BioMol

7/17/2019 BioMol

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MÓDULO 1Introducción a las herramientas para la

detección de ácidos nucleicos(PARTE I)

Herramientas moleculares I:

parámetros y validación para el diagnóstico bioquímico

Dr. Diego Chouhy

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INFRAESTRUCTURA DEL LABORATORIO

Sala de preparación de reactivosPreparación de

reactivos para la PCRPreparación de la mezcla

de PCR

Sala de preparación de muestras

Procesamiento demuestras clínicas.

Aislamiento de ácidosnucleicos

Agregado de ácidosnucleicos a los tubosde reacción de PCR

Sala de amplificación y detección

PCR (termocicladores) Detección de losproductos amplificados

Pipetas Microcentrífuga Vortex

Pipetas Microcentrífuga

Pipetas Microcentrífuga Cicladores térmicos Cubas de electroforesis Fuentes de poder Transiluminador UV Microondas

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OBTENCIÓN- sangre entera anticoagulada con EDTA- plasma / suero

- líquido cefalorraquídeo- biopsia- etc

ETAPAS EN EL PROCESAMIENTO

MÉTODOS MOLECULARES

CONSERVACIÓN- dentro de las 24 horas: 2 - 8°C

- más de 24 horas congelar a –20°C o –70 °C.EXTRACCION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS

1- REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA

2- AMPLIFICACIÓN

3- DETECCIÓN

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MÉTODOS MOLECULARES

AMPLIFICACIÓN DEÁCIDOS NUCLEICOS

AMPLIFICACIÓN DELA SEÑAL

AMPLIFICACIÓN DELA SONDA

Branched DNA signal amplification (bDNA)

Ligase Chain Reaction (LCR)

Amplificación Isotérmica

TMANASBA3SRSDALMPA

Amplificación No Isotérmica

Standard PCRRT-PCRMultiplex PCRNested PCRreal time PCR

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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

KARY MULLIS1985: PCR

1993: PREMIONOBEL DE QUÍMICA

Amplificación Génica

Luego de 30-40 ciclos ≈ 109 – 1012 copias

Reacción en Cadena de la Polimerasa

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Luego de 30-40 ciclos ≈ 109 – 1012 copias

La PCR es una metodología que consiste en la amplificación enzimática en

ciclos repetidos de un fragmento específico de ADN utilizando la enzimaADN polimerasa termoestable (Taq)

La amplificación in vitro del ADN se lograen tres pasos básicos:

1).-Desnaturalización del ADN a copiar(molde o diana) mediante el incrementode la temperatura (92-95°C).

2).-Hibridación de los cebadores al ADNmolde mediante la disminución de latemperatura a la temperatura de anilladode los cebadores (55-65°C).

3).-Copia de las cadenas delimitadas porlos cebadores. Se consigue elevando latemperatura de la reacción a la óptimade la ADN polimerasa utilizada.

N=1N=2N=4

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)


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Oligonucleótidos (cebadores)Tampón (Buffer )ADN Polimerasa termoestableDesoxinucleótidos (dNTPs)Cloruro de Magnesio (MgCl2)

ADN molde


COMPONENTES DE LA PCR

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Secuencias cortas de ADN (18 - 24 nucleótidos) que flanquean el fragmentoa amplificar y actúan como iniciadores (“cebadores”) de la polimerización.

1- Oligonucleótidos

Necesario para crear las condiciones óptimas para la actividad de la ADNpolimerasa. A menudo contienen Tris-HCl, KCl, y a veces, MgCl2.

2- Tampón (Buffer)

Sustrato necesario para la formación de las cadena de ADN.Unen iones Mg2+. Para 1.5 mM de MgCl2, la [dNTPs] ideal es de 200 μM.Pequeños incrementos en la [dNTPs] pueden inhibir la reacción porqueatraparan los iones Mg2+ necesarios para que la ADN-polimerasa funcione.Si cambiamos la [dNTPs] es importante tener en cuenta que existe unarelación entre las cantidades de MgCl2 y las de dNTPs en la reacción.

3- Desoxinucleótidos (dNTPs)


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La [MgCl2] afecta a la incorporación de dNTPs, la actividad polimerasa ytemperatura de hibridación del híbrido cebador-ADN templado.

[MgCl2] Especificidad de la reacción.[MgCl2] Eficiencia de la reacción

A: 0,5 mM - B: 0,8 mM - C: 1,5 mMD: 2,0 mM - E: 2,5 mM - F: 3,0 mM

Efecto de la concentración de MgCl2

4- Cloruro de Magnesio (MgCl2)

Producto final debe estar limpio y libre de cualquier residuo de buffers.Estos productos residuales pueden inhibir la acción de la enzima omodificar la concentración salina del buffer de reacción.

Inhibidores en la muestra (Columnas vs Técnicas manuales de extracción)

5- ADN molde



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Dirección de polimerización 5’-3’.

Solamente añaden desoxirribonucleótidos (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) a unacadena cebadora ya existente unida a una cadena molde.No inicia síntesis de ADN de novo.

6- ADN Polimerasas


Pfu ADN polimerasa

Taq ADN polimerasa Hot Start Taq ADN polimerasa

Mix de enzimas

http://www.thermoscientificbio.com

http://www.thermoscientificbio.com/

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PROTOCOLO GENERAL DE MEZCLA DE REACCIÓN

Componente Volumen Concentraciónfinal

Tampón (buffer) 10X 5 µl 1X

dNTP 2 mM 5 µl 0.2 mM

Cebador sentido (10

pmol/µl)

0.5-5.0 µl 0.1-1.0 µM

Cebador antisentido (10pmol/µl)

0.5-5.0 µl 0.1-1.0 µM

MgCl2 25 mM 2-8 µl 1-4 mM

ADN templado 5 µl 10 pg – 1 µgTaq ADN polimerasa 5 U/µl 0.2-0.5 µl 1.0-2.5 U

H2O (libre de nucleasas) hasta 50 µl

Volumen Total 50 µl


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Paso Temperatura Tiempo Ciclos

Desnaturalización inicial 95ºC 3-5 min. 1

Desnaturalización 95ºC 30-60 seg.

25-40 Anillado 50-68ºC 30-60 seg.

elongación 72ºC 30-60 seg.

Elongación final

72ºC

5-10 min.

1

PROTOCOLO GENERAL DE MEZCLA DE REACCIÓN


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ARN

ADNc

Retrotranscripción, M-MLV

PCR, Taqcebadores

RT-PCR


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En esta modificación de la PCR se incluyen dentro de la mismareacción de amplificación múltiples pares de cebadores específicospara diferentes dianas, por lo que se produce una co-amplificaciónde diferentes dianas.Esta modificación tiene las siguientes ventajas:

se pueden testear grandes regiones de una única secuencia deADN en busca de alteraciones o modificaciones.se pueden testear segmentos no relacionados del genoma diana.se pueden incluir controles internos de amplificación de la muestra.se puede testear una misma muestra contra diferentes patógenos.

200 pb 300 pb500 pb

Electroforesis

200 pb

300 pb

500 pb

PCR

PCR multiplex


ó d d l l

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Desventaja:Mayor probabilidad de contaminación.No es recomendable la apertura del 1° tubo de amplificación (sobre todo en laboratorios dediagnóstico clínico), ya que durante la transferencia se producen aerosoles que puedencontaminar reacciones sucesivas. Para evitar esto se han desarrollado alternativas a fin de

evitar la transferencia de un tubo a otro tras la 1° amplificación.

500 pb

250 pb

1ª amplificación

2ª amplificación

Nested-PCR o PCR anidada

Ventajas:Mejor sensibilidad.

Se puede detectar una sola copia dela diana sin necesidad de hibridarcon sondas marcadas.

Mejor especificidad.La re-amplificación con el par decebadores internos sirve paraverificar la especificidad de laprimera ronda de amplificación.


ió C d d l li

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Los procesos de amplificación y detección se producen simultáneamente.Disminución del riesgo de contaminación.Por detección fluorescente se puede medir la cantidad de ADN sintetizado encada momento durante la amplificación .

Posibilidad de cuantificación La emisión de fluorescencia producida en lareacción es proporcional a la cantidad de ADN formado.

Los sistemas de detección por fluorescenciaempleados en la PCR a tiempo real pueden ser dedos tipos:

Agentes intercalantes: fluorocromos que

aumentan la emisión de fluorescencia al unirse alADN de doble hélice. Baja especificidad.

Sondas de hibridación específicas: sondasmarcadas con 2 fluorocromos (un donador y unaceptor) y el fenómeno de Transferencia de

energía fluorescente mediante resonancia (FRET).

Real time-PCR o PCR en tiempo real


R ió C d d l P li

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DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS

1- Electroforesis

Separación de moléculasMatriz tamponada (agarosa, acrilamida)

Separación de moléculas mediante el usode un campo eléctrico

“Electro” se refiere a la electricidad y “ foresis” (del griego phoros) significa “trasladar”.

COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA

AgarosaTampón o Buffer de corridaTampón o Buffer de carga (Loading Buffer )Visualización


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1- Electroforesis


Polisacárido extraído de algas.Electroforesis rápida, pero con una resolución limitada.

Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad vienedeterminada por su concentración.Un fragmento de ADN migra a

diferentes velocidades a través delos geles según la concentraciónde agarosa.

AGAROSA

R ió C d d l P li

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1- Electroforesis


La movilidad electroforética del ADN está afectada por la composición y lafuerza iónica del medio.

En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra

lentamente o ni siquiera se desplaza.Con elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se

genera una importante cantidad de calor. Generalmente el gel se funde y elADN se desnaturaliza.

BUFFER DE CORRIDA

Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE),

tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a unaconcentración de 50 mM (pH 7,5 – 7,8).EDTA vs degradacion enzimática.

Debido a la carga negativa del ADN, la migraciónen la corrida es hacia el ánodo (color rojo).


R ió C d d l P li

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1- Electroforesis


BUFFER DE CARGA

Xylene cyanolMigra a aprox. 4Kb

Azul de bromofenolAyuda a visualizar que lamuestra este migrando en elgel. Migra a aprox. 200 - 400

pb (depende del porcentajede la agarosa)

GLICEROLAñade densidad a la muestra.

incorporar un colorante a la muestra que,en un campo eléctrico, se desplace hacia el

ánodo a una velocidad previsible.

Añadir color a lamuestra

aumentar la densidad de lasmuestras para que el ADN caiga

uniformemente en el pocillo



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Aplicar 80 V

De 30-40 min

1- Electroforesis

CARGADO DE MUESTRA



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1- Electroforesis


VISUALIZACIÓN

Para cuantificar y/o visualizar el ADN se utilizan agentes colorantesfluorescentes, los cuales aumentan notablemente su emisión cuando se unen ala doble hélice.

Son agentes intercalantes que se introducen entre las bases del ADN.Generalmente son policíclicos aromáticos, hidrofobos y planares:

BROMURO DE ETIDIO

Reactivo mutagénico, por lo que sedeben trabajar con equipo de seguridad.

El material contaminado con ellosgeneralmente se trata con nitrito sódico yácido hipofosforoso para su degradación.



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1- Electroforesis

DETECCIÓN DEL PRODUCTO AMPLIFICADO

1. Colocar gel sobre un transiluminador, encender la lámpara de UV2. Visualizar bandas de ADN3. Tomar fotografía4. Determinar el peso molecular de las bandas

Marcador de peso molecular



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2- Enzimoinmunoanálisis

AMPLIFICACIÓN CON CEBADORES BIOTINILADOS

PCR

B

B

B



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2- Enzimoinmunoanálisis

HIBRIDACIÓN CON SONDA ESPECÍFICA

B

F

F

B +

CAPTURA EN MICROPLACA DEL HÍBRIDO

Microplaca revestida conEstreptavidina

F

B



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2- Enzimoinmunoanálisis (EIA)

DETECCIÓN COLORIMÉTRICA DEL HÍBRIDO

Microplaca revestida con

Estreptavidina

F

B

peroxidasaReactivo

cromóforo

NEGATIVO

POSITIVO

F

B



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EIA-PCR - Amplificación NO isotérmica de ácidos nucleicos

Concentración y Purificación del ARN diana• Centrifugado a alta velocidad• Eliminación de componentes plasmáticos (por lavado)

Paso 1

Amplificación• Retrotranscripción (RT)• Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Paso 2

Detección• Hibridización• Revelado colorimétrico

Paso 3



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Centrifugar1 hora

1000 µL600 µL

GuSCN Lysis Buffer+ CI

Mix,Incubar 10 min

Centrifugar 15 min

Retirar SN

800 µL

Isopropanol

Lavar Pellet,Centrifugar 5 min

Retirar SN

1 ml

70% Ethanol200 µLHCV

ResuspenderPellet

50µL

100 µL

Plasma

Tubos conMaster Mix

HIV

HBV

Diluyente demuestra

EIA-PCR - Amplificación NO isotérmica de ácidos nucleicos


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FIN DE LA PARTE 1 – MÓDULO I

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