BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Semestre 2010-2

ProfesorasM. En C. María del Carmen Parra González (Edificio E lab105)

cparra@servidor.unam.mx Dra. Carmina Montiel Pacheco (Edificio E lab 102)

carmina.montiel@gmail.comwww.bqexperimental.wordpress.com

ALGUNAS COSAS A CONSIDERAR

HORARIO

LUNES 15:00-19:00 h

MIÉRCOLES 15:00-17:00 h

Tiempo límite de entrada 15:10

Evaluación prevía (cada clase) 15:10 hRetroalimentación 15:25 h

Trabajo de laboratorio e informe (reporte científico)

INDIVIDUAL (bitácora) EQUIPO para entregar

Introducción

Hipótesis

Objetivo general o particular

Métodos (Diagrama de Flujo)

Cuadro de registro de datos

y observaciones

Tratamiento de datos (cálculos)

Cuadro de resultados y/o gráficas y figuras

Análisis de resultados

Discusión

Resumen de la introducción

Hipótesis integrada

Tratamiento de datos (cálculos)

Cuadro de resultados (UNIDADES)

Análisis de resultados

Discusión

Trabajo de laboratorio e informe

INDIVIDUAL (bitácora) EQUIPO para entregar

Referencias (revistas, libros, web)

Cuestionario

Borrador del reporte

Referencias (revistas, libros, web)

Cuestionario

Reporte en forma de póster 2 cuartillas máximo

CURVA PATRON Y MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS

Son métodos cuantitativos de análisis químico que utilizan la luz para medir la concentración de las sustancias químicas.

Espectrofotométria de absorción visible (Colorimetría)Absorción ultravioleta (UV)Infrarroja

ESPECTROFOTOMETRÍA

Radiación Efecto Técnica Espectroscópica

Información Obtenida

UV- VIS Transiciones electrónicas entre los orbitales atómicos y moleculares

Espectroscopía ultravioleta-visible

Existencia de cromóforos y/o conjugación en la molécula a las absorciones observadas

Espectrofotómetro

Tungsteno (visible)Deuterio (UV)

LEY DE LAMBERT Y BEER

Establece que la absorbancia es proporcional al número de moléculas absorbentespor las que pasa la luz.

A = ε*C*bA = absorbanciaC= concentraciónb=longitud de la celda

ε= coeficiente de extinción o absortividad molar?

Es una propiedad intrínseca de los compuestos. Es una medida de absorción de luz de las especies químicas a una determinada longitud de onda

Unidades

ε=M-1cm-1

Coeficiente de extinción o absortividad molar

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA

Los métodos más usuales son:

-Absorción en el ultravioleta.

-Reacción del Biuret.

-Método de Lowry.

-Método de Bradford.

•Es un método no destructivo.

•El intervalo de concentración que se puede determinar depende del contenido de los aminoácidos Tyr y Trp, y oscila entre 0,05 y 2 mg/ml.

•La presencia de sustancias absorbentes a 280 nm conduce a interferencias.

Absorción en el ultravioleta

Las características más importantes de la reacción son:

La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los péptidos y proteínas.Su intervalo de determinación es de 1 a 6 mg/ml.No depende de la composición de aminoácidos.Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reacción.

Complejo proteína-Cu(II) (Proteína en solución

alcalina)

Método de Biuret

+ NH3

Coloración violeta-púrpura (540nm)

Esta coloración se atribuye a la reducción del ácido fosfomolíbdico/fosfotúngstico a azul deheteropolimolibdeno de composición no definida, por medio de los residuos tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos e histidilos de las proteínas que forman el complejo con el Cu2+.La intensidad de la coloración varía con la composición de aminoácidos de la proteína.Es más sensible que el ensayo del biuret. El intervalo es de 0,1-1 mg/ml.Presenta muchas interferencias.

Método de LOWRYREACCIÓN DE BIURET + REACTIVO DE FOLIN-CIOCALTEU

(750 nm)

•El rango de determinación de proteína es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4 mg/ml (ensayo estándar).•La intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y aromáticos.

Método de BRADFORD

MÉTODO VENTAJAS DESVENTAJAS

Método de Absorción No se pierden las muestras Interfieren compuestos que absorben en el UV

MÉTODOS COLORIMÉTRICOSBiurtet Específico para proteínas,

muestra pocas interferencias es barato

Poca sensibilidad 1 a 6 mg/mL

Lowry Tiene bastante sensibilidadde 0,1-1 mg/mL.

No todas las proteínas reaccionan igual. Muestra interferencias con detergentes no iónicos, sulfato de amonio

Bradford Muy sensible0,5 -1,4 mg/mL

Muestra interferencias con detergentes

Es un marco de referencia que se construye de cantidades conocidas de una sustancia (por ejemplo la albúmina sérica bovina) que se utiliza para determinar la cantidad de proteínas presente en una muestra incógnita.

Curva Patrón

BSA (µg)BSA (µg)

A750nm

A280nm

PRECISIÓN Y EXACTITUD

• La precisión se refiere a cuánto concuerdan dos o más mediciones de una misma cantidad.

• Ej.Todos los lanzamientos de las flechas concuerdan en un punto que no es la posición exacta

• Hay precisión en los lanzamientos pero no exactitud.

Precisión

Exac

titud

Alta Baja

Alta

Baja

PRECISIÓN Y EXACTITUD

• La exactitud indica cuán cerca está una medición del valor real de la cantidad medida.

• Ej.Todas las flechas alcanzan el centro que es la posición exacta de los lanzamientos..

• Hay exactitud y precisión en el lanzamiento

Precisión

Exac

titud

Alta

Alta

Baja

Baja

PRECISIÓN Y EXACTITUD

Estudiante 1 Estudiante 2 Estudiante 3

2,65 2,87 3,01

2,76 2,86 3,00

2,68 2,87 2,99

Se solicitó a tres estudiantes determinar la masa de un cilindro de aluminio cuya masa real es de 3,00 g.