Biología Molecular 2

Transcripciones de Cátedras Química Fisiológica y Patológica

Macarena Las Heras – Hugo Díaz – Fabián Pinto – Marjorie Reyes – Carlos Rivera – Rocío Romero

Universidad de Chile | Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

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26-04-2011 Biología Molecular II

Mario Chiong

Procedimientos para inhibir la expresión génica

Estos procedimientos tienen que ver con el uso de dos estrategias, una de ellas es el DNA Anti Sentido (DNA AS) y el segundo, con RNA interferente (iRNA)

Corresponden a pequeños oligonucleótidos (20-30 bases de DNA), desde el punto de vista farmacéutico, lo que se usa son trozos pequeños de DNA monohebra que son antisentido, es decir, que se aparean con el RNA mensajero y por lo tanto tienen el sentido opuesto a la lectura, de ahí su nombre. Lo que se utiliza en la práctica son derivados de estos ácidos nucleicos, que corresponden a nucleótidos fosforotioatos (S-ODN, El fosfato en vez de tener O tiene S) que aumentan la estabilidad del oligonucleótido, de manera de ser utilizados

DNA AS




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mediante diversas aplicaciones (Inyectable, Digestión Oral, Inhalación y Aplicación Tópica), además son resistentes a hidrolisis por medios enzimáticos, particularmente a endonucleasas y exonucleasas.

Como vemos en la imagen de arriba, la situación normal es que el DNA se transcriba, por medio de la RNApol, formando un transcrito primario el cual se traduce a una proteína mediante ribosomas. Uno de los mecanismos por el cual funciona el DNA AS es que este oligonucleótido se aparea con el mRNA y, una vez apareado, impide la traducción porque a éste no se pueden unir los ribosomas, por lo tanto la cantidad de proteínas que se produce es bastante menor. El segundo método es que el mRNA al aparearse con el oligonucleótido, ahora, es reconocido por RNAasa tipo H y posteriormente el RNA es degradado.

Con el uso de oligonucleótidos complementarios al RNA es posible disminuir la cantidad de proteínas producidas dentro del organismo. Estos oligonucleótidos pueden ser dirigidos de manera altamente específica contra un RNA particular, pues es secuencia especifica. Dentro de medicamentos que utilizan esta tecnología encontramos:

• Vitravene: Es un oligonucleotido AS. Se administra en forma intravitreal (En forma ocular) en apcientes que tienen SIDA y que sufren infecciones de la retina producidas por citomegalovirus. Actualmente se comercializa de forma oficial.

• Antisentidofosforotioato:(administrado i.v. y proximamente rectal) para tratar la enfermedad de Crohn’s (los neutrófilos atacan células intestinales y las destruyen). Administración del antisentido por 26 días produjo una protección total en 75% de los pacientes por 6 meses (www.isispharm.com).

Existe una serie de oligos AS que se encuentran terminando su fase III de ensayo clínico, son producidos por genzyme y se espera que salga al mercado el próximo año. Su nombre es mipomersen y son dirigidas contra la proteína apoB·100, esta proteína tiene que ver con el anclaje de la lipoproteína LDL oxidada hacia el endotelio, provocando la formación de la placa de ateroma y su uso va a ser para combatir el riesgo de arteriosclerosis en pacientes con colesterol elevado.

Hace algunos años se dio el premio nobel por el descubrimiento de esta tecnología. En forma natural hay dos tipos de iRNA, los miRNA (micro RNA) y los siRNA (o shRNA), el iRNA propiamente tal existe sólo en forma sintetica. Ambos RNA (miRNA y siRNA)ocurren naturalmente y su función es regular la expresión génica, la diferencia entre ellos es donde se originan. Los siRNA se fabrican en respuesta a un RNA foráneo, habitualmente un RNA viral.

iRNA

http://www.isispharm.com/�




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Una célula se ve infectada por un RNA viral, por ejemplo a un retrovirus, y esa célula responde fabricando RNA de doble hebra (dsRNA) que da origen al siRNA. En cambio el miRNA, es un RNA que se produce en forma natural en todas las células desde levaduras, hasta mamíferos y se forma a través de un RNA mensajero de hebra simple (ssRNA), que se forma una horquilla y regula post-traduccionalmente la expresión de muchos genes, prácticamente todos los genes dentro de una célula humana están regulados por estos miRNA y es a menudo no 100% complementario al blanco.

Sintesis de miRNA

La síntesis del miRNA ocurre a partir de un mRNA maduro, que tiene el extremo 5’ modificado por el CAP y el extremo 3’ con poli A y forma una horquilla (ver la imagen superior) denominada miRNA primario (pri-miRNA),

la formación de ésta estructura ocurre en el nucleo. Existe un par de proteínas (Drosha y Pasha) que forman el complejo microprocesador el cual se une a la zona de horquilla indicada con cabezas de flechas; la enzima Pasha reconoce la horquilla y la enzima Drosha, que tiene una actividad RNAsa (III)endonucleasa, corta separando la horquilla formando el pre-miRNA. Esta horquilla posteriormente es transportada al citoplasma por una proteína de transporte (Exportina 5), que es una carioferina1;y es en el citoplasma donde es reconocida por otra proteína que se conocen con el nombre de Dicer (una Argonauta2

) la cual también es una endonucleasa, ésta que remueve la parte superior de la horquilla formando un RNA de doble hebra, el cual tiene una longitud exacta de 21-22pb (de no ser así no es posible formar el miRNA). Posteriormente el dupletemiRNA es reconocido por el complejo RISC, separando las dos hebras (mediante una helicasa) y generando el miRNA maduro, el cual tiene dos caminos, ser degradado (mecanismo similar al que ocurre con DNA AS) o pueden bloquear la traducción de proteínas.

1 Factor de transporte nucleocitoplasmatico que requiere Ran y GTP 2 Enzima RNAsa




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Estos miRNA en forma natural, están regulados en la expresión post-transcripcional de prácticamente todos los genes del organismo. Son muy importante en el desarrollo (en mamíferos se descubrieron en la embriogénesis), además tienen regulación metabolica (controlan la sisntesis, secreción y exportación de insulina) y generalmente un miRNA es codificado por muchísimos genes3

Existen tres mecanismos de acción:

.

1. Unión del complejo RISC al miRNA y degradación. 2. Unión del complejo RISC al miRNA y bloqueo de la traducción. 3. Se ha descrito recientemente, que le complejo RISC es capaz de viajar al nucleo,

unirse al DNA y producir hipermetilación del DNA, silenciando la expresión génica. Este mecanismo permite controlar, sin modificar el patrón de expresión génica, la expresión de un gen a nivel de la cantidad de mRNA. Este método bloquea la traducción o la estabilidad del mRNA.

Los RNA interferente, son muy parecidos al miRNA, pero se producen en respuesta a un RNA foráneo, también producen metilación tanto de histonas como de DNA. Se utiliza como herramienta de investigación, pues pueden ser fabricados para producir Knockdown

siRNA

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de la expresión génica.

3 Expresión multiloci, varios locus expresan el mismo miRNA 4 Disminución de la expresión de un gen existente. Knockout: eliminación del gen.




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ExpresióndesiRNA

• Para expresión transiente: Se puedeentregara lacélulaelRNAdúplex (RNA doble hebra)

• Paraexpresiónestable: Se pueden entregar mediante un vector que contiene un DNA para producir un RNAhorquilla. Elvector puedeserplasmidio, retrovirus, adenovirus.

Entrega delsiRNA

• Paracultivocelular – Transfecciónconliposomas – Electroporación

• In Vivo – Liposomas – Conjugaciones

• RNAdefagosbacterianos • Cholesterol • Atelocolágeno

– Sistemasvirales(ejretrovirus&adenovirus)

Entrega y Procesamiento de los siRNA

Existen virus que se están utilizando mucho en terapia génica, éstos producen una

horquilla la cual se conoce con el nombre de shRNA (para diferenciarlos de los siRNA




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endógenos), éste utiliza el mismo mecanismo que los miRNA. El otro método es entregar el

DNA de doble hebra por transfección y éste reconoce al complejo RISC para ser utilizado enel

control de la expresión génica.

Por lo tanto, hay dos métodos actualmente usados, en forma exitosa, para el control de

la expresión génica, reduciendo la cantidad de proteínas blanco que uno quiere ver:

• Los oligos AS, que son ácidos desoxirribonucleicos de tipo fosforotioatos.

Existe un producto en el mercado (Vitravene).

• El método de los iRNA aún está en fase experimental.

En ambos casos se produce un knockdown de la expresión génica.

Farmacogenómica

Para entender algo de fármacogenómica, debemos entender el concepto de

polimorfismo genético (múltiples formas de un mismo gen). El proyecto genoma humano

también determinó el descubrimiento de los polimorfismo genéticos. Existen mutaciones

puntuales en el genoma, de muy alta frecuencia (sobre el 1% de la población), las cuales son

responsables de las diferencias entre individuos.

Siendo mutaciones tan frecuentes ¿Tiene consecuencias funcionales en el gen? SI, por lo

tanto, los genes entre individuos son distintos, ya que tienen distintos polimorfismos. La

fármacogenómica, estudia las bases genéticas y la fármacogenética estudia las bases

fenotípicas, que explican diferencias en respuesta farmacológicas para una población. Es

conocido que no todos los pacientes responden igual a una misma dosis de medicamento,

hay pacientes que responden, otros que no lo hacen y otros que generan reacciones

adversas, la diferencia de estas reacciones es la diferencia genética (La farmacogenómica es la

ciencia que estudia estas diferencias geneticas).

Por ejemplo, tres mujeres con una misma enfermedad (depresión), misma altura, mismo

peso, misma edad, las tres con depresión y el médico les prescribe la misma dosis del mismo

medicamento (Nortripilina 100 mg); sin embargo, la respuesta es diferente en los tres casos:

• Persona A Reacción adversa




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• Persona B Pasa nada

• Persona C Se siente mejor

¿POR QUÉ?

Estas diferencias están

dadas por diferencias

genéticas y en el caso de la

Nortripilina se debe a un

metabolismo diferente del

fármaco. Al realizar un

análisis de la cantidad de

nortriptilina en la sangre, se

observará distintas concentraciones del medicamento en la sangre.

Una de las primeras

áreas de estudio de la

farmacogenómica se

centró en la

metabolización de los

medicamentos y en este

tipo de metabolización,

actualmente todos

podemos ser catalogados

en tres tipos de

metabolizadores: Normales, Rápidos, Lentos; depende del tipo de metabolizador de la

persona, es la dosis del medicamento a prescribir.

Es decir, el concepto de medicamento que se utiliza actualmente es basada en el

paciente “promedio”, por lo tanto se utiliza una dosis estándar para todos por igual. Hace un

par de años atrás se empezó a utilizar la farmacogenómica.

Hace 3 años atrás, tanto la Food and Drugadministration, como la Comunidad Europea

estableció como obligatorio hacer estudios de farmacogenética dependiendo de la población




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en la que iba a ser utilizado el medicamento para todos los medicamentos nuevos que salen al

mercado. Por lo tanto, en los medicamentos nuevos se recomendará la dosis de acuerdo a los

polimorfismos presentes en una determinada población (Puede ser ordenada por etnias).

En el futuro, se plantea el análisis de DNA como herramienta de diagnóstico, además

permitirá predecir el medicamento adecuado y la respectiva dosis.

La farmacogenómica determina la

influencia genética en la farmacocinética

y farmacodinámica de los medicamentos.

Cada uno de los componentes del ADME

es susceptible a una variación genética,

también, toda la maquinaria del sistema

de transducción de señales es susceptible a modificaciones genéticas.Por lo tanto, al hablar

de polimorfismos, hay que tener incorporado todas las probabilidades de variación genetica

en cada uno de los componentes del sistema de manejo de los medicamentos, tanto

farmacocinéticos, como farmacodinámicos.

Por ejemplo, al observar un gen involucrado en el metabolismo de un medicamento

existe el gen silvestre, aquel que presenta un polimorfismo (homo y hetero cigoto).

Por otro lado,

enzimas metabolizadoras

de medicamentos,




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principalmente enzimas asociadas al citocromo p450 hepático, de estas enzimas existen

cuatro enzimas que dan cuenta de la metabolización del 80% de todos los medicamentos

existentes (citocromo 3A4, 5 y 7; citocromo 2C9, citocromo 2D6 y citocromo 2C19). Por lo

tanto, si queremos hacer una clasificación genética de la metabolización, lo primero a realizar

es revisar los polimorfismos en los cuatro citocromos mencionados anteriormente.

Por ejemplo, el citocromo

involucrado en la metabolización de

la nortriptilina es el CYP2D6, en

éste el polimorfismo que existe es

el número de copias del gen del

CYP2D6. En la imagen observamos

los distintos polimorfismos

existentes para el CYP2D6. Cabe

destacar, que a mayor número de

copias del gen, es mayor la cantidad

de citocromos presentes. Por lo

tanto, la dosis a utilizar debiese

depender del polimorfismo

existente en el citocromo.

El otro componente a

considerar, además de la metabolización es la eficacia del medicamento. Suponiendo que la

toxicidad del medicamento es igual en los tres individuos (A, B y C), suponiendo, además, que

un individuo tiene el receptor WT y otro tiene el receptor mutado (heterocigoto que no

funciona bien); uno puede ver que en el individuo que posee el receptor de tipo silvestre

(WT) son suficientes concentraciones de entre 100-200 mg para tener máxima eficacia a una

mínima toxicidad; al seguir observando los gráfico vemos que el tercer individuo tiene más

probabilidad de generar reacciones adversas que el primer individuo.




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Otro ejemplo, es el receptor β2-adrenérgico humano (7TM acoplado a proteína G). Este

receptor presenta dos polimorfismos en el extremo –NH2, uno en el codón 16 (Arg/Gly) y otro

en el codón 27 (Gln/Glu). Si observamos el codón 16, aquellos individuos que poseen Arg/Gly

o Gly/Gly, la respuesta es constante; mientras que los individuos que poseen Arg/Arg, al cabo

de minutos empieza a disminuir la respuesta. Es decir, el polimorfismo Arg/Arg produce

desensibilización (downregulation) del receptor, mientras que aquellos individuos

heterocigotos o Gly/Gly no hacen downregulation.

Por ejemplo, en el caso de individuos asmáticos, aquellos que son Arg/Gly o Gly/Gly

podrán utilizar salbutamol de forma crónica y siempre tendrán la misma respuesta, en cambio

aquellos que son Arg/Arg tendrán que aumentar la dosis cada cierto tiempo, hasta llegar al

punto que se vuelven resistentes al uso del salbutamol.

El downregulation es producido por endocitosis del receptor y está relacionado con la

unión de la proteína G al extremo C terminal, no tiene relación con la afinidad con el receptor.




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Es posible observar este

polimorfismo mediante una

electroforesis, previa amplificación por

PCR y, mediante el uso de enzimas de

restricción es posible reconocer el

cambio en la mutación (Se utilizan

enzimas de restricción, ya que cortan el

DNA de forma específica según la

secuencia); dado que el cambio de Arg

por Gly es generado por el cambio en

una base, la enzima corta si esta la secuencia correcta y, si existe la mutación la enzima no lo

hace. Si es Arg/Arg no corta, si es Gly/Gly corta, y si es heterocigoto uno de los genes se corta,

el otro no. Lo mismo ocurre al observar la posición 27: Si es Glu/Glu no corta, y el

heterocigoto presenta ambos

patrones.

El 16% de la población

Chilena desensibilizaal

receptor, no así el resto. Tal

como vemos en el recuadro el

porcentaje de desensibilización

depende de la etnia. Por esta

razón, el tratamiento al asma

en la población afroamericana es bastante exitoso (Bajo porcentaje de desensibilización al

receptor). Por el contrario, la población China posee un porcentaje alto de desensibilización.

A continuación vemos un estudio de un polimorfismo en el receptor β 1-adrenergico,

específicamente en la mutación Arg389Gly de este receptor en pacientes con Insuficiencia

Cardiaca tratados con carvelidol. Este medicamento es un bloqueador inespecífico de los

receptores β1- y β2-adrenérgicos, además posee propiedades antioxidantes. (La herramienta

de combate para pacientes con IC es realizar un bloqueo de los receptores β-adrenérgicos).




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El estudio está

realizado en pacientes

con IC grado 4, tratados

con carvelidol por 6

meses.Se observan

parámetros de función

cardiaca: La fracción de

Eyección es el

porcentaje de sangre,

contenida en el corazón,

expulsada al producirse el latido cardiaco; una persona normal expele más del 40% de la

sangre contenida en el corazón, un valor menos índica patología de IC. Este padecimiento

genera que los pacientes no puedan recorrer grandes distancias, ya que se cansan con

facilidad, además de una alta frecuencia cardiaca. Al final del tratamiento, en los pacientes

que son Arg389Arg, se observa un aumento significativo de la FE, un aumento no significativo

en la DR y una disminución en la FC; en otras palabras en los pacientes con este polimorfismo

se observa una respuesta compensatoria, generando mejoría.

En la población Chilena no se encontró homocigotos Gly389Gly.

En el caso de los pacientes heterocigotos Arg389Gly no se observan diferencias

significativas, por lo tanto no respondieron al tratamiento.

Actualmente, antes de prescribir carvelidol, a los pacientes que llegan descompensados

a la unidad coronaria se les realiza una determinación del receptor β1, de manera de saber si

son hetero u homocigotos para el polimorfismo.

Como dato relevante, cabe mencionar que el 50% de la población presenta un

polimorfismo y el otro 50% presenta el otro. Por lo tanto, sólo la mitad de los pacientes

responden al tratamiento con carvelidol.

A continuación se observan dos polimorfismos, a modo de ejemplo, el de

metabolización y la eficacia de la droga, tenemos homocigoto normal, heterocigoto y

homocigoto polimórfico. Si ordenamos al aleatoriamente, podríamos tener silvestre/silvestre,




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polimórfico/polimórfico, dado que son genes distintos (cada gen tiene su genotipo). Todas las

alternativas existentes para estos dos polimorfismos explican la gran variabilidad que existe

en la población con respecto a la eficacia de los fármacos en el tratamiento de una patología.

Si destacamos que los polimorfismos ocurren en cada uno de los genes involucrados,

tanto en la farmacocinética, como en la farmacodinámica, la respuesta global a un

medicamento es mínima.

Un ejemplo de cómo se utiliza

actualmente la farmacogenómica es el

tratamiento en cáncer de mama, se

comenzó a utilizar un marcador genético

para la Herceptina. El receptor Her2

permite la unión a la Herceptina en las

células de cáncer mamario y cuando está

presente este receptor hay respuesta

terapéutica, que consiste en muerte de la

célula cancerosa. Existen células que no

tienen este receptor (Her2-) y estos pacientes no producen respuesta terapéutica. Por lo

tanto, existe un diagnóstico genético para determinar la presencia o auscencia del gen que

codifica para este receptor y el 25% de los pacientes son Her2+, es decir, solo el 25% de los

pacientes puede ser tratado con Herceptina. En cualquier clínica privada, el primer análisis

genético antes de comenzar a tratar un cáncer de mama es la determinación de la presencia

del receptor Her2.




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Otro ejemplo, es en un futuro predecir, a partir de la farmacogenómica individual, los

medicamentos y las dosis a utilizar.

Actualmente existe un test genético capaz de predecir el uso de Warfarina

(anticoagulante utilizado en pacientes con problemas coronarios o de hipercoagulación), el

problema de utilizar cualquier anticoagulante es el estrecho margen farmacéutico. Es decir,

bajas dosis, no produce respuesta; por el contrario, una sobredosis, produce fallo en la

coagulación, por lo tanto el paciente muere de hemorragia. Debido a este estrecho margen

terapéutico, fue el primer blanco a ser estudiado, por farmacogenómica, para determinar los

polimorfismos. La estrategia era predecir, mediante análisis farmacogenéticos o

farmacogenómicos, la dosis de Warfarina a utilizar en un determinado paciente.

Uno de los polimorfismos

involucrados en la farmacocinética de la

Warfarina es el Citocromo 2C9 (CYP2C9),

éste corresponde al 20% de todas las

enzimas hepáticas, hay dos frecuencias

alélicas interesantes (CYP2C9*2 con una

frecuencia alélica del 10% y CYP2C9*3 con

una frecuencia alélica del 8%). El CYP2C9 predice con mayor exactitud el metabolismo de la

Warfarina.

INR: Índice de coagulación.




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La warfarina tiene un isómero óptico, la S-warfarina es el principio activo y es

metabolizado por CYP2C9. La S-warfarina inhibe a la vitamina K reductasa, la cual controla la

trasformación de factores hipofuncionales en funcionales.

Observando el ciclo de la imagen anterior, vemos que para realizar el proceso de

coagulación se requiere de Vit K, ésta se obtiene gracias a la Vitamina K Reductasa. En los

individuos con hipercoagulación, se inhibe la Vit K Reductasalo que reduce la disponibilidad

de Vit K, con esto se reduce la cantidad de factores de coagulación, son lo que se corrige la

hipercoagulación.

Si volvemos a observar el esquema, existen dos blancos farmacogenómicos

interesantes para el control de la coagulación mediante el uso de Warfarina: Uno, es el

CYP2C9, pues éste controlará la velocidad de degradación, por lo tanto la concentración

plasmática disponible de S-warfarina y el otro blanco, son polimorfismos en la Vit K-

Reductasa, los cuales pueden aumentar o disminuir la interacción con la Warfarina y también,




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controlar la actividad enzimática de ésta enzima. Por lo tanto, cuando pensamos en

warfarina, los blancos a estudiar son el CYP2C9 y la VitK-Reductasa.

Los polimorfismos del CYP2C9 tienen distintos

tiempos de clearance, al observar la imagen vemos

las distintas variantes (homo y heterocigotos). Es

evidente que la dosis a utilizar en cada uno es

distinta, dado que cada polimorfismo genera distinto

tipo de metabolización.

Existen varias variantes de la VitK-

Reductasa (VKORC1), en la imagen vemos

la cantidad de medicamento necesaria

para producir el 50% de inhibición de la

actividad enzimática. La variante A/A es

más sensible que el resto de las variantes,

por lo tanto, en este caso, se requiere

menos warfarina para producir el 50% de

inhibición.

Entonces utilizando distintos parametros como edad, peso, genotipo del CYP2C9 y

genotipo de la VKORC1, podemos hacer una fórmula matemática que nos permite

determianrla dosis ( ) en función de los distintos polimorfismos. A continuación se

observan las ecuaciones corregidas para los distintos parámetros. La fórmula final permite

predecir con certeza la dosis apropiada de warfarina para un paciente.




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El año 2006, otro grupo incluyo, también, el sexo. Esta fórmula predice la dosis de

mejor manera que la formula anterior.

Por lo tanto, datos como la edad, sexo, peso y polimorfismos nos permiten,

actualmente, determinar que medicamento y que dosis podemos utilizar.




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Esta tecnología se hace cada día más frecuente con el uso de los microarray.

Actualmente, el análisis polimórfico de todos los citocromos P450 hepáticos tiene un valor de

US $400 y basta sólo una muestra salival tomada por un hisopo. Los resultados nos muestran

un catastro de alrededor de 30.000 polimorfismos de todos los genes de este citocromo y nos

indica que tipo de metabolizador es el individuo para el 98% de los medicamentos que se

comercializan actualmente.

Además la farmacogenómica nos permite determinar la susceptibilidad a

enfermedades. En el año 2008, se publicó un artículo en dónde se secuencio el genoma

completo de 14.000 personas que tenían 7 patologías (3000 controles), se buscaba alguna

diferencia en el genoma entre los controles y las personas con la enfermedad. Las

enfermedades se observan en la imagen posterior.

Los puntos azules muestran la secuencia la secuencia polimórfica normal, los puntos

verdes muestran las mutaciones más frecuentes encontradas. Existen ciertas enfermedades

que tienen mutaciones bastante frecuentes (diabetes tipo I, enfermedad de Crohn’s) en las

personas que tienen estas patologías.




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Por ejemplo, en la diabetes tipo I,en el cromosoma 6 asociado al complejo de

histocompatibilidad hay una mutación A por G. El odds ratio es un dato estadístico que indica

las veces de riesgo sobre el control que un tiene un individuo de producir la enfermedad. En

el caso de la diabetes tipo I, el heterocigoto, para la mutación en el cromosoma 6, tiene 5,5

veces más de probabilidades de tener diabetes tipo I; si es homocigoto tiene 18 veces de

probabilidades de tener la enfermedad, con un 95% de certeza.




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Si vemos otro polimorfismo para la misma enfermedad, por ejemplo, el cromosoma 1

fragmento 13, si es homocigoto existen 5 veces más de riesgo. Por lo tanto, si un individuo

tiene la mutación (homocigota) en el cromosoma 6 y el 1 el riesgo se multiplica (5 x 18).

En la actualidad, se ha ido

secuenciando más pacientes y

más enfermedades. Este examen

está disponible, desde el año

pasado, para uso general y tiene

un valor de US $600-800, y

mediante una muestra de saliva

nos entregan un mapeo para 86

enfermedades.

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