las cua-les superarían las defensas del huésped, generan-do enfermedad periodontal. Al desarrollo de éstacontribuirían todos los gérmenes al interior de laplaca, no siendo importante identificar un germenaislado. Por ende, las medidas de higiene oral,buscando remover tanta placa dental como fueraposible, se hicieron imprescindibles para la conser-vación de la salud oral2,28.

En cambio, la hipótesis de placa específicapostula que sólo ciertos gérmenes dentro de laplaca serían patógenos, y que el grado de dañodependería de un crecimiento excesivo o selecciónde las bacterias más virulentas. Según esta teoría,la enfermedad periodontal sería el resultado denoxas celulares causadas por patógenos específi-cos, las que provocarían respuestas inflamatorias einmunes por el huésped2.

En Otorrinolaringología, aunque existe escasaliteratura respecto a la participación de los biofilmsen enfermedades localizadas en esta área, gradual-mente se está evidenciando que los biofilms po-seerían un rol importante en derrame crónico enoído medio, amigdalitis crónica, sinusitis crónica,colesteatoma, e infecciones asociadas a dispositi-vos, tales como tubos de timpanostomía, prótesisvocales y tubos endotraqueales3-8,10,13,29-32.Pawlowski y cols33, en 2005, notificaron la presen-cia de biofilm bacteriano en un implante coclearhumano.

Los tubos de timpanostomía son quizás losdispositivos de material foráneo más frecuentemen-te implantados en humanos. Se ha estudiado conmicroscopía, tanto electrónica como láser confocal,las influencias que la superficie y las propiedadesfísicas del material tienen en la formación de biofilm.Experimentos efectuados con P aeruginosa y Saureus han encontrado que las superficies lisas(vgr: silicona y plástico tetrafluoruro) son menospropensas al desarrollo de biofilm34,35.

El comportamiento de los patógenos en otitismedia aguda se ajusta bastante bien con los princi-pios microbiológicos clásicos: las bacterias soncultivables en la mayoría de los casos, y la terapiaantimicrobiana tiene un efecto significativo en los

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síntomas clínicos. En cambio, en otitis media conderrame el comportamiento de patógenos no estan claro. Los cultivos a menudo no muestrandesarrollo, la terapia antibiótica posee escaso onulo efecto en la resolución, y la duración de laenfermedad es, con frecuencia, prolongada. Lasevidencias respecto a la formación de biofilm enderrame crónico de oído medio están comenzandoa arrojar luces en muchos de estos misterios6.

Hall-Stoodley y cols36 detectaron presencia debiofilms en 92% de muestras de mucosa oídomedio, examinadas con microscopio láserconfocal, de 26 niños portadores de otitis mediacon derrame y otitis media recurrente, estructurasque no se observaron en las muestras de 8 pacien-tes controles.

En el pasado se ha identificado ácidodesoxirribonucleico bacteriano en derrames deoído medio con cultivos negativos. Sin embargo,permanecen interrogantes respecto a la viabilidad ycarácter patógeno de estas bacterias. Estudiosrecientes respecto a ARN mensajero bacteriano yendotoxinas bacterianas en derrames de oído me-dio sin cultivos positivos implican a biofilms en lapatogénesis de estas infecciones. Si los biofilmsestán involucrados en enfermedad crónica de oídomedio, es lógico presumir que ellos también po-drían participan en otras enfermedades crónicasrespiratorias altas, tales como amigdalitis, sinusi-tis, y adenoiditis6,19.

Chole y cols8 encontraron biofilms en el inte-rior de criptas en 11 de 15 tonsilas infectadascrónicamente. Las bacterias biofilms, así protegi-das de las defensas del huésped y de losantibióticos, continuarían metabolizando y for-mando endotoxinas. Lo anterior puede conducir auna inflamación crónica. Cuando las condicionesmedioambientales locales fuesen eventualmentefavorables, estas bacterias podrían hacerse móvi-les, determinando que se repita una infecciónaguda.

La rebeldía de la rinosinusitis crónica (RSC) escompatible con el perfil de una infección porbiofilm. Cryer y cols37 fueron los primeros eninformar sobre la presencia de biofilms en pacien-tes quienes habían sido intervenidos quirúrgica-

mente, y continuaban presentando síntomas apesar de tratamiento médico. Estos enfermos te-nían, principalmente, infección por P aeruginosa.Ramadan4 mediante el empleo de microscopíaelectrónica de barrido encontró evidencias debiofilms en todas las biopsias de mucosa en cincopacientes quienes habían sido intervenidosquirúrgicamente por RSC.

En un estudio posterior, este autor realizó unainvestigación prospectiva controlada en 30 pacien-tes. Las muestras tisulares fueron obtenidas desenos enfermos, específicamente mucosa etmoidal.El examen de las 30 muestras detectó evidencias debiofilms en 24 (80%) de los sujetos. En cambio, loscontroles tenían cilios y células caliciformes deaspecto saludable, sin presencia de biofilms5.

Investigaciones efectuadas respecto a cambiosde la mucosa en rinosinusitis crónica revelan dife-rentes grados de denudación, generando superfi-cies con muchas de las características requeridaspara la formación de un biofilm, incluyendo: aspe-reza de la superficie, hidrofobicidad, sodio, calcio,iones férricos, abundante suministro de nutrientes,y temperatura adecuada3,4,38.

El exacto papel de los biofilms bacterianos enRSC aún permanece por aclararse. Se postula que,en la etiología de esta enfermedad, la mutación delas bacterias biofilm -fenotípicamente diferentes delas formas planctónicas- sería de mayor importan-cia que la resistencia de la matriz del biofilm a lapenetración antibiótica. Adicionalmente, debido aesta resistencia al tratamiento, las bacterias biofilmse convertirían en reservorios para el estableci-miento de infecciones sinusales crónicas7,39.

ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS FUTURAS

El reconocimiento que el biofilm es responsable deun grupo significativo de enfermedades humanasposibilita la búsqueda de enfoques novedosos parael tratamiento y prevención, como podría ser elinhibir la adhesión mediante la alteración de lasuperficie. Una alternativa para disminuir la fijacióna superficies incluye uso de agentes quelantes, quelimitan el hierro, el cual es necesario para la

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adhesión de los pili de Pseudomonas sp40. Elxilitol, un alcohol natural del azúcar administradobajo la forma de jarabe o goma de mascar, hamostrado una efectividad clínica significativa enprevenir caries y disminuir la incidencia de otitismedia en niños, posiblemente vía reducción demecanismos de adhesión bacteriana41.

Debido a que la resistencia que presenta elbiofilm depende de la agregación de bacterias encomunidades multicelulares, una estrategia puedeser desarrollar terapias que rompan su estructuramulticelular. Si la multicelularidad del biofilm esderrotada, las defensas del huésped pueden sercapaces de resolver la infección logrando, de estamanera, restituir la eficacia de los antibióticos.Terapias potenciales incluyen enzimas que disuel-van los polímeros de la matriz, reacciones quími-cas que bloqueen la síntesis de la matriz del biofilmy el empleo de análogos de proteínas y péptidosseñalizadores que interfieran con la comunicacióncélula-a-célula, indispensables para la formaciónde un biofilm23,24.

Se ha demostrado que los antibióticosmacrólidos parecen inhibir la síntesis depolisacáridos y, de esta manera, degradarían laprotección de la superficie del biofilm. Estosantimicrobianos podrían tener un efectoinmunomodulador logrando impedir señalesbacterianas. El tratamiento de biofilms conclaritromicina reduce la matriz que cubre el biofilm,tanto de P aeruginosa como de S epidermidis,aunque las bacterias mismas sean resistentes alantibiótico10,42.

Finalmente, otras dos estrategias promisoriasson cambios en el medioambiente a través deinhibición competitiva por otras bacterias (vgr:estreptococos alfa) o incremento de la tensión deoxígeno (vgr: en pacientes con tubos de timpanos-tomía)6.

Se ha identificado una molécula denominada“furanona”, producida por el alga Delisea pulcra,con una estructura similar a las acil-homoserina-lactonas. Estas moléculas bloquean el sistemaquorum sensing y la consiguiente formación debiofilm. En la actualidad se intenta desarrollarinhibidores de la formación de biofilm basados en

derivados de la furanona, ya que esta molécula esextremadamente tóxica43.

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