Biología Molecular y Celular - CNBdrodrig/memorias CNB/memoria 2005-2006... · de la gripe y la...

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Biologa Molecular y Celular

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Luis EnjuanesLaboratorio Coronavirus

Mariano EstebanPoxvirus y vacunas

Llus Montoliu JosModelos animales por manipulacin gentica

Jos Ramn NaranjoAnlisis funcional del represortranscripcional DREAM

Amelia NietoMecanismos de interaccin entre el virusde la gripe y la clula infectada

Juan OrtnTranscripcin y replicacin del RNA del virus de la gripe

Dolores Rodrguez AguirreCaracterizacin molecular y epidemiologade torovirus

Jos F. Rodrguez AguirreBiologa molecular de birnavirus

Antonio Alcam (Investigador visitante)Modulacin de la respuesta inmune por virus

Estructura cristalina de la RNApolimerasa dependiente deRNA del virus de la bursitisinfecciosa.

11 BiologaMolecularyCelular

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Laboratorio CoronavirusResumen

Los coronavirus tienen un genomaRNA de cadena sencilla y positiva conun tamao de 30 kb, y son responsablesde infecciones en las mucosas del trac-to respiratorio y entrico. Los corona-virus tienen un alto impacto en saludhumana y animal. Nuestro grupo estinteresado en las bases moleculares dela replicacin y transcripcin, ensambla-je e interaccin virus-husped utilizan-do como modelos experimentales elcoronavirus de la gastroenteritis porci-na transmisible (TGEV) y el virus pro-ductor del sndrome respiratorio agudoy severo (SARS-CoV). La informacinderivada de estos estudios se est apli-cando a la ingeniera de vectores basa-dos en genomas de coronavirus.

La replicacin y transcripcin, ascomo las interacciones virus-husped,estn mediadas por uniones entre el

RNA y protenas virales y del husped,y por interacciones protenaprotena.Nosotros hemos postulado que lareplicacin y transcripcin del genomade coronavirus implica la interaccinde los extremos 5 y 3 del genoma yestamos comprobando esta hiptesise identificando las protenas virales ycelulares implicadas en este proceso.La transcripcin de coronavirusrequiere la sntesis discontinua deRNA, mediante la que el lder se une alas secuencias codificantes, en un pro-ceso de seleccin de copia mediadapor recombinacin de RNA asistidapor homologa de secuencias.Basndonos en una coleccin de datosgenerados por gentica reversa, nues-tro laboratorio ha propuesto unmecanismo de transcripcin.

Hemos demostrado que la extensindel apareamiento entre la cadenanaciente de RNA y secuencias dellder regulan la cantidad de RNA sub-genmico. No obstante, existen meca-nismos reguladores adicionales quemodulan la cantidad de RNA subge-nmico producido, tales como lasinteracciones RNAprotena. Un obje-tivo importante de nuestro programaes el estudio del papel de las chapero-nas de RNA en el cambio de moldedurante la sntesis de RNA viral.Hemos demostrado que las protenasN de coronavirus son chaperonas deRNA.En la segunda rea de trabajo delgrupo, interaccin virus-husped,hemos postulado que protenas espe-cficas del virus, tales como la protenaN que se ha encontrado en el ncleode la clula, y protenas virales no

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Figura 1: Las chaperonas de RNAposiblemente estn implicadas en elcambio de molde durante la trans-cripcin de coronavirus. El panel dela izquierda muestra los elementosimplicados en el cambio de moldedurante la transcripcin en corona-virus. TRS-B y TRS-L, secuencias queregulan la transcripcin, situadas enla zona codificante de un gen o des-pus del lder, respectivamente. En elpanel de la derecha se representa elumbral mnimo de energa que serequiere sobrepasar durante el cam-bio de molde, y que se reducemediante la colaboracin de la cha-peronas de RNA.


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Laboratorio Coronavirus

esenciales, modulan estas interaccio-nes. Utilizando estrategias de genticareversa, basadas en la construccin dedos clones cDNA infectivos produci-dos en nuestro laboratorio para losvirus TGEV y SARS-CoV, estamosestudiando la influencia de los genesde coronavirus en la atenuacin deestos virus, sobre el ciclo celular, osobre funciones relevantes del hus-ped tales como la respuesta inmune.La informacin generada por prote-mica y genmica funcional ser esen-cial para estos estudios. Hemos des-arrollado una vacuna recombinanteque previene el SARS.).


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Figura 2: Anlisis ultraestructural de un mutante dedelecin del SARS-CoV que carece de la protenaE (rSARS-CoV-E), al infectar clulasVero E6. ClulasVeroE6 se infectaron con el virus recombinante rSARS-CoV yel mutante de delecin rSARS-CoV-E y se procesaronpara microscopa electrnica de cortes ultrafinos.

El panel de la izquierda muestra el citoplasma de unaclula infectada, conteniendo sacos de Golgi llenos departculas virales virulentas. El panel de la derechamuestra el citoplasma de una clula infectada con elmutante de delecin, conteniendo los sitios deensamblamiento del virus defectivo. Este mutante estatenuado in vivo y proporciona proteccin completafrente al SARS-CoV virulento.


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Publicaciones seleccionadas

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Enjuanes, L., Sola, I., Alonso, S., Escors, D. and Ziga, S. (2005). Coronavirus reverse geneticsand development of vectors for gene expression. Curr.Top. Microbiol. & Immunol.287, 161-197.

Sola, I., Moreno, J. L., Ziga, S. and Enjuanes, L. (2005). Role of nucleotides immediatelyflanking the transcription-regulating sequence core in coronavirus subgenomic mRNAsynthesis. J. Virol. 79, 2506-2516.

Galn, C., Enjuanes, L. and Almazn, F. (2005). A point mutation within the replicase genedifferentially affects coronavirus genome versus minigenome replication.J. Virol. 79, 15016-15026.

Almazn, F., De Diego, M. L., Galn, C., Escors, D., lvarez, E., Ortego, J., Sola, I., Ziga, S., Alonso,S., Moreno, J. L., Nogales, A. Capiscol, M. and Enjuanes, L. (2006).Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA cloneand a replicon to study coronavirus RNA synthesis s. J. Virol. 80, 10900-10906.

Enjuanes, L., Almazan, F., Sola, I. and Zuiga, S. (2006). Biochemical aspects of coronavirusreplication and virus host-interaction. Ann. Rev. Microbiol. 60, 211-230.


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Investigadores Postdoctorales:Fernando AlmaznIsabel SolaSonia ZigaEnrique lvarez

Investigadores Predoctorales:Carmen GalnCarmen CapiscolJose L. MorenoMarta L. De DiegoAitor NogalesJazmina L. GonzlezBeatriz Gil-Araujo

Tcnicos de Investigacin:Carlos M. SnchezMargarita Gonzlez

Jefe de Lnea:Luis Enjuanes


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Poxvirus y vacunasResumen

Los objetivos fundamentales de nuestrolaboratorio van dirigidos a comprenderlas bases moleculares en la patogenia deagentes infecciosos y su relacin con elhusped, as como utilizar estos conoci-mientos para desarrollar vacunas quepuedan ser efectivas en el control deenfermedades como SIDA, hepatitis C,Malaria y Leishmaniasis. Como sistemamodelo de agente infeccioso y comovector de expresin, utilizamos el virusvaccinia que pertenece a la familia delos poxvirus.

Logros obtenidos en el perodo2005-2006 fueron:

1) Definida la estructura de la formainfectiva mayoritaria del virus vaccinia(IMV) a una resolucin de 4-6 nmpor criomicroscopa y microscopaelectrnica con reconstruccin

topogrfica (Cyrklaff, M et al 2005).

2) Identificado el gen que codifica laprotena responsable del Sndrome deWiskott-Aldrich como necesaria parala patognesis del virus vaccinia facili-tando la salida del virus de la clula(Guerra et al, 2005).

3) Demostrado cmo los alfavirus(Semliki y Sindbis) escapan a la accinde la protena dependiente de RNAbicatenario, PKR, por un novedosomecanismo que evita los requerimien-tos del factor de iniciacin eIF-2 alfa(Ventoso et al, 2006), identificado elfactor transcripcional ATF-3 comonecesario para la induccin de apop-tosis por PKR (Guerra et al, 2006),demostrado accin antiviral del gensupresor de tumores ARF pormediacin de PKR y su liberacin de

nucleofosmina (Garca et al, 2006);hemos escrito un artculo de revisinsobre el impacto de PKR en la biologacelular (Garca et al, 2006).

4) Hemos desarrollado vacunas poten-ciales contra leishmaniasis (Prez-Jimnez et al, 2006) y frente alVIH/SIDA (Gmez et al, 2006a, 2006b).

5) Los resultados obtenidos han dadolugar a la solicitud de tres patentes.


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Figura 1: Mecanismo de accin dela protena quinasa PKR, un regula-dor antiviral y antiproliferativo.


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Cyrklaff, M., Risco, C., Fernndez, J. J., Jimnez, M.V., Esteban, M., Baumeister, W. andCarrascosa, J.L. (2005). Cryo-Electron tomography of vaccinia virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.102, 2772-2777.

Ventoso, I., Sanz, M. A., Molina, S., Berlanga, J. J., Carrasco, L. and Esteban, M. (2006).Translational resistance of late alphavirus mRNA to eIF-2 alfa phosphorylation: a strategyto overcome the antiviral effect of protein kinase PKR. Genes Development 20, 87-100.

Guerra, S., Lpez-Fernndez, L. A., Garca, M. A., Zaballos, A. and Esteban, M. (2006). Humangene profiling in response to active protein kinase PKR in infected cells: involvement of thetranscription factor ATF-3 in PKR-induced apoptosis. J. Biol. Chem 281, 18734-18745.

Garca, M. A., Gil, J.,Ventoso, I., Guerra, S., Domnguez, E., Rivas, C. and Esteban, M. (2006).The impact of protein kinase PKR in cell biology: from antiviral to antiproliferative action.Microb. Mol. Biol. Reviews 70, 1032-1060.

Garcia, M. A., Collado, M., Muoz, C., Mathew, A., Arroyo, J., Esteban, M., Serrano, M. and Rivas,C. (2005). Antiviral action of tumour suppressor ARF. The EMBO Journal 25, 4284-4292.


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Cientficos Asociados:Alberto RamosAlejandro Piris

Investigadores Postdoctorales:Susana GuerraCarmen E. GmezJose Manuel GonzlezPaul HeinenMariang GarcaBeatriz PerdigueroJuan F. Garca

Investigadores Predoctorales:Elena DomingoJos Luis NjeraEva Prez JimnezMagdalena KrupaJacobo NietoAna CceresLucas Snchez

Tcnicos de Investigacin:Mara Victoria Jimnez

Jefe de Lnea:Mariano Esteban


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Modelos animales por manipulacin genticaResumen

En el laboratorio estamos esencial-mente interesados en entender el fun-cionamiento y la organizacin de losdominios de expresin en el genomade mamferos. En particular nos gusta-ra conocer los elementos reguladoresnecesarios que identifican un dominiode expresin determinado y especifi-can su patrn de expresin en espacio,en tiempo y cantidad, con objeto deinterpretar adecuadamente el genoma,especialmente la funcin de lassecuencias intergnicas, y tambinpara eventualmente mejorar el diseode estrategias de transferencia gnica,usadas en transgnesis animal y enterapia gnica.

Usamos varios modelos experimenta-les: fundamentalmente el gen de latirosinasa y tambin el gen de laprotena cida del suero de la leche

de ratn, dos locus independientes,regulados a nivel de desarrollo y espe-cficos de tejido, que nos han servidopara identificar elementos reguladoresfundamentales, como por ejemplo ais-ladores genmicos y regiones contro-ladoras de locus (LCR). Desarrollamosnuestros experimentos in vivo, median-te el uso de animales transgnicos, congrandes construcciones basadas encromosomas artificiales que modifica-mos mediante recombinacin hom-loga, con objeto de investigar el papelfuncional de secuencias especficas. Invitro, analizamos la funcin de lassecuencias aisladoras genmicasmediante anlisis de bloqueo deenhancers y de proteccin frente a losefectos de posicin.


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Figura 1: Determinacin de la base molecular de mutaciones en alelos del gende la tirosinasa de ratn. De izquierda a derecha: ratn albino (Tyr c), ratnhomocigoto para la mutacin extreme chinchilla mottled (Tyr c-em / Tyr c-em), ratnhomocigoto para la mutacin chinchilla mottled (Tyr c-m / Tyr c-m), (ver Lavado A,Olivares C, Garcia-Borron JC, Montoliu L. Journal of Biological Chemistry 2005,280:4817-24).


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Modelos animales por manipulacin gentica

Adicionalmente, nuestro laboratorioha generado y analizado nuevosmodelos animales para el estudio delas anomalas en el desarrollo de laretina asociadas al albinismo. Medianteratones transgnicos hemos logradoexcluir a la melanina e identificado alos dficits en metabolitos intermedia-rios en la va de sntesis del pigmento(como la L-DOPA) como la causaprincipal de las alteraciones visualesobservadas en sndromes hipopigmen-tarios. Finalmente, a travs de colabo-raciones, hemos desarrollado variosmodelos animales adicionales (trans-gnicos y mutantes) para elestudio de enfermedades o procesosasociados al SNC (Alzheimer, dolor).


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Figura 2: Recuperacin de la conexin neuronal ipsilateral entre retina y cerebro de forma independiente de la pigmentacin.Los ratones transgnicos fenotpicamente albinos y con expresin ectpica de tirosina hidroxilasa en el epitelio pigmentado de laretina (TyrTH) logran recuperar las proyecciones axonales ipsilaterales de las clulas ganglionares de la retina, indicadas medianteflechas y teidas con el colorante fluorescente DiI, que aparecen muy disminuidas en animales albinos (izquierda) frente a las cla-ramente presentes en los ratones transgnicos TyrTH (centro), de forma similar a las existentes en animales pigmentados(derecha). OT = nervio ptico. La barra indica 0.5 mm (ver Lavado, A,. Jeffery, G., Tovar, V., de la Villa, P., Montoliu, L. Journalof Neurochemistry 2006, 96:1201-11).


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Lavado, A., Jeffery, G.,Tovar,V., de la Villa, P. and Montoliu, L. (2006). Ectopic expressionof tyrosine hydroxylase in the pigmented epithelium rescues the retinal abnormalitiesand visual function common in albinos in the absence of melanin. Journal of eurochemistry.Feb; 96(4): 1201-11.

Lavado, A. and Montoliu, L. (2006). New animal models to study the role of tyrosinasein normal retinal development. Frontiers in Bioscience. Jan; 1;11: 743-52.

Lavado, A., Matheu, A., Serrano, M. and Montoliu, L. (2005). A strategy to studytyrosinase transgenes in mouse melanocytes. BMC Cell Biology. Apr; 12; 6(1): 18.

Gimenez, E., Lavado, A., Jeffery, G. and Montoliu, L. (2005). Regional abnormalities in retinaldevelopment are associated with local ocular hypopigmentation. Journal of ComparativeNeurology. May; 16; 485(4): 338-47.

Lavado, A., Olivares, C., Garca-Borron, JC. and Montoliu, L. (2005). Molecular basis of theextreme dilution mottled mouse mutation: a combination of coding and noncoding genomicalterations. Journal of Biological Chemistry. Feb; 11; 280(6): 4817-24.


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Investigadores Postdoctorales:Rosa Roy Barcelona(hasta Abril 2005)Victoria Tovar Herrador(hasta Junio 2006)MagdalenaValdivieso Ugarte(desde Junio 2006)

Investigadores Predoctorales:Luca Regales lvarez(hasta Marzo 2005)Julio Pozueta Larios(hasta Abril 2006)ngel Garca DazJulia Fernndez Punzano(Titulado Superior)Esther Zurita Redondo(desde Diciembre 2005)

Tcnicos de Investigacin:Patricia Cozar Lpez(hasta Febrero 2005)Marta Cantero GonzlezJuan Jos Lazcano Duque(desde Mayo 2005 hastaNoviembre 2006)Cristina de Juana Ortn(tcnico en formacin, desdeEnero 2005 hasta Junio 2005)

Jefe de Lnea:Llus Montoliu Jos


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Anlisis funcional del represor transcripcional DREAMResumen

La lnea de investigacin de mi labora-torio durante los ltimos aos ha idoenfocada a comprender las redestranscripcionales que controlan laexpresin gnica en respuesta aseales externas que inducen despola-rizacin de la membrana plasmtica yque se traducen en cambios de laconcentracin intracelular de calcio. Enconcreto, nuestro trabajo se centra enaquellas redes reguladas por elrepresor transcripcional sensiblea Ca2+, DREAM.

Nuestros objetivos incluyen I) el cono-cimiento de estos mecanismosmoleculares tanto en sistemas experi-mentales sencillos como su anlisis invivo mediante modelos animales modi-ficados genticamente o protocolosusando ARNs de interferencia en ani-mal entero y 2) la caracterizacin

fenotpica de modelos animales depatologas humanas con valor potencialpara el rastreo farmacolgico o su apli-cacin en estrategias de terapia gnica.

En el periodo 2005-2006 los principa-les logros de nuestro grupo de investi-gacin estn relacionados con 1) lacaracterizacin de potenciales domi-nios funcionales en la protena DREAM,en particular aquellos mediando el pro-ceso de tetramerizacin, el dominio deunin a DNA y los relacionados con eltrfico de la protena DREAM entre losdistintos compartimentos subcelulares,y 2) el anlisis funcional in vivo delrepresor transcripcional DREAM enratones transgnicos.

Estos estudios nos han permitido iden-tificar genes diana en la glndula tiroi-dea, en el timo y en la mdula espinal,

lo que ha contribuido a desvelar elpapel de DREAM en la funcin tiroi-dea, en la respuesta del sistema inmu-ne y en la respuesta endgena al dolor.


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Figura 1: La localizacin celular deDREAM es un proceso finamenteregulado. El panel superior muestraDREAM-IR en el ncleo y en elcitosol (wt DREAM) o exclusiva-mente en el citosol (mutantesDREAM). El panel inferior muestrala expresin de una GFP dirigidaal ncleo de esas mismas clulas.

Figura 2: La expresin de EFmut-DREAM en el hipocampo de rato-nes transgnicos DREAM/-Gal (A)se correlaciona con cambios en lamaduracin dendrtica de neuronaspiramidales (B) y en aprendizajeespacial. Trabajo realizado en cola-boracin con los Drs. Mara Dierssenand Javier De Felipe.

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Scsucova, S., Palacios, D., Savignac, M., Mellstrom, B., Naranjo, J. R. and Aranda, A. (2005).The repressor DREAM acts as a transcriptional activator on Vitamin D and retinoic acidresponse elements. Nucleic Acids Res. 33: 2269-79.

Savignac, M., Palzcewska, M., Pintado, B., Gutierrez-Adan, A., Mellstrm, B. and Naranjo, J. R.(2005).Transcriptional repressor DREAM regulates T lymphocyte proliferation and cytokinegene expression. EMBO J. 24: 3555-3564.

Gomez-Villafuertes, R., Barrio, J.,Torres, B., Gabellini, N., Savignac, M., Rizzato, F., Pintado, B.,Gutierrez-Adan, A., Mellstrm, B., Carafoli, E. and Naranjo, J. R. (2005).The down regulationof the Na+/Ca2+ exchanger 3 by Ca2+-insensitive DREAM mutants regulates neuronalviability. J. Neurosci. 25: 10822-10830.

Cabrera-H, J. R., Sanchez-Pulido, L., Rojas, A. M.,Valencia, A., Maes, S., Naranjo, J. R. andMellstrm, B. (2006). Gas1 is related to the GDNF family receptors and regulatesRet signalling. J. Biol. Chem. 281: 14330-14339.


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Cientficos Asociados:Britt MellstrmMagali Savignac

Investigadores Postdoctorales:Rosa GmezMalgorzata PalczewskaMarcos RivasEstrella Lpez

Investigadores Predoctorales:J. Rubn CabreraJorge BarrioSofa DomingoTomaso Benedet

Tcnicos de Investigacin:David CamposM. Paz GnzalezRafael Susin

Jefe de Lnea:Jos Ramn Naranjo


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Mecanismos de interaccin entre el virus de la gripey la clula infectada

Resumen

En nuestro grupo, estamos interesadosen el estudio de la contribucin defactores celulares en la expresin delgenoma del virus de la gripe. En estecontexto hemos caracterizado lafuncin celular de dos protenas queinteraccionan con la subunidad PA dela polimerasa del virus de la gripe,hCLE y CHD6. La caracterizacin dehCLE nos ha mostrado que es unmodulador transcripcional y la deCHD6 su posible funcin deremodelador de cromatina. Estas inter-acciones parecen indicar un acopla-miento entre las polimerasas viral ycelular y supondran una unin fsicade la polimerasa del virus con los sitiosintranucleares donde se estngenerando oligonucletidos con cap

por la RNA polimerasa II, que el virusutiliza como iniciadores para su propiatranscripcin. Adems hemos caracte-rizado que durante la infeccin congripe se produce una degradacinespecfica de la forma hipofosforiladade la RNA polimerasa II y que la poli-merasa viral parece ser la responsablede la degradacin, ya que la polimera-sa viral reconstituida, es capaz de pro-ducir este efecto.

La interaccin virus-clula infectada secomplementa con el estudio de la fasecitoslica en la que se realiza latraduccin de los mensajeros virales.Adems de la funcin previamentecaracterizada de la protena NS1 en elaumento selectivo de la traduccin de

los mRNAs virales, hemos caracteriza-do la contribucin de la polimerasaviral en este proceso. Hemos observa-do que la polimerasa viral se asocia acomplejos de preiniciacin de la tra-duccin, de una manera independien-te de NS1. Adems la replicacin viralocurre en condiciones de baja funcio-nalidad del factor celular de unin a lasestructuras 5cap de los mRNAs, laprotena eIF4E, sugiriendo una posibleindependencia de este factor para latraduccin de los mRNAs virales).


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Figura 1: Se representa la entradadel virus de la gripe en una clula, ascomo las interacciones que lapolimerasa viral establece concomponentes celulares tanto en elncleo como en el citoplasma de laclula infectada.


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Prez-Gonzlez, A., Rodrguez, A., Huarte, M., Salanueva, I.J. and Nieto, A. (2006). hCLE/CGI99, a human protein that interacts with the influenza virus polymerase, is a mRNA transcrip-tion modulator. J. Mol. Biol. 362, 887-900.

Lutz, T., Stger, R. and Nieto, A. (2006). Chd6 is a DNA-dependent ATPase and localizesat nuclear sites of mRNA synthesis. FEBS Lett 580, 5851-5857.


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Investigadores Postdoctorales:Thomas Lutz

Investigadores Predoctorales:Idoia BurguiAlicia PrezAriel RodrguezEmilio YangezRoberto Alfonso

Jefe de Lnea:Amelia Nieto


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Transcripcin y replicacin del RNA del virus de la gripeResumen

Los virus de la gripe son patgenoshumanos que causan epidemias anua-les y ocasionalmente pandemias congran morbilidad y exceso de mortali-dad. Nuestro grupo est interesadoen el estudio de los mecanismos dereplicacin y expresin gnica delvirus mediante abordajes de Gentica,Biologa Molecular y Estructural.

Recientemente se han obtenidomodelos 3D de la ribonucleoprotenay del complejo de la polimerasamediante microscopa electrnica quemejoran y amplan la informacin pre-via publicada por nuestro grupo(Torreira et al., manuscrito en revisin;Coloma et al., en preparacin). Lasinteracciones entre la polimerasa y laclula se han analizado mediante an-lisis protemico de complejos intrace-lulares purificados por cromatografa

de afinidad y se han identificado facto-res celulares normalmente involucra-dos en la transcripcin, splicing, eltransporte y la traduccin de mRNAscelulares como asociados al complejode la polimerasa (Jorba et al., manus-crito en revisin).

Se han generado virus recombinantescon mutaciones puntuales o de dele-cin en la protena NS1 que presentanfenotipo termosensible. Algunos deestos mutantes estn afectados en lareplicacin del RNA viral o en suexpresin gnica tarda, mientras queotros presentan defectos en la morfo-gnesis de los viriones (Garaigorta elal. 2005). Algunos de estos virusrecombinantes son atenuados eninfecciones experimentales en el ratnpero son tan inmunognicos como losvirus silvestres y protegen frente

a infecciones letales, por lo quepodran contribuir a la generacin decepas vacunales atenuadas (Falcnet al., 2005.

Otros de estos virus recombinanteshan permitido evaluar la transmisibili-dad de virus de la gripe aviar en infec-ciones experimentales en hurones(Maines et al., 2006).


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Transcripcin y replicacin del RNA del virus de la gripe


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Figura 1: Atenuacin e inmunogenicidad de virus de la gripe mutantes. El panel de arriba muestra los ttulos de virus obtenidos en pulmones de ratones infectados experimentalmentecon los virus WSN,Victoria y los virus mutantes indicados. El panel de abajo presenta la proteccin de los ratones inoculados con los virus mutantes indicados frente a un desafo letalcon virus WSN, medida por la evolucin del peso de los animales.


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Elton, D., Digard, P.,Tiley, L. and Ortn, J. (2005). Structure and function of the influenza virusRNP. In Kawaoka,Y. (ed.), Current Topics in Influenza Virology.Horizon Scientific Press, Norfolk, pp. 1-92.

Falcn, A.M., Fernandez-Sesma, A., Nakaya,Y., Moran,T.M., Ortn, J. and Garca-Sastre, A. (2005).Attenuation and immunogenicity in mice of temperature-sensitive influenza viruses expressingtruncated NS1 proteins. J. Gen.Virol., 86, 2817-2821.

Garaigorta, U., Falcon, A.M. and Ortin, J. (2005). Genetic analysis of influenza virus NS1 gene:a temperature-sensitive mutant shows defective formation of virus particles.J Virol, 79, 15246-15257.

Maines,T.R., Chen, L.M., Matsuoka,Y., Chen, H., Rowe,T., Ortin, J., Falcon, A., Nguyen,T.H., Mai le,Q., Sedyaningsih, E.R., Harun, S.,Tumpey,T.M., Donis, R.O., Cox, N.J., Subbarao, K. and Katz, J.M.(2006). Lack of transmission of H5N1 avian-human reassortant influenza viruses in a ferretmodel. Proc Natl Acad Sci USA, 103, 12121-12126.

Ortin, J. and Parra, F. (2006). Structure and Function of RNA Replication.Annu Rev Microbiol, 60, 305-326.


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Investigadores Postdoctorales:Susana de Lucas

Investigadores Predoctorales:Roberto AlfonsoRoco ColomaUrtzi GaraigortaNria JorbaEva TorreiraMercedes ArredondoPatricia Resa

Tcnicos de Investigacin:Yolanda FernndezNoelia Zamarreo

Jefe de Lnea:Juan Ortn


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Caracterizacin molecular y epidemiologa de torovirusResumen

Los torovirus son virus con RNA decadena simple y polaridad positiva quepertenecen a la familia Coronaviridae, yson causantes de enfermedades ent-ricas en distintos mamferos entre losque se encuentra el hombre. Las par-tculas virales son polimrficas y cons-tan de cuatro protenas estructurales:la protena de la nucleocpsida (N), laprotena de membrana (M), la prote-na hemaglutinina esterasa (HE) y laprotena de las espculas (S). Estas dosltimas, HE y S, dan lugar a una doblecorona de espculas en la superficie dela partcula viral, y estn implicadas enla unin a receptores celulares. El aisla-do equino Berne virus (BEV) es elnico que ha podido ser crecido encultivo celular hasta el momento, porello, es el virus que estamos utilizandocomo modelo para la caracterizacinmolecular de torovirus.

Uno de los objetivos del laboratorio esestudiar la estructura y morfologa delas partculas virales por distintos pro-cedimientos de microscopa electrni-ca. Por otra parte, para caracterizar elproceso de morfognesis detorovirus estamos produciendo unacoleccin de anticuerpos policlonales ymonoclonales, con los cuales podemosestudiar la localizacin intracelular delas protenas virales a lo largo de lainfeccin, tanto por microscopa confo-cal como por inmunomicroscopa elec-trnica. De forma paralela estamoscaracterizando las protenas estructura-les de BEV mediante su expresin ensistemas heterlogos. La expresin ypurificacin de estas protenas permiti-r el desarrollo de nuevas herramientasdiagnsticas, as como la generacin devacunas frente a torovirus.

Otro objetivo del laboratorio es elestudio epidemiolgico de torovirusporcino en Espaa. Para ello, en primerlugar estamos desarrollando lasherramientas necesarias para estable-cer ensayos serolgicos para ladeteccin de anticuerpos frente alvirus en muestras de suero, as comoensayos virolgicos que nos permitandetectar la presencia del virus enmuestras clnicas.


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Caracterizacin molecular y epidemiologa de torovirus


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Figura 2: Colocalizacin de la protena M de BEV con la protena ERGIC-53 del compartimento inter-medio celular a 10h post-infeccin.

Figura 1: Seccin ultrafina de clulas infectadas con BEVmostrando estructuras tubulares presentes en el ncleo quese marcan especficamente con anticuerpos contra la protenaN de BEV.


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Gonzlez, B., Reina, R., Garca, I., Andrs, S., Glaria, I., Alzueta, M., Mora, M. I., Rodrguez, D.,Rodrguez, J. R., Esteban, M., Grill, M. J., Jugo, B., Blacklaws, B. A., Harkiss, G. D., Chebloune,Y.,Lujn, G., de Andrs, D. and Amorena, B. (2005). Mucosal immunization of sheep with aMaedi-Visna virus (MVV) env DNA vaccine protects against early MVV productive infection.Vaccine 23, 4342-4352.

Abaitua, F., Rodrguez, J. R., Garzn, A., Rodrguez, D. and Esteban, M. (2006). Potentiation ofthe immune response to HIV with MVA and DNA vectors expressing env and the cytokinesIL-12 and IFN-?. Virus Res. 116, 11-20.

Rodrguez, D., Brcena, M., Mbius, W., Schleich, S., Esteban, M., Geerts, W. J. C., Koster, A. J.,Griffiths, G. and Krijnse Locker, J. (2006). A vaccinia virus lacking A10L: viral core proteinsaccumulate on structures derived from the endoplasmic reticulum.Cellular Microbiology 8, 427-437.

Morrot, A., Cockburn, I. A., Overstreet, M., Rodrguez, D. and Zavala, F. (2006). ProtectiveCD8+T cells induced by malaria sporozoites do not undergo modulation of IL-7 receptorexpression. Infec. and Immunity 74, 2495-2497.

Garzn, A., Maestre, A., Pignatelli, J., Rejas, M.T. and Rodrguez, D. (2006). New insightson the structure and morphogenesis of Berne virus. Adv. Exp. Med. Biol. 581, 175-180.


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Investigadores Postdoctorales:Soledad Blanco Chapinal

Investigadores Predoctorales:Ana Garzn GutirrezAna M Maestre MernsJaime Pignatelli GarrigsAna Isabel Garca Mace

Tcnicos de Investigacin:Ignacio Rodrguez Otero

Jefe de Lnea:Dolores Rodrguez Aguirre


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Biologa molecular de birnavirus


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Resumen

Los virus de la familia Birnaviridae secaracterizan por la posesin de unacpsida icosadrica nica que encierraun genoma dsRNA bipartito. Laestrategia replicativa de los birnavirusse diferencia en gran medida de la delos virus dsRNA prototpicospertenecientes a la familia Reoviridae.Estas diferencias tienen un reflejodirecto sobre la morfognesis de lapartcula y los procesos de replicaciny transcripcin del genoma viral. Lamayor parte de nuestros estudios serealizan empleando el virus de labursitis infecciosa (IBDV), un impor-tante patgeno aviar, como modeloviral. Nuestro inters se centra en lacaracterizacin estructural y funcionalde las diferentes protenas viralesy en el estudio del proceso morfoge-ntico de la partcula viral y delcomplejo ribonucleoproteico (RNP).

La informacin obtenida se aplica aldesarrollo de nuevas estrategias antivi-rales potencialmente transferibles alsector industrial.

La caracterizacin de la estructuraatmica de la protena de la cpsida(VP2) (Garriga et al., 2006) nos hapermitido determinar con precisinlos contactos inter e intramolecularesimplicados en el proceso de ensam-blaje de la partcula, as como la locali-zacin de las regiones de la protenaresponsables de su plasticidad estruc-tural (Luque et al., en prensa). Estosestudios han conducido al desarrollode una vacuna de subunidad frente aIBDV, basada en la utilizacin deensamblados subvirales (SVPs),actualmente en fase ensayos decampo. La reciente determinacin dela estructura atmica de la RNA

polimerasa viral (VP1) (Garriga et al.,en preparacin) ha abierto nuevas vaspara el estudio de los procesos dereplicacin y transcripcin del genomaviral y para el diseo de nuevosagentes antivirales. La utilizacin demutantes dominantes negativos de laprotena VP3, una protena multifun-cional que dirige el proceso morfoge-ntico y acta como transactivador dela RNA polimerasa viral, nos ha permi-tido desarrollar una nueva estrategiade control de la replicacin viral(Gonzlez et al., 2005).

Figura 1: Estructura cristalinade la RNA polimerasa dependientede RNA del virus de la bursitis infecciosa.


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Biologa molecular de birnavirus


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Figura 3: Micrografa de microscopa confocal de una clula deinsecto (HighFive) infectada con un baculovirus recombinanteque dirige la expresin de la protena VP3 del virus de la bursitisinfecciosa. La seal verde (Alexa 488) corresponde a la protenaVP3. La seal azul (ToPro-3) corresponde a la tincin nuclear.

Figura 2: Vista interna del eje quinario de la partcula del virusde la bursitis infecciosa.


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Gonzlez, D., Rodrguez, J. F. and Abaitua, F. (2005). Intracellular Interference of InfectiousBursal DiseaseVirus. J. Virol. 79: 14437-14441.

Garriga, D., Querol-Audi, J., Abaitua, F., Saugar, I., Pous, J.,Verdaguer, N., Caston, J. R., Rodrguez,J. F. (2006).The 2.6-Angstrom Structure of Infectious Bursal DiseaseVirus-Derived T=1Particles Reveals New Stabilizing Elements of the Virus Capsid. J. Virol. 80: 6895-6905.


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Cientficos Asociados:Dolores Gonzlez de Llano

Investigadores Postdoctorales:Ana Oa Blanco

Investigadores Predoctorales:Aitor Navarro NietoDaniel Luque BuzoLaura DelguiNerea IrigoyenVergara

Tcnicos de Investigacin:AntonioVaras Ros

Jefe de Lnea:Jos F. Rodrguez Aguirre


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Modulacin de la respuesta inmune por virusResumen

Estamos investigando los mecanimosmoleculares utilizados por virus DNAde gran tamao (poxvirus y herpesvi-rus) para modular la respuesta inmunedel husped.

Estamos caracterizando protenas vira-les secretadas que unen citoquinas yquimioquinas, importantes mediadoresde las respuestas inflamatoria e inmuneactivadas tras la infeccin viral. Porejemplo, hemos identificado un nuevodominio de unin a quimioquinas,dominio SECRET (smallpox-encodedchemokine receptor), que se encuentraen cinco protenas de poxvirus, bienformando parte del receptor viral delfactor necrosante de tumores o expre-sado de forma independiente.

Este dominio est presente en la pro-tena CrmB del virus de la viruela, uno

de los virus ms virulentos jams cono-cidos en la historia de la humanidad.

Estamos utilizando el modelo mousepoxpara estudiar la actividad inmunomodu-ladora de los receptores virales de cito-quinas y su contribucin a la patogne-sis viral. Mousepox es una enfermedadparecida a la viruela humana que estcausada por el virus ectromelia, unpatgeno natural del ratn, y constituyeuno de los modelos ms poderosos depatognesis viral. La identificacin deprotenas virales con actividad inmuno-moduladora nos ofrece nuevas herra-mientas y estrategias anti-inflamatoriasque pueden tener aplicaciones terapu-ticas en la clnica.

En colaboracin con compaasbiotecnolgicas estamos trabajando en eldesarrollo de las protenas inmunomo-

duladoras virales como medicamentospara tratar enfermedades humanas cau-sadas por reacciones inmunopatolgicas.

Por ltimo, hemos extendido el con-cepto de modulacin de quimioquinasa otros patgenos y, en colaboracincon parasitlogos, hemos descrito laprimera protena de unin a quimio-quinas identificada en un parsitohumano (Schistosoma mansoni).


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Modulacin de la respuesta inmune por virus


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Figura 2: Microscopa electrnica de clulas infectadas con elvirus ectromelia

Figura 1: Una nueva familia de protenas virales de unin aquimioquinas que contienen el dominio SECRET (smallpoxvirus-encoded chemokine receptor).


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Jamieson,T. , Cook, D., Nibbs, R. J. B., Rot, A., Nixon, C., Mclean, P., Alcami, A., Lira, S. A.,Wiekowski, M. and Graham, G. J. (2005).The chemokine receptor D6 limits the inflammatoryresponse in vivo. Nature Immunol. 6, 403-411.

Smith, P., Fallon, R. E., Mangan, N. E., Walsh, C. M., Saraiva, M., Sayers, J. R., McKenzie, A. N. J.,Alcami, A. and Fallon, P. G. (2005). A human parasite blocks inflammation by secretionof a chemokine binding protein. J. Exp. Med. 202, 1319-1325.

Alejo, A., Ruiz-Argello, M. N., Ho,Y., Smith, V. P., Saraiva, M. and Alcami, A. (2006).A chemokine binding domain in the tumour necrosis factor receptor from variola(smallpox) virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 5995-6000.

Fallon, P. G. and Alcami, A. (2006). Pathogen-deriven immunomodulatory molecules: futureimmunotherapeutics? Trends Immunol. 27, 470-476.

Poole, E., King, C. A., Sinclair, J. H. and Alcami, A. (2006).The UL144 gene product of humancytomegalovirus activates NFkB via a TRAF6-dependent mechanism.EMBO J. 25, 4390-4399.


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Investigadores Postdoctorales:Al AlejoBegoa Ruiz-ArgelloAbel ViejoEdel McNeelaAlberto Lpez BuenoDaniel Rubio

Investigadores Predoctorales:Marcos PalomoSergio MartnMar Fernndez de Marco

Tcnicos de Investigacin:Roco Martn

Jefe de Lnea:Antonio Alcam


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Biología Molecular y Celular - CNBdrodrig/memorias CNB/memoria 2005-2006... · de la gripe y la...

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