bioqimica practicA 2

PRACTICA Nº1

1) Explicar el diseño experimental.

Como el objetivo de nuestra practica es demostrar la actividad enzimática determinando para ello la actividad de la ureasa, por conocimiento sabemos que las enzimas son biocatalizadores específicos de naturaleza proteica que actúan acelerando las reacciones químicas en este caso uno de los factores que afectan esta actividad enzimática es el tiempo de incubación en los tubos 1 y 2 ( con los componentes indicados en cada uno de ellos) que nos permitió expresar esta actividad en términos de velocidad; es decir, la cantidad de producto formado por unidad de tiempo que generalmente se determina en micromoles de producto formado por minuto, teniendo en cuenta un pH optimo de 7.2 y un temperatura de 37ºC.

Una vez obtenidos los tubos 1 y 2 por sistema de incubación procedemos a la valoración de la actividad de la ureasa por el método de productos formados. Primero lo haremos por reacción de neutralización donde tomamos 1 mL de cada tubo para colocarlos en los tubos 1(B) y 2(B) donde luego añadimos 1 gota de rojo de metilo al 0.04% y lo titulamos con HCL 0.05N observando como punto final un rosa pálido que indicara por finalizada la titulación. En el tubo (B) observamos que necesito mas acido para lograr neutralizarse. Con los datos obtenidos en esta experiencia se precedio a calcular los resultados en términos de velocidad de reacción o actividad enzimática expresados como micromoles de urea desdoblados por minuto a 37ºC (unidades de ureasa) con un pH optimo de 7.2.

Segundo por reacción de Nessler donde haremos tres tubos: Blanco, 1 y 2 de acuerdo a los componentes indicados, dejaremos en reposo por 10 minutos y lo leeremos en l fotocolorímetro con filtro verde, o un espectrofotómetro a 540 nm. Lo cual nos permitió hacer cálculos en corrección de lecturas y hallar la velocidad de reacción o actividad de ureasa.

¿Cuál es el propósito de cada tubo?

Observar en cada uno de ellos como se da, que factores afectan y a qué velocidad se da la actividad enzimática.

¿Cuál es el tubo control?

El tubo control es una solución que contiene una cantidad conocida de sustancia que se va a cuantificar y sirve para tomarla de referencia en el momento en que se mida la muestra real. En este caso actuaron como tubos control: 1, 1 (B) y blanco (como referencia para las tres experiencias) ya que en estos no se formo ninguna base

¿Es necesario más de un tubo control?

No, ya que solo se necesita como referencia.

2) Observe las reacciones en los tubos de titulación y anotar sus observaciones.

Después del sistema de incubación de los tubos 1 y 2; agregamos en los tubos 1(B) y 2(B) 2mL de estos para agregarles rojo de metilo al 0.04 % se observo q en ambos la solución torno amarillenta procedimos a titular con HCl hasta que torne en ambos una coloración rosa pálido que dará por finalizada esta. Las observaciones en el tubo 1(B) fueron que con solo 0.15 mL se torno al color rosa pálido lo que se indico como tubo control, en el tubo 2(B) para que se torne rosa pálido en la titulación de HCl requirió 2.40 mL lo que se indico como un tubo problema que requiere de más acido para poder neutralizar se.

- Se concluye que el el primer tubo 1 (B) se indico como un tubo control ya que solo contiene una cantidad sustancia que se procederá a cuantificar para tomarla de referencia cuando se mida la muestra real. En el segundo tubo 2(B) se indico como tubo problema porque se formo una base requirió de mas acido ya que en este existe una cantidad de sustancia que servirá para la cuantificación de la velocidad de reacción.

3) Calcule las unidades de la ureasa a partir sus resultados.

vol. Hcl gastado TUBO 1 = 0.15 m l

vol. Hcl gastado TUBO 2 = 2.40 m l

NEUTRALIZACION

VELOCIDAD = (volumen Hcl gastado (problema) – vol Hcl (blanco) )(molaridad) (1000)(4)

(15 minutos ) (2)(2)

VELOCIDAD = (2.40 m l – 0.15 ml ) (0.05 N) (1000)(4) = 7.5 mM/ min NH3 ( PH 7.2 -37 °C)

(15)(2) (2)

COLORIMETRIA

Lecturas en el fotocolorímetro

Tubo blanco= 0.02

Tubo 1 = 0.05

Tubo 2 = 0.59

>Tubo blanco –tubo 1 = 0.02 -0.05 = -0.03 ……………(x)

>Tubo blanco – tubo 2 = 0.02 – 0.59 = -0.57 …………….(y)

Restamos x-y

-0.03- (- 0.57) = 0.54

VELOCIDAD = (LECTURA TUBO 2) (FACTOR DE CALIBRACION)

|tubo blanco |negativa | |0.02 |

|Tubo 1 A |negativa | |0.05 |

|Tubo 2 A |positiva |amarillo intenso (ambar) |0.59 |

6) ¿A que datos experimentales puede remitirse para afirmar que las enzimas son de naturaleza proteica? Según ello. ¿Qué precauciones se deben tomar para manipular las enzimas?

La naturaleza proteica de la enzima se demuestra al usar una solucion HCl para la titulación de los tubos en la VALORACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE UREASA POE EL METODO DE LOS PRODUCTOS FORMADOS. De no ser usada dicha 'sustancia' y los indicadores respectivos la toma de datos no sería al correcta devido a la desnaturalización de la enzima a causa del pH.

La precauciones necesarias seria control del pH con indicadores u otros métodos

cuantitativos y cualitativos.

7) Explique el fundamento de la valoración de la actividad de ureasa mediante el método de los productos formados utilizando la reacción de neutralización.

En este proceso el fundamento de la valoración es poder neutralizar a la sustancia básica que contienen el problema mediante un acido, para ello utilizamos el HCL (a mayor gasto de acido mayor producto). Por eso se observo un gran diferencia en valor del gasto entre el tubo 1(B) y 2(B).

8) Explique el fundamento de la valoración de la actividad de ureasa por los productos formados utilizando el método de colorimetría, reacción de Nessler

Utilizamos el método colorimétrico para determinar que el NH3 es un producto liberado por la urea.

El fundamento de la valorización d e la ureasa utilizando el método de reacción de Nessler es directamente proporcional a mayor intensidad mayor producto formado.

9) ¿Cómo se denomina las sustancias sobre las cuales actúan las enzimas? Explique los mecanismos.

Las enzimas catalizan un solo tipo de reacción y siempre actúa sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos.

E + S [ES] E + P

E: Enzima

S: sustrato

[ES]: complejo enzima sustrato

P: Producto

PRACTICA Nº2

1) ¿Cual es el significado de Km?

El km es la afinidad de una enzima por su sustrato, también se denomina km cuando la cantidad de sustrato se hace igual a la mitad de la velocidad máxima (Vmax).

2) ¿Todas las enzimas presentan el mismo valor numérico de Km?

El valor de km para cada enzima es diferente, depende de cada sustrato y de factores ambientales tales como pH, temperatura y fuerza iónica

3) ¿Cual es el significado de un km alto y un km bajo?

Un km alto indica poca afinidad de la enzima por su sustrato mientras que un km bajo significa alta afinidad de la enzima por su sustrato.

4) ¿A que se denomina velocidad máxima de una reacción enzimática?

Vmax: Es aquella que revela o da el numero de recambio de una enzima, que es el numero de moléculas de sustrato convertidas en productos por unidad de tiempo x una molécula de enzima cuando este está totalmente saturado de sustrato

5) ¿A que se denomina velocidad inicial de una reacción enzimática?

Se denomina velocidad inicial (V0) como la velocidad de incremento de producto en función del tiempo cuando [P] es baja.

6) Utilizando la ecuación final obtenida por Michaelis-Menten;

a) Despejar el valor de Km en función de las otras variables.

[pic]

luego de los arreglos respectivos:

[pic]

b) Despejar el valor de [S] en función de las otras variables.

[pic]


[pic]

c) Despejar el valor de Vmax en función de las otras variables.

[pic]


[pic]

7) ¿En que unidades se expresa el Km?

La unidad de Km es: micromoles (μM)

8) ¿Qué importancia tiene la determinación del Km de una enzima?

Es importante para determinar cuánto sustrato abra que agregar cuando se desea

medir una enzima y para determinar cuan efectivamente una enzima esta

funcionando en los tejidos de un organismo vivo.

9) ¿Qué parámetros deben conocerse para determinar el Km de una enzima?

►Enzima

►Sustrato

►Temperatura (T°)

►Ph

►Tiempo

►Cofactor

10) ¿Cómo deben tabularse los datos para calcular la Km por el método de

Lineweaver-Burk?

Para este método se necesita tabular de la siguiente manera:

|tubos |1/Sutrato (mM) |1/Velocidad |

|#1 |[S]1 |V1 |

|#2 |[S]2 |V2 |

|#3 |[S]3 |V3 |

|#4 |[S]4 |V4 |

Para la grafica en el eje de las ‘x’ va la inversa de la concentración de sustrato y el eje de las ‘y’ la inversa de la velocidad.

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