Bioqu mica Qu^antica das Estatinas, Aspirina e Anti-hipertensivos · Departamento de Biof´ısica e...

Roner Ferreira da Costa

Bioquımica Quantica das Estatinas,

Aspirina e Anti-hipertensivos

Fortaleza – CE

Abril / 2011

Roner Ferreira da Costa

Bioquımica Quantica das Estatinas,

Aspirina e Anti-hipertensivos

Tese apresentada a Coordenacao da Pos-Graduacao de Fısica da Universidade Federaldo Ceara para a obtencao do tıtulo de Doutorem Fısica.

Orientador:

Prof. Dr. Valder Nogueira Freire

Co-orientador:

Prof. Dr. Ewerton Wagner Santos Caetano

Departamento de FısicaCentro de Ciencias

Universidade Federal do Ceara

Fortaleza – CE

Abril / 2011

Tese de Doutorado sob o tıtulo “Bioquımica Quantica das Estatinas, Aspirina e Anti-

hipertensivos”, defendida por Roner Ferreira da Costa e aprovada em 12 de Abril de 2011,

em Fortaleza, Ceara, pela banca examinadora constituıda pelos doutores:

Prof. Dr. Valder Nogueira FreireDepartamento de Fısica - UFC

Orientador

Prof. Dr. Ewerton Wagner Santos CaetanoInst. Fed. de Educacao, Ciencia e Tecnologia do Ceara

Co-orientador

Prof. Dr. Carlos Roberto Martins Rodrigues SobrinhoDepartamento da Medicina - UFC

Prof. Dr. Eudenilson Lins AlbuquerqueDepartamento de Biofısica e Farmacologia - UFRN

Prof. Benildo Sousa CavadaDepartamento de Bioquımica - UFC

Dedico esta tese a Roberio Ferreira da Costa pela licao de humildade e amor pelo

proximo que ele me ensinou e a Deus pela vida.

Agradecimentos

Dedico meus sinceros agradecimentos para:

o professor Doutor Valder Nogueira Freire, por ter me dado a oportunidade de de-

senvolver a pesquisa academica, pela orientacao desta tese e tambem pelo seu apoio no

desenvolvimento da minha carreira cientifica;

o professor Doutor Ewerton Wagner dos Santos Caetano, pelo suporte dado no estudo

dos metodos ab initio e pela co-orientacao desta tese;

o professor Doutor David Lima Azevedo, pelo contribuicao na obtencao pessoal e

profissional;

o professor Nilson Sena, pelas otimas discussoes e debates sobre Mecanica quantica. ;

a MSc. Eveline Matias , pelo apoio dado durante essa jornada, principalmente nos

momentos difıceis;

os amigos da sala 06, Dr. Maia jr, e MSc. Sergio Gomes, pelo grupo que formamos e

por toda a convivencia amigavel no ambiente de trabalho;

o coordenador da Pos-Graduacao em Fısica, Professor Doutor Paulo de Tarso Caval-

cante Freire;

o professor Umberto Laino, pela colaboracao nos trabalhos desenvolvidos em conjunto

com a Biofısica de UFRN;

os professores Dr. Antonio Carlos Santana Santos, Dr. Sergio Souza Sombra, MSc.

Ana Tereza de Abreu Lima, pelo companheirismo necessario na jornada que se iniciou no

meu Mestrado e que se estende ate hoje;

todos os professores que conheci e com os quais aprendi muito durante a minha

formacao academica;

minha famılia, pelo alicerce que se fizeram ao longo de toda a minha vida.

“Missao dada e

missao cumprida.

”

[Trecho do filme “Tropa de Elite”,

Capitao Nascimento.]

Resumo

As doencas cardiovasculares (CVDs) compreendem um amplo espectro de doencas do coracaoe vasos sanguıneos (arterias e veias), entre as quais se incluem a doenca das arterias coronarias,o ataque cardıaco, a angina, a sındrome coronariana aguda, o aneurisma da aorta, arritmiascardıacas, a doenca cardıaca congenita, a insuficiencia cardıaca e a doenca cardıaca reumatica.Entre os principias farmacos que tratam as doencas cardiovasculares estao: (i) as estatinas, queatuam inibindo a 3-hidroxi-3-metilgluratil coenzima A (HMG-CoA) redutase no processo de con-versao da HMG-CoA em mevalonato, numa das etapas da biossıntese do colesterol. Observa-seem ensaios clınicos que a acao das estatinas pode diminuir os nıveis de colesterol de baixa densi-dade (LDL) entre 20% e 60%, reduzindo os eventos coronarianos em ate 1/3 no perıodo de cincoanos; (ii) a aspirina, com a qual ha mais de 400 preparacoes nos EUA e se produz cerca de 20 miltoneladas anualmente. Apos mais de um seculo de pratica clınica, a aspirina continua sendo adroga antitrombotica, antitermica, analgesica e antiproliferativa mais amplamente recomendada.Ela age bloqueando a biossıntese de hormonios inflamatorios prostanoides atraves da inibicaodas enzimas ciclooxigenase COX-1 e COX-2; (iii) os anti-hipertensivos, para os quais a EnzimaConversora de Angiotensina (ECA) e o principal alvo (inibidores da ECA estao no mercado amais de 20 anos) visando o combate das pressoes arteriais elevadas, que provocam alteracoesnos vasos sanguıneos e na musculatura do coracao, e levam a hipertrofia do ventrıculo esquerdodo coracao, acidente vascular cerebral, infarto do miocardio, morte subita, insuficiencias renal ecardıaca, etc. A hipertensao arterial (HTA) ou hipertensao arterial sistemica (HAS), conhecidapopularmente como pressao alta, e uma das doencas com maior prevalencia no mundo moderno.A ECA atua na regulacao da pressao sanguınea via conversao do decapeptıdeo angiotensina Ino potente vasopressor angiotensina II e tambem pela inativacao da bradicinina, sendo com-ponente central do Sistema Renina-Angiotensina-Aldeosterona (SRAA), que controla a pressaosanguınea e tem forte influencia nas funcoes relacionadas ao coracao e os rins, bem como nacontracao dos vasos sanguıneos. Nesta tese realiza-se um estudo da bioquımica quantica deestatinas (atorvastina, rosuvastatina, cerivastatina, mevastatina, sinvastatina e fluvastatina), daaspirina/bromoaspirina e de anti-hipertensivos (captopril, enalapril, lisinopril, ramipril, tran-dolapril e perindopril) levando-se em conta dados cristalograficos dos seus sıtios de ligacao nasproteınas HMGR, COX-1 (o da aspirina foi simulado partindo-se dos dados da bromoaspirina) eECA, respectivamente. As simulacoes computacionais foram realizadas considerando-se a Teoriado Funcional de Densidade (DFT) na aproximacao da densidade local (LDA) e funcional de trocae correlacao PWC, com energia de interacao entre os resıduos das proteınas circunscritos ao sıtiode ligacao de raio r e os farmacos calculada atraves do metodo de fracionamento molecular comcapas conjugadas (MFCC). Os resultados obtidos para as estatinas sugerem que: (i) as mais(menos) eficazes sao a atorvastatina e a rosuvastatina (sinvastatina e fluvastatina), o que estade acordo com a clınica e valores dos seus ındices de concentracoes inibitorias IC50; (ii) sıtiosde ligacao com raios de pelo menos 12 A (alem do raio de 9,5 A sugerido pela analise estritade dados cristalograficos) devem ser considerados para que resıduos importantes como E665,D767, e R702 sejam considerados para que as eficiencias das estatinas sejam corretamente ex-plicadas. Para a aspirina/bromoaspirina utilizou-se um refinamento quantico de segunda ordemdos dados cristalograficos para se demonstrar que a energia de ligacao de ambos com a COX-1 emuito aproximadamente a mesma, o que explica resultados experimentais de IC50 similares. Aexistencia de resıduos atrativos e resulsivos e destacada, mostrando-se que Arg120 e o resıduo

que mais atrai o acido salicılico apos acetilacao da Ser530, seguido de Ala527, Leu531, Leu359e Ser353; por outro lado, Glu524 e o resıduo repulsivo mais efetivo (intensidade comparavel aoArg120), nunca tendo sido antes considerado como resıduo importante no sıtio de ligacao daaspirina/bromoaspirina na COX-1. Finalmente, no caso dos anti-hipertensivos, obtem-se quee necessario se considerar raios do sıtio de ligacao de 16 A para se obter que o lisinopropil e oramipril (trandolapril e perindopril) apresentam as maiores (menores) energias de ligacao, o queexplica a maior (menor) constante de inibicao dos mesmos entre os anti-hipertensivos estudadospara a ACE da Drosophila melanogaster.

Abstract

Cardiovascular diseases (CVDs) comprise a large spectrum of heart and blood vessels (ar-teries and veins) diseases, among which include coronary artery disease, heart attack, angina,acute coronary syndrome, aortic aneurysm, cardiac arrhythmias, heart failure and rheumatic he-art disease. Among the major drugs used to treat CVDs are: (i) Statins, which act by inhibiting3-hidroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase in the process of convention ofHMG-CoA to mevalonate, one of the steps of the cholesterol biosynthesis. Observed in clinicaltrials that the action of statins may reduce levels of bad cholesterol (LDL) between 20% and60%, reducing the coronary events in 1/3 the period of five years; (ii) The aspirin, with whichmore than 400 preparations in the U. S. and produces about 20.000 tons annually. After morethan a century of clinical practice, aspirin remains the antithrombotic, antipyretic, analgesicand anti-proliferative drug most widely recommended. Its acts by blocking the hormones in-flammatory prostanoids biosyntheses by inhibiting ciclooxygenase enzymes COX-1 and COX-2;(iii) the antihypertensives, for which the Converting Enzyme (ACE) is the main target (ACEinhibitors are in market for over 20 years) in order to combat the high blood pressure, whichcause changes in blood vessels and heart muscle and lead to heart left ventricular hypertrophy,stroke, myocardial infarction, death sudden, kidney and heart failure, etc. Arterial Hyperten-sion, known popularly as high blood pressure, is a disease more prevalence in the modern world.ACE acts in the regulation of pressure blood via conversion of the decapeptide angiotensin I ina potent vasopressor angiotensin II and also by the inactivation of bradykinin, being a centralcomponent of the Renin-Angiotensin-Aldosterone (RAAS), which controls blood pressure andhas a strong influence on functions related to the heart and kidneys, as well as contraction ofblood vessels. In This work is carried out a quantum biochemical study of statins (atorvastina,rosuvastatin, cerivastatin, mevastatina, simvastatin and fluvastatin), aspirin / bromoaspirin andantihypertensive (captopril, enalapril, lisinopril, ramipril, trandolapril and perindopril) takingadvantage of the crystallographic data of binding pocket on proteins such as HMGR, COX-1(the aspirin was simulated starting from the bromoaspirin data) and ACE, respectively. Com-puter simulations were performed considering the Density Functional Theory (DFT) in the localdensity approximation (LDA) exchange functional and PWC correlation with interaction energybetween residues of limited to the protein binding pocket of radius r and drugs calculated by themethod of molecular fractionation conjugate caps (MFCC). The results for statins suggest that:i) the more (less) effective are atorvastatin and rosuvastatin (simvastatin and fluvastatin), whichis consistent with clinical data and values concentrations inhibitory IC 50; (ii) binding pocket atconsider a radius 12 A (beyond the range of 9.5 A suggested by strict analysis of crystallographicdata) should be considered important to residues as E665, D767, and R702 be considered sothat the efficiencies of statins are properly explained. For aspirin / bromoaspirin was used asecond order quantum refinement of crystallographic data to demonstrate that the interactionenergy with both COX-1 is very nearly the same, which explains results experimental IC 50

similar. The existence of residues attractive and repulsive is highlighted, showing that Arg120 isresidue that attracts more salicylic acid after acetylation of Ser530, followed by Ala527, Leu531,Leu359 and Ser353, on the other hand, Glu524 is the residue most effective repellent (intensitycomparable to Arg120), having never before been considered important in the residue of sitebinding of aspirin / bromoaspirin in COX-1. Finally, in the case of antihypertensive drugs, youget what is necessary to consider radius of the binding pocket 16 A to obtain the lisinopropil and

ramipril (trandolapril and perindopril) present the higher (lower) interactions energies, whichexplains the higher (lower) inhibition constant of the same among the anti-hypertensive studiedfor ACE Drosophila melanogaster.

Lista de Figuras

0.1 Anatomia do coracao humano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 26

0.2 Desenvolvimento de uma lesao ateroesclerotica. A progressao da lesao

atheroesclerotica e mostrada de forma simplificada, comecando a desenvolver-

se num vaso sanguıneo normal (extremidade esquerda) ate o apareci-

mento de uma placa ateroesclerotica e um trombo superposto (extremi-

dade direita) [3]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 27

0.3 Exemplos de estruturas tridimensional de cristais de proteınas determi-

nada por difracao de raio-X onde os codigos PDB sao: (a) 3MGF, (b)

3Q4A (c) e (d) 3NSL, onde pode-se visualizar as protınas em ribbon e na

representacao N ate C terminal sendo que em (d) as aguas sao destacadas

na estrutura. Figuras obtidas a partir do software Molsoft. . . . . . . . p. 32

0.4 Sitio de ligacao representado por uma superfıcie na cor cinza da proteına

HMGR co-cristalizada com a cerivastatina. . . . . . . . . . . . . . . . . p. 34

0.5 Estruturas tridimensionais de dois homologos da enzima conversa em

angiotensina co-cristalizada com o farmaco anti-hipertensivo lisinopril.

Codigos PDB: (a) 1O86, (b) 2X91, onde pode-se visualizar as enzimas

em ribbon e na representacao N ate C terminal. Figuras obtidas a partir

do software Molsoft. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 36

0.6 Sitio de ligacao representado por uma superfıcie na cor cinza da proteına

fator Xa co-cristalizada com o anticoagulante oral apixaban. . . . . . . p. 37

1.1 O tetramero da HMGR ligado a quatro atorvastatinas. O quatro sıtios de

ligacao similares estao indicados por cırculos. E mostrado quatro esferas

do sıtio de ligacao (ESL), cada uma com um raio r. . . . . . . . . . . p. 45

1.2 A variacao da energia de interacao como uma funcao do raio para: ator-

vastatina (linha solida preta), enalapril (linha com traco longo verme-

lha), lisinopril(linha com pontos preto), ramipril(linha com traco longo e

pontos azul), trandolapril (linha com traco longo e dois pontos marron)

e perindopril(linha com traco curto cinza). O grafico menor mostra a

energia de interacao para os raios menores que 5 A. O sıtio de ligacao e

medido a partir do centroıde de cada anti-hipertensivo e o resıduo mais

distante da enzima ECAn. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 50

1.3 A energia de interacao total entre a HMGR e atorvastatina (A), rosu-

vastatina (R), cerivastatina (C), sinvastatina (S), mevastatina (M), e

fluvastatina (F) para os raios de interacao de 6,5 A, 9,5 A e 12 A. . . . . p. 52

1.4 Sıtios de ligacao da atorvastatina, rosuvastatina, sinvastatina, fluvas-

tatina, sinvastatina e mevastatina. Os resıduos mais importantes da

HMGR ligados as estatinas tambem sao mostrados: K735, R590, K692,

K691, R702, e R628 (atrativos) e E665, D767, D690, E559 (repulsivos) p. 53

1.5 Estruturas quımicas e principais funcionais quımicos da atorvastatina,

rosuvastatina, sinvastatina, e fluvastatina. . . . . . . . . . . . . . . . . p. 54

1.6 Sıtio de ligacao, energia de interacao e resıduos do domınio (Binding

site, Interaction energy an Residues Domain - BIRD) esse painel mos-

tra os resıduos relevantes da atorvastatina, rosuvastatina, sinvastatina, e

fluvastatina que contribui para a ligacao com a enzima HMGR . . . . . p. 55

1.7 Distancias entre os resıduos da HMGR e atorvastatina, rosuvastatina,

sinvastatina, e fluvastatina. Suas energias de interacao sao as mais im-

portantes contribuicoes para a energia total do complexo HMGR/estatina p. 56

1.8 Os aminoacidos blindados R568, D767 e R702 interagindo com atorvas-

tatina, rosuvastatina, sinvastatina e fluvastatina (a estrutura das quatro

estatinas e seis aminoacidos estao superpostas) . . . . . . . . . . . . . . p. 61

2.1 Dımero da COX-1 ovina co-cristalizada com bromaspirina, pdb 1PTH.

Os resıduos do sıtio de ligacao estao dentro do cırculo com linhas tra-

cejadas que envolve a bromaspirina. Figura obtida usando o software

pymol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 73

2.2 As moleculas de bromaspirina (ver a ligacao C3’Br) e de aspirina (ver

a ligacao C3’H), e suas regioes i, ii e iii. Encontram-se em ambiente

neutro ou levemente alcalino, com pH 7.2-7.4, dando origem ao estado

protonado em que a carga negativa −e e atribuida aos oxigenios (ver na

regiao i as ligacoes em linhas tracejadas) . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 76

2.3 O sıtio de ligacao da bromaspirina depois da acetilacao obtida consi-

derando calculos de quımica quantica: A - refinamento de ordem zero

dos dados estruturais originais; B - refinamento de segunda ordem dos

dados estruturais originais; C - Troca do Br por H (isto e, uma con-

versao da bromospirina em aspirina depois da acetilacao) considerando

o refinamento de segunda ordem dos dados estruturais originais . . . . p. 78

2.4 As distancias em A(numeros pequenos) entre os onze resıduos mais im-

portantes no sıtio de ligacao da COX-1 com a bromaspirina depois da

acetilacao obtidos por calculos de quımica quantica em: A,B - refina-

mento dos dados estruturais originais; C,D - refinamento de segunda

ordem dos dados originais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 79

2.5 A posicao do acido salicılico no sıtio de ligacao da COX-1 no refinamento

de ordem zero (ligacoes em verde escuro) e a segunda ordem (ligacoes em

verde claro) dos dados da estrutura original da bromaspirina depois da

acetilacao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 80

2.6 Energia de interacao dos principais resıduos do sıtio de ligacao do monomero

da COX-1 com o acido salicılico depois da acetilacao entre Ser530 e a bro-

maspirina obtida considerando o refinamento de ordem zero (cinza claro)

e refinamento de segunda ordem (cinza escuro) dos dados estruturais ori-

ginais. A energia de ligacao total da bromaspirina depois da acetilacao

e -39,56 kcal/mol e -70,21 kcal/mol para a ordem zero e segunda ordem

de refinamento, respectivamente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 82

2.7 Energia de interacao dos principais resıduos do sıtio de ligacao do monomero

da COX-1 com o acido salicılico depois da acetilacao entre Ser530 e a

aspirina obtidos considerando calculos de quımica quanticas de segunda

ordem (cinza escuro) dos dados originais. A energia total da aspirina des-

pois da acetilacao e -72,82 kcal/mol. Para efeito de comparacao, a energia

de interacao dos principais resıduos do sıtio de ligacao do monomero da

COX-1 com o acido salicılico depois da acetilacao do Ser530 com a bro-

maspirina obtido a partir de calculos de quımica quantica considerando

o refinamento de segunda ordem (cinza claro) dos dados originais. A

energia total da bromaspirina depois das acetilacao do Ser530 e -70,21

kcal/mol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 83

2.8 Isosuperfıcies de potencial eletrostatico envolta do acido salicılico dos

resıduos mais repulsivos e atrativos da bromaspirina (A) e aspirina (B)

depois da acetilacao obtido por calculos de quımicas quantica conside-

rando o refinamento de segunda ordem dos dados estruturais originais. p. 84

3.1 Esquema simplificado mostra o processo que controla a pressao sanguınea

e os alvos para desenvolvimento de farmacos. . . . . . . . . . . . . . . . p. 97

3.2 Estrutura tridimencional do captopril . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 98

3.3 Estrutura tridimencional da enzima conversora de angiotensina co-cristalizada

com um anti-hipertensivo na representacao soft ribbon, onde o ıon de

zinco e destacado no interior do sıtio de ligacao da ECA daDrosophilaMelanogaster

(codigo PDB : 2X8Z). Figura obtida usando o software Molsoft . . . . p. 98

3.4 Estrutura 3D da ECAn (DrosophilaMelanogaster) co-cristalizada com

o anti-hipertensivo captopril e com destaque do raio de interacao r (PDB:

2X8Z). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 99

3.5 A variacao da energia de interacao como uma funcao do raio para: cap-

topril (linha solida verde), enalapril (linha com traco longo vermelha),

lisinopril (linha com pontos preto), ramipril(linha com traco longo e pon-

tos azul), trandolapril (linha com traco longo e dois pontos marron) e

perindopril (linha com traco curto cinza). O grafico menor mostra a

energia de interacao para os raios menores que 5 A. O sıtio de ligacao e

medido a partir do centroıde de cada anti-hipertensivo e o resıduo mais

distante da enzima ECAn. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 103

3.6 A variacao da energia de interacao usando blindagem como uma funcao

do raio para: captopril (linha solida verde), enalapril (linha com traco

longo vermelha), lisinopril(linha com pontos preto), ramipril(linha com

traco longo e pontos azul), trandolapril (linha com traco longo e dois

pontos marron) e perindopril(linha com traco curto cinza). O grafico

menor mostra a energia de interacao para os raios menores que 5 A. . . p. 104

3.7 A energia de interacao total entre a ECAn e captopril (C), enalapril (E),

lisinopril (L), ramipril (R), trandolapril (T), e perindopril (P) para os

raios de interacao de 6,0 A, 9,0 A, 12.0 A. e 12.0 A. . . . . . . . . . . . . p. 105

3.8 Estrutura quımica dos seis anti-hipertensivos mais importantes com os

funcionais em destaques por regioes identificadas por letras minusculas e

em negrito. Os atomos estao numerados de acordo com dados do arquivo

PDB. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 110

3.9 Sıtio de ligacao, energia de interacao e resıduos do domınio (Binding site,

Interaction energy an Residues Domain - BIRD) esse painel mostra os

resıduos relevantes da captopril, enalapril, lisinopril que contribui para a

ligacao com a enzima ECAn, usando blindagem . . . . . . . . . . . . . p. 111

3.10 Sıtio de ligacao, energia de interacao e resıduos do domınio (Binding site,

Interaction energy an Residues Domain - BIRD) esse painel mostra os

resıduos relevantes da ramipril, trandolapril, e perindopril que contribui

para a ligacao com a enzima ECAn usando blindagem . . . . . . . . . . p. 112

3.11 Distancias dos principais aminoacidos aos anti-hipertensivos capitopril

(verde escuro) e enalapril (verde claro). . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 113

3.12 Distancias dos principais aminoacidos aos anti-hipertensivos lisinopril

(roxo) e ramipril (amarelo). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 113

3.13 Distancias dos principais aminoacidos aos anti-hipertensivos trandolapril

(verde cana) e perindopril (azul claro). . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 114

3.14 Aminoacidos pertencentes ao sıtio de ligacao (HEEYH) do Zn+2 da ECAn,

que blindam as interacao desse ıon com os resıduos carregados. Em (a)

mostra a estruturas superpostas do Captopril (roxo), Enalapril (verde),

Lisinopril (laranja) e os aminoacidos (branco), os atomos de N, S e O,

estao representados pelas cores azul, amarelo e vermelho, respectiva-

mente. Em (b) mostra a estruturas superpostas do Ramipril (cinza),

Trandolapril (azul claro) e Perindopril (amarelo claro). . . . . . . . . . p. 114

Lista de Tabelas

0.1 Os medicamentos mais vendidos (blockbuster) no ano de 2004, Ref. [6]. p. 30

1.1 Resıduos da enzima HMGR que interagem com atorvastina (A), rosu-

vastatina (R), cerivastatina (C), sinvastatina (S), mevastatina (M), e

fluvastatina (F) com o aumento do raio de interacao. Vermelho (azul) re-

presenta resıduos carregados negativamente (positivamente). O resıduos

mais importantes que interagem com as estainas estao em negrito. O

raio de interacao varia de 9,5A a 12A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 51

2.1 Comprimento das ligacoes quımicas entre os atomos pertencentes a molecula

da timina no cristal anidro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 87

3.1 Resıduos da enzima ECAn que interagem com captopril (C), enalapril

(E), lisinopril (L), ramipril (R), trandolapril (T), e perindopril (P) com

o aumento do raio de interacao. Vermelho (azul) representa resıduos

carregados negativamente (positivamente). O resıduos mais importantes

que interagem com as estainas estao em negrito. O raio de interacao

varia de 2,0A a 11,5A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 106

3.2 Resıduos da enzima ECAn que interagem com captopril (C), enalapril

(E), lisinopril (L), ramipril (R), trandolapril (T), e perindopril (P) com

o aumento do raio de interacao. Vermelho (azul) representa resıduos

carregados negativamente (positivamente). O resıduos mais importantes

que interagem com as estainas estao em negrito. O raio de interacao

varia de 12,0A a 16,0A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 107

Sumario

Introducao p. 25

Escopo da tese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 36

Referencias p. 39

1 Estatinas p. 43

1.1 Estatinas e HMGR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 43

1.2 Resultados e Discussao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 49

1.3 Consideracoes finais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 60

1.4 Calculos de primeiros princıpios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 62

1.5 Sumario do Capıtulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 65

Referencias p. 67

2 Aspirina p. 71

2.1 Aspirina e COX-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 71


2.2.1 Metodologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 87


Referencias p. 91

3 Anti-hipertensivos p. 95

3.1 Anti-hipertensivos e ECA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 95



Referencias p. 117

4 Conclusoes Gerais & Perspectivas p. 119

Perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 121

Anexo A -- Metodologia Computacional p. 123

A.1 O Hamiltoniano Geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 123

A.2 Hartree-Fock . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 125

A.3 Teoria do Funcional da Densidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 128

A.3.1 Aproximacao da Densidade Local . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 136

A.3.2 Aproximacao do Gradiente Generalizado . . . . . . . . . . . . . p. 137

A.4 Conjuntos de Bases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 138

Referencias p. 143

Anexo B -- Publicacoes p. 145

25

Introducao

As doencas cardiovasculares (CVDs) compreendem um amplo espectro de doencas

do coracao e vasos sanguıneos, (arterias e veias), entre as quais se incluem a doenca das

arterias coronarias, o infarto, a angina, a sındrome coronariana aguda, o aneurisma da

aorta, arritmias cardıacas, a doenca cardıaca congenita, a insuficiencia cardıaca e a doenca

cardıaca reumatica. Entre os fatores de risco para as CVDs estao condicoes medicas,

fatores relacionados ao estilo de vida e fatores hereditarios. As CVDs sao reconhecidas

como a principal causa de mortalidade humana, tendo sido responsavel por 17 milhoes

de mortes em 2005, 30% do total. Destas, 7,6 milhoes sao causadas por ataques do

coracao e 5,7 milhoes sao devido a enfartes [1]. Cerca de 80% das mortes por doencas

cardiovasculares ocorrem em paıses de renda per capita baixa ou media. Nos paıses

desenvolvidos, as CVDs causam o dobro de mortes que o HIV, malaria e tuberculose

combinadas. As CVDs impoem elevado custo social, incluindo limitacoes na qualidade de

vida, sendo responsavel por grandes dispendios dos recursos financeiros governamentais

para a saude [2].

O infarto e o acidente vascular cerebral (AVC, vulgarmente conhecido como derrame)

sao as mais espetaculares – e letais – manifestacoes de CVD, mas sao usualmente o re-

sultado de um longo processo de deteriorizacao sutil do sistema circulatorio. Um ataque

do coracao ocorre quando uma ou mais das tres arterias coronarias que fornecem sangue

ao musculo cardıaco torna-se bloqueada. Isto causa um corte no suprimento de oxigenio

e outros nutrientes a uma parte do coracao, que e entao danificado ou morto. A area

danificada do musculo do coracao (myocardium) e chamada de infarto. O infarto do

miocardio, oclusao coronariana, doenca isquemica do coracao, crise cardıaca e trombose

coronariana sao todos sinonimos de ataque do coracao. Se o dano e tao intenso que o

coracao nao consegue mais funcionar, entao o indivıduo morre. Mas mesmo danos me-

nos severos podem perturbar os impulsos eletricos que se originam do marcador interno

do coracao e regulam a pulsacao cardıaca. Isto ira produzir ritmos cardıacos anormais

(aritmias cardıacas), algumas podendo ser muito perigosas pois podem resultar em fi-

brilacoes ventriculares, i.e. contracoes rapidas das camaras maiores do coracao de uma

forma descoordenada. A morte pode ocorrer dentro de poucos minutos, a nao ser que

26 Introducao

Figura 0.1: Anatomia do coracao humano

o ritmo normal do coracao seja restaurado. Fibrilacoes ventriculares podem resultar de

injurias ou anormalidades do coracao diferentes do bloqueio das arterias coronarianas.

Muitos infartos sao causados pelo aprisionamento nas arterias coronarias de coagulos

do sangue formados em outra parte do corpo; usualmente, entretanto, o entupimento das

arterias e o resultado da formacao de placas ateroscleroticas. As placas desenvolvem-

se gradualmente durante um perıodo de muitos anos. Elas contem uma acumulacao

de celulas de tecido muscular das paredes arteriais, lipıdeos (especialmente colesterol) e

calcio. As placas ateroscleroticas servem como sıtios de iniciacao para a formacao de

coagulos no sangue, que bloqueiam as arterias. Alem disto, as placas podem evoluir ate o

ponto onde elas bloqueiam parcialmente as arterias coronarianas de modo que os musculos

ainda recebem suficiente oxigenio quando o indivıduo esta em repouso, mas nao durante

a realizacao de atividades que demandam esforco (exercıcios), resultando em dores tran-

sientes (angina pectoris). As condicoes caracterizadas pelo inaquedado suprimento de

oxigenio ao coracao sao denominadas coletivamente de doencas coronarianas. A ateroes-

clerose pode afetar e bloquear qualquer arteria. Se as lesoes formam-se em arterias da

perna, o fluxo do sangue para a extremidade pode ser cortado, causando entorpecimento,

dor e por ultimo grangrena se nao for tratado (desbloqueado). Se as arterias bloquedas

pelas placas ateroescleroticas estiverem no cerebro, um acidente vascular cerebral pode

Introducao 27

Figura 0.2: Desenvolvimento de uma lesao ateroesclerotica. A progressao da lesao athe-roesclerotica e mostrada de forma simplificada, comecando a desenvolver-se num vasosanguıneo normal (extremidade esquerda) ate o aparecimento de uma placa ateroes-clerotica e um trombo superposto (extremidade direita) [3].

resultar e uma parte do cerebro ira ser danificada. Alternativamente, o acidente vascular

cerebral pode ocorrer quando um dos vasos sanguıneos do cerebro se rompe. Este tipo

de acidente vascular cerebral e mais provavel de ocorrer em pessoas que nao controlam a

pressao sanguınea elevada, especialmente se elas tambem apresentam ateroesclerose.

Entre os principias farmacos que tratam as doencas cardiovasculares estao: (i) as es-

tatinas, que atuam inibindo a 3-hidroxi-3-metilgluratil coenzima A (HMG-CoA) redutase

no processo de conversao da HMG-CoA em mevalonato, numa das etapas da biossıntese

do colesterol. Observa-se em ensaios clınicos que a acao das estatinas pode diminuir os

nıveis de colesterol de baixa densidade (LDL) entre 20% e 60%, reduzindo os eventos

coronarianos em ate 1/3 no perıodo de cinco anos; (ii) a aspirina, com a qual ha mais

de 400 preparacoes nos EUA e se produz cerca de 20 mil toneladas anualmente. Apos

mais de um seculo de pratica clınica, a aspirina continua sendo a droga antitrombotica,

antitermica, analgesica e antiproliferativa mais amplamente recomendada. Ela age blo-

28 Introducao

queando a biossıntese de hormonios inflamatorios prostanoides atraves da inibicao das

enzimas ciclooxigenase COX-1 e COX-2; (iii) os anti-hipertensivos, para os quais a En-

zima Conversora de Angiotensina (ECA) e o principal alvo (inibidores da ECA estao

no mercado a mais de 20 anos) visando o combate das pressoes arteriais elevadas, que

provocam alteracoes nos vasos sanguıneos e na musculatura do coracao, e levam a hiper-

trofia do ventrıculo esquerdo do coracao, acidente vascular cerebral, infarto do miocardio,

morte subita, insuficiencias renal e cardıaca, etc. A hipertensao arterial (HTA) ou hi-

pertensao arterial sistemica (HAS), conhecida popularmente como pressao alta, e uma

das doencas com maior prevalencia no mundo moderno. A ECA atua na regulacao da

pressao sanguınea via conversao do decapeptıdeo angiotensina I no potente vasopressor

angiotensina II e tambem pela inativacao da bradicinina, sendo componente central do

Sistema Renina-Angiotensina-Aldeosterona (SRAA), que controla a pressao sanguınea e

tem forte influencia nas funcoes relacionadas ao coracao e os rins, bem como na contracao

dos vasos sanguıneos.

A elevada pressao sanguınea, tambem chamada de hipertensao, e um dos principaias

fatores de risco nao somente para o acidente vascular cerebral, mas tambem para o ataque

cardıaco e a ateroesclerose. A hipertensao nao produz sintomas a nao ser que ela seja

severa ou nao tenha sido tratada durante muito tempo, mas ela execerce tensao sobre o

coracao, que e forcado a trabalhar mais intensamente de modo a mover o sangue contra

pressoes mais elevadas que o normal. Um aumento do coracao tambem e resultado de

pressao sanguınea elevada. A hipertensao tambem pode contribuir para o desenvolvi-

mento da ateroesclerose ao danificar as paredes arteriais. Ela pode ser classificada como

hipertensao primaria, que ocorre em 90–95% dos casos, para a qual nao se descobre ne-

nhuma causa medica, e o restante dos 5-10% dos casos, que sao causados por problemas

que afetam os rins, arterias, coracao e o sistema endocrino.

O colesterol e a pressao arterial elevada, hipercolesterolemia e hipertensao, respecti-

vamente, aumentam os riscos de se desenvolver doencas coronarianas. Esses dois fatores

estao relacionaodos a dois sistemas essenciais ao bom funcionamento do corpo humano,

que sao a biossıntese do colesterol e o sistema renina—angiotensina—aldeosterona. O

colesterol e um importante constituinte da membrana celular e tambem e o precursor

de hormonios esteroides, por isso e vital, para o funcionamento saudavel das celulas. A

mortalidade relacionada de doencas coronarianas tem sido associada com altos nıveis de

lipoproteinas de baixa densidade (LDL do ingles, Low-Density Lipoprotein) e baixos nıveis

de lipoproteınas de alta densidade (HDL do ingles, High-Density Lipoprotein). Alem disso,

LDL transporta o colesterol para as arterias, e o se o colesterol ficar retido la, podera levar

Introducao 29

a formacao de placas de gordura que estreitam as arterias, aumentando o risco de infarto.

O colesterol e sintetizado dentro das celulas, e uma estrategia para reduzir os nıveis de

colesterol no sangue e bloquear essa sıntese. As estatinas sao um importante grupo de

farmacos que reduzem o colesterol atuando como inibidores da enzima que catalisa o passo

limitante de todo o processo, a HMG-CoA reductase [4]. O mercado para os farmacos que

reduzem o colesterol e dos maiores no setor farmaceutico, sendo dominado pelas estatinas

(ver Tab. 0.1).

Por outro lado, a angiotensina II e um importante hormonio que causa a contracao

dos vasos sanguıneos, resultando no aumento da pressao arterial. Esse hormonio deriva

da angiotensina I, que nao tem atividade apreciavel em si, porem e convertida pela ECA

(enzima conversora de angiotensina) em angiotensina II. A ECA e uma enzima ligada

a membrana presente na superfıcie das celulas endoteliais. A isoforma comum da ECA

tambem e encontrada em outros tecidos vasculares (coracao, cerebro, rins, etc), mas

tambem existe uma isoforma diferente da ECA nos testıculos. Portanto, a ECA e um

importante alvo para a inibicao da formacao da angiotensina II e consequentemente, um

importante alvo quando se visa reduzir a pressao arterial.

O principal interesse da industria farmaceutica e que centenas de milhoes de adultos

tem colesterol alto, sao hipertensivos ou tem problemas no sistema de coagulacao do san-

gue, o que gerou um mercado bilionario de farmacos concebidos para reduzir e controlar os

nıveis sericos do colesterol total, a pressao arterial e a coagulacao sanguinea. A Tab. 0.1

mostra que entre os quinze farmacos mais vendidos no mundo, cinco estao relacionados a

prevencao de doencas cardıacas. Os farmacos que tem um faturamento anual de mais de

um bilhao, os assim chamados Blockbusters [5], torna o setor de pesquisas e desenvolvi-

mento (P&D) de farmacos altamente competitivo, com elevados nıveis de investimentos

da industria farmaceutica [5].

Os avancos quımicos e biologicos tornam possiveis uma melhor compreensao dos me-

canismos fisisologicos e farmacologicos que levam ao aparecimento e desenvolvimento de

doencas, tornando possıvel o planejamento e a descoberta de farmacos capazes de re-

presentar notaveis benefıcios terapeuticos, alem de melhorias na qualidade de vida das

diversas populacoes mundiais [5]. As estrategias de planejamento de novos farmacos

fundamentam-se no conhecimento previo do processo fisiologico envolvido no surgimento

da doenca alvo e na selecao de um alvo macromolecular adequado. Os alvos moleculares

sao principalmente proteınas (enzimas), podendo ter ou nao a estrutura tridimensional

determinada. Os grandes avancos da genomica e proteomica, e tambem a evolucao das

30 Introducao

Tabela 0.1: Os medicamentos mais vendidos (blockbuster) no ano de 2004, Ref. [6].

tecnicas de raios-X e ressonancia magnetica nuclear (RMN), proporcionaram um aumento

significativo do numero de alvos moleculares que possuem estruturas tridimenssionais de-

positadas no Banco de Dados de Proteınas (PDB, Protein Data Bank) [7]. Como exemplo,

a Fig. 0.3, mostra tres estrutas cristalograficas de proteınas depositadas no PDB com os

seguintes codigos de identificacao 3Q4A, 3MGF e 3NSL. A partir dessas estruturas co-

cristalizadas com uma molecula ou farmaco e possivel se investigar o sıtio ativo, descreve-lo

qualitativamente e quantitativamente. Para isso, e necessario se conhecer quais os tipos

de interacoes ocorrem entre a macromolecula alvo e o farmaco.

Ha varios tipos de ligacoes intermoleculares, que diferem na sua forca de interacao. O

numero e tipo dessas interacoes dependem da estrutura do farmaco e dos grupos funcio-

nais que estao presentes no sıtio de ligacao. Os tipos de interacoes intermoleculares sao:

as interacoes eletrostaticas ou ionicas, as ligacoes de hidrogenio, as interacoes de Van der

Walls, as interacoes dipolo-dipolo e ıon-dipolo, e as interacoes repulsivas e hydrofobicas [8].

A interacao ionica ou eletrostatica e uma forte interacao intermolecular (20 - 40 kJ/mol

[8], e se localiza entre dois grupos quımicos que tenham cargas opostas. A forca da in-

teracao e inversamente proporcional ao quadrado da distancia entre as cargas e tambem

depende da natureza do ambiente, sendo mais forte em ambientes hidrofobicos que em

ambientes polares. As ligacoes de hidrogenio variam substancialmente na sua forca (16

Introducao 31

- 60 kJ/mol) [8], e normalmente ocorrem entre um heteroatomo rico em eletrons e um

hidrogenio com deficiencia de eletrons. A forca da ligacao de hidrogenio pode variar am-

plamente, mas a maioria dessas interacoes sao moderadas. As interacoes de Van der Walls

sao muito fracas (2 - 4 kJ/mol) [8], e envolvem interacoes entre as regioes hidrofobicas de

diferentes moleculas. As interacoes de dipolo-dipolo e ıon-dipolo depende das diferencas

de eletronegatividades, que geram um momento de dipolo permanente. A interacao de

um ıon-dipolo e quando um grupo quımico carregado de uma molecula interage com um

dipolo de uma segunda molecula. Essas duas ultimas interacoes sao fortes, porem decaem

rapidamente com a distanca. Existem tambem as interacoes repulsivas, que podem ajudar

a aumentar a aproximacao entre determinados grupos quımicos, e assim ajudar na estabi-

lizacao da molecula dentro do sıtio de ligacao. As interacoes repulsivas estao relacionadas

a superposicao de orbitais moleculares quando os grupos quımicos ficam muito proximos,

e tambem dependem da carga do grupos quımicos (se as cargas tiverem mesmo sinal, irao

se repelir). As interacoes hidrofobicas ocorrem entre moleculas que possuem uma regiao

hidrofobica e os aminoacidos que possuem essa cararcteristica. A Fig. 0.4 mostra uma

molecula dentro de um sıtio de ligacao hidrofobico, e sua superfıcie de interacao dentro

dessa regiao, onde e possivel ver parcialmente os tipos de interacoes descritos acima.

Nao obstante a pesquisa muito intensa sobre os mecanismos de ligacao dos farmacos

com proteinas, nao ha um entendimento claro sobre os detalhes da interacao de drogas

com estas macromoleculas. Tal entendimento e fundamental para se descrever e desenhar

novos farmacos (ou derivativos dos ja conhecidos) mais eficientes e com melhor acao

inibitoria, alem de resistentes a mutacoes e com menores efeitos colaterais. Os muitos

papeis da computacao na descoberta de novas drogas abordam principalmente triagem

virtual (do ingles, virtual screening), e o desenvolvimento e a avaliacao das semelhancas

das estruturas dos farmacos usando docking e dinamica molecular [9].

Por outro lado, os metodos de quımica quantica, chamados de ab initio uma vez

que trabalham sem o uso de parametrizacoes empıricas, comecam a ser utilizados para a

simulacao de sistemas moleculares com centenas ou milhares de atomos (no ultimo caso,

usando super computadores). Uma compreencao detalhado da atuacao do ligante via uma

descricao bioquımica quantica [10] do sıtio de ligacao da enzima-proteina e essencial para

a descricao de suas energias e tambem quantificar contribuicoes individuais dos resıduos

para a energia de interacao total (afinidade), e isso pode ser bastante utilizado para o

desenvolvimento de novos ligantes derivados dos compostos lideres. Como foi enfatizado

por Zhou et al. [11], Metodos de mecanica quantica estao se tornando cada vez mais

populares em pesquisa de farmacos, esse deselvovimento esta relacionado principalmente

32 Introducao

Figura 0.3: Exemplos de estruturas tridimensional de cristais de proteınas determinadapor difracao de raio-X onde os codigos PDB sao: (a) 3MGF, (b) 3Q4A (c) e (d) 3NSL,onde pode-se visualizar as protınas em ribbon e na representacao N ate C terminal sendoque em (d) as aguas sao destacadas na estrutura. Figuras obtidas a partir do softwareMolsoft.

a alta precisao na estimativa (relativa) da afinidade de ligacao. Segundo Raha et al. [12],

o uso rotineiro de metodos QM (do ingles, Quantum Mechanics) em todas as fases do

desenvolvimento de farmacos in silico e de extrema importancia para a evolucao dessa

area de pesquisa. Nesse aspecto, calculos teoricos usando aproximacoes semi-empirıricos

e ab inito quanticos sao muito utilizados, pois permitem calcular a energia de interacao

em nıvel atomico, orientando o desenvolvimento experimental de novas e mais potentes

farmacos. No entanto, como as macromoleculas (em geral, proteinas) sao muito grandes,

e necessario alcancar um compromisso entre custo computacional dos calculos e a precisao

necessaria para obter resultados confiaveis.

Os metodos de bioquımica quantica tem sido adotados recentemente em diversos tra-

Introducao 33

balhos que descrevem a interacao farmaco-proteına, com resultados expressivos [13, 14,

15, 16]. Por exemplo, Zang et al. [17] relatou um mapa completamente quantico das

interacoes proteına-ligante da β - tripsina benzamidina. Hoffman e Nowosielski usaram

calculos em nivel da Teoria do Funcional da Densidade (DFT) para investigar a inter-

conversao do acido hidroxi-lactona da atorvastatina [18], e foram encontrados resultados

que apoiam dados experimentais anteriores sobre o carater pH-dependente desse processo.

Outros trabalhos tambem relatam o uso de metodos de bioquımica quantica para descrever

a interacao de inibidores de macrocıclicos de α-trombina humana [19] e investigar como

eles fazem para descrever a energia de um modelo peptıdeo do colageno [20]. Tambem

e encontrado na literatura calculos quanticos com a finalidade de terminar as caracteris-

ticas famacoforicas do inibidores da ECA e endopeptideses neutras [21]. Recentemente,

interacoes aromaticas entre o sıtio de ligacao responsaveis pela acao da estabilizar o li-

gante enzima HMGR foi e estudada por Kee et al. [22], utilizando metodos DFT e varios

MP2, mostrando que a correspondencia dos valores de energia dos metodos DFT local

MP2 valores para as ligacao aromaticos do metodo DFT hıbrido ou gradiente corrigido.

Kee et al. [22] concluiu que a interacao entre Tyr478 e HMGR sao muito importantes,

sugerindo que as interacoes de empilhamento π−π entre as estatinas e aromaticas HMGR

merece mais atencao no desenvolvimento de farmacos para inibir a acao dessa enzima [22].

No Apendice A desta tese encontra-se uma descricao abreviada da Teoria do Funcional

da Densidade.

A modelagem computacional das estatinas e de outros inibidores da HMGR humana

foi realizada principalmente por meio de docking. Uma busca racional baseada na estru-

tura para possıveis novos inibidores da HMGR humana, combinando modelagem quan-

titativa QSAR-3-dimensional (do ingles, quantitative structure-activity relationships), e

triagem virtual foi realizado por Zhang et al. [23], sendo obtido um conjunto represen-

tativo de oito novas estruturas diferentes das estatinas com valores de IC50 potentes.

No entanto, os aminoacidos foram selecionados no sıtio ativo localizados na faixa de 6,5

A de distancia de qualquer atomo dos ligantes. Essas ferramentas de desenvolvimento

moleculares auxiliadas por ferramentas computacionais, ou seja, de docking flexıveis, de

triagens virtuais e grandes bases de dados, alem de muitos campos de forca para interacao

molecular foram utilizados por Da Silva et al. [24] para propor novos potenciais inibidores

para a enzima HMG-CoA redutase que sao promissores para o tratamento da hiperco-

lesterolemia. Metodos de docking molecular foram utilizados para investigar dezenove

inibidores HGMR, sendo realizada uma comparacao da sua eficacia hipolipidemica, tendo

sido observado que a maioria das estruturas que continham o acido benzoico, catequina,

34 Introducao

Figura 0.4: Sitio de ligacao representado por uma superfıcie na cor cinza da proteınaHMGR co-cristalizada com a cerivastatina.

acido hidroxicıtrico e piperina tem semelhancas com as propriedades da atorvastatina em

estudo in silico [25]. No entanto, um caixa de apenas 5 A x 5 Ax 5 Afoi criada para as

simulacoes, e a forca das interacoes locais nao foi estimada [25].

Apos mais de um seculo de pratica clınica, a aspirina continua sendo a antitrombotica,

antitermica, analgesica e antiproliferativa droga mais amplamente recomendada [26, 27,

28]. Ela age bloqueando a biossıntese de hormonios inflamatorios prostanoides atraves da

inibicao das enzimas ciclooxigenase (COXs),que estericamente impede a entrada do acido

araquidonico ligante fisiologico [29]. As evidencias disponıveis sugerem que as proprie-

dades anti-inflamatorias e analgesicas dos AINEs tradicionais sao devidos a inibicao da

COX-2, enquanto que os efeitos colaterais ulcerogenicos desses inibidores sao associados ao

bloqueio da COX-1 (2-11). Vane [28, 30] e Smith e Willis [31] propuseram que a aspirina

e outros AINEs inibem a atividade da enzima que converte acidos graxos polinsaturados

em prostaglandinas durante o processo inflamatorio. A base estrutural da atividade da

Introducao 35

aspirina inferida a partir da infra-estrutura de cristal de prostaglandina H2 sintase inati-

vada foi revelado por Loll, Picot e Garavito (18). Eles obtiveram (por difracao de raios-X)

uma estrutura com resolucao de 3,4 A de COX-1 ovina inativado pelo bromoaspirin (po-

tente analoga da aspirina), que foi escolhida devido ao seu alto poder de espalhamento

do atomo de bromo que permitiu sua localizacao inequıvoca, mesmo com um mapa de

densidade eletronica de baixa resolucao. A estrutura cristalina da bromoaspirina mos-

trou ser isosterica ao da aspirina [32], sendo verificada que a aspirina inibe a COX-1 tao

eficientemente quanto bromoaspirina [33]. De acordo com a interpretacao habitual dos

dados estruturais, os resıduos mais importantes no sıtio de ligacao da aspirina na COX-1

sao: Ser530, devido a acetilacao irreversıvel da aspirina; Arg120, que faz uma ponte de

sal com a porcao de acido carboxılico; Ser353, devido ao seu carater polar. Alem disso,

Ile523 e crucial, pois a sua mutacao para Val523 transforma a primeira camada do sıtio

ativo da COX-1 na de COX-2.Entretanto, a analise baseada em comprimentos de ligacao

de dados estruturais de difracao de raios-X, bem como os procedimentos de docking e si-

mulacoes de dinamica molecular [34] sao muito limitadas em quantificar a eficacia de cada

resıduo para a ligacao da aspirina a COX-1. Em particular, a baixa resolucao dos dados

estruturais podem comprometer a sua interpretacao, limitando seriamente uma profunda

compreensao do papel dos resıduos e os atomos ligantes sobre as caracterısticas do sıtio

de ligacao. Uma compreensao detalhada das do mecanismo da aspirina descrito ao nıvel

quımica quantica [10] e de sua ligacao a cada resıduo da COX-1 e essencial para uma

descricao energetica e para quantificar as contribuicoes individuais para a energia total de

ligacao, e deve ser muito util para a concepcao de novos derivados de acido acetilsalicılico.

A enzima conversora de angiotensina (ECA) e o maior alvo para a terapias cardiovas-

culares, e os inibidores da ECA estao no mercado a mais de 20 anos [35]. Essa enzima e

membro do grupo de enzimas chamadas de metalopeptidases, que catalisam a hidrolise de

um fragmento dipeptideo do fim da cadeia da chamada angiotensina I e a transforma em

um poderoso vasoconstritor, o octapeptıdeo angiotensina II, que resulta no aumento da

pressao sanguinea. Existem varias estruturas homologas da ECA, porem o terminal C da

forma somatica da ECA humana e o responsavel pela conversao da angiotensina II [36].

A ECA somatica humana e uma enzima com dois domınios, os domınios terminal N e C,

cada um deles possuindo um sıtio ativo similar, mas com especificidades distintas para

os substratos naturais bradicinina e angiotensina I [37]. A ECA e uma enzima ligada a

membrana, o que tem tornado difıcil o seu isolamento e estudo [8]. Por esse motivo, ou-

tras estrategias foram utilizadas para o desenvolmento dos seus inibidores. Recentemente

foram determinados as estruturas cristalograficas de alta resolucao da ECA testicular

36 Introducao

humana (ECAt) e da ECA da Drosophilamelanogaster (ECAn) (ver Fig. 0.5), duas en-

zimas homologas da ECA, complexada com farmacos anti-hipertensivos. Estas estruturas

tem oferecido novos detalhes em nıvel molecular da interacao desses inibidores [38, 39, 36].

Essas estruturas homologas da ECA oferecem oportunidades para o desenvolvimento de

inibidores seletivos entre o dominio N e C a partir do desenvolvimento do farmaco guiado

por dados estruturais [35]. A modelagem dos inibidores da ECA consiste principalmente

em propor a estrutura tridimensional da ECA somatica humana por homologia e algoriti-

mos de mecanica molecular [40, 41]. Outros peptıdeos bioativos derivados de alimentos ou

artificialmente que inibem a ECA estao sendo estudados por meio de docking molecular;

segundo Jimsheena et al., o tripeptideo IKP mostrou-se um potente inibidor com IC50 da

ordem de 7µM, valor similar aos dos peptıdeos IPP e VPP encontrados no soro de leite

[42, 43].

Figura 0.5: Estruturas tridimensionais de dois homologos da enzima conversa em an-giotensina co-cristalizada com o farmaco anti-hipertensivo lisinopril. Codigos PDB: (a)1O86, (b) 2X91, onde pode-se visualizar as enzimas em ribbon e na representacao N ateC terminal. Figuras obtidas a partir do software Molsoft.

Escopo da tese

Nesta tese realiza-se um estudo da bioquımica quantica de estatinas (atorvastina, rosu-

vastatina, cerivastatina, mevastatina, sinvastatina e fluvastatina), da aspirina/bromoaspirina

e de anti-hipertensivos (captopril, enalapril, lisinopril, ramipril, trandolapril e perindopril)

levando-se em conta dados cristalograficos dos seus sıtios de ligacao nas proteınas HMGR,

COX-1 (o da aspirina foi simulado partindo-se dos dados da bromoaspirina) e ECA, res-

Introducao 37

Figura 0.6: Sitio de ligacao representado por uma superfıcie na cor cinza da proteına fatorXa co-cristalizada com o anticoagulante oral apixaban.

pectivamente. A tese apresenta-se organizada em tres capıtulos distintos: estatinas 1,

aspirina 2 e anti-hipertensivos 3. Para os sistemas estudados foram utilizados os dados

cristalograficos publicados no banco de dados de proteinas (PDB). Calculos de bioquımica

quantica foram realizados em todos os sistemas para um estudo da energia de interacao

do sıtio de ligacao com as estatinas, aspirina/bromoaspirina e anti-hipertensivos. As

simulacoes computacionais foram realizadas considerando-se a Teoria do Funcional de

Densidade (DFT) na aproximacao da densidade local (LDA) e funcional de troca e cor-

relacao PWC, com energia de interacao entre os resıduos das proteınas circunscritos ao

sıtio de ligacao de raio r e os farmacos calculada atraves do metodo de fracionamento mo-

lecular com capas conjugadas (MFCC). Os resultados obtidos para as estatinas sugerem

que: (i) as mais (menos) eficazes sao a atorvastatina e a rosuvastatina (sinvastatina e flu-

vastatina), o que esta de acordo com a clınica e valores dos seus ındices de concentracoes

inibitorias IC50; (ii) sıtios de ligacao com raios de pelo menos 12 A (alem do raio de 9,5 A

sugerido pela analise estrita de dados cristalograficos) devem ser considerados para que

resıduos importantes como E665, D767, e R702 sejam considerados para que as eficiencias

das estatinas sejam corretamente explicadas. Para a aspirina/bromoaspirina utilizou-se

um refinamento quantico de segunda ordem dos dados cristalograficos para se demonstrar

que a energia de ligacao de ambos com a COX-1 e muito aproximadamente a mesma, o

que explica resultados experimentais de IC50 similares. A existencia de resıduos atrativos

e resulsivos e destacada, mostrando-se que Arg120 e o resıduo que mais atrai o acido

salicılico apos acetilacao da Ser530, seguido de Ala527, Leu531, Leu359 e Ser353; por ou-

38 Introducao

tro lado, Glu524 e o resıduo repulsivo mais efetivo (intensidade comparavel ao Arg120),

nunca tendo sido antes considerado como resıduo importante no sıtio de ligacao da aspi-

rina/bromoaspirina na COX-1. Finalmente, no caso dos anti-hipertensivos, obtem-se que

e necessario se considerar raios do sıtio de ligacao de 16 A para se obter que o lisinopro-

pil e o ramipril (trandolapril e perindopril) apresentam as maiores (menores) energias de

ligacao, o que explica a maior (menor) constante de inibicao dos mesmos entre os anti-

hipertensivos estudados para a ACE da Drosophila melanogaster. No Apendice B desta

tese encontra-se os artigos (i) Inactivation of ovine cyclooxygenase-1 by bromoaspirin and

aspirin: a quantum chemistry description, e (ii) Explaining Statin Inhibition Effectiveness

of HMG-CoA Reductase by Quantum Biochemistry Computations, que foram submetidos

para publicacao.

39

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43

1 Estatinas

1.1 Estatinas e HMGR

As doencas cardiovasculares se tornarao a maior causa da diminuicao de anos produ-

tivos no mundo ate o ano 2020, a qual se deve ao declınio das doencas transmissıveis e a

adocao de certos habitos ocidentais pouco saudaveis tais como dietas ricas em gordura,

uso do cigarro e falta de exercıcios fısicos [1, 2, 3]. As tres maiores manifestacoes das

doencas cardiovasculares sao problemas coronarianos (incluindo infarto do miocardio e

angina), doencas vasculares cerebrais (isquemia transiente e acidente vascular) e doencas

arteriais perifericas. Enquanto alguns fatores de risco nao podem ser controlados (por

exemplo, idade, genero e etnia), outros como o habito de fumar, a obesidade, hipertensao,

e hiperlipidemia podem ser modificados, tratados ou controlados. De fato, o risco de

doencas cardiovasculares pode ser reduzido atraves do uso de farmacos capazes de reduzir

o nıvel de colesterol, mudancas no estilo de vida (deixar o habito de fumar e praticar

exercıcios) e da mudanca na alimentacao, por meio de uma dieta que reduz o colesterol,

bem como por meio de tratamentos com remedios que nao tratam o colesterol (incluindo

aspirina e anti-hipertensivos) [4]. Centenas de milhoes de adultos possuem colesterol alto,

o que gera um mercado bilionario de remedios concebidos para reduzir e controlar os

nıveis de colesterol no sangue [5]. Consideradas como presentes da natureza citeEndo,

as estatinas sao as drogas mais efetivos, embora recentemente tenha havido tambem um

renascimento de nao-estatinas. Ha a esperanca, da parte de muitos medicos, de se ob-

ter a mesma eficacia das altas doses de estatinas sem os seus efeitos adversos atraves

da administracao de nao-estatinas (ezetimibe, niacina) juntamente com baixas doses de

estatinas [5]. As patentes das principais estatinas expiraram ou vao expirar logo (Lipitor

em 2010, Lescol em 2011, Crestor em 2012), o que pressiona as industrias farmaceuticas

a desenvolverem novos remedios para o mercado hipolipidemico, em particular derivados

das estatinas novos e mais efetivas [5].

44 1 Estatinas

As estatinas atuam inibindo a 3-hidroxi-3-metilgluratil coenzima A (HMG-CoA) re-

dutase no processo de conversao da HMG-CoA em mevalonato [6], numa das etapas da

biossıntese do colesterol. Observa-se em ensaios clınicos que esta acao diminui os nıveis

de colesterol de baixa densidade (LDL) entre 20% e 60%, reduzindo os eventos coronari-

anos em ate 1/3 no perıodo de cinco anos. As estatinas tambem aumentam os nıveis de

colesterol de alta densidade (HDL) entre 5 e 8% [7]. A HMG-CoA redutase humana con-

siste de uma cadeia polipeptıdica simples contendo 888 aminoacidos. Destes, 339 resıduos

com terminacao amina estao presos na membrana do retıculo endoplasmatico, enquanto a

atividade catalıtica da proteına se da na porcao imersa no citoplasma (parte soluvel com

terminal C, resıduos de 560 a 888). Uma regiao de ligacao (resıduos 340–459) conecta

as duas porcoes da proteına [8, 9, 10]. Dados de difracao de raio X com resolucao de

2 Amostram que as porcoes catalıticas da HMGR sao formadas pelos resıduos de 426 a

888, originando um tetramero cujos monomeros estao distribuıdos em dois dımeros, cada

um dos quais possui dois sıtios ativos, como mostra a Figura 1.1 [8]. Os monomeros

da HMGR possuem um terminal N (resıduos 460–527), um domınio L grande (resıduos

528–590 e 694–872), e um pequeno domınio com terminal S (resıduos 592–682).

As estruturas elucidadas de HMGR co-cristalizado com seis estatinas (compactina,

sinvastatina, fluvastatina, cerivastatina, atorvastatina e rosuvastatina) demonstram que

o sıtio de ligacao da HMGR esta localizado entre os domınios L e S, e sugere que vinte e

um resıduos de monomeros vizinhos (incluindo os do loop cis) contribuem para a ligacao:

E559 (E=acido glutamico), C561 (C=cisteına), L562 (L=leucina), S565 (S=serina), R568

(R=arginina), R590, V683 (V=valina), S684, N686 (N=asparagina), C688, D690 (D=acido

aspartico), K691 (K=lisina), K692, K735, H752 (H=histidina), N755, D767, S852, L853,

A856 (A=alanina) e L857 [8, 9, 10]. Alem disso, uma analise da distancia e do tipo de

interacao entre os resıduos e os atomos de uma dada estatina, trabalhos baseados nos da-

dos cristalograficos para HMGR complexado com estatinas sugerem, o que e amplamente

aceito, que os resıduos mais importantes no sıtio de ligacao sao S684, D690, K692 (in-

teracoes polares); E559, D767 (ligacoes de hidrogenio); e L562, V683, L853, A856, L857

(contatos de van der Waals) [9, 10]. Como ressaltam Istvan e Deisenhofer [9], a flexibi-

lidade inata da regiao com terminal COOH da HMGR e explorada fortuitamente pelas

estatinas para criar um sıtio de ligacao para si, e uma comparacao entre as seis estruturas

complexadas revela diferencas sutis nos modos de ligacao das estatinas com a HMGR.

Diferencas estruturais entre as estatinas podem explicar em parte as suas variacoes

de potencia na inibicao da HMGR [9, 10]. Existem varias estatinas importantes que di-

ferem na capacidade de reduzir o nıvel de colesterol e nos efeitos colaterais: a lovastatina

1.1 Estatinas e HMGR 45

Figura 1.1: O tetramero da HMGR ligado a quatro atorvastatinas. O quatro sıtios deligacao similares estao indicados por cırculos. E mostrado quatro esferas do sıtio de ligacao(ESL), cada uma com um raio r.

(C24H36O5) e a pravastatina (C23H16O7) sao usadas comumente para diminuir o nıvel de

LDL em ate 30%; a sinvastatina (C25H38O5) e empregada em comprimidos de 20 mg ou

40 mg para reduzir o nıvel de LDL em 30% ou mais, e/ou quando o paciente tem alguma

doenca cardıaca e diabetes, teve um ataque cardıaco ou sındrome coronariana aguda e

quando os nıveis de LDL nao sao altos; a atorvastatina (C33H35FN2O5) e usada em com-

primidos de 40 ou 80 mg se o nıvel de LDL esta elevado e o paciente teve ataque cardıaco

ou sındrome coronariana aguda; a rosuvastatina (C22H28FN3O6S), que e a estatina mais

potente disponıvel no mercado, com perfil de toxicidade semelhante ao das outras estati-

nas, mas com indicacoes ainda sendo determinadas, reduz em quase pela metade a taxa de

doenca tromboembolica venosa em doses diarias de 20 mg; a fluvastatina (C24H26FNO4),

que e efetiva para a prevencao secundaria de eventos cardıacos em pacientes apos inter-

vencoes cirurgicas nas coronarias e para a prevencao primaria de eventos cardıacos em

pacientes apos transplante renal; a cerivastatina, retirada do mercado em 2001 por causa

de sua toxicidade excessiva (foram registrados casos fatais de rabdomiolise); a compac-

tina ou mevastatina, que foi a primeira estatina potente capaz de inibir a HMGR, mas

nunca chegou ao mercado por causa dos efeitos toxicos adversos observados em ensaios

46 1 Estatinas

pre-clınicos; e a pitavastatina (C25H24FNO4), que pode aumentar consistentemente o co-

lesterol HDL (10–25%), especialmente em pacientes com HDL mais baixo que 40mg/dl,

alem de reduzir fortemente o colesterol LDL (40%), sendo provavelmente mais apropriada

para pacientes com sındrome metabolica e LDL alto, HDL baixo e diabetes mellitus [4].

O valor de concentracao inibitoria, IC50, mede o quao efetiva uma droga e na inibicao

da funcao biologica de seu alvo ou, mais precisamente, qual e a concentracao de droga

necessaria para bloquear em 50% um processo biologico. A variacao dos valores inibitorios

de algumas estatinas e: atovartastina, 3.8–6.2 nM; rosuvastatina, 2.1–5.4 nM; cerivasta-

tina, 2.8–10.0 nM; sinvastatina, 4.3–18.0 nM; mevastatina, 23 nM; e fluvastatina, 3–28 nM

(dados retirados de [10]). Investigacoes sobre a cinetica inibitoria e a analise microcalo-

rimetrica (incluindo calorimetria de titulacao isotermica) da pravastatina, fluvastatina,

cerivastatina, atorvastatina e rosuvastatina [11], mostraram entalpias de ligacao com a

HMGR variando entre 0 (fluvastatina) e -9.3 kcal/mol (rosuvastatina) a 25oC. A rosu-

vastatina exibiu a ligacao mais forte, com variacao na energia de Gibbs ∆G de cerca de

-12.3 kcal/mol, seguida pela cerivastatina, com ∆G ≈ -11.3 kcal/mol e pela atorvastatina

(∆G ≈ -10.8 kcal/mol).

Mesmo com as intensas pesquisas que vem sendo feitas sobre os mecanismos de ligacao

da droga, um entendimento claro dos detalhes de sua interacao com seus alvos macromo-

leculares ainda nao foi alcancado. Tal entendimento e essencial para descrever e projetar

novas drogas com acao inibitoria mais eficiente, resistencia a mutacoes, e com menos efei-

tos colaterais. O uso de ferramentas computacionais na descoberta de novos farmacos vem

tendo como foco o screening virtual, design de novo, e a avaliacao de efeitos do medica-

mento por docking e dinamica molecular [12]. A modelagem computacional das estatinas

e outros inibidores da HMGR humana, em particular, vem sendo realizada principalmente

atraves de simulacoes de docking. De fato, uma busca baseada em estrutura por novos

inibidores potenciais da HMGR humana foi realizada por Zhang et al. [13] combinando

modelagem CoMFA 3D QSAR e screening virtual, tendo sido encontrados oito novas nao-

estatinas representativas com altos valores de IC50. Contudo, apenas atomos localizados

em um raio de ate 6.5 A de cada atomo dos ligantes no ensemble de estruturas proteicas

foram levados em consideracao na construcao do sıtio ativo. Ferramentas de design mo-

lecular assistido por computador, ou seja, docking flexıvel, screening virtual em bancos

de dados grandes, e campos de interacao molecular foram usados por Da Silva et al. [14]

para propor novos potenciais inibidores da HMG-CoA redutase que sao promissores para

o tratamento de hipercolesterolemia. Metodos de docking molecular tambem foram em-

pregados para investigar dezenove inibitores de HGMR, sendo feita uma comparacao de

1.1 Estatinas e HMGR 47

suas eficacias hipolipidemicas, observando-se que o acido benzoico, a catequina, o acido

hidroxicıtrico e a piperina possuem, in silico, caracterısticas parecidas com as da atorvas-

tatina. Mesmo assim, uma caixa de apenas 5 A× 5 A× 5 A foi usada nas simulacoes, e a

intensidade das interacoes locais nao foi estimada [15].

Por outro lado, metodos de quımica quantica, frequentemente descritos com ab initio,

uma vez que operam sem o uso de parametrizacoes empıricas, estao sendo usados para a

simulacao de sistemas moleculares com ate centenas ou mesmo milhares de atomos (no

ultimo caso, usando supercomputadores). Uma compreensao detalhada da trajetoria do

ligante ate a sua fixacao no sıtio ativo e suas interacoes com os resıduos de aminoacidos

ali presentes no nıvel da bioquımica quantica [16] e importante e depende da estimativa

das contribuicoes de cada resıduo de aminoacido para a energia total de ligacao, o que

permite o design de novas variacoes do ligante. Como enfatizado por Zhou et al. [17],

metodos quanticos estao se tornando populares no design computacional de drogas por

causa do alto grau de acuracia exigido para estimar as afinidades de ligacao relativas.

De acordo com Raha et al. [18], o uso rotineiro de metodos quanticos em todas as fases

do design de drogas in silico e de fundamental importancia para o avanco do campo.

Sob este ponto de vista, calculos teoricos usando abordagens quanticas ab initio e se-

miempıricas sao bastante uteis, pois permitem computar a interacao de ligacao no nıvel

atomico, guiando o design experimental de drogas novas e mais potentes. Contudo, como

as macromoleculas envolvidas (em geral, proteınas) sao gigantescas, e necessario estabe-

lecer um compromisso entre o custo computacional dos calculos e a acuracia exigida para

obter resultados confiaveis.

O uso de metodos de bioquımica quantica aparece em varios trabalhos recentes descre-

vendo interacoes droga-proteına com resultados bastante sugestivos [19, 20, 21, 22, 23].

Por exemplo, Zhang et al. [24] reportaram um mapa quantico completo da interacao

proteına-ligante do complexo β-tripsina/benzamidina. Hoffman e Nowosielski usaram a

teoria do funcional da densidade (Density Functional Theory - DFT) para investigar a

interconversao hidroxiacido-lactona da atorvastatina [25], encontrando resultados que re-

forcam dados experimentais anteriores sobre o carater dependente do pH deste processo.

Outros trabalhos mostram o uso de metodos bioquımicos quanticos para descrever a in-

teracao de inibidores macrocıclicos da α-trombina humana [26] e para investigar sua capa-

cidade de descrever as energias de um peptıdeo que modela o colageno [27]. Recentemente,

as interacoes aromaticas de ligantes a uma estrutura HMGR truncada foram estudadas

por Kee et al. usando varios metodos DFT e teoria da perturbacao MP2, mostrando que

metodos DFT locais produzem energias bem mais proximas dos valores MP2 para ligacoes

48 1 Estatinas

aromaticas em comparacao com metodos DFT hıbridos ou corrigidos pelo gradiente. Kee

et al. [28] enfatizaram que as estatinas usam primariamente interacoes dipolo-dipolo e

ligacoes de hidrogenio para se conectarem ao sıtio ativo da redutase, focando na porcao

do sıtio ativo dominada pela lisina 691 (K691), lisina 692 (K692), acido aspartico 690

(D690), e serina 684 (S684), com incorporacao explıcita mınima de interacoes laterais

hidrofobicas. Kee et al. [28] tambem sugeriram que o empilhamento aromatico π–π entre

as estatinas e a HGMR merece mais atencao no design de farmacos que inibem a acao

desta enzima, e que a interacao ligante-proteına entre o resıduo tirosina 479 e o ligante,

pouco explorada, pode ser importante para a criacao de novas estatinas no futuro.

Sao apresentados aqui, tirando total proveito dos dados cristalograficos publicados

para a HMGR complexada com estatinas [9], os resultados de simulacoes quanticas ab

initio usando a estrategia de fracionamento molecular com capuzes conjugados (Molecular

Fractionation with Conjugate Caps – MFCC) [13] para investigar os detalhes da interacao

de ligacao das estatinas atorvastatina (A, PDB ID 1HWK, ver Fig. reffig:fig1), rosuvas-

tatina (R, 1HWL), fluvastatina (F, 1HWI), cerivastatina (C, 1HWJ), mevastatina (M,

1HW8) e sinvastatina (S, 1HW9) com a enzima HMGR. O proposito e elucidar por que

as estatinas possuem diferencas em sua eficacia na reducao do nıvel de colesterol por meio

da estimativa e comparacao das energias de interacao entre os resıduos de aminoacido na

HMGR e os atomos do ligante. O raio do sıtio de ligacao (r, definido como a distancia

a partir do centroide do ligante) usado para estimar as energias de interacao variou de

2.5 a 12.0 A, e um perfil das energias de interacao com r foi obtido para cada complexo

HMGR-estatina. A energia de ligacao total das seis estatinas com a HMGR e estimada,

explicando com sucesso porque a rosuvastatina e a atorvastatina sao os inibidores de

HMGR mais efetivos, e a sinvastatina e a fluvastatina sao menos efetivos. Os resıduos de

aminoacidos mais relevantes atraindo (repelindo) as estatinas sao, em ordem decrescente

do valor absoluto da energia de interacao: K735 > R590 > K692 > K691 > R702 > R568

(E665 > D767 > D690 > E559). Tambem se mostra aqui que a escolha de um raio de

sıtio de ligacao menor que 9.5 A nao e suficiente para alcancar uma energia interacao bem

convergida. Na verdade a energia total do complexo HMGR-estatina so e bem convergida

quando resıduos a distancias entre 9.5 e 12.0 A sao incluıdos. Logo, conclui-se tambem que

resıduos importantes que interagem com as estatinas, tais como E665, D767, e R702 nao

foram considerados em trabalhos importantes publicados na literatura [8, 9, 10, 21, 14].

1.2 Resultados e Discussao 49

1.2 Resultados e Discussao

Cada estatina se liga a HMGR de um modo especıfico, que e determinado por sua

propria estrutura molecular e pelos resıduos com os quais interage. Nao e trivial especi-

ficar quais sao os resıduos do sıtio de ligacao usando apenas os dados cristalograficos ou

informacoes de docking estrutural. Por exemplo, nao existe uma relacao simples entre a

energia de interacao e a distancia ate o resıduo de amino acido (um resıduo carregado dis-

tante pode interagir mais fortemente com uma estatina em comparacao com um resıduo

bem mais proximo mas sem carga). Mesmo assim, a estrategia de fracionamento mole-

cular com ”caps”conjugados (MFCC) permite calcular a energia de interacao entre um

dado resıduo e o atomo da estatina mais proximo no nıvel quantico [23]. Aqui definimos

a esfera do sıtio de ligacao (ESL) com raio r como sendo uma esfera imaginaria centrada

no centroide do ligante (ver Fig. 1.1), enquanto o sıtio de ligacao de raio r, (SL(r)) e

definido como o conjunto de resıduos de aminoacidos com pelo menos um atomo dentro

da ESL correspondente. A energia de interacao calculada para uma molecula de estatina

complexada com HMGR e uma funcao de r, E(r), e e obtida somando as energias de to-

dos os elementos interagentes dentro de SL(r). Aumentando r, mais e mais resıduos sao

levados em consideracao, modificando a energia de interacao. Quando r e pequeno, pode-

se esperar uma contribuicao dominante de resıduos carregados proximos. Para tamanhos

intermediarios da ESL, a energia de interacao provavelmente variara mais devagar e, final-

mente, para valores r suficientemente grandes, a energia de interacao deve se estabilizar

e convergir. Na verdade esse e justamente o comportamento que aparece na Figura 1.2,

onde as energias de interacao em funcao de r para a atorvastatina (linha solida), fluvas-

tatina (linha com tracejado longo), cerivastatina (linha pontilhada), mevastatina (linha

tracejada e pontilhada), rosuvastatina (linha com tracejado e dois pontos) e sinvastatina

(tracejado curto) sao exibidas. Cada curva de energia e claramente distinta das outras,

sendo exclusiva da estatina correspondente. Uma olhada rapida na Fig. 1.2 mostra que

a energia de interacao em funcao de r se estabiliza (varia menos que 10%) para todas as

estatinas quando r ≈ 11 A, o que significa que o tamanho do sıtio de ligacao HMGR-

estatina e subestimado nos trabalhos classicos de Istvan et al. [8, 9, 10], que adotam

r ≈ 9.5 Apara atorvastatina, como mostram as Tabelas reftab:tab1. Este valor reduzido

de r exclui varios resıduos carregados (E850, D767, E655, R702, E528, K662) que sao

relevantes para avaliar a energia de interacao no sıtio de ligacao. O detalhe inserido na

Fig. 1.2 mostra que a energia de interacao possui uma rapida diminuicao que comeca

em r ≈ 4.5 A para a mevastatina e a fluvastatina, e em r ≈ 4.7 A para a sinvastatina,

rosuvastatina e cerivastatina. No caso da atorvastatina, a diminuicao rapida da energia

50 1 Estatinas

ocorre para r ≈ 5.7 A . Existe um mınimo na energia total para E(r) com r ≈ 8.6 Apara

a mevastatina e fluvastatina, r ≈ 8.8 A para a cerivastatina, r ≈ 9.2 para a sinvastatina

e r ≈ 9.0 A para a rosuvatatina. Alem deste intervalo de energia, E(r) tende a aumentar

devido a inclusao de resıduos de aminoacidos carregados que repelem os ligantes.

Figura 1.2: A variacao da energia de interacao como uma funcao do raio para: atorvas-tatina (linha solida preta), enalapril (linha com traco longo vermelha), lisinopril(linhacom pontos preto), ramipril(linha com traco longo e pontos azul), trandolapril (linha comtraco longo e dois pontos marron) e perindopril(linha com traco curto cinza). O graficomenor mostra a energia de interacao para os raios menores que 5 A. O sıtio de ligacaoe medido a partir do centroıde de cada anti-hipertensivo e o resıduo mais distante daenzima ECAn.

A Figura 1.3 mostra uma comparacao das energias de interacao calculadas, E(r),

para HMGR complexada com as estatinas da Figura 1.1 com r =6.5, 9.5, e 12.0 A. Para

o menor dos sıtios de ligacao, o valor absoluto da energia de interacao da HMGR com

cada estatina segue a sequencia decrescente R>M>A>F> S>C, sugerindo que a rosu-

vastatina (cerivastatina) e a estatina mais (menos) potente para inibir a HMGR, isto se

assumirmos uma correlacao direta entre a potencia da estatina e a intensidade da interacao


Tabela 1.1: Resıduos da enzima HMGR que interagem com atorvastina (A), rosuvasta-tina (R), cerivastatina (C), sinvastatina (S), mevastatina (M), e fluvastatina (F) com oaumento do raio de interacao. Vermelho (azul) representa resıduos carregados negativa-mente (positivamente). O resıduos mais importantes que interagem com as estainas estaoem negrito. O raio de interacao varia de 9,5A a 12A

total HMGR-estatina. Para o sıtio de ligacao com r ≈ 9.5 A, que e aproximadamente

o valor usado para atorvastatina nos artigos de Istvan e colaboradores [8, 9, 10], o valor

absoluto de E(r) obedece a sequencia A>R>M> S>F>C, sugerindo que a atorvasta-

tina (cerivastatina) e a estatina mais (menos) efetiva na inibicao da HGMR. Depois da

estabilizacao de E(r) para r > 11.0 A, a energia de interacao apresenta a seguinte ordem:

A>C>R>M> S>F, sugerindo que a atorvastatina e a rosuvastatina sao as estatinas

nao-toxicas mais potentes, enquanto a sinvastatina e a fluvastatina sao as menos potentes

(a cerivastatina, embora tendo praticamente o mesmo valor de E(r) da atorvastatina,

nao e considerada aqui por causa de sua toxicidade). Em experimentos termodinamicos,

a ligacao mais fraca foi observada para a fluvastatina, com ∆G ≈ -9 kcal/mol, enquanto

a rosuvastatina possui a afinidade mais alta pela HMGR [11]. A energia de interacao

varia de ≈ −320 kcal/mol para A e C, -310 kcal/mol para R, ate -295 kcal/mol para

a fluvastatina (uma variacao de cerca de t25 kcal/mol). As estatinas que exibem maior

mudanca quando se passa de r = 9.5 para r = 12.0 A sao A (E(r) aumenta em cerca de

52 1 Estatinas

Figura 1.3: A energia de interacao total entre a HMGR e atorvastatina (A), rosuvastatina(R), cerivastatina (C), sinvastatina (S), mevastatina (M), e fluvastatina (F) para os raiosde interacao de 6,5 A, 9,5 A e 12 A.

50 kcal/mol), C (E(r) diminui cerca de 40 kcal/mol), S (E(r) aumenta em cerca de 35

kcal/mol), e M (E(r) diminui em cerca de 25 kcal/mol). Mudancas mınimas de E(r) sao

observadas para R e F na transicao de r = 9.5 A para r = 12.0 A. Esses resultados sao

consistentes com os resultados de ensaios clınicos, que mostram que a rosuvastatina e a

atorvastatina (sinvastatina e fluvastatina) possuem os valores mais baixos (mais altos) de

IC50 entre as estatinas nao-toxicas, 2.1 nM e 6.2 nM (18 nM e 28 nM), respectivamente

[10].

Os resıduos da HMGR dentro de cascas esfericas com espessura de 0.5 A centra-

das no centroide de cada estatina sao mostrados nas Tabela 3.1. Os resıduos atrativos

mais importantes (ver painel da Fig. 1.5) aparecem em negrito. Resıduos negativamente

(positivamente) carregados sao exibidos em cor vermelha (azul). O resıduo de arginina

positivamente carregado R590 ocorre nas cascas com raios de 5.0 A (para M e F), 5.5

A (R, C, S) e 6.5 A (atorvastatina). O resıduo de acido glutamico negativamente carre-

gado, E559, se encontra na casca com 5.5 A de raio para todas as estatinas, exceto a

cerivastatina, que possui o E559 na casca com 6.0 A de raio. O resıduo K691 (lisina,

carga positiva), por outro lado, aparece na casca de 6.0 A para M e F, 6.5 A para R, 7.0


A para C e S, e 7.5 A para S. O resıduo K735 aparece nas cascas de 7.5 A (R, C, M, F) e

8.0 A (A, S). O resıduo de acido aspartico D690, com carga negativa, esta nas cascas de

6.5 A (F), 7.0 A (M), 7.5 A (R, C, S) e 8.0 A (A), enquanto o resıduo D767 ocorre nas

cascas com raio 9.0 A (M, F), 9.5 A (R, C, S) e 10.0 A (A). K692 ocorre nas cascas com

raios de 8.5 A (R,C,M,F), 9.0 A (S), e 9.5 A (A), enquanto R568 esta nas cascas de 8.5

A (A), 9.0 A (R,S), 9.5 A (C), e 10.0 A (M,F). Os resıduos carregados E850, E665, R702,

E528, e K662 estao todos alem da esfera de raio 9.0 A, mas contribuem significativamente

para a energia de interacao, como veremos (especialmente E665 e R702). O resıduo de

aminoacido mais distante que da uma contribuicao notavel para to E(r) e o resıduo E665

no caso da fluvastatina, situado em uma casca esferica com raio de 11.0 A.

Figura 1.4: Sıtios de ligacao da atorvastatina, rosuvastatina, sinvastatina, fluvastatina,sinvastatina e mevastatina. Os resıduos mais importantes da HMGR ligados as estatinastambem sao mostrados: K735, R590, K692, K691, R702, e R628 (atrativos) e E665, D767,D690, E559 (repulsivos)

As Figuras 1.4 e 1.5 sao um auxılio para compreender os resultados obtidos para a in-

54 1 Estatinas

Figura 1.5: Estruturas quımicas e principais funcionais quımicos da atorvastatina, rosu-vastatina, sinvastatina, e fluvastatina.

teracao especıfica de cada molecula de estatina com os resıduos de aminoacidos proximos

no sıtio de ligacao da HMGR. A Figura 1.4 mostra os sıtios de ligacao da HMG-CoA

redutase complexados com quatro estatinas representativas: atorvastatina, rosuvastatina,


Figura 1.6: Sıtio de ligacao, energia de interacao e resıduos do domınio (Binding site,Interaction energy an Residues Domain - BIRD) esse painel mostra os resıduos relevantesda atorvastatina, rosuvastatina, sinvastatina, e fluvastatina que contribui para a ligacaocom a enzima HMGR

56 1 Estatinas

Figura 1.7: Distancias entre os resıduos da HMGR e atorvastatina, rosuvastatina, sinvas-tatina, e fluvastatina. Suas energias de interacao sao as mais importantes contribuicoespara a energia total do complexo HMGR/estatina

sinvastatina e fluvastatina. As duas primeiras (duas ultimas) sao as estatinas mais (me-

nos) potentes de acordo com os calculos realizados, e a Figura 1.4 revela os resıduos

de aminoacidos mais relevantes no sıtio ativo. A Figura 1.5, por outro lado, descreve


a estrutura e os grupos funcionais relevantes das estatinas A, R, S e F, que sao o foco

principal do presente estudo. O grupo a (grupo HMGR) e comum a todas as estatinas e

esta diretamente ligado com sua ligacao a enzima. A atorvastatina, a rosuvastatina e a

fluvastatina compartilham o grupo fluorofenil b, enquanto as partes restantes de suas es-

truturas (incluindo os grupos fenilc e sulfonamida d) sao distintos. A sinvastatina exibe

grupos butiril e decalina (e) formando sua regiao nao-HMGR, enquanto a fluvastatina

possui um grupo benzeno caracterıstico f.

O painel BIRD - A Figura 1.6 mostra um painel grafico com as energias de interacao

entre as quatro estatinas A, R, S, e F e os resıduos de aminoacidos mais importantes no

sıtio de ligacao da HMGR. Este painel grafico sera chamado aqui de BIRD, um acronimo

em ingles para as palavras-chave sıtio de ligacao, energia de interacao e domınio de resıduos

(Binding site, Interaction energy and Residues Domain), e mostra claramente: (i) a ener-

gia de interacao (em kcal/mol) de cada resıduo com a droga usando barras horizontais,

a partir do qual pode-se estimar quantitativamente o papel de cada resıduo no sıtio de

ligacao, ou seja, sua eficacia para atrair ou repelir a droga; (ii) os resıduos mais importan-

tes que contribuem para a ligacao no lado esquerdo; (iii) a regiao e os atomos da droga

(letras em negrito na Fig. 1.5) que estao mais proximos de cada resıduo (lado esquerdo)

no sıtio de ligacao. A energia de ligacao dos resıduos de aminoacidos interagindo com a

molecula de estatina dentro do sıtio de ligacao serao definidas aqui como sendo o negativo

das energias de interacao correspondentes calculadas atraves do metodo MFCC. Pode-

mos ver da Figura 1.6 que seis resıduos de aminoacidos contribuem fortemente para a

estabilizacao dessas estatinas: R590, K691, K692, K735, R568, e R702, enquanto quatro

resıduos de aminoacidos, D690, E559, E665, e D767 apresentam energias de interacao

positivas (repulsivas). Em comparacao, Istvan e Deisenhofer [9] apontaram que varias

interacoes polares e ligacoes de hidrogenio sao formadas entre a parte HMGR (grupo a)

das estatinas e os resıduos de aminoacidos no loop cis: S684 (serina), D690, K691 e K692.

Eles tambem indicaram a formacao de redes de ligacoes de hidrogenio envolvendo E559,

D767, e K735. Cadeias laterais hidrofobicas da HMGR envolvendo os resıduos L562 (leu-

cina), V683 (valina), L853, A856 (alanina), e L857 participam de interacoes de van der

Waals com as estatinas, mas nao parecem relevantes em nossos calculos (provavelmente

porque o formalismo DFT puro e incapaz de descrever as forcas de van der Waals). A

sinvastatina interage atraves dos aneis de decalina com uma helice da enzima, enquanto a

rosuvastatina e a atorvastatina possuem interacoes atrativas adicionais entre seus grupos

fluorofenil e o resıduo R590.

O resıduo K735 exibe a energia de ligacao mais forte (cerca de 115 kcal/mol) com

58 1 Estatinas

o grupo a das estatinas F, R, S e A, em ordem decrescente de intensidade, atraves de

uma ligacao ionica envolvendo o grupo terminal hidrofılico (C1)OO−, sendo seguido pelo

resıduo R590, com energia de ligacao de cerca de 90 kcal/mol para A, F, S e R (tambem

em ordem decrescente de intensidade). Se olharmos para a Figura 7, que apresenta os

principais resıduos de aminoacidos complexados com A, R, S e F, e as principais distancias

interatomicas envolvidas, podemos ver que o resıduo K735 mostra aproximadamente as

mesmas distancias interatomicas para as quatro estatinas investigadas. A interacao com

R590, por outro lado, envolve o grupo b das moleculas A, R e F, que esta um pouco

mais proximo no caso de A (2.6 A), como mostrado na Figura 1.7. Aparentemente o

atomo de fluor nao altera significativamente a energia de ligacao em comparacao com a

sinvastatina, que interage com R590 atraves de seu grupo butiril e da sua regiao HGMR,

que e um pouco mais proxima de R590 quando contrastada com R e F. O terceiro resıduo

mais importante, K692, possui energia de ligacao com as estatinas entre 75 e 77 kcal/mol,

com intensidade de ligacao seguindo a sequencia F > A > R > S, envolvendo o grupo a.

A menor distancia interatomica e observada, neste caso, para a fluvastatina, com 2.3 A

entre um atomo de oxigenio de F e um atomo de hidrogenio pertencente ao grupo NH3

do resıduo K692. O resıduo K691, por sinal, interage com o grupo (C5)OH atraves de

ligacao de hidrogenio com energias de ligacao entre 54 kcal/mol e 58 kcal/mol, seguindo a

sequencia de intensidades de ligacaoS > R > A > F, com a rosuvastatina e a fluvastatina

mais proximas do resıduo (distancias de 1.6 A e 1.7 A, respectivamente, ver Fig. 1.7).

Com uma energia de ligacao de cerca de 41 kcal/mol, R702 se liga mais fortemente com

a sinvastatina, com distancias interatomicas de 6.4 e 6.8 A entre dois atomos de oxigenio

no grupo a e um atomo de hidrogenio pertencente a um dos grupos NH2 do residuo

de aminoacido. Finalmente, R568 se liga com diferentes grupos funcionais de A (grupo

c), R (grupo d, que contem SO2), S (grupo e, decalina, com dois aneis), e F (grupo f,

anel de benzeno), o que produz uma notavel variacao da energia de interacao. Neste

caso, R mostra a ligacao mais forte (cerca de 43 kcal/mol), seguida por A (cerca de

39 kcal/mol), F (cerca de 37 kcal/mol) e S (cerca de 35 kcal/mol). Considerando as

distancias interatomicas, R esta mais proxima de R568, com distancias de cerca de 4 A,

seguida por S, com distancias entre 4.6 e 5.5 A. O ligante mais distante de R568 e F (a

segunda interacao mais fraca com R568 das quatro estatinas investigadas), para o qual

o espacamento interatomica fica entre 5.9 A e 6.6 A. De um modo geral, na regiao a as

quatro estatinas exibem uma variacao na energia de interacao entre elas mesmas sempre

menor que 10 kcal/mol para os resıduos atrativos R590, K691, K692, K735, e R702.

Os resıduos repulsivos mais importantes no sıtio de ligacao sao, em ordem decrescente


de importancia, E665, D767, D690, e E559. E665 tem energias de interacao entre 32 e

37 kcal/mol, com A, S e F tendo praticamente a mesma energia de interacao. Por outro

lado, R tem a menor energia porque E665 fica muito longe, dentro de uma casca esferica

entre 11.0 A e 11.5 A, centrada em seu centroide (ver Tabela 3.1). Alem disso, a interacao

com E665 envolve o grupo fluorofenil de A, R e F, e o grupo butiril de S. Para o resıduo

D767, temos energias de interacao seguindo a sequencia S > F > A > R, variando de

cerca de 36 kcal/mol (S) ate 29 kcal/mol (R), o que e interessante porque S tem a maior

distancia interatomica ate E665 (4.9 A, mas podemos notar que A tem praticamente a

mesma distancia interatomica medida para S). Tambem e digno de nota que estendendo

o raio da esfera do sıtio de ligacao para incluir ambos D767 e R702, o aumento na energia

de ligacao devido a interacao com R702 nao e compensado pela diminuicao promovida

pela energia de interacao positiva com D767 (o ganho lıquido na energia de ligacao por

conta da inclusao das contribuicoes de ambos os resıduos, D767 e R702 e de 5 kcal/mol,

em media). A seguir na sequencia, vemos que D690 repele as quatro estatinas interagindo

com a regiao HMGR (grupo a), com a maior repulsao sendo calculada para S, seguida por

F, A e R, em ordem decrescente. Energias de interacao para este resıduo variam de 35

kcal/mol (S) ate 27 kcal/mol (R). A atorvastatina tem o menor espacamento interatomico

ate D690, 1.7 A, enquanto R e F possuem as maiores distancias interatomicas, de cerca

de 2.5 A. Por fim, E559 exibe a maior variacao na energia de interacao, comecando com

S, cerca de 18 kcal/mol, diminuindo para 12 kcal/mol (F), 10 kcal/mol (A) e 8 kcal/mol

(R).

Os resultados acima apontam para graves limitacoes em estudos de modelagem com-

putacional das estatinas. No caso da modelagem CoMFA 3D QSAR e do screening virtual

de Zhang et al. [21], apenas atomos do ligante situados dentro de uma esfera de 6.5 A de

raio para qualquer resıduo no sıtio de ligacao da HMGR foram considerados. Consequen-

temente, a contribuicao significante dos resıduos E665, R702 e R568 para a ligacao das

estatinas foi desconsiderada por Zhang et al. [21]. Por outro lado, em seu trabalho sobre

o uso de screening virtual, docking flexıvel e campos de interacao molecular para desen-

volver novos inibidores da HMG-CoA redutase para o tratamento de hipercolesterolemia,

Da Silva et al. [14] levaram em conta os resıduos K691, D690, N755, R590, E559, N684,

K735, L853, V683 e L857 como os que interagem mais fortemente com a cerivastatina.

Por comparacao com os dados das Tabelas 3.1, bem como com a Figura 6, existe acordo

sobre a grande importancia dos resıduos K691, D690, K735, e R590 para a ligacao da

cerivastatina com a HMGR. Da Silva et al. [14] parecem ter superestimado a importancia

dos resıduos S684, V683, L857, L853, E559 e N755, enquanto que, ao mesmo tempo,

60 1 Estatinas

ignoraram completamente os importantes resıduos K692, R568, E655, D767 e R702, que

contribuem para a energia de ligacao. De acordo com Kee et al. [28], os resıduos lisina 691

(K691), lisina 692 (K692), acido aspartico 690 (D690) e serina 684 (S684) sao os resıduos

mais importantes para a ligacao das estatinas com o sıtio ativo da HMGR, e ainda, a

interacao proteına-ligante inexplorada entre o resıduo tirosina 479 e HMGR pode ser im-

portante para o design de futuras estatinas. Isto significa que os resıduos que se ligam

mais fortemente, K735 e R590, nao foram considerados importantes por Kee et al. [28],

bem como os resıduos R568, E559, E665, D767, e R702. Alem do mais, o resıduo tirosina

479 nao esta dentro de raio de 12.0 A a partir do centroide das moleculas de estatina, o

que faz com que ele nao contribua de modo relevante para a energia total de ligacao das

estatinas, sugerindo que ele nao deve ser importante no design de futuras estatinas, em

flagrante contraste com a conclusao de Kee et al. [28].

Efeitos de blindagem parcial – Quando se calcula a energia de interacao entre um

resıduo de aminoacido e um ligante, e importante considerar o efeito de blindagem parcial

causado pela presenca de outros resıduos de aminoacidos nas vizinhancas (notamos que os

dados reportados anteriormente incluem este efeito de blindagem). Na Figura 1.8 temos

as tres situacoes possıveis de blindagem parcial por outros resıduos de aminoacidos encon-

tradas nas estatinas complexadas com HMGR: R568 blindada por L853, D767 blindada

por K691 e R702 blindada por D690. Usando o metodo MFCC [21], estimamos o efeito

de blindagem para esses tres casos. No caso da interacao com R568, encontramos uma

diminuicao maxima na energia de ligacao de 3.4 kcal/mol para S, 3.2 kcal/mol para F,

1.5 kcal/mol para A e 0.9 kcal/mol para R quando a interacao com L853 e levada em

consideracao. No caso de D767, uma diminuicao na energia de ligacao de 6.4 kcal/mol

foi observada para F, 5.2 kcal/mol para S, 4.1 kcal/mol para R e 3.2 kcal/mol para A. A

interacao com R702, por outro lado, diminui a energia de ligacao em 3.5 kcal/mol para

S, 3.1 kcal/mol para F, 2.3 kcal/mol para A e 1.7 kcal/mol para R. Essas mudancas de

energia provocadas pela blindagem parcial nao podem ser ignoradas se lembrarmos que a

variacao na energia de ligacao total entre as estatinas e de cerca de 25 kcal/mol.

1.3 Consideracoes finais

Nos proximos 2 anos, varias drogas de grande vendagem, incluindo o Lipitor da Pfizer

(atorvastatina), terao suas patentes nos EUA expiradas, o que levara a uma diminuicao

abrupta das vendas por causa da competicao com versoes genericas e perda de bilhoes de

dolares de lucro por parte das maiores companhias farmaceuticas [29]. Para conciliar a

1.3 Consideracoes finais 61

Figura 1.8: Os aminoacidos blindados R568, D767 e R702 interagindo com atorvasta-tina, rosuvastatina, sinvastatina e fluvastatina (a estrutura das quatro estatinas e seisaminoacidos estao superpostas)

producao de remedios mais eficientes e a necessidade de diminuir seu custo de desenvolvi-

mento, o uso de simulacoes computacionais relativamente baratas e bastante promissor. O

presente trabalho reforca o papel das simulacoes computacionais no nıvel quantico como

uma ferramenta valiosa para a compreensao e o desenvolvimento de novos farmacos. A

62 1 Estatinas

analise da energia de ligacao das estatinas complexadas com HGMR aqui apresentada

mostra uma boa correlacao com estudos termodinamicos [11] e dados de ensaios clınicos

[30], uma vez que estes apontam para a rosuvastatina e a atorvastatina como sendo as

melhores estatinas disponıveis no mercado. De acordo com os calculos aqui realizados,

a atorvastatina tem a maior energia de ligacao, cerca de 320 kcal/mol, enquanto a ro-

suvastatina tem uma energia de ligacao de cerca de 310 kcal/mol, e a sinvastatina e a

fluvastatina possuem energias totais de ligacao de cerca de 290 kcal/mol. Tal diferenca

e causada principalmente por conta da diminuicao das interacoes repulsivas entre o sıtio

ativo de ligacao da HGMR e as moleculas de A e R. Isto sugere que a potencia inibidora

das estatinas e ditada principalmente pela intensidade de sua atracao pelo sıtio de ligacao,

apesar da presenca de outros fatores que podem afetar a eficiencia dessas moleculas alem

da energia de ligacao, tais como o processo dinamico pelo qual elas sao aprisionadas no

sıtio de ligacao e interacoes com outros caminhos bioquımicos. A principal vantagem

da metodologia que usamos e propomos aqui e a possibilidade de avaliar quais resıduos

de aminoacidos contribuem mais intensamente para a estabilizacao do complexo statina-

HMGR, o que pode ser de grande ajuda para propositos de design de farmacos. Por

exemplo, a abordagem MFCC permitiu concluir que modificacoes na regiao a (regiao

HMGR), que definem uma molecula como sendo uma estatina, nao sao necessarias para

aumentar a interacao de ligacao, uma vez que outras regioes (c, d, e e) tambem sao

importantes neste aspecto. De fato, foram realizadas simulacoes DFT/LDA para uma

forma modificada da sinvastatina na esperanca de melhorar sua energia de ligacao sem

mudar profundamente sua estrutura (a sinvastatina, entre todas as estatinas, possui me-

nos efeitos colaterais). Os primeiros resultados sao muito promissores, com a energia de

ligacao da variante de sinvastatina que foi testada sendo maior que aquela calculada para

a atorvastatina. Finalmente, demonstramos que efeitos de blindagem parcial da carga de

um resıduo de aminoacido por seus vizinhos pode ser importante para dar uma descricao

acurada da ligacao das estatinas com a HGMR, diminuindo a energia de ligacao em ate

26% em comparacao com a variacao da energia total para diferentes moleculas de estatina.

1.4 Calculos de primeiros princıpios

Os dados de difracao de raio X da referencia citeIstvan1 fornecem as estruturas da

HMG-CoA redutase complexada com estatinas com uma resolucao de 2.2 A em pHs alto

e neutro. Essas estruturas foram usadas como inputs para os calculos, sendo definida

a energia de interacao com o sıtio ativo para raios variaveis. As posicoes atomicas dos

1.4 Calculos de primeiros princıpios 63

atomos nao-hidrogenios no sıtio de ligacao (incluindo os das moleculas das estatinas) foram

mantidas fixas, enquanto os atomos de hidrogenio foram otimizados inicialmente usando

o campo de forca de valencia consistente (Consistent Valence Force Field - CVFF), que

possui parametros especıficos para os aminoacidos. Em seguida, simulacoes dentro do for-

malismo da Teoria do Funcional da Densidade (Density Functional Theory - DFT) usando

a aproximacao de densidade local (Local Density Approximation - LDA) para o funcional

de troca e correlacao (Exchange-Correlation Functional - XC) foram realizadas usando o

programa DMOL3 [31, 32]. E bem sabido que metodos DFT puros sao incapazes de des-

crever acuradamente sistemas onde interacoes nao-covalentes, tais como forcas de van der

Waals, sao relevantes [33, 34]. Alem disso, a aproximacao LDA nao e a melhor opcao para

dar uma boa descricao das ligacoes de hidrogenio. Mesmo assim, alguns estudos DFT de

cristais em camadas tais como o grafite e cristais de guanina hidratados [35, 36, 37] mos-

traram que a aproximacao LDA apresenta valores razoaveis para as distancias atomicas

por causa de um cancelamento de erros. Alem disso, Kee et al. [28] investigaram as in-

teracoes aromaticas na ligacao de diversas moleculas no sıtio ativo da HMGR, mostrando

que o funcional LDA possui melhor acordo com o metodo MP2, que e bem mais sofisticado

(e pesado, do ponto de vista computacional), quando comparado com funcionais hıbridos

e funcionais corrigidos pelo gradiente da densidade eletronica (Generalized Gradient Ap-

proximation - GGA). Considerando todos esses fatos e a necessidade de alcancar o melhor

equilıbrio entre o custo computacional por simulacao e o tamanho do complexo formado

pela estatina mais o sıtio ativo (que envolve dezenas de resıduos de aminoacidos), bem

como o carater dominante das forcas dispersivas (nao-covalentes) presentes no sistema,

foi feita aqui a escolha pelo funcional XC LDA para estimar a intensidade das energias de

interacao intermoleculares entre a droga e os resıduos de aminoacidos. Logo, os valores

para as energias total e de interacao entre as estatinas e os resıduos da HMGR no sıtio de

ligacao devem ser reconhecidas como estimativas que garantem uma melhor descricao das

tendencias de comportamento do sistema, e nao como uma serie de valores absolutamente

acurados que podem ser comparados diretamente com os dados experimentais.

Um conjunto de base de precisao numerica dupla mais polarizacao (Double Numerical

Plus Polarization - DNP) foi escolhido para expandir os orbitais eletronicos de Kohn-Sham

levando em conta todos os eletrons explicitamente e com spin irrestrito. O conjunto de

base DNP tem acuracia equivalente a do conjunto de base gaussiano 6-311+G(3df,2pd)

[?, ?, 38], com erro de superposicao de base (Basis Set Superposition Error - BSSE)

muito pequeno. O raio de corte de orbital para esta base foi ajustado para to 3.7 A e a

tolerancia para convergencia do campo autoconsistente escolhida foi 10−6 Ha. As posicoes

64 1 Estatinas

dos atomos de hidrogenio do sistema formado pela molecula de estatina e pelo sıtio de

ligacao foram otimizadas classicamente e depois otimizadas de novo usando a aproximacao

DFT, com tolerancias de convergencia de 10−5 Ha/A para a forca maxima por atomo e

0.005 A para o deslocamento atomico maximo.

As energias de interacao entre cada molecula de estatina e os resıduos de aminoacidos

proximos no sıtio de ligacao da HMG-CoA redutase foram estimados usando o metodo

MFCC (Molecular Fractionation with Conjugate Caps) [13]. A energia de interacao entre

a molecula de estatina S e o resıduo de aminoacido Ri, E(S −Ri), e dada por:

E(S −Ri) = E(S − C i−1RiCi+1)− E(Ci−1RiC i+1)+

−E(S − C i−1Ci+1) + E(Ci−1Ci+1)(1.1)

onde o cap (capuz) Ci e obtido acoplando-se um grupo carboxil ou amina nas ligacoes

passivadas do resıduo Ri. No lado direito da Eq. (1), E(S−Ci−1RiCi+1) e a energia total

do sistema formado pela estatina e pelo resıduo com capuz; o termo E(Ci−1RiC i+1) e a

energia total do resıduo com ”caps”isolado; E(S−Ci−1Ci+1) e a energia total do sistema

formado pela molecula de estatina e os capuzes isolados. Por ultimo, E(Ci−1Ci+1) e

a energia total do sistema formado apenas pelos capuzes moleculares. A energia total

de cada estatina e obtida somando as energias de ligacao de cada um dos resıduos de

aminoacidos levados em consideracao na definicao do sıtio ativo.

Se a interacao da molecula de estatina S com o resıduo de aminoacido Ri e parci-

almente blindado pelo resıduo de aminoacido Rj, a energia de interacao total entre S e

Ri e estimada como se segue. Primeiramente e realizado um calculo MFCC para obter

a energia de interacao entre S e os resıduos Ri e Rj ao mesmo tempo (o que denotamos

aqui como E(S−RiRj)). Neste caso, Ri e Rj tem seus capuzes escolhidos de acordo com

o que foi descrito anteriormente. Em seguida, e calculada a energia de interacao entre S

e Rj (E(S − Rj)), sem levar em conta Ri. Finalmente, estima-se a energia de interacao

blindada, E ′(S −Ri), tomando a diferenca entre E(S −RiRj) e E(S −Rj):

E ′(S −Ri) = E(S −RiRj)− E(S −Rj). (1.2)

1.5 Sumario do Capıtulo 65

1.5 Sumario do Capıtulo

Em resumo neste capıtulo, foi feito um estudo quantico para estimar a energia de in-

teracao para cada estatina considerando o sıtio de interacao com diferentes raios. Tambem

foi proposta uma correlacao entre a intesidade da energia de interacao e os dados clınicos,

bem como valores de IC50 desses farmacos redutores do colesterol. Para os resıduos R568,

D767, e E665 foram levados em conta efeitos de blindagem parcial, o que apresentou re-

levante importancia na energia total de interacao, esses resıduos, que nao sao levados em

conta em estudos de estrutura atividade, tambem apresentaram importante contribuicao

para estabilizacao das estatinas/HMGR. A atorvastatina, cerivastatina e rosuvastatina

apresentaram as mais fortes (em modulo) energia de interacao e a mevastatina e sin-

vastatina, valores intermediarios e a fluvastatina o menor valor de energia de interacao.

Um painel BIRD foi construido para os dez aminoacidos mais importante para a estabi-

lizacao das estatinas, onde neste pode-se se relacionar a parte da estrutura quımica do

farmaco com o resıduo do sıtio de ligacao da HMGR, permitindo uma analise qualitativa

e quantitativa das interacoes mais importantes.

66 1 Estatinas

67

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70 Referencias

71

2 Aspirina

2.1 Aspirina e COX-1

Apos mais de um seculo de pratica clınica, a aspirina continua sendo a droga an-

titrombotica, antitermica, analgesica e antiproliferativa mais amplamente recomendada

[1, 2, 3]. Ela age bloqueando a biossıntese de hormonios inflamatorios prostanoides atraves

da inibicao das enzimas ciclooxigenase (COXs),que estericamente impede a entrada do

acido araquidonico, ligante fisiologico [4], a semelhanca de outros anti-inflamatorios nao-

esteroidais (AINEs) como o ibuprofeno, diclofenaco, cetoprofeno, aspirina, etc, que inibem

em graus diferentes tanto as isoformas COX-1 e COX-2, (note que uma terceira isoen-

zima COX, a COX-3, foi descrita recentemente [5, 6]), sendo para o primeiro 10-170

vezes mais potente que para este ultimo [3, 7, 8, 3]. As evidencias disponıveis sugerem

que as propriedades anti-inflamatorias e analgesicas dos AINEs tradicionais sao devidas a

inibicao da COX-2, enquanto que os efeitos colaterais ulcerogenicos desses inibidores sao

associados ao bloqueio da COX-1 [9]. Na verdade, a administracao prolongada de AINEs

apresentam diversos efeitos colaterais indesejados, o mais importante sendo as irritacoes

gastro-intestinais e ulceras, que ainda representam um problema sem solucao terapeutica

[10, 9]. A COX-1 e constitutivamente expressa em altos nıveis nas celulas e tecidos, tais

como endotelio, monocitos, plaquetas, tubulos coletores renais e vesıculas seminais, in-

dicando que e regulado no desenvolvimento [11]. Por conseguinte, atua COX-1 e meio

neutra ou ligeiramente alcalino, com o pH entre 7,2 a 7,4.

A COX-1 foi purificada em 1976 [12], clonada em 1988 [9, 13, 14] e co-cristalizada

com o analogo da aspirina, acido 2-bromoacetoxi-benzoico (bromoaspirina), em 1995 [15].

A COX-1 tem 70 kD, tamanho gene com 22 kb e localizado no cromossomo 9q32-q33.3,

com 602 aminoacidos compondo sua estrutura primaria. Ele forma homodımeros (ver

Figura 2.1), cujo monomeros sao compostos de tres domınios estruturais: um domınio

N-terminal relativo fator de crescimento epidermal (EGF); um domınio de ligacao a

72 2 Aspirina

membrana (MDB); e um grande domınio catalıtico C-terminal, que compreende 80%

da proteına e contem os sıtios ativos ciclooxigenase e peroxidase [4, 7]. Os dımeros de

COX-1 sao aproximadamente elipsoidais, e as estruturas de seus monomeros sao muito

semelhantes. A interface do dımero e relativamente aberta, com inumeras moleculas de

agua intercaladas exteriormente. Um total de 22 interacoes intermoleculares polares, que

podem ser identificadas na interface do dımero, bem como diversas interacoes hidrofobicas

e pontes entre moleculas de agua contribuem para o empacotamento dos dois monomeros.

Como regra geral derivada de dados estruturais, o local de ligacao dos os AINEs

envolve a metade superior do canal de Arg120 ate a Tyr385 proximo, e varios des-

ses aminoacidos sao particularmente importantes na catalise da ciclooxigenase [16]. Os

aminoacidos que revestem o canal hidrofobico do sıtio ativo da ciclooxigenase incluem:

Leu117, Arg120, Phe205, Phe209, Val344, Ile345, Tyr348, Val349, Leu352, Ser353, Tyr355,

Leu359, Phe381, Leu384, Tyr385, Trp387, Phe518, Ile523, Gly526, Ala527, Ser530, Leu531,

Gly533, Leu534. Apenas tres dos resıduos do canal sao polares (Arg120, Ser353 e S530).

Ser530 e o sıtio de acetilacao da aspirina, e a Arg120 faz uma forte interacao ionica com

os grupos carboxilatos dos acidos graxos e muitos AINEs [16].

Vane [3] e Smith e Willis [17] propuseram que a aspirina e outros AINEs inibem

a atividade da enzima que converte acidos graxos polinsaturados em prostaglandinas

durante o processo inflamatorio. A base estrutural da atividade da aspirina inferida a

partir da infra-estrutura de cristal de prostaglandina H2 sintase inativada foi revelado

por Loll, Picot e Garavito [15]. Eles obtiveram (por difracao de raios-X) uma estrutura

com resolucao de 3,4 Ade COX-1 ovina inativado pelo bromoaspirina (potente analoga da

aspirina), que foi escolhida devido ao seu alto poder de espalhamento do atomo de bromo

que permitiu sua localizacao inequıvoca, mesmo com um mapa de densidade eletronica

de baixa resolucao. A estrutura cristalina da bromoaspirina mostrou ser isosterica ao da

aspirina [18], sendo verificada que a aspirina inibe a COX-1 tao eficientemente quanto

bromaspirina [15]. De acordo com a interpretacao habitual dos dados estruturais, os

resıduos mais importantes no sıtio de ligacao da aspirina na COX-1 sao: Ser530, devido

a acetilacao irreversıvel da aspirina; Arg120, que faz uma ponte de sal com a porcao de

acido carboxılico; Ser353, devido ao seu carater polar. Alem disso, Ile523 e crucial, pois

a sua mutacao para Val523 transforma a primeira camada do sıtio ativo da COX-1 na de

COX-2.

Entretanto, a analise baseada em comprimentos de ligacao de dados estruturais de

difracao de raios-X, bem como os procedimentos de docking e simulacoes de dinamica

2.1 Aspirina e COX-1 73

Figura 2.1: Dımero da COX-1 ovina co-cristalizada com bromaspirina, pdb 1PTH. Osresıduos do sıtio de ligacao estao dentro do cırculo com linhas tracejadas que envolve abromaspirina. Figura obtida usando o software pymol.

molecular [19] sao muito limitadas em quantificar a eficacia de cada resıduo para a ligacao

da aspirina a COX-1. Em particular, a baixa resolucao dos dados estruturais podem

comprometer a sua interpretacao, limitando seriamente uma profunda compreensao do

papel dos resıduos e os atomos ligantes sobre as caracterısticas do sıtio de ligacao. Uma

compreensao detalhada das do mecanismo da aspirina descrito ao nıvel quımica quantica

[20] e de sua ligacao a cada resıduo da COX-1 e essencial para uma descricao energetica

e para quantificar as contribuicoes individuais para a energia total de ligacao, e deve

ser muito util para a concepcao de novos derivados de acido acetilsalicılico. Conforme

ressaltado por Zhou et al. [21], os metodos de mecanica quantica (MQ) estao se tornando

populares no design e desenvolvimento de drogas in silico, principalmente por causa da

alta precisao necessaria para estimar as (relativa) afinidades de ligacao. Segundo Raha

et al. [22], o uso rotineiro de metodos de MQ em todas as fases do design de drogas in silico

e de extrema importancia para a evolucao deste campo. Metodos de MQ tambem podem

ser usados localmente para melhorar de estruturas cristalinas [23]. O refinamento quantico

possui alto custo computacional em comparacao com o refinamento padrao da estrutura

de um cristal, mas como os computadores estao se tornando mais rapidos e mais baratos,

ele pode se tornar uma ferramenta padrao, principalmente quando o re-refinamento de

74 2 Aspirina

um sıtio e maior interesse [23].

Metodos de Mecanica Quantica, muitas vezes descritos como ab initio, uma vez que

trabalham sem o uso de parametrizacoes empıricas, sao frequentemente usados para simu-

lar sistemas moleculares com centenas ou ate mesmo milhares de atomos (no ultimo caso,

utilizando supercomputadores). Apesar da complexidade dos sistemas biologicos, o po-

der computacional crescente na ultima decada, combinada com a melhoria dos metodos

quanticos, como o DFT (Density Functional Theory) [24, 25], permitiu a aplicacao da

mecanica quantica (muitas vezes combinados com tecnicas mecanica molecular) para es-

tudar, por exemplo, reacoes enzimaticas e a estrutura de proteınas e complexadas com

seus ligantes [26, 27]. Em particular, os metodos baseados em fragmentacao para calculos

quanticos envolvendo sistemas proteicos tem sido desenvolvidos para acelerar os calculos

nesses sistemas [28, 29].

O objetivo deste capitulo e apresentar uma melhor descricao da inativacao da COX-1

pela bromoaspirina e aspirina atraves de uma investigacao da quımica quantica de sua

interacao com os resıduos proximos da regiao dentro de um raio de 6,5 A em torno do

sıtio de ligacao. Tomamos o maximo proveito da estrutura ja publicada COX-1 ovina co-

cristalizada com bromoaspirina [15]. Simulacoes foram feitas para realizar a transformacao

da bromoaspirina em aspirina no sıtio de ligacao pela substituicao de Br→H no resıduo

Ser530 acetilado. O sıtio de ligacao e estabilizada por um procedimento de minimizacao

de energia baseada na mecanica quantica, uma estrategia aplicada considerando dois

tipos de refinamentos de quımica quantica aos dados originais de difracao de raios-X.

Esta abordagem permite um melhor posicionamento do acido salicılico, resultando, dos

hidrogenios dos resıduos, e a cadeias laterais da Ser530Ac [Br; H] em relacao aos dados

originais estruturais. Finalmente, a energia de interacao resultante entre COX-1 e o

acido salicılico e obtido no esquema de Fracionamento Molecular com Caps Conjugados

(MFCC do ingles, Molecular Fractionation with Conjugate Caps) apos as tres ordens de

refinamento - ver Metodos.

Neste capitulo e explicado por que os nıveis de inativacao de COX-1 pela bromoas-

pirina e aspirina sao aproximadamente os mesmos, o que e devido ao equilıbrio entre o

forte carater atrativo e o mais fraco repulsivo dos resıduos que interagem com o acido

salicılico apos a acetilacao da bromoaspirina e aspirina, respectivamente. Isto envolve

principalmente a interacao atrativa (repulsiva) entre a resıduos Arg120, Ser353, Leu359,

Ala527 e Leu531 (Pro528, Glu524, Trp387 e Gln350) e o acido salicılico resultante da

acetilacao. Alem disso, Arg120 mostrou ser o resıduo atrativo mais eficaz, enquanto fosse


muito surpreendente encontrar o distante (a 6,2 A) resıduo Glu524 repelindo fortemente a

acido salicılico. Ate o momento, Glu524 nunca foi considerada em qualquer lista anterior

de aminoacidos importantes no canal do sıtio de ligacao da COX-1.


Dificuldades associadas com a cristalizacao de proteınas de membrana estao impe-

dindo, ate agora, a obtencao de um padrao de difracao da COX-1 co-cristalizada com

acido acetilsalicılico [15], que e facilmente observado na consulta de entradas da aspi-

rina em bancos de dados de proteınas como a Collaboratory for Structural Bioinformatics

(RCSB) Protein Data Bank (PDB). No entanto, ao escolher um analogo da aspirina

contendo um atomo de bromo eletron-denso, a estrutura da analoga da aspirina, a bro-

moaspirina co-cristalizada com a COX-1 foi resolvida a 3,4 A[15] como um meio para

sondar indiretamente a estrutura da aspirina inativando a COX-1. Na verdade, a bromo-

aspirina possui uma estrutura cristalina isosterica e inibe a COX-1 ovina de forma analoga

ao observado com a aspirina, ambas apresentando valores identicos para o IC50 de mM

126µM para a atividade da COX-1, medida por Loll, Picot e Garavito [15].

A enzima COX-1 de ovino focada por nos e um dımero de subunidades identicas com

dois sıtios ativo da ciclooxigenase de ligacao da bromoaspirina bastante semelhantes, en-

trada no pdb 1PTH, cuja a resolucao da estrutura e mostrada na Figura 2.1. Ambas as

subunidades monomericas estao ativos ao mesmo tempo, cada sıtio de ligacao da bromo-

aspirina com a COX-1 e situada na extremidade de um canal hidrofobico [15]. Devido a

marcante semelhanca dos sıtios de ligacao em cada monomero, a estrutura de um unico

sıtio de ligacao foi considerada no estudo de inativacao COX-1 de ovinos por bromoaspi-

rina e aspirina.

Bromoaspirina difere da aspirina por substituicao de um atomo de hidrogenio por um

atomo de bromo (Br→H), ambos ligados covalentemente ao carbono C3’, como mostrado

na Figura 2.2. Atraves da simulacao desta substituicao, os dados estruturais da aspi-

rina na ovinos COX-1 foram obtidos atraves da busca de uma configuracao de energia

mınima no sıtio de ligacao apos a acetilacao do resıduo S530, por exemplo, de forma que

Ser530AcBr torna-se Ser530AcH. Isto e realizado levando em conta a Ser530 e o reposi-

cionamento de acido salicılico, bem como a hidrogenacao dos resıduos do sıtio de ligacao

atraves de calculos de quımica quantica realizada no ambito do DFT-LDA. Os dados es-

truturais publicados da bromoaspirina co-cristalizada com COX-1 ovina [15] foi tomada

76 2 Aspirina

em proveito para a inicializacao dos calculos. Esta estrategia permitiu-nos realizar um

estudo comparativo das caracterısticas de ligacao da bromoaspirina e aspirina no sıtio

de ligacao da COX-1 de ovinos, e para explicar porque bromoaspirina e aspirina tem o

mesmo valor de IC50 de 126µM para a atividade da COX-1 [15].

Figura 2.2: As moleculas de bromaspirina (ver a ligacao C3’Br) e de aspirina (ver aligacao C3’H), e suas regioes i, ii e iii. Encontram-se em ambiente neutro ou levementealcalino, com pH 7.2-7.4, dando origem ao estado protonado em que a carga negativa −ee atribuida aos oxigenios (ver na regiao i as ligacoes em linhas tracejadas)

Uma vez que o meio da COX-1 e neutro ou ligeiramente alcalino, a desprotonacao

da bromoaspirina e aspirina ocorrem de tal forma que o eletron adicional e partilhado

pelos oxigenios do grupo carboxılico na regiao i, como mostrado na Figura 2.2. Por outro

lado, a desativacao da enzima COX-1, impedindo o acesso de acido aracdonico no sıtio

ativo ocorre atraves do grupo [Br; H] acetil, que e retratado na regiao iii da Figura 2.2.

Apos acetilacao, o resıduo Ser530 e transformado em Ser530AcBr e Ser530AcH nos casos

da bromoaspirina e aspirina, respectivamente, que interage com o hidrogenio do carbono

C4 na Regiao ii, como observado na Figura 2.3. Apos o processo de acetilacao, o acido

salicılico (C7H6O3) e ligado nao covalentemente ao sıtio de ligacao. A Arg120 liga aos

oxigenios na regiao i e fortemente influenciada pela interacao eletrostatica local, pois e um


processo dependente do pH. O objetivo desse capitulo foi concentrado no caso da COX-1

em um ambiente neutro ou ligeiramente alcalino (como no sangue e no meio intracelular,

cujo pH varia no intervalo de 7,2-7,4). O acido salicılico se torna desprotonado, ou seja, o

atomo de hidrogenio ligado ao oxigenio do grupo carboxılico e removido, sendo uma carga

negativa (−e) atribuıdo ao oxigenios - veja a Figura 2.2. A existencia do estado acido

salicılico desprotonado dependente do ambiente deve ser considerado para uma melhor

descricao quantica da inativacao de COX-1 por bromoaspirina e aspirina.

Considerando um sıtio de ligacao de 5 A, ha onze resıduos interagindo com o acido

salicılico: Val116, Arg120, Val349, Leu352, Ser353, Tyr355, Leu359, Ile523, Ala527,

Ser530AcBr (H) e Leu531. Apenas os resıduos Arg120, Ser353, e Ser530AcBr (H) sao

polares e, consequentemente, devem interagir mais fortemente com os atomos do acido

salicılico, de acordo com os atuais dados bioquımicos e estruturais. Por outro lado, no

sıtio de 6,5 A ha mais oito resıduos que interagem com o acido salicılico: Leu93, Gln350,

Trp387, Phe518, Met522, Glu524, Gly526 e Pro528. No sıtio hidrofobico abaixo do grupo

heme, existem os resıduos Tyr385, Thr387 e Leu352; na entrada do sıtio ativo, ha a

Arg120, a Tyr355 e o novo resıduo polar Glu524, dispostos para formar uma rede de

ligacao de hidrogenio; e no sıtio lateral compreendendo ha os resıduos conservados His90,

His513, e Ile523. Uma vez que a combinacao entre o estado de carga dos resıduos e sua

distancia para o acido salicılico determina o seu papel na caracterıstica de ligacao da

bromoaspirina e aspirina apos acetilacao, os calculos de quımica quantica foram realiza-

dos considerando o sıtio de ligacao com resıduos de dezenove resıduos, o maior, para se

concentrar sobre o papel do resıduo polar Glu524, a cerca de 5,6 Ade distancia do iiC6(H).

Indo alem da estrutura de dados de difracao de raios-X para bromoaspirina [15], a

Figura 2.3A e 2.3B mostra o posicionamento dos hidrogenios nos resıduos no sıtio de

ligacao, a primeira para o refinamento de ordem zero e a ultima para o refinamento de

segunda ordem. Isto e possıvel atraves de um procedimento de minimizacao da energia

total realizado no sıtio de ligacao de 6,5 Aatraves de calculos de quımica quantica de DFT-

LDA para encontrar a melhor estrutura convergida - ver Metodos. Apos a transformacao

in silico de bromoaspirina a aspirina no sıtio de ligacao, um novo posicionamento para o

acido salicılico foi obtida desde a substituicao Br→H alterando a vizinhanca estrutural do

hidrogenio de C4. A Figura 2.3C mostra a melhor estrutura convergida do acido salicılico

no sıtio de ligacao de COX-1 de ovinos apos o refinamento de segunda ordem, obtidos

in silico apos a acetilacao de S530 pela aspirina.

Entre os resıduos do pdb 1PTH, nos escolhemos aqueles na vizinhanca 6,5 Ado sıtio

78 2 Aspirina

Figura 2.3: O sıtio de ligacao da bromaspirina depois da acetilacao obtida considerandocalculos de quımica quantica: A - refinamento de ordem zero dos dados estruturais ori-ginais; B - refinamento de segunda ordem dos dados estruturais originais; C - Trocado Br por H (isto e, uma conversao da bromospirina em aspirina depois da acetilacao)considerando o refinamento de segunda ordem dos dados estruturais originais

ativo para bromoaspirina (aspirina) para realizar calculos de quımica quantica. Sao Leu93,

Val116, Arg120, Val349, Leu352, Gln350, Ser353, Tyr355, Leu359, Thr387, Phe518,


Figura 2.4: As distancias em A(numeros pequenos) entre os onze resıduos mais impor-tantes no sıtio de ligacao da COX-1 com a bromaspirina depois da acetilacao obtidos porcalculos de quımica quantica em: A,B - refinamento dos dados estruturais originais; C,D- refinamento de segunda ordem dos dados originais

Met522, Ile523, Glu524, Gly526, Ala527, Pro528, Ser530AcBr(H) e Leu531. Alguns deles

(os onze mais importantes de acordo com a energia de interacao, veja a Figura 2.6 e Figura

2.7) estao representados na Figura 2.3A (obtida apos a refinamento de zero ordem dos

dados estruturais originais) e 3B (Figura obtida considerando o refinamento de segunda

ordem dos dados estruturais originais) para bromoaspirina, e a figura 2.3 C para a aspi-

rina (obtido simulando a substituicao Br→H, e considerando o refinamento de segunda

ordem dos dados estruturais originais). Uma diferenca muito clara entre Ser530AcBr e

Ser530AcH e evidente: o primeiro e mais distante para o hidrogenio de C4 do que o

segundo.

Como regra geral, a melhoria dos dados originais pela quımica quantica aumentou a

distancia total entre os resıduos do sıtio de ligacao e o acido salicılico, como observado na

Figura 2.4 para o caso de bromoaspirina. Os refinamentos estruturais mais importantes

80 2 Aspirina

foram as maiores distancias do acido salicılico para Thr387 (de 4,3 Apara 6,0 A), S530AcBr

(de 2,8 Apara 4,0 A), E524 (de 5,7 Apara 6,2 A), e Pro528 (de 6,2 Apara 7,1 A). Quando

dois atomos do resıduo estao interagindo com o acido salicılico, a distancia de um deles

pode mudar mais relevantemente do que o outro. Estes sao os casos de Arg120 (de 2,6 Ae

2,8 Apara 2,8 Ae 1,9 A) e S353 (de 4,0 Ae 3,9 Apara 4,1 Ae 4,6 A).

Figura 2.5: A posicao do acido salicılico no sıtio de ligacao da COX-1 no refinamento deordem zero (ligacoes em verde escuro) e a segunda ordem (ligacoes em verde claro) dosdados da estrutura original da bromaspirina depois da acetilacao.

O efeito dessas mudancas sobre o posicionamento do acido salicılico no sıtio de ligacao

da bromoaspirina e claramente mostrada na Figura 2.5. O refinamento de segunda ordem

aumenta a distancia do acido salicılico a Ser530AcBr. Vale ressaltar que as correcoes

das distancias (que chegou a 1,7 A) sao muito menores do que a resolucao estimada dos

dados de difracao original, que e de 3,4 A[15]. Por conseguinte, o refinamento de quımica

quantica baseada em dados estruturais e relevante para uma descricao mais exata do

sıtio ativo de COX-1, um resultado que tambem deve ser valido para os sıtios ativos das

proteınas em geral [23].

Mesmo com o processo de refinamento, os dados estruturais do sıtio de ligacao da

bromoaspirina e aspirina na COX-1 apos a acetilacao apenas sugere quais sao os principais

resıduos envolvidos, mas nao pode fornecer informacoes quantitativas e comparativas sobre

o papel de cada resıduo em relacao a ligacao. Este nao e o caso quando um calculo de


quımica quantica e realizado para descrever as energias de interacao entre os atomos do

ligante e os resıduos do sıtio de ligacao, como claramente demonstrado nos paineis BIRD

mostrado na Figura 2.6 e Figura 2.7 - veja a descricao do painel de energia de ligacao

BIRD em Metodos deste capıtulo - para a bromoaspirina desprotonada e aspirina ligada

a COX-1 de ovino. Eles foram calculados usando o metodo de Fracionamento Molecular

com Capas Conjugados (MFCC) [30, 31], conforme descrito em Metodos. O esquema

para o calculo da energia de interacao E (M − Ri) entre a molecula do acido 2-benzoico

e cada resıduo de aminoacido Ri e mostrado nos Metodos.

As energias de interacao de bromoaspirina (apos acetilacao Ser530) com os onze mais

importantes COX-1 de resıduos do sıtio de ligacao sao mostrados no painel BIRD na

Figura 2.6 - veja a descricao do painel de energia de ligacao BIRD em Metodos. Eles

foram calculados sob refinamento ordem zero e de segunda ordem a partir dos dados

estruturais originais. O refinamento de ordem zero significa que apenas os resıduos da

hidrogenacao foram levados em consideracao, uma comparacao das energias de interacao,

neste caso, descreve o efeito estrutural do refinamento segunda ordem dos dados sobre

como a bromoaspirina se liga a COX-1 ovina. Na verdade, a energia total de ligacao da

bromoaspirina a COX-1 e -72,82 kcal/mol, tendo em conta o refinamento quantico de

segunda ordem estrutural, e -39,56 kcal/mol considerando o refinamento de ordem zero.

Esta energia menor significa processo quantico de minimizacao de energia empregado foi

capaz de encontrar um melhor posicionamento para o acido salicılico e dos resıduos no

sıtio de ligacao da COX-1, mesmo com as restricoes impostas, que sao necessarias para

transformar o custo acessıvel computacional da calculos quanticos.

Os aminoacidos Arg120 e Glu524 sao mostrados na Figura 2.6 por serem os resıduos

mais importantes que interagem com o acido salicılico, apos acetilacao pela bromoas-

pirina, o primeiro sendo o mais atrativo por i(C1’)O1’ com uma energia de ligacao de

-73,59 kcal/mol (-77,80 kcal/mol), e o segundo sendo o mais repelente por ii(C6)H com

uma energia surpreendente repulsiva de 48,02 kcal / mol (41,65 kcal / mol), no caso de

refinamento de ordem zero (segundo). Ala527, Leu531 e Leu359 tambem sao importan-

tes resıduos de atracao, interagindo com ii(C5)H, ii(C2)OH, ii(C2)OH com energias de

ligacao de -4,55, -4,24 e -3,47 (-5,12, -5,13 e -5,89) kcal/mol considerando o refinamento

de ordem zero (segunda), respectivamente. Alem disso, Pro528, Trp387 e Gln350 tambem

sao resıduos que estao repelindo o acido salicılico apos acetilacao pela bromoaspirina, inte-

ragindo com i(C1’)O1, ii(C4)H, e ii(C3)H com pequenas energias repulsivas de 2,98; 2,24

e 1,83 (2,51, 1,41 e 1,63) kcal/mol considerando o refinamento de ordem zero (segunda),

respectivamente.

82 2 Aspirina

Figura 2.6: Energia de interacao dos principais resıduos do sıtio de ligacao do monomeroda COX-1 com o acido salicılico depois da acetilacao entre Ser530 e a bromaspirina obtidaconsiderando o refinamento de ordem zero (cinza claro) e refinamento de segunda ordem(cinza escuro) dos dados estruturais originais. A energia de ligacao total da bromaspirinadepois da acetilacao e -39,56 kcal/mol e -70,21 kcal/mol para a ordem zero e segundaordem de refinamento, respectivamente.

Uma comparacao entre as energias de interacao para os onze resıduos mais importantes

no sıtio de ligacao da bromoaspirina na COX-1 e aspirina, apos acetilacao da Ser530

e tendo em conta o refinamento de segunda ordem dos dados estruturais originais, e

mostrado no painel BIRD na Figura 2.7. Somando-se todas as energias dos resıduos

que interagem com o acido salicılico, apos acetilacao pela bromoaspirina e aspirina, nos

obtemos que a energia total de ligacao de bromoaspirina e aspirina sao muito proximas,

sendo -72,82 kcal/mol para a primeira e -70,21 kcal/mol para a segunda. Por conseguinte,

correlacionando diretamente a eficacia da droga para a forca de ligacao, os valores identicos

para o IC50 na COX-1 da bromoaspirina e aspirina, medidos anteriormente, sao explicado

[15] a partir das energias de interacao total que sao muito proxima no refinamento de

segunda ordem levado em consideracao. Note que esta conclusao so e possıvel porque os

dados estruturais da aspirina apos acetilacao da Ser530 foi criado computacionalmente no

ambito da quımica quantica.


Figura 2.7: Energia de interacao dos principais resıduos do sıtio de ligacao do monomeroda COX-1 com o acido salicılico depois da acetilacao entre Ser530 e a aspirina obtidosconsiderando calculos de quımica quanticas de segunda ordem (cinza escuro) dos dadosoriginais. A energia total da aspirina despois da acetilacao e -72,82 kcal/mol. Paraefeito de comparacao, a energia de interacao dos principais resıduos do sıtio de ligacaodo monomero da COX-1 com o acido salicılico depois da acetilacao do Ser530 com abromaspirina obtido a partir de calculos de quımica quantica considerando o refinamentode segunda ordem (cinza claro) dos dados originais. A energia total da bromaspirinadepois das acetilacao do Ser530 e -70,21 kcal/mol.

Mais uma vez Arg120 e Glu524 sao mostrados na Figura 2.7 por serem os resıduos

mais importantes na interacao com o acido salicılico, agora, apos a acetilacao da aspirina,

sendo atraıdo por i(C1’)O1’ com uma energia de ligacao de -78,31 kcal/mol (uma atracao

um pouco mais forte do que a da bromoaspirina), e sendo repelido pelo ii(C6)H com

uma energia de ligacao bastante surpreendente repulsiva 41,64 kcal/mol (uma atracao

um pouco mais fraca do que a da bromoaspirina). Ala527, Leu531 e Leu359 tambem

sao importantes resıduos de atracao, interagindo com ii(C5)H, ii(C2)OH, ii(C2)OH com

energias de ligacao de -5,12, -5,13 E -5,89 kcal/mol. Alem disso, Pro528, Trp387 e Gln350

tambem sao resıduos que estao repelindo o acido salicılico apos acetilacao pela bromoas-

pirina, interagindo com i(C1’)O1, ii(C4)H, e ii(C3)H com pequenas energias repulsivas

de 2,51, 1,41 e 1,63 kcal/mol.

84 2 Aspirina

Figura 2.8: Isosuperfıcies de potencial eletrostatico envolta do acido salicılico dos resıduosmais repulsivos e atrativos da bromaspirina (A) e aspirina (B) depois da acetilacao obtidopor calculos de quımicas quantica considerando o refinamento de segunda ordem dos dadosestruturais originais.

A isosuperfıcies de potencial eletrostatico em torno do acido salicılico e dos resıduos

mais atraentes e repelentes da bromoaspirina e aspirina apos acetilacao da Ser530 sao

mostrados na Figura 2.8A e 2.8B , respectivamente. A alta densidade de carga positiva

ocorre em i(C1’)O1’, que determina a sua atracao/repulsao pelos resıduos no sıtio de

ligacao. Como a Arg120 tem a maior densidade de carga positiva no sıtio de ligacao, e


claramente o mais importante resıduo a atrair i(C1’)O1’; por outro lado, Glu524 tem a

maior densidade de carga negativa, sendo o mais importante resıduo a repelir ii(C6)H.

A descricao da inativacao de COX-1 de ovinos por bromoaspirina e aspirina apos a

acetilacao da Ser530 no ambito da quımica quantica realizada neste trabalho confirma

os resultados estruturais que aponta para Arg120 e Ser530AcBr(H) como os resıduos

mais eficazes no sıtio de ligacao, que e devido a atracao eletrostatica e proximidade.

No entanto, analises anteriores das caracterısticas baseadas na estrutura da ligacao da

bromoaspirina e aspirina com a COX-1 desprezaram completamente, no conhecimento

dos autores, a existencia do resıduo Glu524 com grande contribuicao repulsiva indicada

por nos. Por conseguinte, ao realizar um estudo de quımica quantica, e possıvel melhorar a

descricao da inativacao COX-1 pela bromoaspirina e aspirina, e para obter uma descricao

quantitativa do papel dos principais resıduos envolvidos. A Tabela 2.1 apresenta um

resumo das figuras de merito obtidas para as energias de interacao e as distancias da

bromoaspirina e aspirina apos a refinamento de ordem zero e segunda ordem dos dados

estruturais. Mostra-se claramente a relacao entre as energias de interacao e as distancias

entre os dezenove resıduos, bem como o papel do refinamento da mecanica quantica em

uma compreensao mais profunda da ligacao da bromoaspirina e aspirina a COX-1.

Metodos High-throughput (de alta capacidade) para a determinacao de estruturas de

proteınas fornecem as informacoes necessarias para construir relacoes estrutura-atividade,

sendo a cristalografia de raios-X a principal fonte de informacoes estruturais de atual-

mente. Detalhes nos nıveis atomicos e eletronicos das moleculas de proteına, necessarios

para uma compreensao mais profunda de propriedades que permanacem ocultas apos elu-

cidacao estrutural tradicional, sao fornecidos atraves de metodos baseados em calculos

de quımica quantica [29]. Em particular, o refinamento quantico esta se tornando uma

importante ferramenta para a melhoramento de dados de cristais de proteınas [22]. Em

nossa descricao pela quımica quantica da inativacao de COX-1 de ovinos pela bromo-

aspirina e aspirina, os dados estruturais de resolucao de 3,4 Ade Loll et al. [15] foram

melhorados atraves do refinamento quantico de ordem zero e de segunda ordem desenvol-

vidos no ambito da abordagem LDA-DFT. Alem disso, criamos dados estruturais para a

aspirina com a simulacao de Brrightarrow¿H no sıtio de ligacao seguido de um processo

de minimizacao da energia total apos a acetilacao Ser530. Dados quantitativos sobre o

papel de cada resıduo que interage com a bromoaspirina e aspirina foram obtidos pelo

esquema MFCC, e os resultados foram retratados em paineis BIRD, que sao muito uteis

para a analise energetica do sıtio de ligacao, fornecendo uma visao simples da energia de

ligacao de cada resıduo a seu atomo mais proximo.

86 2 Aspirina

Foi necessario se realizar o refinamento de segunda ordem dos dados estruturais da

bromoaspirina de Loll et al. [15] para obter -72,82 kcal/mol para a energia total de

ligacao da bromoaspirina com a COX-1 (apos o refinamento de segunda ordem), que

esta em estreita concordancia com o valor da aspirina (simuladas), -70,21 kcal/mol. Por

conseguinte, um refinamento quantico de segunda ordem dos dados estruturais publicado

por Loll et al [15] e necessario para explicar corretamente porque os valores de IC50 de

126µM para a COX-1 da bromoaspirina e aspirina sao identicas de acordo com as medidas

de Loll et al. [15]. Sem o refinamento nao obtivemos este resultado.

Geralmente, nao e uma tarefa facil a determinacao dos principais resıduos envolvidos

na interacao com o ligante. Com base nos dados estruturais, o sıtio ativo da COX-1 e

considerado como tendo cerca de 24 resıduos [16], a partir da qual e atualmente aceitavel

que resıduos polares Arg120, Ser353 e Ser530 sao os mais importantes. Alem disso, Ile523

e Tyr385 sao importantes devido a sua mutacao para Val523 e Phe385, respectivamente, o

que reduz consideravelmente a acao da aspirina [16, ?]. Os resultados dos nossos calculos

de bioquımica quantica mostram que a Arg120 e o resıduo que se liga de forma mais eficaz

ao acido salicılico apos a acetilacao da Ser530. Assim, nao so confirmamos a interpretacao

baseada estritamente em dados estruturais de que Arg120 e um importantes resıduo na

ligacao da bromoaspirina e aspirina com a COX-1, mas tambem obtivemos de forma

inequıvoca que e o mais importante. Por outro lado, nossos resultados tambem mostram

que Leu359, Ala527 e Leu351 se ligam fortemente ao acido salicılico, apos acetilacao, mais

que Ser353 e Ser530. Consequentemente, a interpretacao usual do papel destes resıduos

e limitada uma vez que subestimou o papel de Leu359, Ala527 e Leu351.

Dentre os 24 resıduos, que sao considerados os mais importantes de acordo com a

analises anteriores, baseados estritamente em dados estruturais, Phe205, Phe209, Val344,

Ile345, Tyr348, Phe381, Leu384, Tyr385, Gly355 e Leu354 estao fora do sıtio de ligacao

de 6,5A COX-1. Devido a sua distancia maior para o acido salicılico, a sua energia de

interacao individual, devera ser menor do que 1,0 kcal/mol, nao contribuindo significativa-

mente para a ligacao ao acido salicılico. Por outro lado, Leu93, Val116, Gln350, Met522,

Glu524 e Pro528 sao resıduos no sitio de ligacao presentes no raio de 6,5 A, mas nao foram

considerados tao importantes para o acido salicılico de acordo com as interpretacoes an-

teriores baseados em dados estruturais [16]. No entanto, foi bastante surpreendente para

nos descobrir que entre esses ”resıduos esquecidos”, Glu524 tem uma energia muito forte

interacao repulsiva (41,6 kcal / mol) com o acido salicılico, que certamente o coloca como

o segundo resıduo mais importante para a interpretacao da bromoaspirina e aspirina com

a COX-1.


Tabela 2.1: Comprimento das ligacoes quımicas entre os atomos pertencentes a moleculada timina no cristal anidro.

No que diz respeito as mutacoes Ile523 relacionados a Tyr385, foram realizados

calculos de energias de interacao com o acido salicılico, encontrando cerca de +0,41kcal/mol

e +1,17kcal/mol para os mesmos. Note-se que Tyr385 esta fora de 6,5 A, e sua energia

de interacao calculada calcula foir maior do que a Ile523 (que esta mais proxima do acido

salicılico), devido ao seu estado de carga. Consequentemente, as alteracoes estruturais re-

lacionadas com as mutacoes de Phe385 e Val523 podem aumentar localmente seu carater

de ligacao. Ressalta-se que o nosso trabalho sugere para os especialistas em design de

drogas alguns locais da aspirina para serem modificados visando o aumento ou reducao

de sua interacao com a COX-1, por exemplo ii(C3)H. Na verdade, analogos da aspirina

com modificacoes no ii(C3)H foram propostos recentemente [?].

2.2.1 Metodologia

O estado de protonacao - Para avaliar a importancia do estado de protonacao do

acido 2-benzoico, o esquema MFCC foi aplicado para a bromoaspirina e aspirina levando

em conta a condicao do pH. De fato, considerando um ambiente neutro ou ligeiramente

alcalino (como no sangue e no meio intracelular, pH 7,2-7,4), o acido salicılico torna-se

desprotonado, ou seja, o atomo de hidrogenio ligado ao oxigenio do grupo carboxılico e

removido, sendo uma carga negativa (−e) atribuıdo aos oxigenios - veja a Figura 2.2.

Para considerar a existencia do estado desprotonado do acido salicılico dependente do

88 2 Aspirina

meio e de fundamental importancia para uma melhor descricao pela quımica quantica da

inativacao COX-1 pela bromoaspirina e aspirina. O pH relacionado ao estado da carga

de COO− contribui significativamente para a eficiencia da inativacao da COX-1.

A simulacao da aspirina na COX-1 - A estrutura cristalina original da COX-1 de

ovinos utilizada para efetuar os calculos possui uma molecula de bromoaspirina covalen-

temente ligada. Para simular o efeito de uma molecula de aspirina no sıtio de ligacao, nos

substituımos o atomo de bromo por um de hidrogenio. Alem disso, a Ser530 acetilada,

o acido 2-benzoico e os atomos de hidrogenio no sıtio de ligacao foram otimizados utili-

zando o codigo do DMOL3 DFT com os mesmos parametros da otimizacao da geometria

dos hidrogenios, conforme descrito cuidadosamente nas subsecoes abaixo, indo alem da

estrutura do sıtio de ligacao e os procedimentos de calculo de energia. Apos atingir a

convergencia da geometria, o esquema do MFCC foi utilizado para estimar a energia de

ligacao da COX-1 acetilada e do acido 2-benzoico. Os onze resıduos de maior importancia

no sıtio de COX-1 de ovinos interagindo com o acido salicılico, apos acetilacao pela bro-

moaspirina estao representados na Figura 2.3A e 2.3B apos a refinamento ordem zero e

de segunda ordem dos dados do cristal, respectivamente. A Figura 2.3C mostra o sıtio

de ligacao simulado pela quımica quantica obtido apos a transformacao Br→H e o refina-

mento de segunda ordem dos dados cristalograficos originais. Os tipos de refinamento de

dados de cristal sao descritos na proxima subsecao.

Os hidrogenios estao ausentes nos dados estruturais 3,4 Ada COX-1 de ovino co-

cristalizada com a bromoaspirina. Para contornar este problema, foi adicionado os hi-

drogenios aos resıduos. Todos os atomos pesados, juntamente com o acido salicılico no

sıtio de ligacao, foram mantidos estruturalmente fixos, enquanto o posicionamento dos hi-

drogenios foi a variado para o refinamento dos dados cristalograficos. O processo de mini-

mizacao de energia via LDA para os atomos no sıtio de ligacao permite a determinacao do

melhor posicionamento para os hidrogenios. Esta melhoria e um refinamento da quımica

quantica baseado no LDA de ordem zero sobre os dados estruturais primarios (mostrado

na Figura 2.3A) da COX-1 de ovinos co-cristalizada com a bromoaspirina. Para contornar

este problema, foi adicionado os hidrogenios aos resıduos. Todos os atomos pesados, jun-

tamente com o acido salicılico no sıtio de ligacao, foram mantidos estruturalmente fixas,

enquanto o posicionamento dos hidrogenios foi a variado para o refinamento dos dados

cristalograficos. O processo de minimizacao de energia no LDA para os atomos no sıtio

de ligacao permite a determinacao do melhor posicionamento para os hidrogenios. Esta

melhoria e um refinamento da quımica quantica baseado no LDA de ordem zero sobre os

dados estruturais primarios (mostrado na Figura 2.3A).


O calculo da energia de ligacao - Os resıduos com capas do sıtio do acido 2-benzoico (e

o proprio acido) foram hidrogenados, a geometria dos atomos de hidrogenio foi otimizada

utilizando o codigo do DMOL3 DFT. A aproximacao LDA (Local Density Approximation)

para a correlacao de troca de energia foi escolhida dentro da parametrizacao PWC [31].

A base numerica DNP foi adotada para expandir os orbitais de Kohn-Sham, juntamente

com o DSPP (DFT semi-core pseudopotentials). O ponto de corte orbital foi estabelecido

em 3,7 A, e uma variacao total de energia menor do que 10−6 Ha foi assumida para atingir

auto-consistencia. Para a otimizacao de geometria, as tolerancias de convergencia foram:

variacao maxima de energia menor do que 10−5 Ha, forca maxima por atomo menor do

que 0.002 Ha/A3 e deslocamento atomico maxima menor que 0,005 A. Nestes calculos,

as coordenadas atomicas dos atomos de COX-1 obtidos a partir de medidas de difracao

de raios-X foram mantidos fixos em caso da bromoaspirina, enquanto que para a Ser530

foi permitido sua alteracao durante o processo de minimizacao da energia total realizado

para o posicionamento do acido salicılico na construcao de dados de ligacao da aspirina.

O potencial eletrostatico - O potencial eletrostatico molecular e visualizado atraves

de um mapa de seus valores sobre a superfıcie refletindo seus limites moleculares. Ele

foi gerado atraves da sobreposicao dos raios de van der Walls de todos os atomos da

molecula, considerando um valor constante para a densidade eletronica. A densidade de

carga eletronica total foi calculada ao determinar um numero de pontos de grade em

torno da molecula, o que da origem a uma grade tridimensional. A densidade media de

pontos de uma resolucao de grade de 0,25 Ae um intervalo da grade de 3,0 A; o valor da

superfıcie de densidade de carga foi fixada em 0,017 eletrons/A3. O potencial eletrostatico

total foi calculado usando a mesma resolucao de grade. A densidade de carga e visualizada

como uma isosuperfıcie normal (uma unica superfıcie e gerada no isovalor especificado,

neste caso 0,45 A3), enquanto que o dados volumetricos do potencial eletrostatico foram

gerados como um campo 3D, cujos valores foram mapeadas em cada ponto da isosuperfıcie

de densidade eletronica.

90 2 Aspirina


Em resumo, neste capıtulo foram realizados calculos da energia de interacao entre os

resıduos do sitio de ligacao da COX-1 de ovinos e a bromaspirina (pdb 1PTH) e aspirina

(estrutura 3D obtida a partir da bromaspirina) utilizando a aproximcao MFCC dentro da

teoria do funcional da densidade (DFT) usando o formalismo da aproximacao da densidade

local para o funcional de troca-correlacao do pacote DMOL3. Alem disso, foram criados e

otimizados novos dados do cristal da COX-1 complexada com a aspirina apos a acetilacao

com o resıduo Ser530, o que tornou possivel calcular a energia de interacao entre a aspirina

essa enzima. Para isso foram utilizadas duas ordens de refinamento: (i) a primeira ordem

consiste em adicionar os atomos de hidrogenio na estrutura original e em seguida fazer uma

otimizacao da geometria somente dos hidrogenios, ou seja, mantendo a posicao dos dados

originais fixa, utilizando o campo de forca classico CVFF. (ii) a segunda ordem consiste

em fazer uma otimizacao usando DFT/LDA da estrutura da bromaspirina e aspirina

dentro do sıtio de ligacao da COX-1. As energias de interacao entre as resıduos da COX-1

e as moleculas foram computados utilizando a aproximacao MFCC, e os resultados sao

mostrados no painel BIRD. Os resultados das energias de interacao total estao de acordo

com dados experimentais de IC50. E tambem foi constatado que o resıduo Arg120 e o

mais efetivo na estabilizacao da bromaspirina e aspirina no sıtio da COX-1, seguido por

Ala527, Leu531, Leu539 e Ser353. Por outro lado, o resıduo Glu524, que nunca tinha

sido considerado por estudos estruturais, apresentou forte energia de interacao repulsiva

no sıtio de interacao da COX-1.

91

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94 Referencias

95

3 Anti-hipertensivos

3.1 Anti-hipertensivos e ECA

A hipertensao e um disturbio comum que aparece entre as principais causas de morte,

principalmente nos paıses em desenvolvimento [1], alem disso, quando nao tratada de

modo efetivo, resulta num aumento da probabilidade de morte prematura ou invalidez

causada por trombose coronariana, acidentes vasculares cerebrais e insuficiencia renal.

Ate a decada de 50, nao existia nenhum tratamento eficaz, e o desenvolvimentos de agen-

tes anti-hipertensivos, que restauram a expectativa de vida dos indivıduos, representou

um grande avanco terapeutico. Apesar do sucesso dos anti-hipertensivos, cerca de 25%

dos pacientes apresentam algum problema de saude com tratamentos longos devido aos

efeitos colaterais, sendo a tosse seca um dos sintomas mais comuns e persistentes e, em

alguns casos mais serios apresentam um efeito adverso conhecido como angiodema. Entre

os tipos mais comuns de hipertensoes estao as causadas por feocromocitoma, que e um

tipo tumor secretor de catecolaminas em geral localizado na medula adrenal. Esse tipo de

hipertensao e passıvel de tratamento cirurgico. Outro tipo comun de hipertensao sao as

classificadas como hipertensoes essenciais, devido ao fato de, a princıpio acreditar-se que

a elevacao da pressao arterial era essencial para manter uma perfusao tecidual adequada.

A elevacao persistente da pressao arterial causa hipertrofia do ventrıculo esquerdo e da

media das arterias de resistencias, com estreitamento do diametro do vaso. A pressao

arterial elevada desencadeia diversas respostas fisiologicas que envolvem os sistemas car-

diovascular, nervoso e renal. Esses cırculos viciosos que se estabelecem proporcionam

alvos para desenvolvimentos de farmacos, sendo o pricipal deles a enzima conversora de

angiotensina [2].

A Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) e tambem denominada como ACE,

sigla que vem do ingles Angiotensin I-converting Enzyme e esta e uma zinco metalo-

peptıdase que tem diversas funcoes fisiologicas, incluindo, principalmente, a regulacao da

96 3 Anti-hipertensivos

pressao sanguınea via conversao do decapeptıdeo angiotensina I no potente vasopressor

angiotensina II e tambem pela inativacao da bradicinina [3, 4, 5, 6]. A ECA e um com-

ponente central do Sistema Renina-Angiotensina-Aldeosterona (SRAA) que controla a

pressao sanguınea e tem forte influencia nas funcoes relacionadas ao coracao e aos rins,

bem como na contracao dos vasos sanguıneos. Por essa razao, a ECA e o principal alvo

terapeutico para hipertensao e doencas cardiovasculares e os inibidores da ECA estao no

mercado a mais de 20 anos [7]. Atualmente, e conhecido duas isoformas da ECA humana,

a somatica e a testicular. A ECA somatica (ECAs) humana, e um tipo de proteına trans-

membranar, existente como uma glicoproteina composta por uma unica e grande cadeia

polipeptıdica com 1277 aminoacidos que possui dois dominios catalıticos homologos (N

e C), e cada um contem um sitio ativo para o atomo de zinco que caracteriza esse tipo

de proteına. O sıtio do ıon de zinco e essencialmente formado por dois aminoaciodos

denominados histidinas que e representada pela letra H e, acido glutamico que esta re-

presentado pela letra E e a letra X representa os aminoacidos que caracterizam o tipo de

ECA na sequecia HEXXH [4]. A ECA testicular (ECAt) humana e originada do mesmo

gene que a forma somatica, possui um unico domınio com 702 aminoacidos que e iden-

tico ao domınio do terminal C da ECAs, exceto pelos primeiros 36 resıduos da sequencia

[8, 7] e segundo Fuchs et al. [9] tem fundamental importancia na fertilizacao humana. A

ECA possui ambos os domınios altamente glicosilados, caracteristica que tem dificultado

a determinacao da estrutura tridimensional dessa proteina por muito tempo. Apesar dos

domınios apresentarem cerca de 60% de semelhanca na sequencia, os mesmo possuem

propriedades funcionais e fisico-quımicas diferentes, onde o domınio N tem mais afinidade

por substratos tais como os peptıdeos hemoregulatorios AcSDKP [10, 11], Angiotensina

1-7 e keto-ECA [12] e o domınio C tem mais afinidade pela angiotensina I e bradicinina,

por essa razao e mais importante para a regulacao da pressao sanguınea, e isso torna o

domınio C o principal alvo para o desenvolvimento de uma nova geracao de inibidores

especıficos dessa enzima.

Com base em sistemas modelos foram desenvolvidos varios inibidores especıficos da

ECA, dos quais o primeiro foi o captopril. O desenvolvimento do captopril foi um dos pri-

meiros exemplos de planejamento bem sucedido de farmaco com base nos conhecimentos

quımicos da molecula alvo, todavia a enzima ECA nao podia ser isolada, o desenvol-

vimento foi possivel com a ajuda do estudo da estrutura e mecanismo de outra zinco

metaloproteinase, a carboxipeptidase, que possui um mecanismo homologo. Essa enzima

provoca a quebra do aminoacido do terminal C do seu substrato natural e e inibida pelo

acido L-bezilsuccinil [13], nesse processo a ECA cliva o par de aminoacidos do terminal C

3.1 Anti-hipertensivos e ECA 97

Figura 3.1: Esquema simplificado mostra o processo que controla a pressao sanguınea eos alvos para desenvolvimento de farmacos.

dos substratos peptıdeos. Foi observado que um nonapeptıdeo derivado do veneno de uma

serpente brasileira (Bothrops jararaca) atua como inibidores fracos da enzima, porem es-

sas substancias nao eram bons candidatos a farmacos devido a sua baixa potencia e pouca

absorcao oral. O captopril foi planejado para combinar as propriedades estericas desses

antagonistas peptıdicos numa molecula nao peptıdica, que contem um grupo sulfidrila de

localizacao apropriada para interagir com o atomo de zinco, acoplado a um resıduo de

prolina que interage com o sıtio que normalmente acomoda a leucina presente no terminal

da angiotensina I. Varios outros inibidores da ECA (IECA) foram desenvolvidos com base

nesses conhecimentos, entre os quais estao o enalapril, lisinopril, trandolapril, ramipril, e

perindopril, onde cada um difere entre si na estrutura, potencia e especıficidade [2].

A conservacao estrutural e funcional do gene que codifica a ACE sao indıcios de sua im-

portancia evolucionaria generalizada como metalopeptidase-chave envolvidas no metabo-

lismo de peptıdeos reguladores. O genoma da mosca da fruta (Drosophila melanogaster)

possui seis genes que codificam as enzimas homologas da ECA que sao denominadas ECAr

(Enzima Conversora de angiotensina relacionadas), ECAn (Enzima Conversora de Angio-

tensina), ECAn-2, ECAn-3, ECAn-4 e ECAn-5 [8]. Duas dessas angiotensinas a ECAn e


Figura 3.2: Estrutura tridimencional do captopril

Figura 3.3: Estrutura tridimencional da enzima conversora de angiotensina co-cristalizadacom um anti-hipertensivo na representacao soft ribbon, onde o ıon de zinco e destacado nointerior do sıtio de ligacao da ECA da DrosophilaMelanogaster (codigo PDB : 2X8Z).Figura obtida usando o software Molsoft

ECAr, sao enzimaticamente ativas e tem 36% da sequencia identica a da ECA humana [3],

alem disso a ECAn mostra propriedades muito similares ao domınio C da ECAs humana.

Devido a dificuldade de produzir dados cristalograficos com boa resolucao do domınio C

da ECAs humana, outros sistemas modelos foram utilizados para estudar o sıtio ativo

dessa enzima complexada com os principais farmacos inibidores da ECA que sao utiliza-

dos atualmente, com a finalidade de gerar novas informacoes para o desenvolvimento de

uma nova geracao de anti-hipertensivos mais potentes e com menos efeitos adversos.

A estrutura cristalografica da ECAn revelou uma predominancia de conformacoes

de α-helices (com cerca de 21 estruturas), 9 (3/10) helices curtas e duas folhas-β an-

tiparalelas. A estrutura tambem possui um ıon de Zn+2 no fundo do sitio ativo como

pode ser observado na fig. 3.4. Segundo Akif et al apesar da semelhanca com a ECAs,

3.1 Anti-hipertensivos e ECA 99

Figura 3.4: Estrutura 3D da ECAn (DrosophilaMelanogaster) co-cristalizada com oanti-hipertensivo captopril e com destaque do raio de interacao r (PDB: 2X8Z).

tanto na sequencia quanto na topologia, e alem do sitio do ıon Zn+2 esta altamente

conservado em ambas, algumas difencas sao notadas no numero de interacoes entre o

substrato e os subsıtios, onde os resıduos fenilalanina (F363) e tirosina (Y364), que estao

presentes na ECAn, sao trocados por duas valinas (V379 e V380). Na ECAs, contudo,

apesar das diferencas na sequencia as propriedades destas enzimas permanecem bem con-

servadas [8]. A partir destes dados cristalograficos da ECAn co-cristalizados com seis

principais anti-hipertensivos disponıveis no mercado (captopril, enalapril, lisinopril, ra-

mipril, trandolapril e perindopril) com os seguintes codigos PDB, 2X8Z, 2X90, 2X91,

2X92, 2X93 e 2X94, demonstram que o sıtio de ligacao esta localizado a cerca de 10 Ada


entrada e, e dividido em quatro subsıtios denominados S1 (T387, F375, V502, A560,

E207, T40, F383, A203, Y50 e A192), S2 (A500, Y496, E124, G51, K62, E43, T44

e A47), S′1 (D146, N261, R356, T356, T358, E150, Q361, T364, F169, F127 e S154),

S′2 (Q266, F363, S268, D437, V440, A445, S402, L433, D360 e E360). Alem disso,

ha o chamado sıtio catalıtico do ıon Zn+2 formado por H371, E368, E395, Y507 e H

367; (H=Histidina); (E=Acido Glutamico); (Y=Tirosina); (T=Treonina); (A=Alanina);

(G=Glicina); (K=Lisina); (D=Acido aspartico); (S=Serina); (N=Asparagina); (R=Arginina)

[3].

Diferencas estruturais nos anti-hipertensivos acarretam em variacoes na potencia de

inibicao da ECA. Porem sao relatados atualmente varios valores de contantes que mostram

afinidade dos principais anti-hipertensivos com as ECA humanas, onde ha diferencas de

afinidade entre os domınios, bem como nas suas homologas isoladas da mosca da fruta.

Atualmente, existem varios anti-hipertesivos disponiveis no mercado, porem o principal e

o captopril (C9H15NO3S), sendo o menor inibidor de ambos os domınios da ECA oralmente

ativo e, segundo Wei, et al. [10, 11, 14, 3] tambem e um potente inibidor da ECAn. Os

valores da constante de inibicao sao (Ki), 11, 14 e 8,9 nM, para os domınios C e N da

ECAs, e para a ECAn, respectivamente.

O enalapril (C18H24N2O5) e o ramipril (C21H28N2O5) sao potentes pro-drogas que

possuem mais afinidade e especificidade pelo domınio C da ECAs do que pela ECAn.

Estudos termodinamicos de ITC (Isothermal titration Calorimetry mostram potentes va-

lores de Ki [5, 6, 3] e o trabalho de Nichi et al. tambem mostra valores de concentracao

inibitoria (IC50) na ordem de 4.5 nM para esses inibidores. O lisinopril (C21H31N3O5) e

tambem um outro potente inibidor do domınio C da ECAs, sua estrutura deriva do ena-

lapril com a presenca de um longo grupo lisil. Trandolapril (C22H30N2O5) e perindolapril

(C17H28N2O5) tem estruturas quımicas similares e tambem apresentam potentes valores

de IC50 para a ECA humana, 0,93 e 1,5 - 3,5 nM, respectivamente. Outros estudos de

modelagem molecular dos inibidores da ECA foram realizados com a finalidade de pro-

por a estrutura tridimensional do domınio C da ECA somatica humana por homologia,

alem disso sao usados algoritimos de mecanica molecular com o proposito de refinar a

estrutura tridimencional [4, 15]. Outros peptıdeos bioativos derivados de alimentos ou

artificialmente, que inibem a ECA, estao sendo estudados por meio de docking molecular

e, segundo Jimsheena et al., o tripeptideo IKP mostrou-se ser um potente inibidor com

IC50 da ordem de 7µM, valor similar aos dos peptıdeos encontrados no soro de leite IPP

e VPP [16, 17].


Neste capıtulo foram usados dados cristalograficos de alta resolucao (2.6 A) de uma

homologa da ECA (ECA da Drosophilamelanogaster) complexada com seis farmacos

anti-hipertensivos [3] para fazer calculos computacionais usando aproximacoes em mecanica

quantica com a finalidade de investigar detalhadamente as energias de interacoes entre

os resıduos do sıtio de ligacao da enzima conversora de angiotensina da mosca da fruta

(ECAn) com o captopril (C), enalapril (E), ramipril (R), lisinopril (L), trandolapril (T)

e perindolapril (P). Para obtencao dos resultados apresentados neste capıtulo a metodo-

logia utilizada foi a mesma descrita no capıtulo 1. A proposta desse capıtulo e explicar

porque os anti-hipertensivos aqui estudados tem diferencas na sua afinidade, especifici-

dade e eficiencia em reduzir a pressao sanguinea a partir da obtencao e comparacao da

energia de interacao entre a ECAn e seus inibidores. Para esse estudo o raio r do sitio de

ligacao para estimar a energia de interacao varia de 2.5 A a 16 A, obtendo assim o perfil de

energia entre os IECA e a enzima conversora de angiotensina. Alem disso, foi usado uma

blindagem para o ıon de zinco (Zn+2 no sıtio catalıtico da ECAn e novamente foi obtido

o perfil de energia. A energia de interacao total e obtida e tem sucesso na representacao

da afinidade de cada farmaco anti-hipertensivo.


Os anti-hipertensivos possuem estruturas quımicas diferentes o que os faz intera-

gir com o sıtio de ligacao da ECA, de um modo geral, de maneira especifica e com

maior(menor) afinidade. Com base nisso, o desenvolvimento desses farmacos tem levado

em conta informacoes estruturais de sistemas modelos que possam contribuir de forma

decisiva para o desenvolvimento de inibidores mais potentes e especifıcos e consequenti-

mente apresentem menos efeitos adversos. Neste capıtulo foi estudado o sıtio de ligacao

de uma homologa da ECA com a finalidade de fornecer informacoes mais detalhadas em

nıvel quantico do sistema modelo ECAn/IECA. Para isso, o perfil de energia do sıtio de

ligacao foi obtido, considerando duas situacoes: a primeira, nao leva em conta a blindagem

do ıon Zn+2 e a segunda, considera uma blindagem que consiste em considerar tambem

a interacao do chamado sıtio do zinco, para seis farmacos anti-hipertensivos interagindo

com o sıtio de ligacao de uma enzima homolaga da ECA, que foi isolada e cristalizada da

Drosophilamelanogaster (ver fig. 3.4), onde o raio do sıtio de ligacao, conforme descrito

no cap. 1 variou de 2.0 A ate 16.0 A.

A energia de interacao calculada para uma molecula de anti-hipertensivo complexada

com ECAn e uma funcao de r, E(r), e e obtida somando as energias de todos os elemntos


interagentes dentro de SL(r) (sıtio de ligacao). Aumentando r, mais e mais resıduos sao

levados em consideracao, modificando a energia de interacao. Quando r e pequeno, pode-

se esperar uma contribuicao dominante de resıduos carregados proximos. Para tamanhos

intermedıarios de ESL (esfera do sıtio de ligacao), a energia de interacao provavelmente

variara mais devagar e, finalmente, para valores de r suficientemente grandes, a energia de

interacao deve se estabilizar e convergir. Nas Figuras 3.5 e 3.6 as energias de interacao em

funcao de r sao mostradas para o captopril (linha solida), enalapril (linha com tracejado

longo), lisinopril (linha pontilhada), ramipril (linha tracejada e pontilhada), trandolapril

(linha tracejada e dois pontos) e perindopril (tracejado curto). Cada curva de energia e

claramente distinta das outras, sendo exclusiva do anti-hipertensivo correspondente.

A figura.3.5, mostra que a energia de interacao possui uma grande afinidade com

o sıtio de ligacao da ECAn, onde a maior (menor) energia de interacao e do lisinopril

(captopril). Porem, observando esses valores e o comportamento da energia de interacao

com a variacao do raio, nao estao representando o sistema. Observa-se que a a afini-

dade segue a seguinte ordem decrescente: lisinopril> ramipril> enalapril> perindopril

> trandolapril > captopril, o que sugere que esse perfil de energia nao esta descrevendo

o sistema sıtio-ligante, pois esse resultado nao concorda com as constantes de inibicao

medidas para a ECAn/anti-hipertensivos [3]. Esse resultado mostra uma falha do metodo

MFCC para sistemas com interacoes de longo alcance geradas pela presenca de ıons no

sıtio de ligacao ou resıduos carregados [18]. Assim, foi proposta uma blindagem (ver 1)

para reduzir a influencia da interacao dos aminoacidos carregados com o Zn+2 no sıtio de

ligacao conforme mostrado na Figura 3.14.

Na Figura 3.6 foi usado uma blindagem para o ıon Zn+2 para tentar reduzir os efeitos

das interacoes de longo alcance entre os aminoacidos carregados e o ıon. A blindagem

usada consiste em considerar os aminoacidos do entao definido sıtio do zinco que esta

presente em todas as ECA [8, 3, 5] e, assim, realizar os calculos da energia de interacao

como descrito na secao 1.3 do capıtulo 1. Na Figura 3.6 todos os perfis de energia apre-

sentaram grande reducao da energia de interacao, cerca de 50%, alem de mostrar uma

melhor representacao das interacoes entre os resıduos e os ligantes com a variacao do raio.

As contribuicoes atrativas (repulsivas) dos resıduos no sıtio de ligacao ficam mais eviden-

tes e esse resultado tambem mostra que a blindagem escolhida foi eficiente. Nessa figura

3.6 pode-se relacionar as caracteristicas do perfil de energia com os resıduos distrubuidos

por raio de interacao da tabela 3.1 e 3.2 onde nesta, tambem esta identificado o sıtio de

ligacao definido estruturalmente [3], a partir dos dados do cristal da ECAn.


Figura 3.5: A variacao da energia de interacao como uma funcao do raio para: captopril(linha solida verde), enalapril (linha com traco longo vermelha), lisinopril (linha compontos preto), ramipril(linha com traco longo e pontos azul), trandolapril (linha comtraco longo e dois pontos marron) e perindopril (linha com traco curto cinza). O graficomenor mostra a energia de interacao para os raios menores que 5 A. O sıtio de ligacaoe medido a partir do centroıde de cada anti-hipertensivo e o resıduo mais distante daenzima ECAn.

A Figura 3.7 mostra uma comparacao das energias de interacao calculadas, E(r), para

ECAn complexada com os principais anti-hipertensivos da Figura 3.4 com r =6.0, 9.0, 12.0

e 16.0 A. Para o menor dos sıtios de ligacao, o valor absoluto da energia de interacao da

ECAn com cada anti-hipertensivo segue a sequencia decrescente R>P>E>C>T>L,

sugerindo que a ramipril (lisinopril) e o anti-hipertensivo mais (menos) potente para inibir

a ECAn, isto se assumirmos uma correlacao direta entre a potencia dos anti-hipertensivos

e a intensidade da interacao total ECAn-anti-hipertensivos. Para o sıtio de ligacao com

r ≈ 12.0 A, que e aproximadamente o valor usado para atorvastatina nos artigo de Akif

e colaboradores [3], o valor absoluto de E(r) obedece a sequencia E>R>P>E>C>T,

sugerindo que o lisinopril(Trandolapril) e o anti-hipertensivo mais (menos) efetivo na


Figura 3.6: A variacao da energia de interacao usando blindagem como uma funcao do raiopara: captopril (linha solida verde), enalapril (linha com traco longo vermelha), lisino-pril(linha com pontos preto), ramipril(linha com traco longo e pontos azul), trandolapril(linha com traco longo e dois pontos marron) e perindopril(linha com traco curto cinza).O grafico menor mostra a energia de interacao para os raios menores que 5 A.

inibicao da ECAn. Depois da estabilizacao de E(r) para r > 16.0 A, a energia de in-

teracao apresenta a seguinte ordem: L>R>E>C>P>T, sugerindo que o lisinopril e o

ramipril sao as anti-hipertensivos mais potentes, enquanto a perindopril e a trandolapril

sao os menos potentes. Esses resultados possuem uma boa correlacao com resultados ex-

perimentais da constante de inibicao Ki [3] para a ECAn e, atualmente, so existem dados

de estudos de calorimetria que possam comparar a ECAt e a ECAn para o enalapril. Os

anti-hipertensivos que exibem maior mudanca quando se passa de r = 12.0 para r = 16.0

A sao P (E(r) reduz em cerca de 110 kcal/mol), E (E(r) aumenta cerca de 60 kcal/mol),

E (E(r) aumenta em cerca de 60 kcal/mol), e L e R (E(r) diminuiram em cerca de 40

kcal/mol).


Figura 3.7: A energia de interacao total entre a ECAn e captopril (C), enalapril (E),lisinopril (L), ramipril (R), trandolapril (T), e perindopril (P) para os raios de interacaode 6,0 A, 9,0 A, 12.0 A. e 12.0 A.

,


Tab

ela3.1:

Resıd

uos

daenzim

aECAnqueinteragem

comcap

topril

(C),

enalap

ril(E

),lisin

opril

(L),

ramipril

(R),

trandolap

ril(T

),e

perin

dop

ril(P

)com

oau

mento

doraio

deinteracao.

Verm

elho(azu

l)rep

resenta

resıduos

carregados

negativam

ente

(positivam

ente).

Oresıd

uos

mais

importan

tesqueinteragem

comas

estainas

estaoem

negrito.

Oraio

deinteracao

variade2,0A

a11,5A


Tab

ela3.2:

Resıduos

daenzimaECAnqueinteragem

com

captopril(C

),enalap

ril(E

),lisinop

ril(L),

ramipril(R

),tran

dolap

ril(T

),e

perindop

ril(P

)com

oau

mento

doraio

deinteracao.

Vermelho(azul)representa

resıduos

carregad

osnegativam

ente

(positivam

ente).

Oresıduos

maisim

portantesqueinteragem

com

asestainas

estaoem

negrito.O

raio

deinteracaovariade12,0A

a16,0A


Os resıduos da ECAn sao mostrados dentro de cascas esfericas com espessura de 0.5

A centradas no centroide de cada anti-hipertensivo e sao mostrados nas Tabela 3.1 e 3.2.

Os resıduos atrativos mais importantes (ver painel da Fig. 3.9 e 3.10) aparecem em ne-

grito. Resıduos negativamente (positivamente) carregados sao exibidos em cor vermelha

(azul). Os aminoacidos que formam o sıtio de interacao do ıon Zn+2 estao sublinhados.

Segundo Akif et al. [3] o sıtio de ligacao dos anti-hipertensivos e formado por aproxima-

damente 38 aminoacidos (como descrito na introducao deste capıtulo), o que representa

aproximadamente 30% dos aminoacidos considerados neste estudo.

O painel BIRD - As Figuras 3.9 e 3.10 mostram dois paineis grafico com as energias de

interacao entre os seis anti-hipertensivos C, E, L, R, T e P e os resıduos de aminoacidos

mais importantes no sıtio de ligacao da ECAn. Este painel grafico sera chamado aqui

de BIRD, um acronimo em ingles para as palavras-chave sıtio de ligacao, energia de

interacao e domınio de resıduos (Binding site, Interaction energy and Residues Domain),

e mostra claramente: (i) a energia de interacao (em kcal/mol) de cada resıduo com a

droga usando barras horizontais, a partir do qual pode-se estimar quantitativamente o

papel de cada resıduo no sıtio de ligacao, ou seja, sua eficacia para atrair ou repelir a

droga; (ii) os resıduos mais importantes que contribuem para a ligacao no lado esquerdo;

(iii) a regiao e os atomos da droga (letras em negrito na Fig. 3.9) que estao mais proximos

de cada resıduo (lado esquerdo) no sıtio de ligacao. A energia de ligacao dos resıduos de

aminoacidos interagindo com a molecula anti-hipertensiva dentro do sıtio de ligacao serao

definidas aqui como sendo o negativo das energias de interacao correspondentes calculadas

atraves do metodo MFCC. Podemos ver da Figura 3.9 e 3.10 que os onze resıduos de

aminoacidos contribuem fortemente para a estabilizacao desses anti-hipertensivos: Q265,

H337, A338, H367, E368, H371, E395, K495, H497, Y504, Y507, exceto para o lisinopril, o

resıduo K495 posui uma enrgia de interacao repulsiva. Os aminoacidos H367, E368, H371,

E395, e Y507 posuem interacao intermediada pelo ıon do zinco ja eles forma o chamado

sitio do zinco (regiao b), enquanto os outros seis resıduos de aminoacidos, Q265, H337,

A338, K495, H497, e Y504 apresentam energias de interacao atrativas devido as ligacoes

de hidrogenios com grupos quımicos presentes na estruturas dos anti-hipertensivos. Em

comparacao, com Akif que apontou que varias interacoes ligacoes e ligacoes de hidrogenio

sao formadas entre a parte ECAn os atomos de oxigenios da regiao a foram completamente

explicados e bem representados usando o sistema com blindagem. O lisinopril e o unico

com uma grupo lisil (regiao e) que faz diversas interacoes ionicas com os resıduos com

cargas negativas E146, E150, e D360 por volta de 11 A, o que pode ser visto na figura 3.6,

onde apresenta um vale no perfil de energia.


O captopril e o menor anti-hipertensivo, por esse motivo apresenta menos interacoes

do que os outros anti-hipertensivos. Assim, as interacoes com os aminoacidos H337 e A338

nao apresentam grande contribuicao para a estabilizacao do farmaco no sıtio de ligacao

da ECAn. Tambem as energias de interacoes entre os aminoacidos H367, E368, H371 e

E395 sao menores quando comparados com os outros anti-hipertensivos. A explicacao

disso esta no fato da regiao d (ver fig.3.8) possuir um grupo sulfidrila e nao um grupo

carboxilato como presente nos outros anti-hipertensivos. Para o anti-hipertensivo lisino-

pril, que apresenta um aminoacido carregado proximo ao grupo carboxilato da regiao a,

no entanto, a energia de interacao foi repulsiva com mais de 20 kcal/mol, sendo explicado

pelo fato de ligacoes de hidrogenio que envolvem os resıduos H497, Q265 e H337. Porem,

o lisinopril apresenta fortes energias de interacao com os aminoacidos pertencentes ao sıtio

do zinco, sendo os pricipais a E368 e E395.

De uma forma geral as interacoes entre esses aminoacidos selecionados presentes na

fig.3.9 e 3.10 sao atrativos o que sugere uma forte afinidade desses anti-hipertensivos

estudados com o sıtio de interacao da ECAn. O painel BIRD foi divido em dois, cada

um contendo tres anti-hipertensivos. A figura 3.9 mostra as energias de interacao entre

os resıduos Q265, H337, A338, H367, H368, H371, E395, K495, H497, Y504 e Y507 e o

captopril, enalapril e lisinopril, e a figura 3.10 com ramipril, trandolapril e perindopril.

De acordo com os dados das figuras 3.9 e 3.10 os anti-hipertensivos interagem fortemente

com os aminoacidos H367, E368, H371, E395 e Y507 com interacoes intermediadas pelo

ıon Zn+2 desempenhando um importante papel na estabilizacao desses farmacos no sıtio

de ligacao.

O captopril apresentou importante interacoes entre o grupo carboxilato presente na

regiao a (ver Fig. 3.8)e os aminoacidos Q265 e K395, com os quais formam uma rede

de ligacoes de hidrogenio (ver Fig. 3.11, onde as energias de interacao sao 50 kcal/mol

e 15 kcal/mol, respectivamente. Por outro lado o lisinopril apresentou a maior energia

de interacao com o sıtio do zinco (ver Fig. 3.9, e apresentou uma repulsao entre o grupo

carboxilato da regiao a e o resıduo K495 de aproximadamente 25 kcal/mol que deve ter

sido causada pela ligacao de hidrogenio entre esse resıduo e o Q265. O lisinopril e o unico

anti-hipertensivo que possui o grupo lisil, com o qual interage por interacoes ionicas com

aminoacidos D146 (-53 kcal/mol), E150 (-42 kcal/mol) e D360 (-75kcal/mol) que estao

no raio de interacao de aproximadamente 10.5 A.

Na figura 3.10 estao outros tres importantes anti-hipertensivos que apresentam alta

especificidade pelo domınio do terminal C da ECAs humana [3], porem com ECAn nao


Figura 3.8: Estrutura quımica dos seis anti-hipertensivos mais importantes com os fun-cionais em destaques por regioes identificadas por letras minusculas e em negrito. Osatomos estao numerados de acordo com dados do arquivo PDB.

acontece o mesmo. O ramipril apresenta forte energia de interacao com o sıtio do zinco

(regiao b), alem de fazer ligacoes de hidrogenio com o resıduo Q265 (regiao a) e H337

(regiao b). O ramipril nao apresenta altos valores de energia de interacao, porem consegue

ativar mais aminoacidos com interacoes favoraveis a sua estabilizacao. O trandolapril e

perindopril sao menos potentes inibidores da ECAn segundo Akif [19] o que pode ser

observado tanto no perfil de energia quanto nas interacoes na figura 3.10.

Efeitos de blindagem parcial – O calculo da energia de interacao entre um resıduo de

aminoacido e um ligante, e importante considerar o efeito de blindagem parcial causado

pela presenca de outros resıduos de aminoacidos nas vizinhancas (notamos que os dados

reportados anteriormente nao incluem este efeito de blindagem). Na Figura 3.14 temos as


Figura 3.9: Sıtio de ligacao, energia de interacao e resıduos do domınio (Binding site,Interaction energy an Residues Domain - BIRD) esse painel mostra os resıduos relevantesda captopril, enalapril, lisinopril que contribui para a ligacao com a enzima ECAn, usandoblindagem

blindagem parcial usada para todos os resıduos carregados no sıtio de interacao da ECAn

para reduzir os efeitos das interacoes de longo alcance, tais como fortes interacoes ionicas


Figura 3.10: Sıtio de ligacao, energia de interacao e resıduos do domınio (Binding site,Interaction energy an Residues Domain - BIRD) esse painel mostra os resıduos relevantesda ramipril, trandolapril, e perindopril que contribui para a ligacao com a enzima ECAnusando blindagem

causadas por ıons metalicos presentes no interior das proteınas ou tais como moleculas

que apresentam pontas caregadas. Os aminoacidos que blindaram o zinco fazem parte


Figura 3.11: Distancias dos principais aminoacidos aos anti-hipertensivos capitopril (verdeescuro) e enalapril (verde claro).

Figura 3.12: Distancias dos principais aminoacidos aos anti-hipertensivos lisinopril (roxo)e ramipril (amarelo).

do sitio do zinco ja relatado anteriormente neste capıtulo. Neste caso estimamos o efeito

de blindagem para esses seis casos. No caso da interacao com o lisinopril, encontramos

uma diminuicao maxima na energia de ligacao de aproximadamente 600 kcal/mol.Essas

mudancas de energia provocadas sao de fundamental importancia para um boa descricao

do sistema.


Figura 3.13: Distancias dos principais aminoacidos aos anti-hipertensivos trandolapril(verde cana) e perindopril (azul claro).

Figura 3.14: Aminoacidos pertencentes ao sıtio de ligacao (HEEYH) do Zn+2 da ECAn,que blindam as interacao desse ıon com os resıduos carregados. Em (a) mostra a estruturassuperpostas do Captopril (roxo), Enalapril (verde), Lisinopril (laranja) e os aminoacidos(branco), os atomos de N, S e O, estao representados pelas cores azul, amarelo e ver-melho, respectivamente. Em (b) mostra a estruturas superpostas do Ramipril (cinza),Trandolapril (azul claro) e Perindopril (amarelo claro).

3.3 Sumario do Capıtulo 115


Em resumo, neste capıtulo foram realizados calculos da energia de interacao entre seis

anti-hipertensivos mais importantes co-cristalizados com a enzima conversora de angio-

tensina da mosca da fruta (ECAn), com a finalidade de obter dados que possam ajudar

na compreensao do mecanismo de acao desses farmacos com a ECA humana. O per-

fil de energia foi determinado a partir da variacao da energia dos resıduos do sitio de

interacao com o raio de interacao, o qual foi definido como esfera com ponto central no

centroide de cada molecula e alcancando uma raio de 16 A. As interacoes individuais entre

os anti-hipertensivos e os aminoacidos do sıtio de ligacao foi calculada a partir da apro-

ximacao MFCC (ver capıtulo 1, por meio da teoria DFT/LDA (ver anexo A). Tambem

foi usado um esquema de blindagem parcial para uma melhor representacao do sistema

anti-hipertensivos/ECAn, pois este possui um ıon de Zn+2 que pode levar a uma descricao

equivocada de sistemas desse tipo. Dois paineis BIRD foram feitos para uma analise das

interacoes entre os principais resıduos do sıtio de ligacao e a droga.

117

Referencias

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[10] WEI, L. et al. THE 2 HOMOLOGOUS DOMAINS OF HUMAN ANGIOTENSIN-I-CONVERTING ENZYME ARE BOTH CATALYTICALLY ACTIVE. JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY, 266, n. 14, p. 9002–9008, 1991.

[11] WEI, L. et al. THE 2 HOMOLOGOUS DOMAINS OF HUMAN ANGIOTENSIN-I-CONVERTING ENZYME INTERACT DIFFERENTLY WITH COMPETITIVEINHIBITORS. JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 267, n. 19, p. 13398–13405, 1992.

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118 Referencias

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119

4 Conclusoes Gerais & Perspectivas

Neste tese, foram realizados um estudo do comportamento da energia de interacao

a partir dos dados cristalograficos de tres sistemas biologicos ralacionados aos fatores de

risco das doencas do coronarianas, circulatorias e inflamatorias, usando a aproximacao do

fracionamento molecular com capas conjugadas (MFCC) e considerando-se a Teoria do

Funcional de Densidade (DFT) na aproximacao da densidade local (LDA) e funcional de

troca e correlacao PWC. De acordo com os calculos realizados nesta tese, pode-se concluir

que o perfil de energia aparece com uma nova ferramenta no auxilio da descricao do sıtio

de interacao de proteınas co-cristalizadas com farmacos, bem como a necessidade de levar

em consideracao efeitos de blindagem parciais. Tambem constatamos que apesar da falta

de dados cristalograficos de algumas proteınas co-cristalizadas com seus inibidores, pode-

se reproduzir e melhorar dados dos arquivos PDB a partir de um sistema similar. Outra

ferramenta mostrada aqui e o painel BIRD que tras informacoes detalhadas das interacoes

dos resıduos com o farmaco, relacionando suas estruturas quımicas.

Estatinas : A analise da energia de ligacao das estatinas complexadas com HGMR

aqui apresentada mostra uma boa correlacao com estudos termodinamicos e dados de

ensaios clınicos , uma vez que estes apontam para a rosuvastatina e a atorvastatina como

sendo as melhores estatinas disponıveis no mercado. De acordo com os calculos aqui

realizados, a atorvastatina tem a maior energia de ligacao, cerca de 320 kcal/mol, enquanto

a rosuvastatina tem uma energia de ligacao de cerca de 310 kcal/mol, e a sinvastatina e

a fluvastatina possuem energias totais de ligacao de cerca de 290 kcal/mol. Tal diferenca

e causada principalmente por conta da diminuicao das interacoes repulsivas entre o sıtio

ativo de ligacao da HGMR e as moleculas de A e R. Isto sugere que a potencia inibidora

das estatinas e ditada principalmente pela intensidade de sua atracao pelo sıtio de ligacao,

apesar da presenca de outros fatores que podem afetar a eficiencia dessas moleculas alem

da energia de ligacao, tais como o processo dinamico pelo qual elas sao aprisionadas no

sıtio de ligacao e interacoes com outros caminhos bioquımicos. A principal vantagem

120 4 Conclusoes Gerais & Perspectivas

da metodologia que usamos e propomos aqui e a possibilidade de avaliar quais resıduos

de aminoacidos contribuem mais intensamente para a estabilizacao do complexo statina-

HMGR, o que pode ser de grande ajuda para propositos de design de farmacos. Por

exemplo, a abordagem MFCC permitiu concluir que modificacoes na regiao a (regiao

HMGR), que definem uma molecula como sendo uma estatina, nao sao necessarias para

aumentar a interacao de ligacao, uma vez que outras regioes (c, d, e e) tambem sao

importantes neste aspecto. Finalmente, demonstramos que efeitos de blindagem parcial

da carga de um resıduo de aminoacido por seus vizinhos pode ser importante para dar uma

descricao acurada da ligacao das estatinas com a HGMR, diminuindo a energia de ligacao

em ate 26% em comparacao com a variacao da energia total para diferentes moleculas de

estatina.

Aspirina: Dentre os 24 resıduos, que sao considerados os mais importantes de acordo

com a analises anteriores, baseados estritamente em dados estruturais, Phe205, Phe209,

Val344, Ile345, Tyr348, Phe381, Leu384, Tyr385, Gly355 e Leu354 estao fora do sıtio de

ligacao de 6,5 ACOX-1. Devido a sua distancia maior para o acido salicılico, a sua energia

de interacao individual, devera ser menor do que 1,0 kcal/mol, nao contribuindo significati-

vamente para a ligacao ao acido salicılico. Por outro lado, Leu93, Val116, Gln350, Met522,

Glu524 e Pro528 sao resıduos no sitio de ligacao presentes no raio de 6,5 A, mas nao fo-

ram considerados tao importantes para o acido salicılico de acordo com as interpretacoes

anteriores baseados em dados estruturais . No entanto, foi bastante surpreendente para

nos descobrir que entre esses ”resıduos perdidos ”, Glu524 tem uma energia muito forte

interacao repulsiva (41,6 kcal / mol) com o acido salicılico, que certamente o coloca como

o segundo resıduo mais importante para bromoaspirina e aspirina ligado a COX-1. No

que diz respeito as mutacoes Ile523 resıduos relacionados e Y385, foi realizado calculos

de suas energisa de interacao com o acido salicılico, encontrando cerca de +0,41kcal/mol

e +1,17kcal/mol para os mesmos. Note-se que Tyr385 esta fora de 6,5 A, e sua energia

de interacao foi calculada para ser exaustivo, sendo mais forte do que Ile523 (que esta

mais proximo do acido salicılico), devido ao seu estado de carga. Consequentemente, as

alteracoes estruturais relacionadas com as mutacoes de Phe385 e Val523 podem aumen-

tar localmente seu carater de ligacao. Ressalta-se que o nosso trabalho sugere para o

especialista em design de drogas alguns locais da aspirina para serem modificado para o

aumento ou reducao de sua interacao com a COX-1, por exemplo ii(C3)H. Na verdade,

analogos de aspirina com modificacoes no ii(C3)H foram propostos recentemente. Outro

importante resultado foi a eficiencia dos metodos quanticos em reproduzir dados crista-

lograficos de boa qualidade que ajudaram a descrever um sistema que ainda nao possui

4.0 Perspectivas 121

dados estruturais experimentais.

Anti-hipertensivos : Foram aplicadas duas metodologias para estimar a energia de in-

teracao entre os aminoacidos do sıtio de ligacao da enzima ECAn e os anti-hipertensivos

captopril, enalapril, lisinopril, ramipril, trandolapril e perindopril. Sendo obtidos dois

perfis de eneriga que representam a evolucao da energia com relacao ao raio de interacao

definido a partir do centroide de cada anti-hipertensivo. No primeiro perfil de energia,

ver Figura 3.5, as variacoes da energia chegaram a 750 kcal/mol, causa esta devido a

nao consideracao dos efeitos de blindagem. No segundo, ver Figura 3.6, essa variacao

da energia foi menos significativa e de aproximadamente 250 kcal/mol, onde foram con-

siderados os efeitos de blindagem. O perfil de energia com blindagem mostrou-se mais

eficiente em descrever o sistema ECAn/Anti-hipertensivo sendo uma boa correcao apli-

cada a aproximacao MFCC em casos onde exista a presenca de ıons complexados com

a enzima/ligante. A analise da energia de interacao apresentou boa correlacao com as

constantes de inibicao reportadas em diversos estudos. Os anti-hipertensivos lisinopril

e ramipril apresentaram as duas maiores energias de interacao para o raio de 16 A com

valores absolutos de 446 kcal/mol e 426 kcal/mol, respectivamente. Os anti-hipertensivos

captopril e enalapril apresentam energias de interacao intermediarias de 299 kcal/mol e

372 kcal/mol, respectivamente, e os menores valores de energia de interacao foram de

252 kcal/mol e 256 kcal/mol para o trandolapril e perindopril, respectivamente. O pai-

nel grafico BIRD mostra as principais energias de interacao envolvidas na estabilizacao

dos anti-hipertensivos estudados dentro do sıtio catalıtico da ECAn. Devido a falta de

informacoes estruturais do domınio do terminal-C da ECA somatica humana, a qual e a

principal responsavel pelo controle da pressao arterial, o sistema estudado apresenta va-

liosas informacoes para o desenvolvimento da segunda geracao de anti-hipertensivos que

possuam maior potencia e menos efeitos adversos.

Perspectivas

Esta tese gerou, alem dos resultados apresentados, perspectivas diversas:

Estatinas : A metodologia aqui apresentada e os resultados obtidos podem servir de

base para a pesquisa e desenvolvimento de um nova estatina;

Aspirina: Deve-se aplicar a mesma metodologia usada nas estatinas e anti-hipertensivos

com a intencao de refinar os resultados obtidos, fazendo o estudo do raio de interacao;

122 4 Conclusoes Gerais & Perspectivas

Anti-hipertensivos : Estudar sistema homologos da ECA, tais como, ECAt humana

(testicular)e domınio do terminal-N da ECA somatica co-cristalizada com anti-

hipertensivos.

Anticoagulantes : Estender os metodos de calculos realizados para os anticoagulantes

orais co-cristalizados com o fator Xa existentes no Banco de Dados de Proteınas

(PDB).

anticancer : Aplicar os metodos na investigacao dos efeitos nas modificacoes estru-

turais causam na afinidade do farmacos anticancer orais e comparar com resultados

experimentais e para isso utilizaremos dados da proteina Bcr-Abl co-cristalizados

com o farmaco imatinib existentes no Banco de Dados de Proteınas (PDB).

123

ANEXO A -- Metodologia Computacional

A.1 O Hamiltoniano Geral

Sistemas em nıvel atomico e molecular sao regidos pelos princıpios e leis da mecanica

quantica, cuja equacao fundamental e a equacao de Schrodinger. Entretanto, a solucao

para ela ocorre de forma exata apenas para sistemas extremamente simples, e.g. em uma

partıcula sujeita a um potencial conhecido. Assim, sistemas com mais eletrons que atomos

hidrogenoides ou o atomo de helio nao apresentam solucao analıtica exata. Metodos

aproximados e solucoes numericas sao as saıdas inevitaveis para resolver os problemas

mais complexos, e o fazem, em geral, de maneira satisfatoria.

Dado o Hamiltoniano para sistemas multi-eletronicos, a equacao de Schrodinger nao-

relativıstica dependente do tempo sera:

i~∂Ψ(ri; t)

∂t= HΨ(ri; t) (A.1)

onde, de forma a simplificar a notacao, definimos , em que as coordenadas de spin da

i-esima partıcula estao inseridas no conjunto de coordenadas denotada por Ψ(ri; t) =Ψ(r1, r2, ..., rN ; t). Um hamiltoniano adequado para sistemas multi-eletronicos e multi-

nucleares pode ser escrito no sistema de unidades atomicas, em que ~ = me = e =

4π/ε0 = 1, da seguinte forma:

H = Te + VNe + Ve + TN + VN

H = −1

2

∑i

∇2i −

∑i,I

ZI∣∣∣ri − RI

∣∣∣ +∑i=j

1

ri − RI

− 1

2MI

∑I

∇2I +

∑I =J

ZIZJ∣∣∣RI − RJ

∣∣∣ (A.2)

onde usamos as letras minusculas para variaveis relativas aos eletrons e as maiusculas,

para os nucleos. De forma a buscar correlacoes eletronicas descritas satisfatoriamente, as

124 Anexo A -- Metodologia Computacional

interacoes coulombianas eletron-eletron sao os termos de muitos corpos em que reside boa

parte das aproximacoes hoje utilizadas. Para um sistema atomico, podemos separar esse

hamiltoniano em duas partes: uma, levando em consideracao a parte eletronica e a outra,

a nuclear. Se levarmos em conta que a massa do nucleo e muito maior que a do eletron,

entao o unico termo suficientemente pequeno da Eq. A.2 para MI → ∞, e que pode ser

considerado como uma perturbacao, e o termo de energia cinetica. Assim,

H = Hele + VN (A.3)

onde,

Hele = Te + VNe + Ve (A.4)

A interpretacao fısica dessa aproximacao, conhecida como Aproximacao de Born-

Oppenheimer, e de que ao menor movimento nuclear, os eletrons instantaneamente se

rearranjam de forma a recuperar a estrutura eletronica para a nova configuracao nuclear.

Por outro lado, as variacoes sentidas pelos nucleos devido o movimento eletronico podem

ser negligenciadas, de modo que podemos considerar os nucleos “fixos” e desacoplar o

movimento eletronico do nuclear. Dessa forma, resolve-se a equacao de Schrodinger para o

hamiltoniano eletronico, dada uma configuracao nuclear, e se obtem um potencial efetivo,

que seria utilizado no calculo do movimento nuclear, de maneira iterativa.

Em geral, sistemas quanticos ordinarios se apresentam em estados estacionarios, de

forma que a funcao de onda pode ser separada em duas partes, uma dependente das

coordenadas; e a outra, do tempo:

Ψ(ri; t) = ϕ(ri)e−i(E/~)t

De acordo com o princıpio variacional, a energia do sistema e um mınimo variacional

para a classe de funcoes |ϕ⟩ escolhida, assim E = E[ϕ], que e o limite superior para a

energia exata. Assim, para qualquer estado dinamico, onde E0 e a energia do estado

fundamental teremos:

E[ϕ] ≥ E0 (A.5)

em que a energia do sistema sera dada pelo valor esperado do Hamiltoniano,

A.2 Hartree-Fock 125

E[ϕ] ≡⟨H⟩=

⟨Ψ|H |Ψ⟩⟨Ψ| Ψ⟩

(A.6)

e que o princıpio variacional leva a equacao de auto-valor, que e a equacao de Schrodinger

independente do tempo dada na notacao de Dirac

H |Ψ⟩ = E |Ψ⟩ (A.7)

Dada a impossibilidade de se resolver analiticamente e de forma exata sistemas multi-

eletronicos, e.g. moleculares, recorre-se constantemente a aproximacoes. Para o nosso

objetivo, a primeira aproximacao geralmente usada para resolver a equacao de Schrodin-

ger baseia-se na ideia de que a densidade eletronica espacial dos atomos e muito baixa,

ou seja, o raio atomico e compreendido em sua maior parte por regioes sem ocupacao

eletronica, de forma que esse fato e utilizado para justificar a aproximacao e conside-

rar as partıculas independentemente. Essa aproximacao preve que a funcao de onda do

sistema de N eletrons pode ser descrita como um produto de N funcoes de um eletron,

construıdas de forma que o princıpio de exclusao de Pauli seja satisfeito, o que ocorre pela

construcao de uma funcao de onda totalmente anti-simetrica nas coordenadas eletronicas

r1,r2,...,rN , devido ao spin. Essas aproximacoes podem ser classificadas, basicamente, em

nao-interagentes (Hartree) e Hartree-Fock, que se diferenciam pelo fato de a segunda le-

var em consideracao explicitamente termos da interacao coulombiana eletron-eletron na

energia, enquanto que o primeiro faz a corre≫c ao a partir de um potencial efetivo.

A.2 Hartree-Fock

Na aproximacao de Hartree-Fock, a funcao de onda anti-simetrica e escrita como um

determinante formado por funcoes de estado de uma partıcula, e. g. orbital molecular

e spin (chamada aqui de spin-orbital molecular), que minimiza a energia total para o

hamiltoniano (Eq. A.2), usando o metodo variacional. A principal consideracao feita

para o Metodo de Hartree-Fock restrito, se deve ao fato de que o numero de eletrons e par

e a camada orbital molecular e “fechad”. Nos casos em que nao ha interacao spin-orbita,

o determinante funcao de onda Φ pode ser escrito como o determinante de Slater:


Φ =1√N !

∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣

ϕ1(r1, σ1) ϕ1(r2, σ2) · · · ϕ1(rN , σN)

ϕ2(r1, σ1) ϕ2(r2, σ2) · · · ϕ2(rN , σN)...

.... . .

...

ϕN(r1, σ1) ϕN(r2, σ2) · · · ϕN(rN , σN)

∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣(A.8)

em que ϕi(rj, σj) sao funcoes dos orbitais dependente de spin, onde cada partıcula e um

produto da funcao da posicao ψσi (rj) e da funcao da variavel de spin ξi(σj).

ξi(σj) =

α(j) ↑β(j) ↓

(A.9)

Dado o operador anti-simetrizador A, a funcao de onda Φ pode ser escrita como

Φ = (N !)1/2Aϕ(1)

1 ϕ(2)2 ...ϕ

(N)N (A.10)

A =1

N !

∑P

λP P (A.11)

onde o ındice inferior se refere ao estado eletronico e o superior a partıcula em questao.

P e o operador permutacao e λP = (−1)ϵP , com ϵP o numero de permutacoes de P . A

energia do sistema e dada por

E =⟨H⟩=

∫Φ∗HΦdτ ≡ E[Φ]

onde o operador hamiltoniano e dado pela Eq. (A.4). A equacao acima resulta em:

E = 2∑i

hi +∑i,j

(2Jij −Kij) (A.12)

onde hi e a parte do hamiltoniano eletronico relativo a energia cinetica e a interacao

eletron-nucleo. Os termos Jij e Kij sao termos de muitos corpos relacionados com a

interacao eletron-eletron e sao dados por:

Jij =

∫ ∫ϕ∗µi ϕ

∗υj ϕ

µi ϕ

∗υj

1

rµυdϑµυ (A.13)

A.2 Hartree-Fock 127

Kij =

∫ ∫ϕ∗µi ϕ

∗υj ϕ

µj ϕ

∗υi

1

rµυdϑµυ (A.14)

em que ϕji representa a funcao de spin-orbital molecular para o estado eletronico i do

eletron µ. A Eq. (A.13) representa a interacao coulombiana entre as densidades |ϕi|2 e

|ϕj|2, enquanto que o termo Kij nao tem analogo classico, e e conhecido como energia de

troca, devido ao desacordo entre os estados eletronicos da mesma partıcula, ou seja temos

o produto ϕ∗µi ϕ

∗µj . Podemos definir um operador de Coulomb Ji e um operador de Troca

Ki dados por:

Jµi ϕµ =

(∫ϕ∗υi ϕ

∗υi

rµυdϑυ

)ϕµ (A.15)

Kµi ϕ

µ =

(∫ϕ∗υi ϕ

υ

rµυdϑυ

)ϕµi (A.16)

onde

Jij =

∫ϕ∗µi J

µj ϕ

µi dϑ

µυ

Kij =

∫ϕ∗µi K

µj ϕ

µi dϑ

µυ

Se definirmos o operador de interacao eletronica total G e o operador de Fock F por

F = h+ G

G =∑i

(2Ji − Ki

)teremos que a equacao a ser resolvida passa a ser

F ϕi =∑j

ϕjϵji (A.17)

ou em notacao matricial


F ϕ = ϕϵ (A.18)

notemos que a equacao acima deve ser resolvida de maneira auto-consistente, uma vez

que o operador de Fock definido em termos dos operadores de Coulomb e de Troca (Eqs.

(A.13) e (A.14)) depende da propria funcao de onda que se esta buscando saber. A Eq.

(A.18), tambem mostra que o problema de N eletrons se transformou em N problemas de

um eletron. Embora tenhamos descrito apenas para o metodo de Hartree-Fock restrito,

podemos ter uma ideia de como o metodo se desenvolve para os casos nao-restritos, que e

uma generalizacao do primeiro. A principal consideracao que fizemos no caso restrito, foi

devido ao fato de o numero de eletrons ser par e a camada orbital molecular ser “fechada”,

assim a permuta≫c ao de linhas ou colunas no determinante de Slater considerado (Eq.

(A.10)) gera o mesmo resultado. No caso nao-restrito devemos buscar uma formulacao

em que a classe de funcoes de onda Φ e formada por monodeterminantes sem que haja

qualquer relacao entre as partes espaciais dos spin-orbitais e as funcoes de spin α e β,

de forma que permutacoes nas linhas ou colunas desses determinantes levem a diferentes

resultados. O principal problema das aproximacoes do tipo Hartree-Fock e devido a

consideracao inicial de que os eletrons sao nao-interagentes dada pela independencia das

funcoes de estado spin-orbitais de cada elemento. Dessa forma, em princıpio, a energia de

Hartree-Fock (EHF ) diferencia-se da energia exata (Exata), pela ausencia da correlacao

eletronica (Ecorr), assim

Eexata = EHF + Ecorr

A.3 Teoria do Funcional da Densidade

Na secao anterior descrevemos o metodo de Hartree-Fock restrito para resolucao de

sistemas multi-eletronicos a partir da equacao de Schrodinger (Eq. (A.7)). O metodo

consistia, basicamente, em resolver um problema de N partıculas em N problemas de uma

partıcula, resultando em 4N equacoes a ser resolvidas, onde 3N se referiam as variaveis

espaciais e N, a variavel de spin, para o caso nao-restrito. Resolver o problema por esse

metodo consiste, portanto, em tarefa ardua, onde o acrescimo no numero de partıculas

(eletrons) o torna praticamente proibitivo quando esse numero e “grande” o suficiente ,

embora os avancos tecnologicos no poder computacional tenha permitido que o metodo

de Hartree-Fock seja utilizado em sistemas com ate centenas de atomos.

A.3 Teoria do Funcional da Densidade 129

Nessa secao, mostraremos uma outra maneira de resolver o problema multi-eletronico,

chamado de Teoria do Funcional da Densidade (DFT, na sigla em ingles de Density Func-

tional Theory), que tem como objeto fundamental a densidade eletronica ρ(r). Basi-

camente, o metodo consiste em dada uma configuracao nuclear encontrar a densidade

eletronica que minimiza a energia do sistema. Dessa forma, em vez de resolvermos um

problema de N eletrons utilizando-se de 3N coordenadas espaciais e portanto obtendo 3N

equacoes, resolvemos a densidade eletronica com dependencia em 3 coordenadas espaciais!

Dessa forma, a teoria do funcional da densidade e atualmente o metodo escolhido para

o estudo de propriedades estruturais, eletronicas e dinamicas em ciencia dos materiais,

pois fornece a possibilidade de que sistemas relativamente grandes (com 100 atomos ou

mais) sejam abordados em detrimento de outros metodos de primeiros princıpios, alem de

faze-lo em um grau de precisao que pode ser alcancado para diversos sistemas de maneira

sistematica.

Em 1964, Pierre Hohenberg e Walter Kohn publicaram o artigo entitulado “Inhomo-

geneous Electron Gas” [1] que lancou os alicerces da DFT e fez com que Walter Kohn fosse

agraciado com o Premio Nobel de Quımica de 1998 [2]. Nesse trabalho, foi apresentado

dois teoremas que sao os alicerces para o desenvolvimento da DFT.

Teorema A.1 O potencial externo v(r) sentido pelos eletrons e um funcional unico da

densidade eletronica ρ(r).

Demonstracao: A demonstracao desse teorema e baseada na inducao por absurdo.

Imaginemos dois potenciais externos v(r) e v′(r) que levem a mesma densidade eletronica

ρ(r). Assim, sejam ψ e ψ′ os estados fundamentais para sistema sem nao-degenerados

caracterizados pelos hamiltonianos H e H ′, que apresentam a forma geral: H = T+U+ V

(onde U e V sao as energias de interacao eletron-eletron e potencial, respectivamente)

relacionados com os potenciais externos acima citados.

Entao, pelo princıpio variacional (Eq. A.5), temos que para o sistema caracterizado

pelo potencial externo v(r), a energia do sistema sera dada por E0 = ⟨H⟩ = ⟨T + U + V ⟩.Se buscarmos o mınimo de energia para a classe de funcoes ψ′, teremos:

E[ψ′] ≥ E0

onde a igualdade so sera satisfeita caso ψ′ seja a funcao de onda do estado fundamental,

o que contraria a nossa hipotese. Repetindo o procedimento que levou a equacao acima

para o sistema caracterizado pelo potencial externo v′(r), teremos que a energia do estado


fundamental para a classe de funcoes ψ resultara na seguinte desigualdade:

E ′[ψ] ≥ E ′0

assim, para H = H ′ + V − V ′ chegaremos a seguinte conclusao:

E = ⟨ψ| H |ψ⟩ < ⟨ψ′| H |ψ′⟩ = ⟨ψ′| H ′ |ψ′⟩+ ⟨ψ′| V − V ′ |ψ′⟩ (A.19)

de maneira analoga, teremos

E ′ = ⟨ψ′| H ′ |ψ⟩′ < ⟨ψ| H ′ |ψ⟩ = ⟨ψ| H |ψ⟩+ ⟨ψ| V ′ − V |ψ⟩ (A.20)

Se definirmos a densidade eletronica ρ(r) e o potencial V , de maneira usual, tendo as

formas:

ρ(r) = ⟨ψ|N∑i=1

δ(r− ri) |ψ⟩ (A.21)

e

V =N∑i=1

v(ri) (A.22)

entao, teremos

⟨ψ| V |ψ⟩ =N∑i=1

∫d3r1...

∫d3rNψ

∗(r1, ..., rN)v(ri)ψ(r1, ..., rN)

considerando,

v(ri) =

∫d3rv(r)δ(r − ri)

resultara em:

⟨ψ| V |ψ⟩ =N∑i=1

∫d3r

∫d3r1...

∫d3riψ

∗v(r)δ(r− ri)ψ

∫d3ri+1...

∫d3rN


⟨ψ| V |ψ⟩ =∫ρ(r)v(r)d3r (A.23)

Substituindo Eq. (A.23) de maneira sistematica nas Eqs. (A.19) e (A.20), chegaremos

aos seguintes resultados:

E < E ′ +

∫[v(r)− v′(r)]ρ(r)d3r

e

E ′ < E +

∫[v′(r)− v(r)]ρ(r)d3r,

ja que por hipotese, nos consideramos ambos potenciais v(r) e v′(r) levam a mesma

densidade ρ(r). Somando as duas ultimas equacoes, chegaremos a conclusao que:

E + E ′ < E ′ + E (A.24)

que e o absurdo que havıamos previsto que ocorreria, de acordo com a nossa hipotese

inicial, devido ao fato que ψ = ψ′. Assim, esse teorema revela que a densidade ρ(r) do

estado fundamental deve conter as mesmas informacoes que a funcao de onda em questao.

De forma geral, podemos escrever a Eq. (A.21) na forma de um operador

ρ ≡∑i

|ψi⟩ ρii ⟨ψi| (A.25)

onde ρii e um “peso” que caracteriza a densidade dado pela medida de um observavel

O, definido a partir do operador O, tal que a media, ou o valor esperado, desse operador

para funcoes de onda normalizadas, sera:

⟨O⟩=

∑i

ρii ⟨ψi| O |ψi⟩

recorrendo a relacao de fechamento∑b′|b′⟩ ⟨b′|, teremos:


⟨O⟩=

∑i

ρii∑b′′

∑b′

⟨ψi| b′⟩ ⟨b′| O |b′′⟩ ⟨b′′| ψi⟩

⟨O⟩=

∑b′′

∑b′

[∑i

⟨b′′| ψi⟩ ρii ⟨ψi| b′⟩

]⟨b′| O |b′′⟩

⟨O⟩=

∑b′′

∑b′

⟨b′′| ρ |b′⟩ ⟨b′| O |b′′⟩

⟨O⟩=

∑b′′

⟨b′′| ρO |b′′⟩ →⟨O⟩= Tr

(ρO

)(A.26)

em que Tr(ρO) e o traco da matriz formada pelo operador densidade ρ aplicado no

operador O, relativo ao observavel O. Dessa forma, teremos que O = O[ρ(r)], que e uma

das grandes vantagens em se elaborar um formalismo baseado na densidade, pois a medida

do observavel e um funcional da densidade.

Teorema A.2 A energia do estado fundamental E0[ρ] e mınima para a densidade ρ(r)

exata,

E[ρ] = ⟨ψ| T + U + V |ψ⟩ (A.27)

Demonstracao: A prova desse teorema e razoavelmente simples e esta ancorada no

princıpio variacional. De acordo com a Eq. (A.26), temos que a energia e um funcional

da densidade, uma vez que E e o valor esperado do operador hamiltoniano H , onde E =

E[ρ] = Tr(ρH). Pelo princıpio variacional (Eq. (A.5), temos para o estado fundamental

que

E[ρ] ≥ E[ρ0] (A.28)

onde a igualdade e satisfeita quando ρ = ρ0 que leva a ψ = ψ0, em que ρ0 e ψ0 sao a

densidade exata e a funcao de onda do estado fundamental, reciprocamente.

Os teoremas acima apresentados constituem o arcabouco fundamental para a DFT,

uma vez que eles estabelecem: primeiro, a energia e um funcional da densidade, cujo

mınimo de energia do estado fundamental e dado quando a densidade ρ(r) equivale a


exata; segundo, o potencial externo v(r) e funcional unico da densidade eletronica ρr,

ou seja, o potencial externo em questao determina a densidade. Assim, para um sistema

multi-atomico, a solucao eletronica — de acordo com a aproximacao de Born-Oppenheimer

— sera dada considerando um potencial “externo” gerado pela configuracao nuclear. Por-

tanto, se unirmos os dois teoremas, temos que dada a relacao unica entre esse potencial

“externo” e a densidade ρ(r), que deve ser a densidade exata, consequentemente, en-

contraremos a energia mınima do sistema, ou seja a densidade eletronica para um dado

arranjo nuclear que gera um mınimo de energia sera a densidade exata. O grande pro-

blema da DFT consiste justamente no fato de que nao se sabe como construir ab initio

a dependencia do funcional da energia com a densidade ρr exata, portanto recorreremos

a metodos aproximados a saber os mais importantes: Aproximacao Local da Densidade

(LDA, do ingles Local Density Approximation); e Aproximacao do Gradiente Generalizado

(GGA, do ingles Generalized Gradient Approximation).

Para resolver o problema de encontrar a densidade para o sistema de muitos eletrons

interagentes, em 1965, Kohn e Sham [3] demostraram que existe uma equivalencia entre as

densidades eletronicas do sistema real e de um sistema modelo de eletrons nao-interagentes

submetidos ao potencial efetivo, Vef . Dessa forma, obtem-se a densidade eletronica desse

sistema nao-interagente e a correlacionamos com o sistema real. A densidade pode ser

expressa em termos dos orbitais ψi(r) para um eletron, que sao conhecidos com os orbitais

de Kohn-Sham (KS),

ρ =N∑i

|ψi(r)|2 (A.29)

em que a soma e realizada para todos os N eletrons. Como nao sabemos a densidade ρ(r)

exata, de acordo com o segundo teorema de Hohenberg e Kohn apresentado acima (Eq.

A.28), a energia sera

EDFT = minρ(r)

E[ρ(r)] (A.30)

Alem de expressarmos o funcional da energia em termos da densidade (Eq. (A.30)),

podemos faze-lo em termos dos orbitais de um eletron, devido a Eq. (A.29):

EDFT = minψi(r)

EKS[ψi(r) ,

RN

](A.31)


em que EKS pode ser escrito como

EKS =N∑i

∫ψ∗i (r)

(−∇2

2

)ψi(r)d

3r+

∫V (r)ρ(r)d3r+

1

2

∫ ∫ρ(r)ρ(r′)

|r − r′|d3rd3r′+Exc[ρ(r)]

(A.32)

em que Exc[ρ(r)] contem as energias de troca e correlacao de um sistema interagente com

densidade ρ(r). Esse termo nao e universal, dependendo portanto do sistema em questao,

e sua forma funcional exata nao e conhecida. Reescrevamos a Eq. (A.32), considerando

o funcional de energia da seguinte forma:

EDFT =

∫V (r)ρ(r)d3r + T0[ρ] +

1

2

∫ ∫ρ(r)ρ(r′)

|r − r′|d3rd3r′ +

∫ρ(r)Exc[ρ(r)]d

3r (A.33)

e usemos o princıpio variacional, tomando a variacao de E[ρ(r)], com o vınculo da con-

servacao da carga total do sistema

∫ρ(r)d3r = N

De acordo com nossa proposicao Eq. (A.30), de que a energia deve ser um mınimo e

tomando o vınculo acima, teremos:

δ

(EDFT [ρ]− λ

[∫ρ(r)d3r −N

])= 0 (A.34)

que resulta em

∫δρ(r)

δT0δρ

+δV (r)

δρ+ V (r) +

δExcδρ

− λ

d3r

∫δρ(r)

δT0δρ

+

∫ρ(r′)

|r − r′|d3r′ + V (r) + vxc − λ

d3r (A.35)

para o funcional dado por Eq. (A.33). vxc[ρ] e o potencial de troca-correlacao, dado por

vex[ρ] =δExcδρ

(A.36)

Para uma variacao arbitraria da densidade dada por Eq. (A.29), a solucao da Eq.


(A.35) pode ser obtida resolvendo a equacao de Schrodinger para uma partıcula submetida

ao potencial efetivo de Kohn-Sham (vKS):

hKSψi(r) = εiψi(r) →(−1

2∇2 + vKS[ρ]

)ψi(r) = εiψi(r) (A.37)

ou

(−1

2∇2 +

∫ρ(r)

|r − r′|d3r + V (r) + vxc[ρ]

)ψi(r) = εiψi(r) (A.38)

Vemos das Eqs. (A.37) e (A.38) que vKS depende da densidade ρ e esta, por sua vez,

depende do potencial vKS, devido a definicao da densidade dada pela Eq. (A.29). Dessa

forma, a solucao da equacao de Kohn-Sham se apresenta como um esquema autoconsis-

tente, que pode ser resumido pelo fluxograma mostrado na Fig. ??. Alem dessa auto-

consistencia, temos que vKS depende do potencial de troca-correlacao vxc (Eq. (A.36)).

Todos os termos da Eq. (A.38) podem ser calculados de forma exata, exceto vxc[ρ(r)]

obtido a partir de Eq. (A.36) para o qual a DFT nao fornece uma forma explıcita, de-

monstrando apenas que existe uma expressao universal para a energia de troca-correlacao

Exc

Exc[ρ(r)] =

∫ρ(r)εxc[ρ(r)]d

3r (A.39)

e e para a determinacao desse termo que entram os metodos aproximados que serao

discutidos a seguir: LDA e GGA.

Para obtermos o valor da energia total do sistema em funcao dos autovalores εi,

faremos uso das equacoes de KS (A.37), de forma que multiplicando a esquerda da Eq.

(A.38) por ψ∗i , integrando em todo espaco e somando sobre todos os orbitais ocupados,

teremos para funcao de onda normalizada (∫ψ∗iψid

3r):

N∑i

∫ψ∗i

(−1

2∇2 +

∫ρ(r)

|r − r′|d3r + V (r) + vKS[ρ]

)ψi(r)d

3r =N∑i

∫εiψ

∗iψi(r)d

3r

(A.40)

que resulta em


T0[ρ(r)] +

∫V (r)ρ(r)d3r +

∫ ∫ρ(r)ρ(r′)

|r − r′|d3rd3r′ +

∫vxc[ρ]ρ(r)d

3r =N∑i

εi (A.41)

Se compararmos a equacao acima com o funcional de energia semelhante a Eq. (A.30):

E[ρ] =

∫V (r)ρ(r)d3r + T0[ρ(r)] +

1

2

∫ ∫ρ(r)ρ(r′)

|r − r′|d3rd3r′ +

∫ρ(r)εxc[ρ]d

3r (A.42)

obteremos que a energia escrita em funcao dos autovalores εi sera dada por:

E[ρ] =N∑i

εi −1

2

∫ ∫ρ(r)ρ(r′)

|r − r′|d3rd3r′ +

∫ρ(r)εxc[ρ]− vxc[ρ]d3r (A.43)

A.3.1 Aproximacao da Densidade Local

A base da LDA esta em considerar a energia de troca-correlacao Exc para um sistema

de densidade ρ(r) como sendo a energia de troca-correlacao para um gas de eletrons

uniforme com a mesma densidade, que e conhecida de forma precisa. Ainda, ela supoe

que a densidade ρ(r) varia suavemente nas proximidades de r, ou seja, a energia de troca-

correlacao de um eletron em um dado ponto depende da densidade eletronica nesse ponto,

em vez de depender da densidade eletronica em todos os pontos do espaco. Dessa forma,

a energia de troca-correlacao sera escrita como:

Exc[ρ(r)] =

∫ρ(r)εhxc[ρ(r)]d

3r (A.44)

e o potencial vxc

vex[ρ(r)] =d

dρ(r)

(ρ(r)εhxc[ρ(r)]

)(A.45)

Uma das sugestoes para o calculo da Exc, e separar os termos de troca (que para o

caso do gas homogeneo pode ser obtido facilmente) e de correlacao, e assim teremos

Exc[ρ(r)] ≈ ELDAxc [ρ(r)] =

∫ρ(r)εx[ρ(r)] + εc[ρ(r)]d3r (A.46)


Uma extensao da LDA para casos nao restritos ou para sistemas de camadas abertas

(ou seja, sistemas em que a configuracao eletronica apresenta eletrons nao-emparelhados)

leva a Aproximacao da Densidade de Spin Local (LSDA, do ingles Local Spin-Density

Approximation). Para incluir esse efeito, consideraremos a funcao do spin ξ(σ), que pode

ser escrita como de forma semelhante a Eq. (A.9). Assim, a Eq. (A.44) fica:

ELSDAxc [ρα(r), ρα(r)] =

∫ρ(r)εxc[ρα(r), ρα(r)]d

3r (A.47)

em que uma correcao analoga a Eq. (A.46) pode ser feita. Ainda, pode-se usar a

distribuicao de densidade de spin para descrever onde eletrons α(↑) e β(↓) estao localizadosem um dado sistema, ou seja, calcular a diferenca ρα(r) − ρβ(r). Assim, em um sistema

em que todos os eletrons estao emparelhados, a densidade de spin e zero em todos os

pontos no espaco, enquanto que qualquer sistema que contenha eletrons desemparelhados

ira mostrar regioes de densidade de spin nao nulas. A integral da densidade de spin em

todo o espaco

∫[ρα − ρβ] d

3r

fornece o numero total de eletrons desemparelhados (por exemplo, zero para o estado

singleto, um para o dubleto, dois para o tripleto, a assim por diante).

A.3.2 Aproximacao do Gradiente Generalizado

Em sistemas que apresentam inomogeneidades significativas na densidade eletronica

ρ, metodos baseados na aproximacao local da densidade (LDA e LSDA) nao oferecem

a precisao desejada (como ocorre para a maior parte das aplicacoes na quımica e na

biologia), levando a erros de forma nao sistematica, por exemplo, no comprimentos e nas

energias de ligacao. Um avancoo no sentido de resolver essas pendencias que a LDA deixa

consiste em introduzir a dependencia com o gradiente da densidade ρ(r) na expressao do

funcional dado pela Eq. (A.44). Para um sistema de camada aberta, esse funcional pode

ser genericamente escrito da seguinte forma:

EGGAxc [ρα, ρβ] =

∫f [ρα, ρβ,∇ρα,∇ρβ]d3r (A.48)

Tambem no formalismo da GGA, o funcional EGGAxc e geralmente dividido em duas


partes, uma contendo os termos do funcional de troca EGGAx e a outra, do funcional de

correlacao EGGAc . No artigo de Filippi et. al. [4] e feita uma comparacao entre funcionais

de densidade exatos e aproximados para um modelo que pode ser resolvido exatamente,

usando alguns dos funcionais mais utilizados.

Existem tambem os chamados funcionais hıbridos, que sao formados a partir de uma

mistura de uma fracao do termo de troca de Hartree-Fock no funcional de troca da DFT, a

partir de dados experimentais para sistemas moleculares conhecidos, contendo parametros

ajustaveis. O uso desses funcionais faz com que alguns autores questionem a DFT como

sendo uma teoria de primeiros princıpios ou ab initio. Para referencia, podemos citar

alguns dos funcionais mais conhecidos:

PBE - baseado nos trabalhos de Perdew, Burke e Erzenhof [5, 6];

BLYP - combinacao do termo de troca desenvolvido por Becke [7] com o de cor-

relacao, por Lee-Yang-Parr [8];

BP86 - combinacao do termo de troca de Becke [7] e o de correlacao dado por

Perdew [9];

B3LYP - termo de troca exato desenvolvido por Becke [10];

PW91 - aproximacao do gradiente generalizado desenvolvido por Perdew-Wang

[11].

Embora o uso da GGA melhore consideravelmente a descricao de ligacoes (principal-

mente ligacoes de hidrogenio) quando comparado com a LDA sem que haja um aumento

proibitivo do custo computacional, a descricao de ligacoes fracas (e.g. interacoes de van

der Waals) permanece problematica.

A.4 Conjuntos de Bases

Nas secoes anteriores, mostramos que os metodos aproximativos para solucao do pro-

blema de um sistema multi-eletronico e multi-nuclear levam a equacoes que sao resol-

vidas de forma autoconsistente, Eqs. (A.17), (A.18), (A.37), (A.38) e Fig. ??. Uma

lacuna, entretanto, ficou aberta ate aqui, pois o processo autoconsistente reside tambem

no fato de que os operadores (no caso do Hartree-Fock) e dos funcionais (no caso da DFT)

apresentam dependencia com a funcao de onda, de forma que a situacao e de que para

A.4 Conjuntos de Bases 139

construirmos esses operadores e funcionais para encontrarmos a funcao de onda, precisa-

mos conhece-la de antemao. A autoconsistencia tambem serve, entao, para otimizarmos

a funcao de onda na medida em que se minimiza a energia, ou a densidade, no caso da

DFT.

Em geral, supoe-se que a funcao de onda para um dado sistema apresente alguma

simetria que possa facilitar os calculos, de acordo com a simetria do proprio sistema. E

desejavel, principalmente, que se possa escolher a funcao de onda com parametros que

sejam ajustaveis durante a autoconsistencia. De acordo com cada metodologia, existem,

por exemplo para a DFT, duas formas de se estimar a funcao de onda: (i) Orbitais

Numericos, em que se calcula previamente as funcoes de onda para os orbitais atomicos

e os utiliza para construir os orbitais moleculares, e.g. construcao da densidade a partir

dos orbitais em Eq. (A.29); (ii) Conjuntos de Bases, em que as funcoes de onda ψi(r) (ou

os orbitais de Kohn-Sham) sao expandidas em um conjunto de base ϕij(r),

ψi(r) =∑j

cjϕij(r) (A.49)

A expansao acima deve ser, em princıpio, realizada ate o infinito, mas ela e sempre

truncada, de forma que apenas um conjunto limitado de funcoes de base e usado. Uma

das funcoes mais utilizadas em expansoes desse tipo, sao funcoes gaussianas, de forma

que a expansao (A.49) sera dada por:

ψi(r) =∑j

cje−αjr

2

(A.50)

A precisao do calculo dada pela expansao para um determinado conjunto de base,

e. g. a base gaussiana (A.50) depende do numero de funcoes que sao usadas para re-

presentar cada momentum angular atomico e do “espalhamento” da funcao gaussiana,

dado pelo valor do expoente α (valores grandes/pequenos de α resultam em funcoes com-

pactas/difusas). Varias notacoes sao utilizadas para especificar um conjunto particular

funcoes atomicas gaussianas, tais como o conjunto de base de valencia dividida de Pople

(e.g., 3− 21G, 6− 31G ou 6− 311++G(2d; 2p)) ou os conjuntos de base N-zeta valencia

polarizada consistente-correlacionada de Dunning (N = duplo, triplo, etc., e.g., cc-pVDZ,

cc-pVTZ) dentre outros.

Outra forma de se determinar os orbitais de KS, esta no conjunto de base obtido com

a expansao em ondas planas (OP) para sistemas periodicos (cristais),


ψi(r) =1

Ω1/2

Gmax∑G

GeiG·R, (A.51)

onde Ω e o volume da celula e G e o momentum de ondas. Conjuntos de bases de

OP sao denotadas por um valor de energia Ecut relacionado com o maximo valor de G da

expansao (A.51).

As ondas planas, diferentemente das funcoes gaussianas, nao sao centralizadas nos

atomos, mas se estendem por todo o espaco. De maneira a reduzir o grande numero de

ondas planas necessarias para encontrar uma descricao confiavel dos orbitais de KS, os

efeitos dos eletrons de caroco sao usualmente descritos em termos de pseudopotenciais

[12, 13, 14]. Com o uso de pseudopotenciais, as funcoes de onda sao analisadas de forma

diferente, em que os atomos sao descritos por eletrons de valencia ligados a um nucleo

ionico e nesse formalismo e considerado que as propriedades de moleculas e solidos sao

calculadas partindo do princıpio que os nucleos ionicos nao estao envolvidos em ligacoes

quımicas e nao se modificam com mudancas estruturais.

De forma a contornar o fato de que o conjunto de base aumenta consideravelmente

quando todos os eletrons sao tratados explicitamente, a aproximacao por pseudopotenciais

substitui os eletrons de caroco e o potencial Coulombiano forte por um pseudopotencial

fraco que atua em um conjunto de pseudo-funcoes de onda, e que podem ser representados

por um numero baixo de coeficientes de Fourier. Na realidade, pseudopotenciais sao

construıdos de forma a reproduzir com alta fidelidade as propriedades de espalhamento

do potencial ionico completo. De forma geral, os pseudopotenciais podem ser descritos

na forma:

VNL =∑

|lm⟩Vl |lm⟩ (A.52)

onde |lm⟩ sao os harmonicos esfericos e Vl e o pseudopotencial para o momento angu-

lar l. Pseudopotenciais sao usualmente classificados quanto a dureza, relacionado com o

numero de componentes de Fourier que sao necessarios para descreve-los, de forma que

quanto menor for esse numero mais “macio” e considerado o pseudopotencial. De forma

geral, espera-se que esse tipo de aproximacao reproduzam a densidade de cargas associ-

ada com ligacoes quımicas exatamente e, para isso e necessario que as funcoes de onda

tanto pseudo quanto para todos os eletrons sejam identicas a partir de um raio de corte

(relacionado com o “tamanho” do nucleo ionico). Para isso e necessario que as integrais

de amplitude quadrada das duas funcoes sejam as mesmas, ou seja, a norma da pseudo

A.4 Conjuntos de Bases 141

funcao de onda seja conservada. Na linha contraria a essa abordagem, Vanderbilt [50]

sugeriu um formalismo em que a condicao de conservacao da norma seja relaxada de

forma a se obter pseudopotenciais bem mais macios. Nesse esquema, as pseudo funcoes

de onda sao permitidas de serem as mais macias possıveis, resultando em uma diminuicao

dramatica nas energias de corte necessarias. Essas sao basicamente as duas abordagens

de pseudopotenciais que foram utilizadas nessa tese.

A precisao da DFT nao depende, em princıpio, do tipo de conjunto de base utilizado

(gaussiana, ondas planas, ou qualquer outra), uma vez que a expansao e suficientemente

completa para descrever as propriedades relevantes do sistema sob investigacao.

143

Referencias

[1] HAMANN, DR.

[2] KOHN, W. Nobel Lecture: Electronic structure of matter-wave functions and densityfunctionals. Reviews of Modern Physics, v. 71, n. 5, p. 1253–1266, 1999.

[3] KOHN, W.; SHAM, L. J. Self-consistent equations including exchange and correlationeffects. Physical Review, v. 140, p. 1133A, 1965.

[4] FILIPPI, C.; UMRIGAR, C. J.; TAUT, M. COMPARISON OF EXACT AND AP-PROXIMATE DENSITY FUNCTIONALS FOR AN EXACTLY SOLUBLE MODEL.Journal of Chemical Physics, v. 100, n. 2, p. 1290–1296, 1994.

[5] PERDEW, J. P.; BURKE, K.; ERNZERHOF, M. Generalized gradient approximationmade simple. Physical Review Letters, v. 77, p. 3865, 1996.

[6] PERDEW, J. P.; BURKE, K.; ERNZERHOF, M. Generalized gradient approximationmade simple (vol 77, pg 3865, 1996). Physical Review Letters, v. 78, n. 7, p. 1396–1396,1997.

[7] BECKE, A. D. DENSITY FUNCTIONAL CALCULATIONS OF MOLECULAR-BOND ENERGIES. Journal of Chemical Physics, v. 84, n. 8, p. 4524–4529, 1986.

[8] LEE, C. T.; YANG, W. T.; PARR, R. G. DEVELOPMENT OF THE COLLE-SALVETTI CORRELATION-ENERGY FORMULA INTO A FUNCTIONAL OFTHE ELECTRON-DENSITY. Physical Review B, v. 37, n. 2, p. 785–789, 1988.

[9] PERDEW, J. P. DENSITY-FUNCTIONAL APPROXIMATION FOR THECORRELATION-ENERGY OF THE INHOMOGENEOUS ELECTRON-GAS. Phy-sical Review B, v. 33, n. 12, p. 8822–8824, 1986.

[10] BECKE, A. D. A NEW MIXING OF HARTREE-FOCK AND LOCAL DENSITY-FUNCTIONAL THEORIES. Journal of Chemical Physics, v. 98, n. 2, p. 1372–1377,1993.

[11] PERDEW, J. P. et al. Atoms, molecules, solids, and surfaces: Applications of thegeneralized gradient approximation for exchange and correlation. Physical Review B,v. 46, p. 6671, 1992.

[12] PICKETT, W. E. PSEUDOPOTENTIAL METHODS IN CONDENSED MATTERAPPLICATIONS. Computer Physics Reports, v. 9, n. 3, p. 115–197, 1989.

[13] VANDERBILT, D. Soft Self-Consistent Pseudopotentials in a Generalized EigenvalueFormalism. Physical Review B, v. 41, n. 11, p. 7892–7895, 1990.

144 Referencias

[14] HAMANN, D. H2O hydrogen bonding in density-functional theory. PHYSICAL RE-VIEW B, 55, n. 16, p. 10157–10160, 1997.

145

ANEXO B -- Publicacoes

Sobre o tema desenvolvido nesta tese, foi submetido o seguintes artigos:

Ito L. Barroso-Neto, Joao Paulo C. Marques, Roner F. da Costa, Ewerton W.S.

Caetano, Benildo S. Cavada, Carmem Gottfried, Eudenilson L. Albuquerque, Valder

N. Freire: Inactivation of ovine cyclooxygenase-1 by bromoaspirin and aspirin: a

quantum chemistry description.

R. F. da Costa, V. N. Freire, E. M. Bezerra, B. S. Cavada, E. W. S. Caetano, J.

L. de Lima Filho, E. L. Albuquerque: Explaining Statin Inhibition Effectiveness of

HMG-CoA Reductase by Quantum Biochemistry Computations.

1

EXPLAINING STATIN INHIBITION EFFECTIVENESS OF HMG-COA

REDUCTASE BY QUANTUM BIOCHEMISTRY COMPUTATIONS*

Roner F. da Costa

1, Valder N. Freire

1, Eveline M. Bezerra

2, Benildo S. Cavada

3,

E. W. S. Caetano4, José L. de Lima Filho

5, Eudenilson L. Albuquerque

6

From the 1Department of Physics at Federal University of Ceará, 60455-760 Fortaleza, CE, Brazil; 2Sobral Medicine Faculty at Federal University of Ceará, 62042-280 Sobral, CE, Brazil; 3Department of Biochemistry at Federal University of Ceará, 60455-760 Fortaleza, CE, Brazil;

4Federal Institute of Education, Science and Technology, 60040-531 Fortaleza, CE, Brazil; 5Keizo Azami Imunopatology Laboratory at Universidade Federal de Pernambuco, 50670-901

Recife, PE, Brazil, and the 6Department of Biophysics and Pharmacology, at Federal University of Rio Grande do Norte, 59072-970 Natal, RN, Brazil.

Running title: Explaining statins inhibition by quantum biochemistry Address correspondence to: Valder N. Freire, Laboratório ABINITIO, Departamento de Física

UFC, 60455-760 Fortaleza, Ceará, Brazil, E-mail: [email protected]

2

By taking advantage of the

crystallographic data of 3-hydroxy-3-

methylglutaryl coenzyme A reductase

(HMGR) complexed with statins, a

quantum biochemistry study is performed

to estimate the interaction energy for each

statin when one consider binding pockets

of different radii. Assuming a correlation

between statin potency and the strength of

the total HMGR-statin binding energy,

clinical data as well as IC50 values of these

cholesterol-lowering drugs are successfully

explained only after stabilization of the

calculated total binding energy for a larger

size of the ligand-interacting HGMR

region, at least a radius of 12.0 Å.

Furthermore, partial shielding of some

amino acid residues far away the statins

must be taken into account to be achieved

an adequate picture of the stability of the

statin-HGMR complex. Actually, the

binding pocket radius suggested by classic

works, which was based solely on the

interpretation of crystallographic data of

the HMGR-statin complex, is smaller than

the necessary to be achieved total binding

energy convergence in our simulations.

Thus, important residues (E665, D767, and

R702) contributing to the HMGR-statin

binding are disregarded, which implies

that the statin inhibition effectiveness of

HMGR cannot be satisfactorily explained

for binding pocket radii smaller than 12.0

Å. As a matter of fact, after the total

interaction energy convergence

atorvastatin and rosuvastatin are shown to

be the most strongly bound HMGR

inhibitors, simvastatin and fluvastatin are

the weakest ones, while cerivastatin and

mevastatin have intermediate interaction

energies. Atorvastatin, rosuvastatin,

simvastatin, and fluvastatin interact with

residues at the HMGR binding pocket

showing a variation of the binding energy

that follows the sequence of attractive

(repelling) residues K735 > R590 > K692 >

K691 > R702 > R568 (E665 > D767 > D690

> E559). A binding site, interaction energy

between residues and statin atoms, and

residues domain (BIRD) panel is

constructed, indicating clear quantum

biochemistry-based routes for the

development of new statin derivatives.

Cardiovascular diseases will become the

major cause of decreasing productive years worldwide by 2020, which is due to the decline in communicable diseases and adoption of certain insalubrious Western habits as fatty diets, tobacco use, and lack of exercise (1, 2, 3). The three major manifestations of cardiovascular diseases are coronary heart (including myocardial infarction and angina), cerebrovascular (transient ischemia and stroke), and peripheral arterial disease. While some risk factors cannot be controlled (e.g. age, gender and ethnicity), others like smoking, obesity, hypertension, and hyperlipidemia can be modified, treated or controlled. As a matter of fact, the risk of cardiovascular diseases can be reduced by cholesterol lowering drugs, changes in lifestyle (such as smoking cessation and exercising), the use of cholesterol lowering diets, as well as non-cholesterol drug treatments (including aspirin and antihypertensives) (4). Hundreds of millions of adults have high cholesterol, which has generated a billionaire market of drugs devised to reduce and control the total serum cholesterol levels (5). Regarded as gifts from nature (6), statin drugs are the most effective ones, although recently there is also a renaissance of non-statins as physicians hope to achieve the same efficacy of higher statin doses without the risk of adverse effects by prescribing non-statin (ezetimibe, niacin) drugs with lower statin doses (5). Patents covering the leading statins have expired recently (Lipitor in 2010) or are expiring (Lescol in 2011, Crestor in 2012), which pressures the development of new drugs for the hypolipidaemic market, in particular new and more effective statins derivatives (5).

Statins act by inhibiting the 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase in the process of converting HMG-CoA to mevalonate (7), a committed step in the biosynthesis of cholesterol. It is observed in clinical trials that this action decreases by 20-60% the low density protein (LDL) cholesterol levels, reducing coronary events

3

by up to one-third over a five year period; statins also reduce the high density lipoprotein (HDL) cholesterol levels on the order of 5-8% (8). Human HMG-CoA reductase (HMGR) consists of a single polypeptide chain of 888 amino acids. The amino-terminal 339 residues are membrane bound and reside in the endoplasmic reticulum membrane, while the catalytic activity of the protein resides in its cytoplasmic, soluble C-terminal portion (residues 460-888). A linker region (residues 340-459) connects the two portions of the protein (9, 10, 11). X-ray diffraction data of 2.2 Å resolution shows that the catalytic portions of HMGR are constituted of the residues 426-888, forming a tetramer whose quiet similar monomers are arranged in two dimers, each of which has two active sites, as shown in Fig. 1 (9). The HMGR monomers have a N-terminal (residues 460-527), a large L-domain (residues 528-590 and 694-872), and a small S-terminal (residues 592-682) domain.

The elucidated structures of HMGR co-crystallized with six statins (compactin, simvastatin, fluvastatin, cerivastatin, atorvastatin, and rosuvastain) demonstrate that the HMGR-binding pocket is located between the L- and S-domains, and suggest that twenty one residues from neighboring monomers (including those of the cys-loop) contribute to the binding: E559 (E=Glutamic Acid), C561 (C=Cysteine), L562 (L=Leucine), S565 (S=Serine), R568 (R=Arginine), R590, V683 (V=Valine), S684, N686 (N=Asparagine), C688, D690 (D=Aspartic Acid), K691 (K=Lysine), K692, K735, H752 (H=Histidine), N755, D767, S852, L853, A856 (A=Alanine), L857 (9, 10, 11). Besides, through an analysis of the distance and type of interaction between the residues and atoms of a statin, works based on HMGR-statin crystallographic data suggest and is largely accepted that the most important residues in the binding pocket are S684, D690, K692 (polar interactions); E559, D767 (hydrogen bonds); and L562, V683, L853, A856, L857 (van der Waals contacts) (10, 11). As highlighted by Istvan and Deisenhofer (10), the innate flexibility of the

COOH-terminal region of HMGR is fortuitously exploited by statins to create a binding site for the inhibitor molecules, and a comparison between the six complex structures illustrates subtle differences in the HMGR-statins modes of binding.

Structural differences in statins may partially account for variations in potency of HMGR inhibition (10, 11). Actually, there are several main statins and they differ in their ability to decrease the cholesterol level and in their side effects: lovastatin (C24H36O5) and pravastatin (C23H16O7), are used currently to decrease the LDL level by less than 30%; simvastatin (C25H38O5) is used in 20mg or 40mg tablets to decrease the LDL level by 30% or more, and/or when the patient had heart disease and diabetes, heart attack or acute coronary syndrome, and when the LDL levels are not high; atorvastatin (C33H35FN2O5), is used in 40 mg or 80mg tablets if the LDL level is elevated, and the patient had heart attack or acute coronary syndrome; rosuvastatin (C22H28FN3O6S), which is the highest potency statin present on the market, with very similar over all toxicity profile to the other statins, but with indications still being actively developed, being accepted that 20 mg daily almost halves the relative rate of venous thromboembolic disease; fluvastatin (C24H26FNO4), which is effective for secondary prevention of cardiac events in patients following coronary intervention procedures, and for primary prevention of cardiac events in renal transplant recipients; cerivastatin, withdrawn in 2001 due to its excessive toxicity (reports of fatal rhabdomyolysis); compactin or mevastatin (C23H34O5), the first potent statin to be found that inhibited HMGR, but never reached the market due to adverse toxic effects observed during preclinical trials; and pitavastatin (C25H24FNO4), which can consistently increase HDL cholesterol (1025%), especially in patients with HDL lower than 40 mg/dl, in addition to strong reducing LDL cholesterol (40%), being most likely appropriate for patients with metabolic syndrome with high LDL, low HDL and diabetes mellitus (4).

4

The inhibitory concentration value, IC50, measures how effective a drug is in inhibiting the biological function of its target or, more precisely, what is the concentration of drug required to block a biological process by half. The range of inhibitory concentration values of some statins are: atovartastin, 3.8-6.2 nM; rosuvastatin, 2.1-5.4 nM; cerivastatin, 2.8-10.0 nM; simvastatin, 4.3-18.0 nM; mevastatin, 23 nM; and fluvastatin, 3-28 nM - data from refs. (11). Investigations on the inhibition kinetics and the microcalorimetric analysis (including isothermal titration calorimetry) of pravastatin, fkuvastatin, cerivastatin, atorvastatin, and rosuvastatin (12) showed binding enthalpies to the HMGR ranging between 0 (fluvastatin) and -9.3 kcal/mol (rosuvastatin) at 25oC. Rosuvastatin exhibited the strongest binding, showing Gibbs energy ΔG of about -12.3 kcal/mol, followed by cerivastatin, with ΔG≈-11.3 kcal/mol and atorvastatin (ΔG≈-10.8 kcal/mol).

Notwithstanding the very intense research on the mechanisms of drug binding, a clear understanding on the details of the drug interaction with their macromolecular targets is missing. Such an understanding is critical to describe and design new drugs with more efficient inhibitory action, resistance to mutations, and with less collateral effects. The many roles of computation in drug discovery mainly focus on virtual screening, de novo design, evaluation of druglikeness in the docking and molecular dynamics framework (13). Computational modeling of statins and others inhibitors of human HMGR was performed mainly through docking. In fact, a structure-based search for potential novel inhibitors of human HMGR was carried out by Zhang et al. (14) combining CoMFA 3D QSAR modeling and virtual screening, finding a representative set of eight new compounds of non-statin-like structures with high IC50 values. However, only atoms located within a radius of 6.5 Å from any atom of ligands of the protein ensemble structures were took into account to build the active site. Computer-aided molecular design tools, i.e., flexible docking, virtual screening in large data bases, and molecular interaction

fields were employed by Da Silva et al. (15) to propose novel potential HMGR inhibitors that are promising for the treatment of hypercholesterolemia. Molecular docking methods were used also to investigate nineteen HGMR inhibitors, being performed a comparison of their hypolipidemic efficacies, and observed that among them that benzoic acid, catechin, hydroxycitric acid and piperine have similar in silico properties to atorvastatin (16). However, a box of only 5Å × 5Å × 5Å was created for the simulations, and the strength of local interactions was not estimated (16).

On the other hand, quantum chemistry methods, often described as ab initio since they work without using empirical parameterizations, are being used for simulation of molecular systems with up to hundreds or even thousands of atoms (in the last case, using supercomputers). A detailed understanding of the ligand pathway actions leading to its bonding to HMGR residues in the binding pocket at the quantum biochemistry level of description (17) is important and depends on the evaluation of the contributions of each amino acid residue to the total binding energy, allowing for the design of new ligand derivatives. As emphasized by Zhou et al. (18), quantum mechanical (QM) methods are becoming popular in computational drug design and development mainly because high accuracy is required to estimate (relative) binding affnities. According to Raha et al. (19), the routine use of QM methods in all phases of in silico drug design is of upmost importance for the evolution of this feld. In this aspect, theoretical calculations using quantum semiempirical and quantum ab initio approaches are very useful, as they allow one to compute the binding interaction at the atomic level, guiding the experimental design of new and more potent drugs. However, as the macromolecules involved (in general, proteins) are very large, it is necessary to achieve a compromise between the computational cost of the calculations and the accuracy required to obtain trustful results.

The use of quantum biochemistry methods has been adopted in several recent

5

works describing protein-drug interactions with insightful results (20, 21, 22, 23, 24). For example, Zhang et al. (25) reported a full quantum mechanical map of the protein-ligand binding of the β-tripsin/benzamidine complex. Hoffman and Nowosielski have used Density Functional Theory calculations (DFT) to investigate the hydroxy acid-lactone interconversion of atorvastatin (26), finding results supporting previous experimental data on the pH-dependent character of this process. Other works report the use of quantum biochemistry methods to describe the interaction of macrocyclic inhibitors to human β-thrombin (27) and to investigate how they perform to describe the energetics of a collagen model peptide (28). Recently, the aromatic interactions in the binding of ligands to a truncated HMGR was studied by Kee et al. (29), using several DFT methods and MP2, showing that local DFT methods match MP2 energy values for aromatic binding better than hybrid or gradient-corrected DFT methods. Kee et al. (29) have emphasized that statins primarily use dipole/dipole and hydrogen bonds to bind to the active site of the reductase, focusing on the portion of the active site dominated by lysine 691 (K691), lysine 692 (K692), aspartic acid 690 (D690), and serine 684 (S684), with minimal explicit incorporation of hydrophobic side-chain interactions. Kee et al. (29) also have suggested that π-π stacking aromatic interaction between statins and HMGR deserves more attention in the design of drugs the inhibit the action of this enzyme, and that unexploited protein-ligand interaction between tyrosine residue 479 and HMGR can be important in the design of future statin drugs.

In this work, we take full advantage of the published crystallographic data of HMGR complexed with statins (10) to perform computer simulations, within an ab initio quantum mechanical approach and in the framework of the molecular fractionation with conjugate caps (MFCC) strategy (22), to investigate the details of the binding interaction of the statins atorvastatin (A, PDB ID 1HWK, see Fig. 1), rosuvastatin (R, 1HWL), fluvastatin (F, 1HWI), cerivastatin

(C, 1HWJ), mevastatin (M, 1HW8), and simvastatin (S, 1HW9) to the HMGR enzyme. The purpose is to elucidate why statins have differences in their effciency to reduce cholesterol levels by obtaining and comparing the interaction energy between the HMGR residues and ligand atoms. The binding pocket size radius (r, defined as the distance to the centroid of the ligand) used to estimate interaction energies was varied from 3.0 to 12.0 Å, and a profile of the interaction energy with r was obtained for each HMGR-statin complex. The total binding energy of the six important statins to HMGR is estimated, successfully explaining why rosuvastatin and atorvastatin are the most effective HMGR inhibitors, and simvastatin and fluvastatin the less effective ones. The most relevant amino acid residues attracting (repelling) the statin ligands are, ordered by decreasing absolute value of the interaction energy: K735 > R590 > K692 > K691 > R702 > R568 (E665 > D767 > D690 > E559). We also show that using a binding pocket radius size smaller than 9.5 Å is not enough to reach a well converged interaction energy. In truth, the total HMGR-statin complex energy is well converged only when residues in the 9.5-12.0 Å radius range are taken into account. Thus, it is shown here that important HMGR residues binding to statin ligands such as E665, D767, and R702 were not considered in previous works (9, 10, 11, 14, 15).

METHODS

First-Principles Calculations - The X-ray diffraction data of reference (10) provides the structures of HMG-CoA reductase complexed with statins with a resolution of 2.2 Å at high and neutral pH. These structures were used as inputs for the calculations, the interaction energy of the active site being defined by taking into account all amino acid residues inside a radius of approximately 5 Å centered at the statin molecule, which resulted in a set of thirty three amino acid residues for all binding sites investigated. This radius was chosen after perform a convergence study of the total binding energy, increasing the radius

6

from smaller values, starting at 3 Å. The atomic positions of the non-hydrogen atoms at the binding pocket (including those belonging to the statin molecules) were kept fixed, while the hydrogen atomic positions were initially optimized by using the consistent valence force field (CVFF), which has parameters specific for amino acids. Afterwards, simulations within the Density Functional Theory formalism using the Local Density Approximation for the exchange-correlation functional (DFT/LDA) were carried out using the Dmol3 code (30, 31). It is well known that pure DFT methods are unable to accurately describe systems where non-covalent interactions, such as van der Waals forces, are relevant (32, 33, 34, 35). Besides, the LDA approximation is not the best option to give a good description of hydrogen bonds. However, some DFT studies of layered crystals such as graphite as well as guanine hydrated crystals (36, 37, 38) have pointed out that the local density approximation (LDA) gives reasonable values for atomic distances due to a cancelation of errors. Besides, Kee et al. (29) have investigated aromatic interactions in the binding of ligands in the active site of HGMR, showing that the LDA functional has a better agreement with the more sophisticated MP2 method in comparison with generalized-gradient and hybrid functionals. Taking into account all these facts and the need to achieve the best balance between computational cost per simulation run and the size of the drug-protein binding site complex investigated (which involves tens of amino acid residues), as well as the dominant character of noncovalent dispersive forces present therein, we have opted for the LDA XC to estimate the strength of the drug-amino acid residue intermolecular interaction energies. So, the figures for the total and interaction energies between the statins and the HMGR residues in the binding pocket should be better recognized as good estimates, furnishing and improved picture of the general behavior tendencies instead of very precise values to be compared with experimental data.

A double numerical plus polarization (DNP) basis set was chosen to expand the electronic Kohn-Sham orbitals taking into account all electrons explicitly and with unrestricted spin. The DNP basis set has accuracy equivalent to the 6-311+G(3df,2pd) gaussian basis set (30, 31, 39), with neglectful basis set superposition error (BSSE). The orbital cutoff radius for this basis set was set to 3.7 Å and the self consistent field convergence threshold was adjusted to 10-6 Ha. The hydrogen atomic positions of the system formed by the statin molecule and the HMG-CoA binding pocket were optimized classically were optimized again using the DFT approach, with convergence tolerances set to 10-5 Ha for the maximum force per atom and 0.005 Å for the maximum atomic displacement. Interaction energies between each statin molecule and neighbour amino acid residues at the binding pocket of HMG-CoA reductase were estimated by using the MFCC (molecular fractionation with conjugate caps) strategy (22). The interaction (binding) energy between the statin molecule S and the amino acid residue Ri, is given by E(S-Ri): E(S-Ri) = E(S-Ci-1RiCi+1) - E(Ci-1RiCi+1) - E(S-Ci-1Ci+1) + E(Ci-1Ci+1) (1) where the Ci cap is obtained by attaching a carboxyl or amine group to the dangling bond of the residue Ri. At the right side of Eq. (1), E(S-Ci-1RiCi+1) is the total energy of the system formed by the statin and the capped residue; the E(Ci-1RiCi+1) term is the total energy of the capped residue alone; E(S-Ci-1Ci+1) is the total energy of the system formed by the statin molecule and the caps alone. Finally, E(Ci-1Ci+1) is the total energy of the system formed only by the molecular caps. The total binding energy of each statin is obtained by adding the binding energies with each one of the thirty three amino acid residues taken into account within the effective interaction radius of 5 Å. If the interaction of the statin molecule S with the amino acid residue Ri is shielded by the amino acid residue Rj, the total energy between S and Ri is estimated as follows.

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First, we perform a MFCC calculation to obtain the interaction energy between S and the Ri and Rj residues together (denoted here by E(S-RiRj)). In this case, Ri and Rj are capped using the same methodology described in the last paragraph. Afterwards, we calculate the interaction energy between S and Rj, without taking into account Ri(E(S-Rj)). Finally, we estimated the shielded interaction energy E’(S-Ri) by evaluating the difference between E(S-RiRj) and E(S-Rj):

E’(S-Ri) = E(S-RiRj) - E(S-Rj) (2) The binding energy panel BIRD – The binding energy of the amino acid residues interacting with the statins, being through the graphic panel BIRD (see Fig. 6). BIRD is an acronym of the keywords binding site, interaction energy and residues domain, and shows clearly: (i) the binding energy (in kcal/mol) of the residue to one or more atoms of each statin by the horizontal bars, from which one can assign quantitatively the role of each residue in the binding site, i.e., their effectiveness, whether attracting or pushing the drug; (ii) the most important residues contributing to the bonding, which are shown in the column of residues in the left side; (iii) the regions a-f and the atoms of the statins interacting with each residue (placed at the left) of the binding site (see Fig. 5).

RESULTS AND DISCUSSION

Each statin binds to HMGR in a specific way, which is determined by its own molecular structure and the interacting residues. It is not trivial to specify what are the residues of the binding pocket using only crystallographic data or structural docking information. For example, there is not a simple relationship between interaction energy and statin-amino acid residue distance (a charged residue far away can interact more strongly with a statin ligand in comparison with a much closer uncharged residue). Nevertheless, the molecular fractionation with conjugate caps strategy (MFCC, see the Methods section) allows one to calculate the interaction energy

between a given residue and its closer statin atom at the quantum level (22). Here we define the binding pocket sphere (BPS) with radius r as an imaginary sphere centered at the ligand centroid (see Fig. 1), while a binding pocket of radius r, BP(r), is defined as the set of amino acid residues with at least one atom inside the corresponding BPS. The calculated interaction energy of a statin molecule complexed with HMGR is a function of r, E(r), and is obtained by adding up the energies of all the interacting elements inside BP(r). By increasing r, more and more residues are taken into account, changing the interaction energy. When r is small, one can expect a dominant contribution from near charged residues. At intermediate BPS sizes, the interaction energy probably will change more slowly and, finally, for large r values the interaction energy must stabilize and converge. Indeed, such behavior is clearly depicted for different statins interacting with HMGR in Fig. 2, where the interaction energy as a function of r for atorvastatin (solid), fluvastatin (long dashed), cerivastatin (dotted), mevastatin (dashed-dotted), rosuvastatin (dashed-bi-dotted), and simvastatin (small dashed) is displayed.

Each energy curve is clearly distinct from the others, being exclusive to each statin molecular structure. A quick look at Fig. 2 shows that the interaction energy as a function of r stabilizes (varies by less than 10%) for all statins for r≈11 Å, which means that the HMGR-ligand binding pocket size is underestimated in the classic works of Istvan et al. (9, 10, 11), which adopt r≈9.5 Å for atorvastatin, as shown in Tables I and II. This reduced value of r excludes several charged residues (E850, D767, E655, R702, E528, K662) which are relevant to evaluate the interaction energy at the binding site. The inset of Fig. 2 shows that the interaction binding energy exhibits a sharp decrease starting at r≈4.5 Å for mevastatin and fluvastatin, and at r≈4.7 Å for simvastatin, rosuvastatin, and cerivastatin. For atorvastatin the sharp decrease begins at r≈5.7 Å. There is a total energy minimum for E(r) at r≈8.6 Å for mevastatin and fluvastatin, r≈8.8 Å for cerivastatin, r≈9.2 Å for simvastatin, and

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r≈9.0 Å for rosuvastatin. After this energy range, E(r) tends to increase due to the inclusion of amino acid residues which repel the ligands.

Figure 3 shows a comparison of the calculated interaction energies E(r) for HMGR complexed with the statins of Fig. 2 with r=6.5, 9.5, and 12.0 Å. For the smallest binding pocket radius the absolute value of the total HMGR interaction energy follows the order R > M > A > F > S > C, suggesting that rosuvastatin (cerivastatin) is the most (less) potent statin to inhibit HMGR if one assumes a direct correlation between statin potency and the strength of the total HMGR-statin interaction. For the binding pocket with r≈9.5 Å, which is approximately the value used for atorvastatin in the works of Istvan and collaborators (9, 10, 11), the absolute value of E(r) obeys the sequence A > R > M > S > F > C, suggesting that atorvastatin (cerivastatin) is the most (less) effective statin to inhibit HMGR. After the stabilization of E(r) for r > 11.0 Å, the interaction energy presents the following ordering: A > C > R > M > S > F, suggesting that atorvastatin and rosuvastatin are the most potent non-toxic statins, while simvastatin and fluvastatin are the less potent ones (cerivastatin, albeit having practically the same E(r) of atorvastatin, is not considered here due to its toxicity). The weakest bonding in the thermodynamic experiments was observed for fluvastatin, with ΔG≈-9.0 kcal/mol, while rosuvastatin has the highest affinity for HMGR (12). The interaction energy varies from ≈ -320 kcal/mol for A and C, -310 kcal/mol for R, to -295 kcal/mol for fluvastatin (a variation of about 25 kcal/mol). The statins showing largest change when one switches from r=9.5 Å to r=12.0 Å are A (E(r) increases by about 50 kcal/mol), C (E(r) decreases by about 40 kcal/mol), S (E(r) increases by about 35 kcal/mol), and M (E(r) decreases by about 25 kcal/mol). Minimal changes of E(r) are observed for R and F in the transition from r=9.5 Å to r=12.0 Å. These results are consistent with the results of clinical trials, which show that rosuvastatin and atorvastatin (simvastatin and fluvastatin) have the highest (smallest) maximum IC50

values among the non-toxic statins, 2.1 nM and 6.2 nM (18.0 nM and 28.0 nM), respectively (11).

The HMGR residues inside 0.5 Å thick spherical shells centered at each statin centroid are shown in Tables I and II. The most important attracting residues (see BIRD panel in Fig. 5) are in boldface letters. Negatively (positively) charged residues are shown in red (blue) color. The positively charged arginine residue R590 occurs in the 5.0 Å (for M and F), 5.5 Å (R, C, S), and 6.5 Å shells (atorvastatin). The negatively charged glutamic acid residue, E559, belongs to the 5.5 Å shell for all statins except cerivastatin, which has E559 at the 6.0 Å shell. K691 (lysine, positive charge), on the other hand, occurs at the 6.0 Å shell for M and F, in the 6.5 Å shell for R, 7.0 Å shell for C and S, and 7.5 Å shell for S. K735 appears at the 7.5 Å shell (R,C,M,F) and in the 8.0 Å shell (A,S). D690 (aspartic acid, negative charge) is at 6.5 Å (F), 7.0 Å (M), 7.5 Å (R,C,S), and 8.0 Å (A), while D767 is at 9.0 Å (M,F), 9.5 Å (R,C,S), and 10.0 Å (A). K692 occurs at 8.5 Å (R,C,M,F), 9.0 Å (S), and 9.5 Å (A), while R568 is at 8.5 Å (A), 9.0 Å (R,S), 9.5 Å (C), and 10.0 Å (M,F). The charged residues E850, E665, R702, E528, and K662 are all beyond the 9.0 Å binding pocket sphere, but do contribute to the interaction energy by a significant amount, as we will see (specially E665 and R702). The most distant amino acid residue which gives a remarkable contribution to E(r) is E665 for rosuvastatin, in the case of a 11.0 Å BPS.

Figures 4 and 5 are an aid to understand the results obtained for the specific interaction between each statin molecule and neighbor amino acid residues at the binding pocket of HGMR. Fig. 4 shows the binding pockets of HMGR complexed with four representative statins: atorvastatin, rosuvastatin simvastatin, and fluvastatin. The first (last) two are the most potent (least potent) statins according with our calculations, the corresponding most relevant amino acid residues of each binding pocket being also shown. Figure 5, on the other hand, depicts the structure and relevant functional groups of A, R, S, and F, which are

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the main focus of the present study. The a group (HMGR-like) is common to all statins and is directly related to their binding to the HGMR. Atorvastatin, rosuvastatin, and fluvastatin share the b fluorophenyl group, while the remaining parts of their structures (including the c phenyl and d sulfonamide groups) are distinct. Simvastatin has butyril and decalin e groups making up its non-HMGR region, while fluvastatin has a characteristic benzene group f.

Figure 6 shows the graphic panel BIRD with the interaction energies between the four statins A, R, S, and F and the most important amino acid residues at the binding region of HMGR. This graphic panel will be called here BIRD, which is an acronym of the keywords binding site, interaction energy and residues domain, and shows clearly: (i) the interaction energy (in kcal/mol) of the residue with the drug, depicted by the horizontal bars, from which one can assign quantitatively the role of each residue in the binding site, i.e., their effectiveness, whether attracting or repelling the drug; (ii) the most important residues contributing to the bonding in the left side; (iii) the region (boldface letters, identified in Fig. 5 and the atoms of the drug which are closer to each residue (placed at the left) at the binding site. The binding energy of the amino acid residues interacting with the statin molecule inside the binding pocket will be defined here as the negative of the corresponding interaction energy calculated using the MFCC method. We can see from Fig. 6 that six amino acid residues contribute strongly to the stabilization of these statins: R590, K691, K692, K735, R568, and R702, while four amino acid residues, D690, E559, E665, and D767 display positive (repulsive) interaction energies. In comparison, Istvan and Deisenhofer (10) point out that several polar interactions and hydrogen bonds are formed between the HMGR-like part (group a) of statins and amino acid residues in the cis loop: S684 (serine), D690, K691, and K692. They also point out the formation of hydrogen bond networks involving E559, D767, and K735. Hydrophobic side chains of HMGR involving L562 (leucine), V683 (valine), L853, A856 (alanine), and L857 do

participate in van der Waals interactions with the statin molecules, but do not appear relevant in our calculations (probably due to the fact that van der Waals forces cannot be described in the pure DFT formalism). Simvastatin interacts through its decalin ring structure with a helix of the enzyme, while rosuvastatin and atorvastatin have additional binding interactions between their fluorophenyl groups and the R590 residue.

The K735 residue exhibits the strongest binding energy (about 115 kcal/mol) to the a group of F, R, S, and A, in decreasing order of intensity, through an ionic bond involving the (C1)OO- terminal hydrophilic group, being followed by the R590 residue, with binding energy of about 90 kcal/mol for A, F, S, and R (also in decreasing order of intensity). If one looks to Fig. 7, which presents the main amino acid residues complexed with A, R, S, and F and the main interatomic distances involved, one can see that K735 shows approximately the same interatomic distances for the four statins investigated. The interaction with R590, on the other hand, involves the fluorophenyl b group of A, R, and F, which is a bit closer in the case of A (2.6 Å) as shown in Fig. 7. It seems that this fluorine atom does not change significantly the binding energy in comparison with simvastatin, which interacts with R590 through its butyril group and through its HMGR-like region, which is a bit more closer to R590 when contrasted with R and F. The third most important residue, K692, has binding energy to statins between 75 and 77 kcal/mol, with binding intensity following the sequence F > A > R > S, and involves the a group. The smallest interatomic distance is observed, in this case, for fluvastatin, with 2.3 Å between an oxygen atom at F and an hydrogen atom belonging to the NH3 group of K692. The K691 residue, by the way, interacts with the (C5)OH group via hydrogen bonding with binding energies between 54 kcal/mol and 58 kcal/mol, following the sequence of binding intensities S > R > A > F, with rosuvastatin and fluvastatin being the closer ones to the residue (1.6 Å and 1.7 Å, respectively, see Fig. 7). With a binding energy of about 41

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kcal/mol, R702 is bound more strongly to simvastatin, with interatomic distances of 6.4 and 6.8 Å between two oxygen atoms at the a group and a hydrogen atom belonging to one of the NH2 groups of the amino acid residue. Finally, R568 binds with different functional groups of A (group c), R (group d, which contains SO2), S (group e, decalin, with two rings), and F (group f, benzene ring), which leads to a noticeable variation of the interaction energy. In this case, R exhibits the strongest binding (about 43 kcal/mol), followed by A (about 39 kcal/mol), F (about 37 kcal/mol) and S (about 35 kcal/mol). Considering the interatomic distances, R is closer to R568, with distances of about 4 Å, followed by S, with distances between 4.6 and 5.5 Å. The most distant ligand with respect to R568 is F (the second weakest interaction with R568 of the four statins investigated), for which the interatomic spacing stays between 5.9 Å and 6.6 Å. All in all, in region a, the four statins show a variation of the interaction energy among themselves always smaller than 10 kcal/mol for the attracting residues R590, K691, K692, K735, and R702.

The most important repulsive residues in the binding pocket are, in decreasing order of significance, E665, D767, D690, and E559. E665 shows interaction energies between 32 and 37 kcal/mol, with A, S, and F having practically the same interaction energy. On the other hand, R has the smallest energy because E665 is far away, inside the spherical shell between 11.0 Å and 11.5 Å centered at its centroid (see Table 2). Besides, the interaction with E665 involves the fluorophenyl group of A, R, and F and the butyryl group of S. For the D767 residue, we have interaction energies following the sequence S > F > A > R, varying from about 36 kcal/mol (S) to about 29 kcal/mol (R), which is interesting because S has the largest interatomic distance to E665 (4.9 Å, but we note that A has practically the same interatomic distance value measured for S). It is also worth to note that by extending the BPS radius to include both D767 and R702, the increase of binding energy due to the interaction with R702 is not matched by the

decrease of it promoted by the positive interaction energy of D767 (the net gain in the binding energy due to the contributions of D767 and R502 is of 5 kcal/mol, in average). Next in the sequence, we see that D690 repels the four statin molecules by interacting with the HMGR-like a-group, with the largest calculated repulsion being assigned to S, followed by F, A, and R, in decreasing order. Interaction energies for this residue vary from 35 kcal/mol (S) down to 27 kcal/mol (R). Atorvastatin has the smallest interatomic spacing to D690, 1.7 Å, while R and F has the largest interatomic distances, of about 2.5 Å. Finally, E559 exhibits the largest variation of the interaction energy, starting with S, about 18 kcal/mol, decreasing to 12 kcal/mol (F), 10 kcal/mol (A), and 8 kcal/mol (R).

The above results point to severe limitations on previous modeling of statins.In the case of the CoMFA 3D QSAR modeling and virtual screening of Zhang et al. (14), only ligand atoms located within a 6.5 Å radius from any HMGR residue in the binding pocket were took into account. Consequently, the significant contribution of the residues E665, R702 and R568 to the statin binding was disregarded by Zhang et al. (14). On the other hand, in their work on the use of virtual screening, flexible docking, and molecular interaction fields to design novel HMG-CoA reductase inhibitors for the treatment of hypercholesterolemia, Da Silva et al. (15) have considered K691, D690, N755, R590, E559, N684, K735, L853, V683and L857 as the main interaction residues with cerivastatin. By comparison with the data of Table I, II as well as Fig. 6, there is agreement about the high importance of the K691, D690, K735, and R590 residues to the cerivastatin binding to HMGR. Da Silva et al. (15) seems to have overvalued the role of the residues S684, V683, L857, L853, E559 and N755, while at the same time missed completely the highly important residues K692, R568, E655, D767 and R702 contributing to the binding energy. According Kee et al. (29), lysine 691 (K(91), lysine 692 (K692), aspartic acid 690 (D690) and serine 684 (S684) are the most important residues binding statins to the HMGR active site, and

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that the unexploited protein-ligand interaction between tyrosine residue 479 and HMGR can be important in the design of future statin drugs. This signify that the strongest binding residues K735 and R590 were not considered as important by Kee et al. (29), as well as R568, E559, E665, D767, and R702. Besides, the tyrosine residue 479 is not in inside the 12.0 Å binding pocket radius, it will not contribute significantly to the statins total binding energy, suggesting that it will not be important in the design of future statin drugs, in striking contrast with the conclusion of Kee et al. (29). Partial Shielding Effects - When one calculates the interaction energy between an amino acid residue and a ligand, it is important to consider the partial shielding effect caused by the presence of intervening amino acid residues (we note that the data reported previously include this shielding effect). In Fig. 8 we present the three possible situations of amino acid shielding observed for the statins complexed with HMGR: R568 shielded by L853, D767 shielded by K691 and R702 by D690. Using the MFCC methodology (22), we have estimated the shielding effect in these three cases. For the R568 interaction, we obtained a maximum decrease for the binding energy of 3.4 kcal/mol for S, 3.2 kcal/mol for F, 1.5 kcal/mol for A, and 0.9 kcal/mol for R when the interaction with L853 is took into account. In the case of D767, a decrease in binding energy of 6.4 kcal/mol was observed for F, 5.2 kcal/mol for S, 4.1 kcal/mol for R and 3.2 kcal/mol for A. The interaction with R702, on the other hand, decreases the binding energy by 3.5 kcal/mol for S, 3.1 kcal/mol for F, 2.3 kcal/mol for A and 1.7 kcal/mol for R. These energy changes due to partial shielding cannot be neglected if we consider that the variation of the total binding energy among the statins is of about 25 kcal/mol.

FINAL REMARKS

In the next 2 years, a set of blockbuster drugs, including Pfizer's Lipitor (atorvastatin), will

face expiry of their USA patents, which will lead to plummeting sales due to the competition with generic versions and the loss of billions of dollars of revenues from the largest pharmaceutical companies (5). In order to conciliate the production of more efficient medications and the necessity to decrease their cost of development, the use of relatively cheap computational simulations is very promising. The present work reinforces the role of computational simulations at the quantum level as a valuable tool to understand and develop new drugs. The binding energy analysis of statins complexed with HGMR presented here has a good correlation with thermodynamic studies (12) and clinical trial data (29), as these point to rosuvastatin and atorvastatin as the best available statins on the market. According with the calculations we carried out, atorvastatin has the largest binding energy, about 320 kcal/mol, while rosuvastatin has a binding energy of about 310 kcal/mol, and simvastatin and fluvastatin have total binding energies of about 290 kcal/mol. Such a difference is caused mainly due to the decrease of the repulsive interactions between the HGMR pocket site and the molecules of A and R. This suggests that the inhibitory potency of statins is mainly dictated by the strength of their attraction to the binding pocket, notwithstanding the presence of other factors which could affect the efficiency of these molecules beyond binding energy, such as the dynamical process by which they are trapped by the pocket site and interacttions with other biochemical pathways. The main advantage of the methodology we propose here is the possibility to evaluate which amino acid residues contribute more intensely to the stabilization of the statin-HMGR complex, which can be very helpful for purposes of drug design. For example, the MFCC-based approach allows us to infer that modifications in the a region (HMG-like region), which define a molecule as a statin, are not required to improve the binding interacttion, as other regions (c, d, and e) are also important in this aspect. As a matter of fact, we have performed DFT/LDA calculations focusing a modified form of

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simvastatin we have created in the hope of improving its binding energy without deep changes in its structure (simvastatin, among all statins, has less side effects). The first results are very promising, the calculated binding energy of the simvastatin derivative we have created is larger than the value calculated for atorvastatin. We do not give more informations on this simvastatin derivative here due to patenting issues at the

moment of publication of this paper. Finally, we also have demonstrated that partial shielding effects of one amino acid residue on its neighbours can be important to provide an accurate picture of the binding of statins to HGMR, decreasing the binding energy by up to 26% in comparison with the variation of the total binding energy for different statin molecules.

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Chem. B 113, 14810-14815. 30. Delley, B. (1990) J. Chem. Phys. 92, 508-517. 31. Delley, B. (2000) J. Chem. Phys. 113, 7756-7764. 32. Zhao, Y., Truhlar, D. G. (2005) Phys. Chem. Chem. Phys. 7, 2701-2705. 33. Van Der Wijst, T., Guerra, C. F., Swart, M., Bickelhaupt, F. M. (2006) Chem. Phys. Lett.

426, 415-421. 34. Cooper, V. R., Tronhauser, T., Langreth, D. C. (2008) J. Chem. Phys. 128, 204102-204104. 35. Silvestrelli, P. L. (2009) J. Phys. Chem. A 113, 5224-5234. 36. Ortmann, F., Hannewald, K., Bechstedt, F. (2008) J. Phys. Chem. B 112, 1540-1548. 37. Ortmann, F., Schmidt, W.G., Bechstedt, F. (2005) Phys. Rev. Lett. 95, 186101-186105. 38. Ortmann, F., Bechstedt, F., Schmidt, W.G. (2006) Phys. Rev. B 73, 205101-205110.

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39. Inada, Y., Orita, H. (2008) J. Comput. Chem. 29, 225-232.

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FOOTNOTES

*

E. L. A. and V. N. F. are senior researchers from the Brazilian National Research Council (CNPq), and would like to acknowledge the financial support received during the development of this work from the Brazilian Research Agencies CAPES-PROCAD and Rede Nanobiotec, CNPq-INCT-Nano(Bio)Simes project 573925/2008-9, and FAPERN-CNPq (Pronex). E. W. S. C. received financial support from CNPq projects 304338/2007-9 and 482051/2007-8.

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FIGURE LEGENDS

Fig. 1. Fig. 1. The HMGR tetramer bonded to four atorvastatins. The four similar binding

pockets are indicated by circles. The Binding Pocket Spheres (BPS), each one with radius r, are shown.

Fig. 2. Variation of the interaction energy as a function of the interaction radius for: atorvastatin (solid), fluvastatin (long dash), cerivastatin (dot), mevastatin (dash-dot), rosuvastatin (dash-dot-dot), and simvastatin (small dash). The inset shows the interaction energy for inter action radius smaller than 5 Å. The binding pocket radii are given by the distance between each statin centroid and the most distant HMGR residue binding the ligand.

Fig. 3. Total HMGR interaction energy of atorvastatin (A), rosuvastatin (R), fluvastatin (F), cerivastatin (C), mevastatin (M), and simvastatin (S) for interaction radii of 6.5 Å, 9.5 Å, and 13.5 Å. The 9.5 Å binding pocket for atorvastatin has nearly the same HMGR interacting residues proposed by Istvan et al. (9, 10, 11), except by the residues M657, G560, A751, M854, N658, and S661.

Fig. 4. Binding sites of atorvastatin. rosuvastatin, simvastatin, and fluvastatin. The most important HMGR residues bonded to these drug molecules are shown: K735, R590, K692, K691, R702, and R568 attract the statins and E665, D767, D690, E559 repel them.

Fig. 5. Atorvastatin, rosuvastatin, simvastatin, and fluvastatin chemical structure and main functional groups a-f.

Fig. 6. Binding site, interaction energy and residues domain (BIRD) graphic panel showing the most relevant residues of atorvastatin, rosuvastatin, simvastatin, and fluvastatin which contribute to the HMGR binding.

Fig. 7. Distances between HMGR residues and atorvastatin, rosuvastatin, simvastatin, and fluuvastatin. Their interaction energies are the most important contributions to the total binding energy of the HMGR-statin complex.

Fig. 8. Shielded amino acid residues R568, D767, and R702 interacting with atorvastatin, rosuvastatin, simvastatin, and fluvastatin (the molecular structures of the four statins and six amino acid residues are shown superposed).

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TABLE LEGEND

Table I. HMGR residues interacting with atorvastatin (A), rosuvastatin (R), cerivastatin (C), simvastatin (S), mevastatin (M), and fluvastatin (F) as the interaction radius increases. Red (blue) color stands for negatively (positively) charged residues. The most important residues interacting with statins are shown in boldface. The interaction radius varies from 2.5 Å to 9.0 Å. Table II. HMGR residues interacting with atorvastatin (A), rosuvastatin (R), cerivastatin (C), simvastatin (S), mevastatin (M), and fluvastatin (F) as the interaction radius increases. Red (blue) color stands for negatively (positively) charged residues. The most important residues interacting with statins are shown in boldface. The interaction radius varies from 9.5 Å to 12.0 Å.

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Figure 1

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Figure 2

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Figure 3

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Figure 4

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Figure 5

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Figure 6

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Figure 7

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Figure 8

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Table I

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Table II

Inactivation of ovine cyclooxygenase-1 by bromoaspirin and aspirin: a quantum chemistry description. Ito L. Barroso-Neto1, João Paulo C. Marques2, Roner F. da Costa2, Ewerton W.S. Caetano3, Benildo S. Cava-da1, Carmem Gottfried4, Eudenilson L. Albuquerque5, Valder N. Freire2 1 Department of Biochemistry and 2 Department of Physics at Federal University of Fortaleza, 60455-760 Fortaleza, CE, Brazil; 3

Federal Institute of Education, Science and Technology, 60040-531 Fortaleza, CE, Brazil; 4 Department of Biochemistry at Federal University of Rio Grande do Sul, 90035-003 Porto Alegre, RS, Brazil; 5 Department of Biophysics and Pharmacology, at Federal University of Rio Grande do Norte, 59072-970 Natal, RN, Brazil.

Corresponding Author: Valder N. Freire, Department of Physics, UFC, 60455-760 Fortaleza, CE, Brazil. E-mail: [email protected]

KEYWORDS: Aspirin, quantum chemistry, ovine cyclooxigenase-1, binding pocket, active site channel, density functional theory.

BRIEF: COX-1 inactivation by aspirin: a quantum description.

ABSTRACT: The resulting noncovalent bonding of the salicylic acid to ovine COX-1 after bromoaspirin and aspirin acetylation by Ser530 is investigated within the scope of quantum chemistry considering a 6.5 Å radius binding pocket. We take not only full advantage of the 3.4 Å resolu-tion X-ray structural data of the ovine COX-1 co-crystalized with bromoaspirin already published, but we also improve and create new data through the computations. The main achievements are: (i) refinement over the original structural data by finding where the hydrogens should be placed in the residues of the binding pocket, and repositioning of the Ser530Ac[Br;H] lateral chain and salicylic acid by total energy minimization procedures; (ii) simulation of the bro-moaspirin transformation to aspirin in the binding pocket, and estimate of the interaction energies between the COX-1 residues and the resulting salicylic acid. By demonstrating that the binding strength of bromoaspirin and aspirin to COX-1 are very approximately the same when second order quantum refinements of the structural data are performed, the identical IC50 values for the 126 μM COX-1 activity of both bromoaspirin and aspirin measured previously are explained. The existence of attracting and, surprisingly, also repulsive residues is highlighted. It is shown that Arg120 is the most effective residue attracting the salicylic acid, fol-lowed by Ala527, Leu531, Leu359 and Ser353. On the other hand, Glu524 was found the most effective repulsive residue (strength interaction comparable to Arg120). To date, Glu524 was never considered previously as an important residue in the COX-1 active site channel.

INTRODUCTION

After more than a century of clinical practice, aspirin remains a largely recommended antithrombotic, antipyretic, analgesic and antiproliferative drug (1-3). It acts by blocking the biosynthesis of inflammatory prostanoid hormones through inhibition of cyclooxygenase enzymes (COXs), sterically hindering the entrance of the physiological binder arachidonic acid (4). Like other non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) as ibu-profen, diclofenac, ketoprofen, etc, aspirin inhibits in different degrees both COX-1 and COX-2 isoforms, (note that a third distinct COX isozyme, COX-3 was described recently (5,6)), being for the former 10-170 times more potent than for the latter (7-10). The available evidence suggests that the anti-inflammatory and analgesic properties of traditional NSAIDs are due to the inhibition of COX-2, whereas the ulcerogenic side effects of these inhibitors are associated with the blockage of COX-1 (2-11). As a matter of fact, prolonged NSAIDs ad-ministration exhibit several undesired side effects, the most important being gastro-intestinal irritation and ulceration, which still represent an unsolved therapeutic problem (11,12). COX-1

is constitutively expressed at high levels in cells and tissues such as endothelium, monocytes, platelets, renal collecting tubules and seminal vesicles indicating that it is developmental-ly regulated (13). Consequently, the COX-1 environment is neutral or slightly alkaline, with its pH between 7.2 to 7.4.

COX-1 was first purified in 1976 (14), cloned in 1988 (15-17) and co-crystallized with the analog of aspirin, 2-bromoacetoxy-benzoic acid (bromoaspirin), in 1995 (18). COX-1 has 70 kD, 22 kb gene size and chromosome 9q32-q33.3, with a 602 amino acids primary structure. It forms homodimers (see Figure 1) whose monomers are comprised of three structural domains: a N-terminal epidermal growth factor (EGF) domain, a mem-brane binding domain (MBD) and a large C terminal catalytic domain, which comprises 80% of the protein and contains both the cyclooxygenase and peroxidase active sites (4,8). Each monomer contains a 25 Å hydrophobic channel that originates at the membrane binding domain and extends into the core of the globular domain (19-21). The COX-1 dimers are roughly ellipsoidal, and the structures of their monomers are very simi-lar. The dimer interface is relatively open, with numerous water molecules interspersed throughout. A total of twenty two inter-molecular polar interactions can be identified at the dimer interface, as well as numerous hydrophobic interactions and bridging water molecules that contribute to the packing of the two monomers.

As a general rule derived from structural data, the NSAID binding site involves the upper half of this channel from Arg120 to near Tyr385, and several of these amino acids are uniquely important in cyclooxygenase catalysis (22). Amino acids lining the hydrophobic cyclooxygenase active site channel include Leu117, Arg120, Phe205, Phe209, Val344, Ile345, Tyr348, Val349, Leu352, Ser353, Tyr355, Leu359, Phe381, Leu384, Tyr385, Trp387, Phe518, Ile523, Gly526, Ala527, Ser530, Leu531, Gly533, Leu534. Only three of the channel residues are polar (Arg120, Ser353, and Ser530). Ser530 is the site of acetylation by aspirin, and Arg120 binds to the carbox-ylate groups of fatty acids and many NSAIDs (22).

Vane (23,24) and Smith and Willis (25) proposed that aspirin and other NSAIDs inhibits the enzyme activity that converts polyunsaturated fatty acids to prostaglandins during the in-flammatory process. The structural basis of aspirin activity inferred from the crystal structure of inactivated prostaglandin H2 synthase was unveiled by Loll, Picot and Garavito (18). They have obtained a 3.4 Å resolution X-ray structure of the ovine COX-1 inactivated by the potent aspirin analogue bromo-aspirin which was chosen since the strong scattering power of the bromine atom allowed its unambiguous location in even a low resolution electron density map. The crystal structure of the bromoaspirin proved to be isosteric with that of aspirin (26), being verified that aspirin inhibits COX-1 as efficiently as bromoaspirin (18). According to the usual interpretation of the

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structural data, the most important residues in the aspirin-COX-1 binding pocket are: Ser530, due to the irreversible aspirin acetylation; Arg120, which forms a salt bridge with the carbox-ylic-acid moiety; Ser353, due to its polar character. Besides, Ile523 is crucial since its mutation to Val523 transforms the first shell of the COX-1 active site to that of COX-2.

Figure 1. The ovine COX-1 dimer co-crystallized with bromoaspi-rin, pdb 1PTH. The residues of the binding pockets are inside the dashed circles of radius r around the bromoaspirins.

However, analysis based on bond lengths of X-ray structural data, as well as docking procedures and molecular dynamics simulations (27) are very limited on quantify the effectiveness of each residue to the aspirin-COX-1 bonding. In particular, low resolution structural data can compromise its interpretation, limiting seriously a deeper understanding of the role of residues and ligand atoms on the binding pocket characteristics. A de-tailed understanding of the aspirin pathway actions at the quan-tum chemistry level of description (28) of its bonding to each COX-1 residue is essential for a description of its energetic and to quantify the individual contributions to the total binding energy, and should be very useful for the design of new aspirin derivatives. As emphasized by Zhou et al. (29), quantum me-chanical (QM) methods are becoming popular in computational drug design and development mainly because high accuracy is required to estimate (relative) binding affinities. According to Raha et al. (30), the routine use of QM methods in all phases of in silico drug design is of upmost importance for the evolution of this field. QM methods can also be used locally to improve crystal structures (31). Quantum refinement is quite computa-tional costly compared to standard crystal structure refinement, but as the computers are becoming faster and cheaper, it may become a standard tool, mainly when the re-refined site is of major interest (31).

Quantum mechanics methods, often described as ab initio since they work without using empirical parameterizations, are fre-quently used to simulate molecular systems with up to hundreds or even thousands of atoms (in the last case, using supercom-puters). Despite the complexity of biological systems, the rapid-ly increasing computational power in the last decade, combined with the improvement of quantum methods, like the DFT (Den-sity Functional Theory) (32,33) has allowed the application of quantum mechanics (many times combined with molecular mechanics techniques) to study, for example, enzymatic reac-tions and the structure of proteins and their ligand binding sites (34-45). In particular, fragment-based methods for quantum calculations involving protein systems have been developed to speed up the calculations in these systems (46-55).

The purpose of this work is to present an improved description of the inactivation of COX-1 by bromoaspirin and aspirin through a quantum chemistry investigation of their interaction with close residues inside the 6.5 Å radius region encircling the binding pocket. We take full advantage of the already published 3.4 Å resolution X-ray structure of the ovine COX-1 co-crystalized with bromoaspirin (18). We simulate the transfor-mation of bromoaspirin to aspirin in the binding pocket by Br→H replacement in the Ser530 residue acetylation. The binding site is stabilized by a quantum mechanics based energy minimization procedure; a strategy applied considering two types of quantum chemistry refinements to the original X-ray diffraction data. This approach allows an improved positioning of the resulting salicylic acid, of the residues hydrogen, and of the Ser530Ac[Br;H] lateral chains in respect to the original structural data. Finally, the interaction energy between COX-1 and the resulting salicylic acid is obtained within the Molecular Fractionation with Conjugate Cap (MFCC) scheme after the three orders of refinement – see Methods.

We explain why the inactivation levels of COX-1 by bromo-aspirin and aspirin are very approximately the same, which is due to a balance between the stronger attractive and weaker repulsive character of the residues interacting with the salicylic acid after the acetylation of bromoaspirin and aspirin, respec-tively. This involves mainly the attractive (repulsive) interac-tion between the residues Arg120, Ser353, Leu359, Ala527 and Leu531 (Pro528, Glu524, Trp387 and Gln350) and the salicylic acid resulting from the acetylation. Besides, Arg120 is shown to be the most effective attractive residue, while it was quite sur-prisingly to find far away (at 6.2 Å) a residue (Glu524) repel-ling strongly the salicylic acid. To date, Glu524 was never considered in any previous list of important amino acids in the COX-1 active site channel.

RESULTS AND DISCUSSIONS

Difficulties associated with membrane-protein crystallization are preventing up to now the attainment of a diffraction pattern from the COX-1 co-crystallized with aspirin (18), which is easily observed by consulting aspirin entries in protein data banks like the Research Collaboratory for Structural Bioinfor-matics (RCSB) Protein Data Bank (PDB). However, by choos-ing an aspirin analogue containing an electron-dense bromine atom, the X-ray structure of the aspirin analogue bromoaspirin co-crystallized with COX-1 was measured at 3.4 Å resolution (18) as a means to probe indirectly the structure of aspirin-inactivated COX-1. As a matter of fact, bromoaspirin has a crystal structure isosteric with that of aspirin and inhibits ovine COX-1 in a way analogous to those observed with aspirin, both presenting identical IC50 values for the 126 μM COX-1 activity, as measured by Loll, Picot and Garavito (18).

The ovine COX-1 enzime focused by us is a dimer of identical subunits with two quite similar cyclooxigenase active sites binding bromoaspirin, pdb entry 1PTH, whose 3.4 Å resolution X-ray structure is shown in Figure 1. Both monomeric subunits are active simultaneously, each bromoaspirin binding site to COX-1 lying at the end of a hydrophobic channel (18). Due to the remarkable similarity of the binding pockets in each mono-mer, the structure of only one binding site was considered in the study of the ovine COX-1 inactivation by bromoaspirin and aspirin.

Bromoaspirin differs from aspirin by the hydrogen replacement of bromine (Br→H), both covalently bonded to the carbon C3’, as shown in Figure 2. Through simulation of this substitution, structural data of the aspirin in the ovine COX-1 was obtained by searching the minimum energy configuration of the binding pocket after acetylation of the Ser530 residue, e.g. Ser530AcBr

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becomes Ser530AcH. This is performed by taking into account the Ser530 and the salicylic acid repositioning, as well as the binding pocket residues hydrogenation through quantum chem-istry calculations performed within the DFT-LDA framework. The published structural data of bromoaspirin co-crystallized with ovine COX-1 (18) was taken into advantage for the initial-ization of the computations. This strategy allowed us to perform a comparative study of the bonding characteristics of bromo-aspirin and aspirin in the ovine COX-1 binding pocket, and to explain why bromoaspirin and aspirin have the same IC50 value for the 126 μM COX-1 activity (18).

Figure 2. The bromoaspirin [see the C3’Br bond] and aspirin [see the C3’H bond] molecules, and their regions i, ii and iii. They are in a neutral or slightly alkaline environment, which means pH 7.2-7.4, giving rise to the protonation state in which a negative charge -e is assigned to the oxygens (see in region i the dashed line linking the oxygens).

Since the COX-1 environment is neutral or slightly alkaline, the deprotonation of bromoaspirin and aspirin occurs in such a way that the additional electron is shared by the oxygens of carbox-ylic group in region i, as shown in Figure 2. On the other hand, the inactivation of the ovine COX-1 enzime by hindering the access of arachinoid acid to the active site occurs through the [Br;H] acetyl group, which is depicted in region iii of Figure 2. After acetylation, the Ser530 residue is transformed to Ser530AcBr and Ser530AcH in the case of bromoaspirin and aspirin, respectively, which interacts with the hydrogen of the carbon C4 in region ii, as observed in Figure 3. After the acety-lation process, the salicylic acid (C7H6O3) is bonded non-covalently to the binding pocket. The Arg120 binding to the oxygens in region i is strongly influenced by the electrostatic interaction and the local environment since it is a pH-dependent process. We focus the case of COX-1 in a neutral or slightly alkaline environment (as in the blood and in the intracellular medium, whose pH varies in the 7.2-7.4 range). The salicylic acid becomes deprotonated, i.e. the hydrogen atom bounded to the carboxylic group oxygen is removed, being a negative charge (-e) assigned to the oxygens – see Figure 2. The exist-ence of the environment dependent deprotonated salicylic acid state must be considered for an improved quantum chemistry description of the COX-1 inactivation by bromoaspirin and aspirin.

Figure 3. The COX-1 binding pocket of bromoaspirin after Ser530 acetylation as obtained by quantum chemistry computations con-sidering: A - the zeroth order refinement of the original structural data; B - the second order refinement of the original structural data; C - a Br→H replacement (e.g. a bromoaspirin conversion to aspirin after Ser530 acetylation) considering the second order refinement of the original structural data.

Considering a 5 Å binding pocket, there are eleven residues interacting with the salicylic acid: Val116, Arg120, Val349, Leu352, Ser353, Tyr355, Leu359, Ile523, Ala527, Ser530AcBr(H) and Leu531. Only the residues Arg120, Ser353, and Ser530AcBr(H) are polar and, consequently, should interact more strongly with the salicylic acid atoms according structural and current biochemical data. On the other hand, in the 6.5 Å binding pocket there are more eight residues interacting with the salicylic acid: Leu93, Gln350, Trp387, Phe518, Met522, Glu524, Gly526 and Pro528. In the hydro-phobic pocket beneath the heme group, there are the residues Tyr385, Trp387, and Leu352; in the mouth of the active site, there are Arg120, Tyr355 and the new polar residue Glu524, arranged to form a hydrogen bond network; in the side pocket comprising conserved residues, there are His90, His513, and Ile523. Since the interplay between the charge state of the residue and its distance to the salicylic acid determines its role on the bonding characteristic of bromoaspirin and aspirin after acetylation, the quantum chemistry calculations were performed considering the binding pocket with nineteen residues, the

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biggest one, to focus on the role of the polar residue Glu524, about 5.6 Å far from iiC6(H).

Going beyond the structural X-ray diffraction data for bromo-aspirin (18), Figure 3A and Figure 3B shows the hydrogens positioned at the residues in the binding pocket, the former for the zeroth order refinement and the later for the second order refinement. This is possible through a total energy minimization procedure performed in the 6.5 Å binding site through DFT-LDA quantum chemistry calculations to find the best converged structure – see Methods. After the in silico transformation of bromoaspirin to aspirin in the binding pocket, a new positioning for the salicylic acid was obtained since the Br→H replacement changed the C4 hydrogen structural neighborhood. Figure 3C shows the best converged structure of the salicylic acid in the ovine COX-1 binding pocket after the second order refinement as obtained in silico after the Ser530 acetylation of aspirin.

Figure 4. The distances in Å (small numbers) between the eleven most important residues in the COX-1 binding pocket of bromo-aspirin after Ser530 acetylation as obtained by quantum chemistry computations considering: A,B - the zeroth order refinement of the original structural data; C,D - the second order refinement of the original structural data.

Among the ovine COX-1 residues of the pdb 1PTH, we choose those in the 6.5 Å neighborhood of the active binding site for bromoaspirin (aspirin) to perform quantum chemistry calcula-tions. They are Leu93, Val116, Arg120, Val349, Leu352, Gln350, Ser353, Tyr355, Leu359, Trp387, Phe518, Met522, Ile523, Glu524, Gly526, Ala527, Pro528, Ser530AcBr(H) and Leu531. Some of them (the eleven most important according to the interaction energy, see Figure 6 and Figure 7) are depicted in Figure 3A (obtained after the zeroth refinement of the origi-nal structural data) and Figure 3B (obtained considering the second order refinement of the original structural data) for bromoaspirin, and Figure 3C for aspirin (obtained simulating the Br→H replacement, and considering the second order re-finement of the original structural data). A very clear difference between Ser530AcBr and Ser530AcH is apparent; the former is more distant to the C4 hydrogen than the later.

As a general rule, the quantum chemistry improvement of the original crystal diffraction data increases the overall distance between the binding pocket residues and the salicylic acid, as observed in Figure 4 for the case of bromoaspirin. The most important structural refinements are the bigger distances of salicylic acid to Trp387 (from 4.3 Å to 6.0 Å), Ser530AcBr

(from 2.8 Å to 4.0 Å), Glu 524 (from 5.7 Å to 6.2 Å), and Pro528 (from 6.2 Å to 7.1 Å). When two atoms of the residue are interacting with the salicylic acid, the distance of one of them can change more relevantly than the other. These are the cases of Arg120 (from 2.6 Å and 2.8 Å to 2.8 Å and 1.9 Å) and Ser353 (from 4.0 Å and 3.9 Å to 4.1 Å and 4.6 Å).

Figure 5. Salicylic acid positioning in the COX-1 binding site obtained after the zeroth (dark green bonds) and second (clear green bonds) order refinement of the original structural data for bromoaspirin after Ser530 acetylation.

The effect of these changes on the positioning of the salicylic acid in the bromoaspirin binding pocket is shown clearly in Figure 5. The second order refinement increases the distance of the salicylic acid from Ser530AcBr. It is worth to remark that the corrections to the distances (that arrived to 1.7 Å) are much smaller than the estimated resolution of the original diffraction data, which is 3.4 Å (18). Consequently, quantum chemistry based refinement of structural data is relevant for a more accu-rate description of the active COX-1 binding site, a result which should also be valid for the active sites of proteins in general (31).

Even with the refinement procedure, the structural data of the bromoaspirin and aspirin binding pocket in COX-1 after acety-lation only suggests what are the main residues involved, but cannot provide quantitative and comparative information on the role of each residue in respect to the bonding. This is not the case when a quantum chemistry description is undertaken of the interaction energies between atoms of the ligand and the bind-ing pocket residues, as shown clearly in the BIRD panels de-picted in Figure 6 and Figure 7 – see the description of the binding energy panel BIRD in Methods – for the deprotonated bromoaspirin and aspirin states bonded to the ovine COX-1. They were calculated within the Molecular Fractionation with Conjugate Cap (MFCC) framework (52,54), as described in Methods. The scheme for the calculation of the interaction (binding) energy E(M-Ri) between the 2-benzoic acid molecule and each amino acid residue Ri is shown in Methods (see Fig-ure 9 there).

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Figure 6. Interaction energy of the main COX-1 residues in the binding pocket of the monomer with the salicylic acid after Ser530 acetylation of bromoaspirin as obtained by quantum chemistry computations considering the zeroth (clear gray) and second (heavy gray) order refinement of the original structural data. The total bromoaspirin bonding energy after Ser530 acetylation is -39.56 kcal/mol and -70.21 kcal/mol for the zeroth and second order refinement, respectively.

The interaction energies of bromoaspirin (after Ser530 acetyla-tion) with the eleven most important COX-1 binding pocket residues are shown in the BIRD panel of Figure 6 – see the description of the binding energy panel BIRD in Methods. They were calculated under zeroth and second order refinement of the original structural data. Since the zeroth order refinement means that only the residues hydrogenation was undertaken, a comparison of the interaction energies in this case describes the effect of second order structural data refinement on how bro-moaspirin binds to the ovine COX-1. As a matter of fact, the total binding energy of bromoaspirin binding to COX-1 is -72.82 kcal/mol taking into account the second order quantum structural refinement, and -39.56 kcal/mol considering the zeroth order refinement. This smaller total energy means that the employed quantum energy minimization procedure was able to find an improved positioning for the salicylic acid and resi-dues in the ovine COX-1 binding pocket, even with the im-posed restraints which are necessary to turn accessible the computational cost of the quantum calculations.

Arg120 and Glu524 are shown in Figure 6 to be the most im-portant residues interacting with the salicylic acid after bromo-aspirin acetylation, the former being attracted by i(C1’)O1’ with a binding energy of -73.59 kcal/mol (-77.80 kcal/mol), and the later being repelled by ii(C6)H with a quiet surprisingly repulsive binding energy of 48.02 kcal/mol (41.65 kcal/mol) in the case of zeroth (second) order refinement. Ala527, Leu531, and Leu359 are also important attracting residues, interacting with ii(C5)H, ii(C2)OH, ii(C2)OH with binding energies of -4.55, -4.24, and -3.47 (-5.12, -5.13, and -5.89) kcal/mol considering the zeroth (second) order structural data refinement, respectively. Besides, Pro528, Trp387 and Gln350 are also repelling residues for the salicylic acid after bromoaspi-rin acetylation, interacting with i(C1’)O1’, ii(C4)H, and ii(C3)H with the small repulsive binding energies of 2.98, 2.24 and 1.83 (2.51, 1.41 and 1.63) kcal/mol considering the zeroth (second) order structural data refinement, respectively.

Figure 7. Interaction energy of the main COX-1 residues in the binding pocket of the monomer with the salicylic acid after Ser530 acetylation of aspirin as obtained by quantum chemistry computa-tions considering the second order refinement (heavy gray) of the original structural data. The total aspirin bonding energy after Ser530 acetylation is -72.82 kcal/mol. For the sake of comparison, the interaction energy of the main COX-1 residues in the binding pocket of the monomer with the salicylic acid after Ser530 acetyla-tion of bromoaspirin as obtained by quantum chemistry computa-tions considering the second order refinement (clear gray) of the original structural data. The total bromoaspirin bonding energy after Ser530 acetylation is -70.21 kcal/mol.

A comparison between the interaction energies for the eleven most important COX-1 binding pocket residues of bromoaspirin (for the sake of comparison) and aspirin, after Ser530 acetyla-tion and taking into account the second order refinement of the original structural data, is shown in the BIRD panel of Figure 7. By summing up all the energies of the residues interacting with the salicylic acid after bromoaspirin and aspirin acetylation, we obtain that the total binding energy of bromoaspirin and aspirin are very close, being -72.82 kcal/mol for the former and -70.21 kcal/mol for the later. Consequently, by correlating directly drug effectiveness to bind strength, the identical IC50 values for the 126 µM COX-1 activity of both bromoaspirin and aspirin measured previously are explained (18) since the total interac-tion energies are very close if the second order refinement of the original structural data is taken into account. Note that this conclusion is possible only because structural data for aspirin after Ser530 acetylation was created computationally within the quantum chemistry framework.

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Figure 8. The electrostatic potential isosurfaces around the salicyl-ic acid and the most attractive and repelling residues of bromoaspi-rin (A) and aspirin (B) after Ser530 acetylation as obtained by quantum chemistry computations considering the second order refinement of the original structural data.

Once more Arg120 and Glu524 are shown in Figure 7 to be the most important residues interacting with the salicylic acid, now after aspirin acetylation, being attracted by i(C1’)O1’ with a binding energy of -78.31 kcal/mol (a little stronger attraction than that of bromoaspirin), and being repelled by ii(C6)H with a quite surprisingly repulsive binding energy of 41.64 kcal/mol (a little weaker attraction than that of bromoaspirin). Ala527, Leu531 and Leu359 are also important attracting residues, interacting with ii(C5)H, ii(C2)OH, ii(C2)OH with binding energies of -5.03, -5.39, and -5.98 kcal/mol, a little stronger attractions than that of bromoaspirin. Besides, Pro528, Trp387 and Gln350 are also repelling residues for the salicylic acid after aspirin acetylation, interacting with i(C1’)O1’, ii(C4)H, and ii(C3)H with binding energies 2.52, 1.41 and 1.63 kcal/mol, little weaker attractions than that of bromoaspirin.

The electrostatic potential isosurfaces around the salicylic acid and the most attractive and repelling residues of bromoaspirin and aspirin after Ser530 acetylation are shown in Figure 8A and Figure 8B, respectively. A high positive charge density occurs in i(C1’)O1’, which determines its attraction/repulsion by the residues in the binding pocket. Since Arg120 has the highest positive charge density in the binding pocket, it is very clearly the most important residue attracting i(C1’)O1’; on the other hand, Glu524 has the highest negative charge density, being the most important residue repelling ii(C6)H.

The quantum chemistry description of the inactivation of ovine COX-1 by bromoaspirin and aspirin after Ser530 acetylation performed in this work confirms the structural results that points to Arg120 and Ser530AcBr(H) as important effective residues in the binding pocket, which is due to the electrostatic attraction and proximity. However, previous structurally-based

characteristics analysis of the bromoaspirin and aspirin binding to COX-1 missed completely, to the knowledge of the authors, the existence of the highly important repulsive binding residue Glu524 pointed out by us. Consequently, by performing a quantum chemistry study it is possible to improve the descrip-tion of the COX-1 inactivation by bromoaspirin and aspirin, and to obtain a quantitative description of the role of the main residues involved. Table I presents a summary of the figures of merit obtained for the interaction energies and distances for bromoaspirin and aspirin after the zeroth and second order refinement of the structural data. It shows clearly the interplay between the interaction energies and distances between the nineteen residues as well as the role of quantum mechanics refinements on a deeper understanding of the binding of bro-moaspirin and aspirin to COX-1.

High-throughput methods for the determination of protein structures provide information needed to build structure-activity relationships, being X-ray crystallography the major source of structural information nowadays. Details at the atomic and electronic levels of the protein molecules, needed for a deeper understanding of properties that remain unrevealed after tradi-tional structural elucidation, are provided by methods based on quantum chemistry calculations (56). In particular, quantum refinement is becoming an important tool for the improvement of as measured protein crystal data (31). In our quantum chem-istry description of the inactivation of ovine cox-1 by bromo-aspirin and aspirin, the 3.4 Å resolution X-ray structural data of Joll et al. (18) was improved through the zeroth and second order quantum refinement we have developed within the LDA-DFT approach. Besides, we have created structural data for aspirin with the Br→H simulation in the binding pocket fol-lowed by a total energy minimization procedure after the Ser530 acetylation. Quantitative figures on the role of each residue binding bromoaspirin and aspirin were obtained within the MFCC scheme, and the results were depicted in BIRD panels, which are very useful for the analysis of the binding pocket energetic, furnishing a simple view of the binding ener-gy of each residue to its closer ligand atom.

If the bromoaspirin structural data as published by Joll et al. (18) have not being second order refined, a comparison between the total COX-1 binding energy of bromoaspirin (after the zeroth order refinement) and that of aspirin (as simulated), -70.21 kcal/mol and -39.56 kcal/mol, respectively, would sug-gest that aspirin is more effective than bromoaspirin in inacti-vating COX-1, a wrong result. It was necessary to pursue the second order refinement of the bromoaspirin structural data of Joll et al. (18) to obtain -72.82 kcal/mol for the total COX-1 binding energy of bromoaspirin (after the second order refine-ment), which is then in close agreement with that of aspirin (as simulated), -70.21 kcal/mol. Consequently, a second order quantum refinement of the structural data published by Joll et al. (18) is necessary to explain correctly why the IC50 values for the 126 μM COX-1 activities of both bromoaspirin and aspirin are identical according the measurements of Joll et al. (18).

Usually is not an easy task the determination of the main resi-dues involved in the binding of a ligand. On the basis of struc-tural data, the COX-1 active site is considered to have about twenty four residues (22), from which it is currently accepted that the polar residues Arg120, Ser353 and Ser530 are the most important. Besides, Ile523 and Tyr385 are important due to their mutation to Val523 and Phe385, respectively, which con-siderably reduces aspirin action (22,57). The results of our quantum chemistry calculations show that Arg120 is the residue that binds more effectively to the salicylic acid after the Ser530 acetylation. So, we not only confirm the interpretation based strictly on the structural data that Arg120 is and important residue binding bromoaspirin and aspirin to COX-1, but also we obtain unequivocally that it is the most important one. On

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the other hand, our results also shown that Leu359, Ala 527 and Leu351 bind strongly the salicylic acid after acetylation rather than Ser353 and Ser530. Consequently, the usual interpretation of the role of these residues is limited since it underestimated the role of Leu359, Ala 527 and Leu351.

Among the twenty four residues which are considered the most impor-

Table 1. Interaction energies and distances between the nineteen residues in the 6.5 Å COX-1 binding pocket and the salicylic acid

after Ser530 acetylation of bromoaspirin and aspirin. They were calculated considering the zeroth and the second order refinement of

the original crystal diffraction data as published in pdb 1PTH.

RESIDUE BrAsp 0

th Refinement Asp 2

nd Refinement BrAsp 2

nd Refinement

E (kcal/mol) d (Å) E (kcal/mol) d (Å) E (kcal/mol) d (Å)

Leu93 0.77 5.19 -0.42 4.53 -0.40 4.54 Val116 -0.36 3.23 -6.64 2.09 -6.57 2.11 Arg120 -73.59 2.60; 2.80 -78.31 2.00; 2.80 -77.80 1.90; 2.80 Val349 0.66 2.25; 2.40 -1.66 2.50; 2.50 -1.73 2.50; 2.60 Gln350 1.83 6.20 1.63 6.59 1.63 6.50 Leu352 -0.49 2.45 -0.80 3.67 -0.84 3.63 Ser353 -1.85 3.90; 4.00 -3.59 4.10; 4.30 -3.66 3.90; 4.00 Tyr355 -0.56 2.74 -6.07 2.34 -6.09 2.36 Leu359 -3.47 4.10; 4.20 -5.98 3.50; 3.90 -5.89 3.70; 4.30 Trp387 2.24 4.30 1.41 5.98 1.41 6.00 Phe518 0.07 3.52 -0.18 5.06 -0.19 5.01 Met522 -0.25 5.24 -1.41 5.78 -1.40 5.81 Ile523 0.53 2.50; 2.50 0.41 2.10; 3.00 0.41 2.10; 3.00

Glu524 48.02 6.05 41.64 5.61 41.65 5.63 Gly526 -1.57 5.50; 5.90 -2.62 5.90; 6.30 -2.63 6.00; 6.40 Ala527 -4.55 2.80 -5.03 2.73 -5.12 2.80 Pro528 2.98 6.20 2.52 7.09 2.51 7.10

OAH530 -5.88 2.80 0.29 3.35 -2.97 3.10 Leu531 -4.24 2.20 -5.39 2.20 -5.13 2.20

tant ones according previous analysis based on strict structural data, Leu117, Phe205, Phe209, Val344, Ile345, Tyr348, Phe381, Leu384, Tyr385, Gly355 and Leu354 are out of the 6.5 Å binding pocket region of our focused ovine COX-1. Due their larger distance to the salicylic acid, their interaction energy individually should be smaller than 1.0 kcal/mol, do not con-tributing significantly to the salicylic acid binding. On the other hand, Leu93, Val116, Gln350, Met522, Glu524 and Pro528 are residues in the 6.5 Å binding pocket, but were not considered as important to the salicylic acid binding according previous inter-pretations based strictly on the structural data (22). However, it was quite surprisingly for us to find that among these “missed residues”, Glu524 has a very strong repulsive (41.6 kcal/mol) interaction energy with the salicylic acid, which surely place it as the second most important residue for bromoaspirin and aspirin binding to COX-1.

In respect to the mutations related residues Ile523 and Tyr385, we have performed calculations of their interaction energy with salicylic acid, finding about +0.41 kcal/mol and +1.17 kcal/mol for them. Note that Tyr385 is out of the 6.5 Å, and its interac-tion energy was calculated for the sake of completeness, being stronger than that of Ile523 (which is closer to the salicylic acid) due to its charge state. Consequently, the structural modi-fications related to the mutations Phe385 and Val523 can en-hance locally their binding character. We highlight that our work suggest for the drug expert design some aspirin sites to be modified for the enhancement or decrease of its interaction with COX-1, ii(C3)H for example. As a matter of fact, aspirin ana-logues with modifications at ii(C3)H have been proposed re-cently (58).

CONCLUSIONS

Our results suggest strongly that the usual interpretation of restrict structural data cannot allow for a definitive evaluation of what are the main residues involved in the COX-1 inactiva-tion by bromoaspirin and aspirin. As a consequence, docking procedures of aspirin and derivatives based solely on geomet-rical aspects are of limit usefulness. On the other, our quantum refinement of the structural data and quantum chemistry calcu-lations indicate that the most important residues binding bro-moaspirin and aspirin to COX-1 after acetylation are deter-mined by a balance between their charge state and their distance to the salicylic acid. As a matter of fact, Arg120 is the most important attracting binding residue, being 2.6-2.8 Å distant (very close) from i(C1’)O1’ but it is not highly charged; on the other hand, Glu524 is an important repulsive binding residue, being 5.7-6.2 Å distant (very far) from ii(C6’)H but highly negatively charged for the strong repulsion to occur. The locali-zation and charge features of the Arg120 and Glu524 residues are observed in Figure 4 and Figure 8, respectively.

Finally, some words are worth of mention about the limits of our LDA-DFT calculations. Considering that the exact form of the exchange-correlation (XC) functional in DFT is unknown, some kind of approximation must be used. The most common approaches found in the literature are the local density approx-imation (LDA), the generalized gradient approximation (GGA), and hybrid XC functionals. In the first case, only the local electron density enters in the computation of the XC energy, while in the second case the electron density and its gradient are used. GGA functionals perform better to describe systems with hydrogen bonds, including water, ice, and intramolecular bonds in amino acids (59-61), but are not accurate for systems involv-ing van der Waals (vdW) forces (62,63). Hybrid functionals, which combine "pure" DFT functionals with the exact form of the exchange energy, are problematic to describe vdW interac-tions as well. On the other hand, the LDA XC functional does

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not provide an accurate description of hydrogen bonding and has a poorer accuracy, in comparison with GGA, to predict the structures and energies of molecules. Nevertheless, it predicts reasonable values for interlayer distances in graphite (62,63), and has been used to investigate organic molecular crystals (64,65), including crystals of the nucleotide basis guanine (66). Taking into account all these facts and the need to achieve the best balance between computational cost per simulation run and the size of the drug-protein binding site complex investigated (which involves tens of amino acid residues), as well as the dominant character of noncovalent dispersive forces present therein, we have opted for the LDA XC to estimate the strength of the drug-amino acid residue intermolecular interaction ener-gies. So, the figures for the total and interaction energies be-tween bromoaspirin, aspirin and the COX-1 residues in the binding pocket should be better recognized as good estimates, furnishing and improved picture of the general behavior tendencies instead of very precise values to be compared with experimental data.

In summary, the first detailed quantitative evaluation of the role of nineteen binding pocket residues on the inactivation of ovine COX-1 by bromoaspirin and aspirin was performed through a quantum chemistry description. It was given a practical demon-stration that the quantum refinement of X-ray structural data can be consistently undertaken within some approximations (orders of refinement), contributing significantly for an im-proved understanding of experimental data, as the case of the identical IC50 values for the 126 μM COX-1 activity for both bromoaspirin and aspirin measured by Joll et al. (18). It is important to remark that previous structural based results point-ing Arg120 as the most effective residue attracting the salicylic acid after Ser530 acetylation were confirmed, while Glu524 was shown surprisingly to be the second most important effec-tive residue, a repulsive one missed by all previous works focusing the action of aspirin on COX-1. Our results are highly important for the understanding of COX-1 mutations on aspirin binding, as well as for expert design of new aspirin derivatives, research lines that will be pursued by the authors.

METHODS

Computational framework – The quantum chemistry computa-tions were performed within the DFT approach (32-35), a step forward in structured-based drug design beyond docking, Mon-te Carlo statistical mechanics or molecular dynamics simula-tions (30). As a matter of fact, the routine use of quantum me-chanics in all phases of in silico drug design is a logical next step in the evolution of this field (36). The COX-1 fragment involving the resulting salicylic acid in a 6.5 Å binding pocket is decomposed into individual amino acid-based fragments that are treated with proper molecular caps. With this procedure, the interaction energy between the salicylic acid and the COX-1 residues in the binding pocket is given by the summation of interactions between the molecule and individually capped COX-1 fragments. As stated by Zhang and Zhang (37), this scheme, termed molecular fractionation with conjugate caps (MFCC), makes it possible and practical to carry out full quan-tum chemistry calculations of intermolecular interaction ener-gies involving proteins or other similar biological molecules.

The MFCC scheme was employed here to give an accurate and detailed description of the interaction energy between bromo-acetylated COX-1 and 2-benzoic acid. In this approach, the electron density of a protein with N-aminoacids can be obtained by combining linearly the separate electron densities of a set of capped fragments (52), including the disulfide concaps, if pre-sent (54). The electron density, on the other hand, is obtained through DFT, allowing the calculation of the total energy for the protein-ligand system. A suitable choice of conjugated caps is crucial for the method to comply with the chemical valence

requirements and mimic the local electronic environment of the original protein around the capped fragments (55) Presuming the existence of a well-defined local interaction energy, and assuming that the interaction energy of the ligand with regions of the protein decreases with distance, we can take into account only the amino acid residues within a cutoff radius from the ligand as being relevant for the interaction energy calculations, taking great care with the choice of the radius r to consider all the most important contributions.

The ovine COX-1 structural data – As the initialization data for the quantum chemistry calculations, the 3.4 Å resolution X-ray crystal structure of ovine COX-1 published by Joll et al. (18) inactivated by the potent aspirin 2-bromoacetoxy-benzoic acid (bromoaspirin) was employed. Figure 1 shows the focused dimer, pdb entry 1PTH, with the two equally similar binding pockets. In both monomers, bromoaspirin is at the center of a circle of radius r, which determines the number of interacting residues. If r=5 Å, there are eleven residues in the binding pocket interacting with bromoaspirin, while for r=6.5 Å there are nineteen residues. Due to the similarity of the binding pock-ets in the COX-1 dimer, the quantum chemistry calculations were performed for one single monomer only.

The protonation state – To assess the importance of the 2-benzoic acid protonation state, the MFCC scheme was applied to bromoaspirin and aspirin taking into account the pH condi-tion. As a matter of fact, considering a neutral or slightly alka-line environment (as in the blood and in the intracellular medi-um, pH 7.2-7.4), the salicylic acid becomes deprotonated, i.e. the hydrogen atom bounded to the carboxylic group oxygen is removed, being a negative charge (-e) assigned to the oxygens – see Figure 2. To consider the existence of the environment dependent salicylic acid deprotonated state is of up most im-portance for an improved quantum chemistry description of the COX-1 inactivation by bromoaspirin and aspirin. The pH relat-ed COO- charged state contributes significantly to the inactiva-tion effectiveness of COX-1.

The aspirin simulation in COX-1 – The original crystal struc-ture of ovine COX-1 used to carry out the computations has a covalently bounded bromoaspirin molecule as ligand. To simu-late the effect of an aspirin molecule at the same binding pock-et, we replaced the bromine atom by hydrogen. Besides, the acetylated Ser530, the 2-benzoic acid and the hydrogen atoms in the binding site were optimized using the DMOL3 DFT code with the same parameters of the hydrogen geometry optimiza-tion, as described carefully in the below subsections, going beyond the structural binding pocket and binding energy calcu-lation procedure. After achieving the geometry convergence, the MFCC scheme was used to estimate the binding energy of the acetylated COX-1 to 2-benzoic acid. The eleven most im-portant residues in the ovine COX-1 binding pocket interacting with the salicylic acid after bromoaspirin acetylation are depict-ed in Figure 3A and Figure 3B after the zeroth and second order refinement of the crystal data, respectively. Figure 3C depicts the quantum chemistry simulated binding site for aspirin ob-tained after Br→H transformation and a second order refine-ment of the original crystal data. The types of crystal data re-finement are described in the next subsection.

The structural data refinement – To perform the quantum chem-istry computations, a 5 Å radius binding pocket was considered initially. This encircled region delimited eleven residues inter-acting with bromoaspirin and aspirin after acetylation: Val116, Arg120, Val349, Leu352, Ser353, Tyr355, Leu359. Ile523, Ala527, Ser530AcBr(H) [OAH530 in the pdb notation], and Leu531. This choice implied that the residues were 1.9-4.3 Å far apart the salicylic acid in the binding pocket, which seemed reasonable for the main interactions to occur. However, since several residues of the structurally accepted COX-1 active site

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were missed, the binding pocket radius was extended to 6.5 Å, being added the following eight residues (higher than 4.5 Å distant from the salicylic acid) to the binding pocket: Leu93, Gln350, Trp387, Phe518, Met522, Glu524, Gly526, and Pro528. Note that Leu93, Val116, Gln350, Met522, Glu524 and Pro528 are not considered as lining the hydrophobic COX-1 active site channel according to the usual interpretation of the COX-1 structural data (22).

Hydrogens are absent in the 3.4 Å resolution X-ray structural data of the ovine COX-1 co-crystallized with bromoaspirin. To bypass this problem, we have hydrogenated the residues. All of them, together with the salicylic acid in the binding pocket, were maintained structurally fixed, while the hydrogens posi-tioning was the variable for the X-ray structural data refinement process. A LDA minimization energy procedure for the atoms in the binding site allows the determination of the best hydro-gens positioning. This improvement is a LDA-based quantum chemistry refinement of zeroth order over the primary X-ray structural data. It is depicted in Figure 3A.

The binding energy calculation – The capped residues at the 2-benzoic acid binding site (and the acid itself) were hydrogenat-ed, the geometry of the hydrogen atoms being optimized after-wards using the DMOL3 DFT code. The Local Density Ap-proximation (LDA) approximation for the exchange-correlation energy was chosen within the PWC parameterization (54). The DNP numerical basis set was adopted to expand the Kohn-Sham orbitals together with DFT semi-core pseudopotentials. The orbital cutoff was set to 3.7 Å, and a total energy variation smaller than 10-6 Ha was assumed to achieve self-consistency. For the geometry optimization, convergence tolerances were: maximum energy variation smaller than 10-5 Ha, maximum force per atom smaller than 0.002 Ha/Å, and maximum atomic displacement smaller than 0.005 Å. In these calculations, the atomic coordinates of the COX-1 atoms obtained from X-ray diffraction measurements were kept fixed in the case of bromo-aspirin, while Ser530 was allowed to change during the total energy minimization procedure performed for the salicylic acid placement in the construction of the aspirin binding data.

Figure 9. Schematic representation of the MFCC method used for the DFT energy calculations describing the interaction of acid 2-benzoic and COX-1 residues to calculate: A - the first term, E(M-Ci-1RiCi+1); B - the second term, E(Ci-1RiCi+1); C - the third term, E(M-Ci-1Ci+1); D - the total energy of the system formed by the isolated caps, E(Ci-1Ci+1).

The interaction (binding) energy between the 2-benzoic acid mo-lecule and each amino acid residue Ri, E(M-Ri), was calcu-lated according to:

E(M-Ri) = E(M - Ci-1RiCi+1) - E(Ci-1RiCi+1) - E(M - Ci-1Ci+1) +

E(Ci-1Ci+1) (1)

The Ci cap is obtained by taking the residue Ri and attaching a carboxyl or amine group to its dangling bond. At the right side of Eq. (1), the first term E(M-Ci-1RiCi+1) (see Fig. 9A) is the total energy of the system formed by the 2-benzoic acid and the capped residue; the second term, E(Ci-1RiCi+1) (see Fig. 9B), gives the total energy of the capped residue alone, while the third term, E(M-Ci-1Ci+1) (see Fig. 9C) is the total energy of the system formed by the set of caps and ; finally, E(Ci-1Ci+1) (see Fig. 9D) is the total energy of the system formed by the isolated caps.

The binding energy panel BIRD – The binding energy of the amino acid residues interacting with the salicylic acid after bromoaspirin acetylation was calculated considering the zeroth as well as the second order refinement of the original X-ray data. It is depicted in Figure 6 through the graphic panel BIRD. On the other hand, the binding energy of the amino acid resi-

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dues interacting with the salicylic acid after bromoaspirin and aspirin acetylation was calculated considering the second order refinement of the original X-ray data is depicted in the BIRD panel of Figure 7. BIRD is an acronym of the keywords binding site, interaction energy and residues domain, and shows clearly: (i) the binding energy (in kcal/mol) of the residue to one or more atoms of the drug by the horizontal bars, from which one can assign quantitatively the role of each residue in the binding site, i.e., their effectiveness, whether attracting or pushing the drug; (ii) the most important residues contributing to the bond-ing, which are shown in the column of residues (beginning with Arg120 in both figures) in the left side; (iii) the region i, ii or iii and the atoms of the salicylic acid (e.g., i(C1')O, which are placed at the top of the horizontal columns) interacting with each residue (placed at the left) of the binding site.

The electrostatic potential – The molecular electrostatic poten-tial is visualized through a map of its values onto the surface reflecting the molecular boundaries. The latter was generated through overlapping the van der Walls radii of all atoms in the molecule considering a constant value for the electron density. The total electronic charge density was computed by choosing a number of grid points around the molecule, which gives rise to a three dimensional grid. The medium density of points gives a grid resolution of 0.25 Å and a grid interval of 3.0 Å; the value of the charge density surface was set at 0.017 electrons/Å3. The total electrostatic potential was computed using the same grid resolution. The charge density is visualized as a normal isosur-face (a single surface is generated at the specified isovalue, in this case 0.45 Å3), while the electrostatic potential volumetric data was generated as a 3D field whose values were mapped onto each point of the electron density isosurface.

ACKNOWLEDGMENT: C.G., V.N.F., B.S.C., and E.L.A. are senior researchers from the Brazilian National Research Council (CNPq), and would like to acknowledge the financial support received during the development of this work from the Brazilian Research Agencies CAPES-PROCAD and Rede Nanobiotec, CNPq-INCT-Nano(Bio)Simes project 573925/2008-9, FAPERN-CNPq (Pronex), CNPq project 478916/2010-8, National Institute of Science and Technology for Excitotoxicity and Neuroprotection – INCTEN, and FINEP Rede IBN 01.06.0842-00. E.W.S.C. received financial support from CNPq projects 304338/2007-9 and 482051/2007-8.

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