BIOLOGÍA MOLECULARErase una vez…

Dr. GERARDO DANIEL DELUCALaboratorio de Aplicaciones Moleculares

Facultad de Medicina-UNNE

Los primeros pasos …

ADN

ARN

PCR

DOT BLOT

Electroforesis

RFLP

Hibridación Secuenciación

NASBA

Clonación

ARRAYS

HIBRIDACIÓN REVERSA

QUENCHER

El gran ninguneado de la microbiología se toma revancha…

Molar •mMolar - uMolar

L /mL/uL •uLitro

Grs/mgrs •nGrs / fGrs.

Moles •mMoles /nMoles

DNA RNA PROTEINASF. Crick

Dogma central de la biología molecular

El código genético

• 1960 Kromberg aisló y purificó la ADN polimerasa

Doty et al descubren las propiedades de hibridación del DNA.

• 1962 Arber aisla y purifica las enzimas de restricción.

• 1967 Se descubre la ADN ligasa

• 1972 Boyer Cohen y Berg desarrollan las técnicas de clonación

• 1975 Southern desarrolla la hibridación del ADN con sondas específicas

• 1977 Métodos de secuenciación de ADN (Sanger y Gilbert)

• 1981 Primeros animales transgénicos

• 1985 Invención de la PCR (Kary Mullis)

• 1997 Secuenciación de genomas bacterianos completos

• 2001 Secuenciación del Genoma Humano

• 1960 Kromberg aisló y purificó la ADN polimerasa

Doty et al descubren las propiedades de hibridación del DNA.

• 1962 Arber aisla y purifica las enzimas de restricción.

• 1967 Se descubre la ADN ligasa

• 1972 Boyer Cohen y Berg desarrollan las técnicas de clonación

• 1975 Southern desarrolla la hibridación del ADN con sondas específicas

• 1977 Métodos de secuenciación de ADN (Sanger y Gilbert)

• 1981 Primeros animales transgénicos

• 1985 Invención de la PCR (Kary Mullis)

• 1997 Secuenciación de genomas bacterianos completos

• 2001 Secuenciación del Genoma Humano

Principales descubrimientos y avances de la era molecular

Aplicaciones de la Biología Molecular

¿Cuál será la influencia probable de la biología molecular sobre el porvenir de la medicina?

1. Los virus y las enfermedades virales

2. Desórdenes metabólicos hereditarios

3. Malformaciones adquiridas, congénitas y estructurales

4. Cáncer

Edward L. Tatum, Atomes 1968

• Biotecnología (industria, animales, vegetales, microorganismos)

• Clonación de órganos y animales

• Medicina humana y veterinaria (diagnóstico y terapia génica)

• Medicina Personalizada

• Identificación de personas huella genética

• Paleontología

PRINCIPALES APLICACIONES DE LA PCR

INVESTIGACIONES PALEONTOLÓGICAS Y DE FÓSILES

INVESTIGACIONES FORENSES

MEDICINA HUMANA

PCR: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

TIPOS DE PCR CONVENCIONAL

• PCR común• Nested PCR• Nested PCR (1º round primers genéricos y 2º round primers específicos)

• Heminested PCR• PCR de baja astringencia (RAPD PCR)

• RT-PCR

AMPLIFICACIÓN

PCR

• Más ampliamente utilizada

• Distintos formatos caseros y comerciales

NASBA

• Comercial

• Cargas virales y monitoreo

bDNA

• Comercial

• Cargas virales y monitoreo

MANUALES

Con solventes

Sin solventes

AUTOMATIZADOS

Robotizados

Magnéticos y de vacío

EXTRACCIÓN DE ADN O ARN

DETECCIÓN

Electroforesis

Hibridación con sondas marcadas

LIPA

Fluorescencia

RLB

ELISA

HC VMetodología utilizada:

• RT-PCR anidada de la región 5´no codificante (5´NC) del

genoma viral combinada con el análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de

restricción (RFLP)

251pb

AGAROSA / BrEt

100pb

ACRILAMIDA / Nitrato plata

HPV PCR-RFLP

PCR

RFLP

E z d e r e s t r i c c i ó n

GENOTIPO

Micobacterias PCR-RFLP

RT-PCR MÚLTIPLE VIRUS RESPIRATORIOS

HIBRIDACIÓN REVERSA RLB

Inno-Lipa Micobacterias

Curva de amplificación PCR

Real time PCRVentajas

• No se hace corrida• Detección objetiva

del amplicón• Más sensible

• Multiplex• Más rápida

• Menor tamaño amplicones

• Cargas virales

Real time PCR

Curva de melting

Curva de melting

TaqMan probes

Molecular beacon probes

DIAGNÓSTICO MOLECULAR

DETECCIÓN

MÉTODO DE

AMPLIFICACIÓN

EXTRACCIÓN

DE ADN O ARN

Amplificación isotérmicaEj: Bayer Quantiplex – NASBA (HIV – HCV)

Lectura por electroquimioluminiscencia

Branched DNA

Quantiplex bDNA Signal Amplification System, de Chiron Corporation (VIH – VHC –VHB)

Hibridación de captura

HPV – Chlamydia trachomatis – Neisseria

Secuenciación

Ej. aplicaciones en infectología: Determinación de resistencia de la transcriptasa reversa y proteasa a antivirales en pacientes HIV+; resistencia a ganciclovir en CMV y resistencia a rifampicina en Mycobacterium tuberculosis.

DNA CHIPMICROARREGLOS DE

DNA