BIOTECNOLOGIA

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE BIOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS

BIOTECNOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOTECNOLOGÍA

COMPILADORES:

Principal: M. en C. Rocio Cortes Rodríguez

Colaboradores: M. en C. Rocio Cortes Rodríguez

Revisado por: Academia de Biologia 2011

Ciudad Juárez, Chihuahua

Universidad Autónoma de Ciudad Juárez

2009

p. 81

M. en C. Emilio Clarke Crespo

Coordinador de la Academia de Biología

D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias

Coordinador del Programa de Biología

Dr. Alejandro Martínez Martínez

Jefe del Departamento de Ciencias Químico-Biológicas

M.C. Hugo Staines Orozco

Director del Instituto de Ciencias Biomédicas

Aprobados por la Academia de Biología, 2011

Laboratorio de Biotecnología

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CONTENIDO

Practica 1. Preparacion de las soluciones madre para Medios de Cultivos para plantas………………………………………………………………………………………....…3

Practica 2. Preparacion de los Agares para cultivo de plantas in vitro....……………….10

Practica 3. Cutivo in vitro de plantas (semilla)………………………………...…..……….15

Practica 4: Cultivo in vitr de plantas (organos vegetales)……………………...………….19

Practica 5: Fermentaciones…………………………………………………………………..23

Practica 6: Glicolisis anaerobica y fermentación ……..……………………………………26

Practica 7: Fermentacion alcoholica……………………………….………………………..29

Practica 8. Fermentacion lactica……………………………………………………………..34

Practica 9: Analisis de tecinicas para deteccion de alimentos OGM (documental)………………………..………………………………………………………….37

Practica 10: Extraccion de ADN eucariotico……………….……………………………….39

Practica 11: Extraccion de ADN procariotico……………………………………………….43

Practica 12: Electroforesis con geles de Agarosa………..………………………………..46

Practica 13: Reaccion en Cadena de la Polimerasa y sus variantes (PCR) (Demostrativa y Documental)…………………………………………………………….….50

Practica 14. Secuenciacion de ADN (demostrativa, Documental)……………………….53

Practica 15. Prueba diagnosticos (ELISA)…………………………….……………………55

Practica 16: Bioinformatica y Biotecnologia………………………………………………...58

Practica 17. Biorremediacion (documental)……………………...…………………………60

Practica 18. Fitorremediacion……………..……………………………..…………………..62

Practica 19. Biocombustibles………………………………………………………………...64

Practica 20. Analisis de contaminacion del agua………………………….……………….67


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Practica 1: Preparación de soluciones madre para los medios de cultivo

Objetivo:

Que el alumno obtenga un conocimiento práctico sobre los diversos métodos de preparación de medios de cultivo para propagar in vitro.

Introducción:

Son muchos los componentes de un medio para cultivar material vegetal "in vitro": por ejemplo, se encuentran las sales minerales que incluyan todos los elementos esenciales tanto micro como macronutrientes, las vitaminas tales como riboflavina, tiamina, piridoxina, ácido nicotínico, ácido pantoténico, biotina, y ácido fólico. Aminoácidos tales como L-glutamina, asparragina y cisteína, los hexitoles como mio-inositol, hormonas y reguladores del crecimiento, una fuente de carbono y un agente gelificante.

Un método de hacer menos tedioso el trabajo consiste en preparar lo que se conoce como "soluciones madre" de algunos de estos componentes. Estas soluciones tienen una concentración que suele ser 10, 100 e incluso 1000 veces superior a la concentración final del medio. Su ventaja no estriba sólo en el hecho de que hay que pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino también la exactitud de la pesada ya que algunos compuestos están tan diluidos en la solución final, que la pesada que habría que hacer estaría por debajo de los límites de exactitud de las balanzas de precisión.

Las soluciones madre se conservan en frio y en bote color ámbar durante algunos meses, desechándose ante cualquier señal de precipitación.

Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales, los aminoácidos, hormonas, vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente gelificante se pesan cada vez ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y no se conservan bien en solución. En el caso de las hormonas es mejor preparar una solución madre de cada una de ellas y medir volúmenes determinados y congelarlos.

Materiales:

Botes de cristal o de plástico (preferiblemente de los primeros por su transparencia), que en algunos casos habrán de ser de color ámbar para proteger de la luz determinados compuestos que son fotosensibles.

Balanza granataria

Balanza analítica

Espátulas de distinto tamaño para pesar


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Embudos de pesar

Agitador magnético

Imanes

Vasos de precipitados

Probetas

Matraces aforados

Eppendorf

Compuestos químicos

Agua destilada Autoclave

Termoplato

Algodón

Gasas

Tape

Cajas petri estériles

Tubos de ensaye esmerilados con tapa

Procedimiento:

Se establecerán 8 equipos de trabajo por cada grupo de prácticas (2 en cada lateral de una mesa).

Normas generales a la hora de pesar

- Se debe comprobar los cálculos. Y tener en cuenta que los valores de las soluciones madre están expresados para un litro

- Debe leer las características del reactivo que se va a pesar. Algunos son tóxicos por inhalación o en contacto con la piel y hay que mantener las debidas precauciones.

- Para medidas desde 0.01 g se utilizará la balanza granataria. Para valores inferiores la balanza analítica.

- Antes de pesar hay que tarar el recipiente donde se está haciendo la pesada. Nunca se debe pesar directamente sobre el platillo de la balanza, favor de colocar pesa sustancias.


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- Antes de introducir la cucharilla de pesar en un frasco de reactivo hay que asegurarse de que esté limpia y seca. Es una precaución que evita la contaminación de los reactivos.

- Hay que tener la precaución de tomar del frasco de reactivo muy poca cantidad de modo que en la medida de lo posible se evite devolver al frasco parte de lo que se tomó.

Normas generales a la hora de preparar las disoluciones

- Si la disolución se va a remover con un agitador mecánico el mejor recipiente es un vaso de precipitados. Si la agitación es manual, suele ser mejor un erlenmeyer.

- Antes de empezar a añadir los solutos se deberá poner un 70% del volumen total de agua

- Cuando una disolución incluya más de un reactivo, estos se añadirán uno a uno y teniendo la precaución de no añadir uno hasta que el otro esté totalmente disuelto.

- Para enrasar al volumen final se utiliza un matraz aforado o una probeta, nunca un vaso de precipitados o un erlenmeyer.

- Una vez preparada se debe guardar en un frasco perfectamente etiquetado en el que figuren los siguientes datos: - Tipo de solución. Ej. Macro de MS, sol A de DKW etc - Grado de concentración. Ej 100 X (100 veces más concentrada que la

solución final) - Componentes con fórmula y peso en g/l - Fecha de preparación - Nombre de los integrantes del equipo

Equipo 1 Preparará 250 ml de la solución de macronutrientes del medio MS.

Equipo 2 Preparará 250 ml de la solución de Calcio MS y 250 ml de la solución de Hierro y EDTA MS. En este segundo caso, se deberá poner en el recipiente donde se prepara la disolución un volumen de agua de aproximadamente un 80% del final y adicionar la solución de hierro. Cuando se haya disuelto, adicionar poco a poco y en agitación las sales de EDTA hasta su total disolución. Si es necesario, se puede calentar un poco la disolución. Guardar en frasco ámbar y colocar en refrigeración.


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Equipo 3 Preparará 250 ml de la solución de micronutrientes del medio MS.

Equipo 4 Preparará 250 ml de la solución de vitaminas del medio MS.

Equipo 5 Preparará 250 ml de de cada una de las siguientes soluciones A, B, C y D del medio DKW.

Equipo 6 Preparará 250 ml de cada una de las siguientes soluciones: F1, G, H y las hormonas del medio DKW.

- La solución H se prepara del siguiente modo: se pone en el recipiente donde se prepara la disolución un volumen de agua de aproximadamente un 80% del final y se adiciona la sal de hierro. Cuando se haya disuelto, se adicionan poco a poco y en agitación las sales de EDTA hasta su total disolución. Si es necesario, se puede calentar un poco la disolución. Guardar en frasco ámbar en refrigeración.

- Hormonas. Se prepararán 10 ml de cada una de las disoluciones. Para cada una de ellas se procederá del siguiente modo: Se pesará la hormona en el un tubo aforado. Se le añaden unas gotas de NaOH 1N y se disuelve. A continuación se va añadiendo poco a poco y agitando, agua destilada hasta enrasar los 10 ml. Se agita bien y se reparte en 10 eppendorf. Se rotulan cada uno de ellos y se guardan en el congelador.

Equipo 7 Preparará 250 ml de la solución E

Equipo 8 Preparará 250 ml de la solución F2. Primero se preparan 500 ml de la solución de biotina. De estos 500 ml, se toman 250ml y se les añade la cantidad correspondiente a 250 ml del resto de las vitaminas.

Después de la explicación anterior, se prepararan las soluciones madre de las sales, vitaminas, aminoácidos y hormonas necesarias para los medios DKW y MS. Veamos la composición de cada uno de ellos:


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Sales mineralesMS (Murashige and Skoog, 1962)

(g/l)

(NH4 )NO3 1.650

KNO3 1.900

CaCl2.2H2O 0.440

MgSO4.7H2O 0.370

KH2PO4 0.170

FeSO4.7H2O 0.0278

Na2EDTA. 2H2O 0.0372

MnSO4.H2O 0.0169

ZnSO4.7H2O 0.0086

H3BO3 0.0062

KI 0.00083

Na2MoO4.2H2O 0.00025

CuSO4.5H2O 0.000025

CoCl2.6H2O 0.000025

Mioinositol 0.100

Tiamina HCl 0.0001

Acido nicotínico 0.0005

Piridoxina HCl 0.0005

Glicina 0.002

Sales minerales DKW modificado

(g/l)

(NH4)NO3 1.416

Ca (NO3)2 3H2O 1.811

(1.960 si es 4 H2O)

CaCl2 2H2O 0.147

MgSO4 7H2O 0.74

KH2PO4 0.258

FeSO4 7H2O 0.00676

Na2 EDTA 2H2O 0.0908

K2SO4 1.56

Mn SO4 H2O 0.0338

Zn SO4 7H2O 0.0212

BO3H3 0.0124

KI 0.00166

Na2MoO4 2H2O 0.0005

Cu SO4 5H2O 0.00005

Co Cl2 6H2O 0.00005

Mioinositol 0.1

Tiamina H Cl 0.001

Ác. nicotínico 0.001

Piridoxina. HCl 0.001

Biotina D(+) 0.00001

Glutamina (base libre ) 0.001

L-Cysteína H Cl 0.001

Pantotenato de Ca 0.1


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Lo más normal es preparar soluciones que contengan varios componentes, de modo que la preparación de la solución final sea más rápida y tenga menos margen de error.

Veamos la composición de cada una de las soluciones madre de ambos medios:

Soluciones madre del medio MS (g/l)

MACRONUTRIENTES (10 X)

NH4NO3 16.5

KNO3 19

MgSO4.7H2O 3.7

KH2PO4 1.7

CALCIO, (10 X)

CaCl2.2H2O 4.4

MICRONUTRIENTES (100 X)

MnSO4.H2O 1.69

ZnSO4.7H2O 0.86

H3BO3 0.62

KI 0.083

Na2MoO4.2H2O 0.025

CuSO4.5H2O 0.0025

CoCl2.6H2O 0.0025

HIERRO Y EDTA (10 X)

FeSO4.7H2O 0.278

Na2EDTA.2H2O 0.372

VITAMINAS (20 X)

Mioinositol 2

Tiamina HCl 0.002

Acido nicotínico 0.01

Piridoxina HCl 0.01

Glicina 0.04

Soluciones madre del medio DKW modificado (g/l) A (10 X)

NH4NO3 14.16

CaCl2 2 H2O 1.47

Ca (NO3)2 3 H2O 18.11 ( 19.60 g/l si es 4 H2O )

B (10 X)

KH2PO4 2.58

C(10 X)

K2SO4 15.6

D (10 X)

Mg SO4 7 H2O 7.4

E (50 X)

Mn SO4 7H2O 1.69

Zn SO4 7H2O 1.06

BO3H3 0.6.2

KI 0.083

Na2MoO4 2H2O 0.025

Cu SO4 5 H2O 0.0025

Co Cl2 6H2O 0.0025

F1 (100 X)

Glutamina (base libre ) 0.1

L-Cisteína HCl 0.1

F2 (100 X)

Biotina D(+) 0.001

Tiamina H Cl 0.1

Ác. Nicotínico 0.1

Piridoxina 0.1

Pantotenato de Ca 0.1


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Referencias:

Álvarez Tinaut, Carmen y Espinosa Borreguero, Francisco. Guiones de prácticas

de Biotecnología Vegetal. Universidad de Extremadura (Badajoz)

Driver, J.A., Kuniyuki, A.H. (1984). In vitro propagation of Paradox walnut

rootstock. Hort. Science, 19(4).

Murashige, T. And Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and

bioassays with tobacco tissue cultures. Physiología Plantarum, 15, 473-497.

Revilla Bahillo, Ángeles y Ordás, Ricardo. Guiones de prácticas de Biotecnología Vegetal. Universidad de Oviedo

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Conclusiones:

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Practica 2: Preparación de los Agares para cultivar in vitro.

Objetivo:

El estudiante tendrá conocimiento de la preparación de los agares para cultivar plantas in vitro a partir de las soluciones madre (practica 1), para con ello tenga mas claro el concepto de micro propagación de plantas para mejora biotecnológica.

Introducción:

El término “cultivo de tejido vegetal” implica una amplia gama de técnicas de cultivo tanto de órganos, como de tejidos y células e incluso plantas completas, entre las que se encuentra la micro propagación; la recuperación de embriones; la regeneración de plantas a partir del callo y la suspensión de células, así como el cultivo de protoplasma, anteras y microsporas, que se utilizan sobre todo para la multiplicación de plantas en gran escala (Segretin, 2006).

Materiales:

Autoclave Sacarosa

Algodón Agar-Agar

Frascos gerber

Tubos de cultivo

Ligas

Papel aluminio

Matraz de 1000ml

Moscas magneticas

Termoplato

Campana de flujo laminar

Agua destilada

Etanol

Soluciones madre del MS


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Procedimiento:

Para la preparación de los Agares para medio de cultivo para plantas:

El medio de cultivo es el Murashige & Skoogque que consta de una amplia cantidad de nutrientes los cuales se muestra en la siguiente figura:

Para su preparación en 1000 mL se pesan las cantidades de cada uno de los compuestos o en su defecto si estos ya se tienen pre-pesados y en un frasco limpio por separado solo se agrega la cantidad adecuada según el volumen a preparar.

Agrega el agua destilada al matraz en que se preparara, disolver el medio ya pesado, agitar muy bien hasta observar cierto grado de solubilización. Agregar la sacarosa Ajustar el pH a 5.8 y agregar el agar-agar.


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Someter a calentamiento con agitación sin que llegue a la ebullición. Proceda a vaciar el medio en frascos limpios y asegúrese de llenarlos con aproximadamente 50 mL, 2/4 del recipiente o según vea necesario. Meter a la autoclave para su esterilización (250°F, 15 lb, 15 min). Pasado este periodo de esterilización, se sacan de la autoclave y se dejan enfriar y se meten a refrigeración o bien a una alacena limpia.

Resultados:

Pesado y calentado

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Esterilizado

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Vaciado

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Conclusiones:

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Referencias:

Krikoria, A. (1990). Medios de cultivo: generalidades, composición y preparación. Universidad de Nueva York. New York, E.U. 1-19 Mroginski, A. (2008). Establecimiento de cultivos vegetales in vitro. Unidad de investigación de Biotecnología. Cali, Colombia. 1-22 ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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Practica 3: Cultivo in vitro de plantas (semillas)

Objetivo:

Que el estudiante se familiarice con la siembra de semillas in vitro, que aprenda las técnicas para cultivos de tejidos, órganos vegetales y la obtención de callos a partir de secciones de zanahoria.

Introducción:

La biotecnología vegetal es “el cultivo in vitro de las plantas, en recipientes de vidrio”, y supone mantener las plantas en laboratorio, fuera de su entorno natural, teniendo como sustrato un medio de cultivo. En la composición del dicho medio se encuentran elementos minerales, agua, hormonas, sustancias orgánicas y vitaminas, siendo su porcentaje muy variable según las especies vegetales y pudiendo faltar alguno de estos componentes. La biotecnología actual se centra en la obtención de fármaco y vacunas y sobre todo en la obtención de nuevas especies y variedades con capacidad para soportar ataque de microorganismos o situaciones de estrés (salino, hídrico, etc.). Es de destacar la obtención de nuevos híbridos vegetales, por adición de ADN foráneo, obteniéndose los conocidos “organismos transgénicos”.

Materiales:

Campana de flujo laminar

Estuche de disección; bisturí, pinzas grandes, pinzas pequeñas y tijeras.

Frascos gerber con agar para plantas

Tubos con agar para plantas

Vasos de precipitados (7)

Mecheros

Alcohol

Agua estéril

Cloro

Probetas

Cajas petri


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Procedimiento 1: desinfección de semillas

Para nuestra practica con semillas, se dispondrán de diversos tipos de semillas de cereales y frutos cítricos completos. Las semillas que se extraigan de los frutos ya están estériles (luego no hay que desinfectarlas), pero las semillas aisladas si que hay que esterilizarlas (con dos agentes: cloro y alcohol).

Los pasos a seguir para la desinfección son:

1. se deben envolver las semillas en paquetes para poder manipular con las pinzas y una vez hechos se procede a esterilizarlas.

2. Se sumergen en etanol durante 1 min 3. Se sumergen en solución de hipoclorito de sodio o cloro al 20% por 15 min. 4. Se enjuagan en tres vasos de precipitados con agua estéril, destilada,

desionizada durante un par de minutos por cada vaso (7).

Procedimiento 2: Siembra de semillas (área estéril)

Una vez que se tienen en el 7mo vaso de precipitado de agua estéril, las semillas ya están listas para su siembra en tubos de ensayo o en frascos gerber, que tiene medio de cultivo para plantas adecuado. Para sembrar las semillas en los medios de cultivo se enciende el mechero, se lavan las manos hasta el medio brazo y después se remojan en etanol al 10% hasta que se seque inician la manipulación o bien utilizar guantes estériles. Después de eso toman el paquete de material estéril y las cajas de petri de vidrio, que nos servirá como mesa de trabajo. Con la ayuda de unas pinzas, se pone el paquete de semillas sobre una caja de precipitados y se abre, con las pinzas se toman las semillas para depositarlas en el medio de cultivo.

En el caso de los frutos de cítricos completos se procede a esterilizar el fruto entero pulverizando con alcohol y luego la flamea. En la campana de flujo laminar se abren los frutos (limón, naranja o mandarina) y se extraen las semillas con unas pinzas. Tras hacer una pequeña incisión en la cubierta se siembran en tubos o frascos gerber con el medio de cultivo adecuado.


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Resultados:

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Conclusiones:

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Referencias:

Serrano G.M, Biotecnología vegetal, Madrid D.L

Pierik, R.L.M. Cultivo in vitro de plantas superiores, Madrid M.P

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Practica 4: Cultivo in vitro de plantas (órganos vegetales)

Objetivo:

El alumno aprenderá a realizar el montaje de un cultivo de tejidos vegetales a partir de explantes nodales.

Introducción:

El término genérico “cultivo de tejidos vegetales” involucra a diferentes técnicas de cultivo de material vegetal diverso, incluyendo a los protoplastos (células desprovistas de su pared celular), células, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas y otras técnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo aséptico (estéril) en condiciones ambientales controladas. También se lo conoce como “cultivo in vitro de plantas” por realizarse en recipientes de vidrio (hoy también de otros materiales). Las primeras experiencias relacionadas con el cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902, pero recién en 1922 se logró el primer experimento exitoso: la germinación in vitro de semillas de orquídeas. Luego de la germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones asépticas, y así se mantuvieron protegidas del ataque de patógenos (hongos, virus y bacterias).

Materiales:

Microscopio de disección

Microscopio compuesto

Muestra de hongo desarrollado en la caja petri

Asa de platino Formol

Porta y cubre objetos Cutex

Azul o rojo colorantes

Fibra de vidrio

Etiquetas adheribles

Procedimiento:

Para la obtención de explantos nodales, se deben de lavar los tallos seleccionados con abundante agua. Secar cuidadosamente con papel filtro. A continuación se pasa a eliminar las hojas de los tallos, cuidado dejar 2 cm del peciolo unido al tallo. Igualmente deben eliminarse las espinas (si las hubiera). Acto seguido se separa los entrenudos (que deben contener al menos una yema axilar) con ayuda de unas tijeras. Debemos conseguir porciones de tallo de unos 4-5 cm aproximadamente.


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Para la estilización de los explantos nodales, se envuelven en una gasa y se introduce en un bote que contenga 100 ml de la disolución desinfectante (hipoclorito de sodio o cloro al 20%) durante 10 min (agitar esporádicamente). Después se lava 3 veces en vasos de precipitado con agua estéril, ayudándose de unas pinzas largas. Una vez desinfectado el material vegetal se procede a la siembra en los frascos gerber o en tubos de ensaye con medio de cultivo.

Para la siembra de los explantos nodales se enciende el mechero (todo en esterilidad) y se abre el paquete del material estéril y las cajas petri que nos servirá como mesa de trabajo. Con ayuda de unas pinzas, se pone el paquete de explantos nodales sobre la caja petri, se abre y se toman con las pinzas, para depositarlas en el medio de cultivo.

La introducción del material vegetal en los frasco gerber debe ser muy cerca de la llama y usando pinzas estériles.

Resultados:

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Conclusiones:

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Referencias:

Pierik, R.L.M. Cultivo in vitro de plantas superiores, Madrid M.P

Mroginski, A. (2008). Establecimiento de cultivos vegetales in vitro. Unidad de investigación de Biotecnología. Cali, Colombia. 1-22

Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp.


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Practica 5: Fermentaciones.

Objetivo:

El alumno entienda el concepto de fermentaciones, demostrar la formación del acido piruvico durante la fermentación de la glucosa por levadura e identificarlo. .

Introducción:

La fermentación es un tipo de catabolismo parcial, que se caracteriza por ser un proceso de oxidación incompleta, típico de los organismos anaeróbicos. Se realiza, pues, sin la intervención del oxígeno. Durante la fermentación, la energía obtenida procede, igual que en la respiración aerobia, de las reacciones de oxido-reducción habidas durante el catabolismo de la glucosa (glucólisis), pero en la fermentación las coenzimas reducidas no ceden sus electrones a una cadena cuyo aceptor final es el oxígeno, sino que los ceden directamente a un compuesto orgánico que se reduce y es el producto característico de cada fermentación (láctica, alcohólica...).

Materiales:

Tubos de ensaye de 13 x 100

Tubos de centrifuga

Tripie, rejilla, anillo, mechero.

Baño maría.

Pipetas de 5 ml. graduadas.

Centrifuga.

Vasos de precipitados de 250 y 600 ml.

Pinzas para tubos de ensaye.

Solución de glucosa a diversas concentraciones 0.5, 1.0, 2.0%

Suspensión de levadura al 5 % en Na2HPO4 y KH2PO4 (18 hrs de fermentación antes de su utilización).

Ácido tricloroacético al 10%

Nitroprusiato de sodio.


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2,4 dinitrofenil-hidracina.

Hidróxido de amonio concentrado.

Hidróxido de sodio 0.1N

Sulfato de amonio sólido.

Nota: un día antes de la práctica llevar su levadura para fermentarla

Procedimiento:

Formación de Piruvato:

Se deben marcar dos series de tubos de 3 cada una y adicionar 3 ml. de las soluciones de glucosa a las diferentes concentraciones 0.5, 1.0, 2.0% a ambas series. A una de las series de tubos adicionarles 3 ml. de suspensión de levadura con fosfatos de sodio(0.213 g/100 ml) y marcarlos como A; y a la otra serie adicionarle 3 ml. de la suspensión de levadura con fosfatos de potasio(0.09 g/100 ml) y marcarlos como B. Posteriormente se colocar todos los tubos en baño maría a 37º.C por 30 minutos y añadir posteriormente a cada tubo 1 ml. de TCA al 10% mezclado vigorosamente y centrifugar a 2500 r.p.m. por 10 minutos. Separar el sobrenadante y desechar el precipitado.

Identificación de Piruvato:

Reacción con nitroprusiato de sodio

En un tubo de ensaye colocar 1 ml. del sobrenadante obtenido y hervirlo. Se le adicionan 0.5 gr. de sulfato de amonio sólido y agitar. Posteriormente agregar dos gotas del reactivo y mezclar vigorosamente y dejar deslizar por las paredes del tubo unas gotas de hidróxido de amonio concentrado, hasta la formación de dos capas. La formación de un anillo verde o azul en la interfase indica afirmativo para la prueba. Repetir lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series.

Reacción con 2,4 dinitrofenil-hidracina.-

En un tubo de ensaye colocar 1 ml. del sobrenadante obtenido y adicionar 1 ml. del reactivo, agitar con fuerza y pasar a otro tubo la mitad de la mezcla formada, y adicionar 1 ml. de NaOH 0.1N. La aparición de un color rojo indica prueba afirmativa.

Repetir lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series. Observar la coloración e intensidad de la misma en cada caso.


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Referencias:

Bamforth W. Charles. 2007. Alimentos, fermentación y microorganismos. Editorial Acribia S.A.

Owen P. 1991. Biotecnologia de la fermentación Principios, procesos y productos. Editorial Acribia.

Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 6: Glicolisis anaerobica y Fermentacion

Objetivo:

Observar los efectos en una situacion simulada de la fermentacion anerobia que en la realidad se efectua en los seres vivos y verificar la inhibicion ocasionada en la ruta metabolica de la glicolisis por el NaF.

Introducción:

De todos los organismos vivientes solo unas pocas especies son estrictamente anaerobicas, esto es, que solamente pueden vivir en ausencia de oxigeno. La mayoria son microorganismos, en particular aquellas especies propias del amibiente que tiene poco oxigeno o que carece de el, es decir, en los intesitnos de los animales, en el suelo profundo, en sedimientos que se encuentran bajo los lagos y oceanos o en pantano donde el oxigeno esta casi totalmente ausente. Un ejemplo de estas bacterias del suelo Clostridium perfringens, que causa la gangrena gaseosa en infecciones de heridas.

El producto de la fermentacoin varia de un tipo de celula o microorganismo a otro. Cuando se requiere concentracion repetida de celulas musculares, el suministro de oxigeno no tiene capacidad para mantener el paso de las demandas metabolicas de la celula. En estas condiciones ciertos tipos celulas musculares esqueleticas regeneran NAD convirtiendo piruvato a lactato (fermentacion del acido lacatico). Las celulas de levaduras han enfrentado el desafio de la vida anaerobia con una solucion metabolica diferente, convierten el piruvato a etanol (fermentacion alcoholica).

Materiales:

Tubos de ensayo

Beakers de 300 ml

Baño maria

1 hoja de papel milimetrico

Levadura (fresca 5 a 10%)

Glucosa (5 a 10%)

Fluoruro de sodio (5 a 10%)

Agua destilada


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Procedimiento:

Marcar tres tubos de ensayo y prepararlos de la siguiente manera:

Tubo A:

Llene una tercera parte del tubo con suspesión de levadura y luego agregue agua destilada hasta llenarlo totalmente.

Tubo B:

Llene una tercera parte del tubo con suspensión de levadura y agrege solucion de glucosa hasta llenarlo totalmente.

Tubo C:

Llene una tercera parte del tubo con suspensión de levadura, agregue otra tercera parte con solucion de glucosa y termine de llenarlo con solucion de fluoruro de sodio (NaF).

Tomar cada tubo y taparlo con un tapon de caucho (tenga cuidado que no quede muy apretado), invertir suavemente para mezclar. No debe quedar aire en la parte superior del tubo.

Conectar por medio de la manguera del tapon al tuvo en U que contiene la columna del liquido a desplazar.

Colocar en baño maria a 37C. Si el procediemitno estubo bien hecho, solo quedara una columna de aire en la parte superior de la manguera.

Medir la altura del liquido en el tubo en U al conectar.

Examinar los tubos de la siguiente manera (si es posible durante 6 lecturas).

Tubo A: cada tres minuos

Tubo B: cada minuto

Tubbo C: cada 15 minutos

Anotar los resultados en el cuadro

Hacer una grafica con los datos anteriores, coocando en la ordenada el tiempo en minutos y en la abcisa la produccion de CO2 en mL. Hacer el analisis de la grafica (anovas).


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Referencias:

CORN Y STUMPF, Bioquímica Fundamental, Editorial Limusa, 1998

DEVORE G. y Muñoz Mena, Química Orgánica, Editorial Publicaciones Culturales, México 1992.

Resultados:

Tubo Contenido Desplazamiento del liquido (mL) A Levadura y agua B Levadura y glucosa C Levadura, glucosa y

NaF

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Realizar la grafica en papel milimetrico.

Cuestionario:

1. El ATP da el impulso iicial para inicial al glucolisis, fosforilando la glucosa. ¿cuál es la reacción?.

2. La fructosa 1-6 difosfato origina dos triosas que pueden convertirse una en otra. ¿cuáles son estas?

3. Estas triosas en ultimo termino se convierten en acido pirúvico o piruvato. Represente las reacciones respectivas en esta conversión.

4. Los dos productos de la glucolisis piruvato y NADH, se pueden metabolizar siguiendo dos vías muy diferentes según el tipo de célula en la cual se generan. ¿cuáles son estas dos vías?

5. Escriba la reacción de la fermentación del acido láctico. Y diga dos ejemplos de células que la realizan.

6. Escriba la reacción de la fermentación alcohólica y diga dos ejemplos de células que la realizan.

7. Escriba la reacción general de la respiración celular u oxidación aerobia.


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8. En que lugar u organelo de las células procariotas y eucariotas se da la fermentación (oxidación anaerobia del NADH) y la respiración celular (oxidación aerobia) y bajo que condiciones se da cada una.

9. ¿Qué influencia tiene el NaF en el proceso de la fermentación y por medio de que mecanismo lo hace.

Practica 7: Fermentacion alcoholica

Objetivo:

El alumno debe utilizar el metabolismo de las levaduras para producir alcohol etílico (etanol), a partir de un jugo enriquecido con azúcares fermentables.

Introducción:

Para describir la palabra fermentación se refirió originalmente al metabolismo anaeróbico de los compuestos orgánicos mediante microorganismos o sus enzimas para dar lugar a productos más simples que la materia prima. La definición actual es: “Cualquier acción microbiana controlada por el hombre para obtener productos útiles”. Como todos los seres vivos, los microorganismos crecen, se reproducen y segregan algunos compuestos bioquímicos de importancia para el hombre; estas son las características en las que se ha basado el uso de los microorganismos como productores de fermentación, la que de una manera esquemática se puede representar así:

Microorganismos + Nutrientes + Condiciones Ambientales Adecuadas ------- Microorganismos + CO2(g) + Productos intra y extracelurares.

La fermentación se puede clasificar de la siguiente manera:

Fermentación con base al substrato. Proteínas, Grasas, Carbohidratos.

Fermentación con base al producto. Alcohólica. Láctica, Acetonica, etc.

Materiales:

1 Agitador de vidrio 100 grs. Azúcar

1 Anillo de Fierro 250 grs. Cáscara de Piña

1 Cuchillo 200 ml de Jugo de Piña

1 Coladera grande 250 grs. de Piloncillo o azucar

1 Matraz de destilación 100 ml de solución de Hidróxido de Bario al 2%

1 Mechero Bunsen 6 ml de reactivo de Fehling A y B


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2 Pipetas graduadas de 5 ml 2 lts. De Agua

1 Pipeta graduada de 10 ml

1 Pinzas para tubo de ensayo

3 Pinzas universales

1 Pinzas Hoffman

1 Franela

1 Mortero con pistilo

1 Tela de alambre con asbesto

2 Tapones monohoradados

3 Tubos de ensayo de 16x150mm

1 Termómetro

1 Vaso de precipitado de 250 ml

45 cm de Manguera de látex de 4mm de diámetro

1 Refrigerante

2 Soportes universales

1 Frasco claro con tapa, de 3 a 5 litros, de boca ancha.

1 Frasco claro sin tapa de 200 a 300 m

Procedimiento:

DESARROLLO DE LA PRACTICA

Nota. Esta práctica se llevara a cabo en 3 sesiones de laboratorio.

Primera Sesión

1. Lavar, pelar y hacer trocitos de 2.5 cm aproximadamente de la cáscara y de la pulpa de la piña.

2. Se comprime la pulpa de la piña hasta obtener un volumen aproximado de 200 ml de jugo.

3. Lavar perfectamente 1 frasco claro de 3.5 lts. de boca ancha.


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4. Efectuar en el frasco anterior la siguiente mezcla: 200 ml de jugo de piña, toda la cáscara de la piña en cuadritos, 250 grs. de piloncillo, 100 grs. de azúcar y 2 litros de agua.

5. A la tapa del frasco anterior que hará las veces de un fermentador se le hará un orificio para adaptar un tramo de 45 cm de manguera de látex de 4 mm de diámetro a la cual se le coloca una pinza de Hoffman para evitar que escapen los gases que se forman.

6. Agitar vigorosamente la mezcla anterior y del sobrenadante se extraen con la pipeta 6 ml, de los cuales se depositan 3 ml en un tubo de ensayo y los otros 3 ml en otro tubo de ensayo.

7. Al primer tubo de ensayo se introduce una tira de papel ph, con el fin de determinar el pH de la mezcla. pH= .

8. Al segundo tubo se le agregan 1.5 ml de reactivo de Fehling A y 1.5 ml de reactivo de Fehling B.

9. Agitar, el segundo tubo.

10. Calentar suavemente con el fin de detectar la presencia de azucares reductores (precipitado de color rojo ladrillo). Reportar positivo o negativo.

11. Tapar el frasco y cerrar la pinza de Hoffman.

12. Dejar fermentar durante 24 hrs.

Segunda Sesión

1. Transcurridas las 24 hrs. Sumergir la manguera de látex del frasco en 100 ml de solución de hidróxido de Bario al 2%, dispuesta en un frasco de 200 a 300 ml de color claro.

2. Se abre lentamente la pinza de Hoffman, con el objeto de que el gas producido entre en contacto con la solución.

3. Anotar observaciones.

4. Se continúa la fermentación durante otros 6 días.

Tercera Sesión

1. Transcurridos los 6 días, se decanta el sobrenadante en un vaso de precipitado.

2. Se filtra el sobrenadante con una franela colocada en la coladera.


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3. El líquido obtenido contiene de 6.7 a 12 grados de alcohol etílico (tepache).

4. Se efectúa nuevamente la determinación de pH y azucares reductores (repetir los pasos 7,8,9, y 10 de la primera sesión. PH = ; Azucares Reductores ( + o -)=

5. Para separar el alcohol del jugo fermentado se lleva a cabo una destilación (con ayuda de tu maestro armar el dispositivo de destilación.

6. Desechar las primeras y las últimas gotas del destilado (cabeza y cola del destilado).

Nota. El alcohol destila por encima de los 78 grados centígrados.

Referencias:


DEVORE G. y Muñoz Mena, Química Orgánica, Editorial Publicaciones Culturales, México 1992.

Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 8: Fermentacion láctica

Objetivo:

Obtener el yogur por medio de la fermentación láctica y observar las bacterias causantes de dicha fermentación..

Introducción:

Las fermentaciones son procesos de respiración anaerobia realizados por ciertas bacterias y levaduras. En ellos, el aceptor de H+ y electrones cedidos por una molécula orgánica no es el oxígeno sino otra molécula. Dependiendo de cuál sea esta molécula se obtendrán distintos productos finales. En el caso de la fermentación láctica, la molécula aceptora es el ácido pirúvico y el producto resultante es el ácido láctico. Esta fermentación se emplea en la industria alimentaria para obtener derivados lácteos como el yogur. El yogur es un producto producido por la fermentación natural de la leche. A escala industrial se realiza la fermentación añadiendo a la leche dosis del 3-4 % de una asociación de dos cepas bacterianas. El Streptococcus thermophilus, poco productor de ácido, pero muy aromático, y el Lactobacillus bulgaricus, muy acidificante. En esta preparación se podrán, por tanto, observar dos morfologías bacterianas distintas (cocos y bacilos) y un tipo de agrupación (estreptococos, cocos en cadenas arrosariadas). Además, el tamaño del lactobacilo (unos 30 ym de longitud) facilita la observación aunque no se tenga mucha práctica con el enfoque del microscopio.

Materiales:

Microscopio

Portaobjetos

Asa de platino

Mechero Bunsen

Estufa de cultivo o cuarto de cultivo

Yogurtera

Matraz de 250 mL,

Pipeta de 5 mL,


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Varilla de vidrio

Papel indicador de pH

Xileno

Cristal violeta (o azul de metileno)

Frutos de hueso sanos y enfermos

Procedimiento 1: obtención del yogur por la fermentación láctica.

1. Se colocan 100 mL de leche en el matraz y añade 1 mL de yogur.

2. Se deja incubar el matraz en la estufa durante 24 horas a 37 ºC.

3. Saca el matraz y observa el contenido.

4. Mueve con la varilla para homogeneizarlo e introduce una tipa de papel indicador de pH.

5. Describe lo observado en el matraz y en el papel indicador.

Para realizar este experimento también puedes utilizar un yogurtera doméstica.

Procedimiento 2: Observación de las bacterias causantes de la fermentación.

1. Con el asa de siembra toma una gota de yogur y deposítala sobre un portaobjetos limpio. Añade una gota de xileno para desengrasar y mézclala con el yogur.

2. Extiende la mezcla y déjala secar completamente. Luego pasa el portaobjetos por la llama del mechero 4 o 5 veces para fijar la preparación.

3. Aplica el colorante cristal violeta durante 2 minutos.

4. Lava después con abundante agua destilada hasta que el líquido no salga teñido y deposita sobre ella un cubre cuidando que no se formen burbujas.

5. Observa al microscopio con el objetivo adecuado (utiliza los mayores aumentos)

6. Dibuja lo que has observado.

Referencias:

Murray, R. 1994. BIOQUIMICA DE HARPER. Manual Moreno S.A. de C.V



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Resultados:

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Conclusiones:


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Practica 9. Analisis de técnicas para detección de alimentos genéticamente modificados (practica documental)

Objetivo:

Conocer las diferentes técnicas para determinar que un alimento ha sido modificado.

Introducción:

El muestreo y la preparación de la muestra son pasos cruciales en el proceso de detección de OGM. La inspección de una muestra es menos costosa que la inspección de todo un lote; sin embargo, el contenido de una muestra no siempre refleja el contenido del lote de muestreo. El procedimiento de muestreo determina la representatividad de un resultado mientras que la cantidad y calidad de los analitos puede variar dependiendo de la preparación de la muestra. Una muestra al azar es aquella seleccionada en el proceso en la cual cada posible muestra de un lote de muestreo tiene la misma posibilidad de ser seleccionada. Esto significa que una muestra al azar produce un estimado imparcial de la medida de interés. En la práctica una muestra al azar no es siempre fácil de obtener a partir de un lote de muestreo (Asif, 2004).

Material:

Revistas científicas de alimentos

Revistas científicas de Biotecnología

Acceso a internet para accesar a las bases de datos

Procedimiento:

Leer y hacer ensayo de la importancia de realizar análisis a los alimentos transgénicos, y dar cuenta del bien o del mal que hacen no solo a la sociedad, sino también al ecosistema.


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Leer y describir cada uno de los procedimientos biotecnológicos para la formación de un alimento transgénico.

Leer y describir los fundamentos para el análisis molecular de OGM.

Leer y describir los protocolos para la detección molecular de OGM.

Referencias:

Asif M. 2004. Sampling for Detection of GMO. In: NIBGE-FAO Workshop on GMO Detection. Capacity and Building in Biosafety of Genetically Modified Crops: GMOs Detection.

Zafar Y. y Asif M. (ed). National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering. Pakistan.

Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 10: Extracción de ADN eucariotico

Objetivo:

Utilizar técnicas sencillas para poder extraer el ADN de un tejido animal y por el aspecto que presenta, confirmar su estructura fibrilar y confirmar que en el núcleo el ADN se encuentra replegado.

Introducción:

El bioquímico suizo Friedrich Miesches fue el primero en descubrir sustancia, ácidos asociados con las proteínas del núcleo celular. Al estudiarlas mejor, Miesches comprendió que estas sustancias son bastante diferentes de las proteínas y de otros compuestos conocidos. La unidad básica de un ácido nucleico es el nucleótido, cada molécula de ácido nucleótido se forma como una larga cadena de 4 clases de nucleótidos, a su vez lo nucleótidos pueden ser fragmentados en 3 partes; una de esas partes es siempre un azúcar de 5 carbonos y que son la ribosa y la desoxirribosa, los ácidos nucleicos que contienen ribosa se denomina ácido ribonucleico o ARN y los ácidos nucleicos que contienen desoxirribosa se denominan ácido desoxirribonucleicos o ADN.

Materiales:

Hígado de pollo

Probeta

Varilla de vidrio

Alcohol de 96

Mortero

Cloruro sódico 2M

Vasos de precipitado

SDS


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Pipeta

Arena

Portaobjeto

Trozo de tela para filtrar

Colorante básico

Procedimiento:

1. Triturar medio higado de pollo en un mortero. Añadir arena para que al triturar se puedan romper las membranas de y queden los núcleos sueltos.

2. Añadir al triturado, 50 centímetros cúbicos de agua. Remover hasta hacer una especie de papilla.

3. Filtrar varias veces sobre una tela para separar los restos de tejidos que hayan quedado por romper.

4. Medir el volumen del filtrado con una probeta.

5. Añadir al filtrado un volumen igual de cloruro sódico 2M. Con esto conseguimos producir el estallido de los núcleos para que queden libres las fibras de cromatina.

6. A continuación se añade 1 centímetro cúbico de SDS. (Nota: Si no se dispone de este producto puede sustituirse por un detergente de vajillas. La acción de este detergente es formar un complejo con las proteínas y separarlas del ADN. Así nos quedará el ADN libre de las proteínas que tiene asociadas.

7. Añadir mediante una pipeta 50 ml de alcohol de 96. Hay que hacerlo de forma que el alcohol resbale por las paredes del vaso y se formen dos capas. En la interfase, precipita el ADN.

8. Introducir una varilla de vidrio e ir removiendo en la misma dirección. Sobre la varilla se van adhiriendo unas fibras blancas, visibles a simple vista, que son el resultado de la agrupación de muchas fibras de ADN.

9. Esta práctica puede completarse con una tinción específica de ADN.

Tenemos que tomar una muestra de las fibras que se van depositando sobre la varilla de vidrio y depositarlas sobre un portaobjeto.

10. Teñir durante unos minutos con un colorante básico.

11. Observar al microscopio.


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Referencias:

Griffith. 2002. Genetica. Mc. Graw-Hill.

Carey, J., Bamshad M., Jorde L. 2010. Genética medica. Elsevier España S.A.

Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 11: Extracción de ADN procariotico.

Objetivo:

Que el alumno aprenda el fundamento para la obtención del ADN procariotico de la técnica más sencilla.

Introducción:

Existen diferentes métodos para la obtención de ADN bacteriano que varían en duración y complejidad del procedimiento en función de la calidad del ADN que queramos obtener.

Materiales:

MÉTODO DE HERVIDO

Cultivo bacteriano en placa de agar

Asa de platino

Estufa a 37 C

Eppendorf de 1.5 mL esteriles

Pipetas y puntillas desechables esteriles

Temoplato con capacidad de alcanzar 100 C

Centrifuga

Soluciones

Agua molecular esteril

Procedimiento:

Preparar un eppendorf esteril por cada muestra al que se anaden 100 microlitros de agua molecular estéril


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Tomar con un asa de platino unas colonias de la placa de agar e introducirlas en el eppendorf, utilizando posteriormente la pipeta para obtener una suspensión homogénea

Calentar a 100 C durante 15 min.

Anadir 900 microlitros de agua molecular estéril a cada eppendorf y homogenizar.

Centrifugar durante 5 min a 12000 rpm

Recoger el sobrenadante en un eppendorf estéril.

Referencias:

Tagu D., Moussard C. 2006. Fundamentos de las técnicas de biología molecular. Ediciones Pri.

Griffith. 2002. Genetica. Mc. Graw-Hill.

Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 12: Electroforesis en geles de agarosa.

Objetivo:

Que el estudiante se familiarice con la técnica de electroforesis en geles de agarosa para la lectura de los ácidos nucreicos.

Introducción:

La electroforesis es el movimiento de partículas cargadas en un campo eléctrico. A diferencia de las proteínas, las cuales pueden tener una carga positiva o negativa, los ácidos nucleicos están cargados de forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato. Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán hacia el polo positivo, es decir, el ánodo. La concentración de agarosa típicamente utilizada para electroforesis está entre el 0.5 % y el 2%. La concentración a usar se escoge según el tamaño del ácido nucleico a analizar. Esto porque la concentración de agarosa define el tamaño de los poros de la matriz, a mayor concentración, menor el tamaño de los poros y viceversa. Durante la electroforesis, los ácidos nucleicos lineales con un alto peso molecular migrarán al ánodo más lentamente que ácidos nucleicos lineales con un menor peso molecular. La razón de esto es que los ácidos nucleicos de alto peso tardan más tiempo en atravesar los poros de agarosa. En el caso de ácidos nucleicos no linealizados, como plásmidos circulares en conformación nativa, la migración no solo dependerá del peso molecular sino también de otros aspectos como el grado de superenrrollamiento que éste poseea. Generalmente en una preparación de plásmido se pueden observar distintas conformaciones de la misma molécula, la forma superenrrollada, la forma semi relajada y una relajada. Dependiendo de las condiciones externas como pH y salinidad se pueden observar todas las formas o solo una (s).

Materiales:

Marcador de peso molecular.

Cámara de electroforesis y accesorios requeridos: soporte, peines, tabla niveladora, burbuja niveladora, etc.


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Solución amortiguadora de Tris-Boratos-EDTA (TBE). La solución se prepara 5X y se utiliza 0.5X. Para preparar 1 l de una solución 5X TBE mezclar: 54 g de Tris Base, 27.5 g de ácido bórico, 4.7 g de EDTA sódico, llevar a 1 l con agua y autoclavar.

Gel de agarosa al 1% en TBE con bromuro de etidio. Precaución: el bromuro de etidio es un agente mutagénico, utilice guantes para manipular cualquier material o solución que contenga este químico.

Amortiguador de muestra con azul de bromofenol

Tubos de 1.5 ml

Beaker o erlenmeyer de 125 ml

Micropipeta de 20 µl con sus respectivas puntas

Lámpara de UV. Precaución: la luz ultravioleta puede dañar sus ojos. NUNCA observe un gel bajo la luz ultravioleta sin el uso de anteojos que filtren dicha luz.

Guantes

Procedimiento: Pesar la cantidad de agarosa requerida para obtener un gel de agarosa al 1%. El volumen final es de 30 ml.

Disolver la agarosa en 30 ml de amortiguador TBE 0.5x. Calentar en el microondas por 45 s, luego se agita con movimientos circulares hasta que se disuelvan todas las partículas de agarosa translúcidas. Se debe tener precaución con los recipientes calientes ya que pueden causar quemaduras.

Incorporar 1.25 µl de bromuro de etidio a 10 mg/ml en la solución caliente de agarosa y agitando con movimientos circulares. Precaución: El bromuro de etilo es un carcinógeno y debe manejarse con cuidado. Hay que evitar que se derrame la disolución o tener contacto directo con esta. La punta que contiene bromuro de etidio debe ser descartada en un recipiente especial para descartar material contaminado con bromuro de etidio.

El soporte para “vaciar” el gel debe estar limpio y seco, se ajusta en el molde portagel o tabla niveladora y se colocan los peines que generarán los pozos para aplicar las muestras.

Cuando la agarosa alcanza los 50–60 °C aproximadamente se vierte en el centro de la bandeja para gel evitando la formación de burbujas.

Se deja reposar, el gel tarda de 20–40 minutos para solidificar a temperatura ambiente.


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Una vez solidificado el gel se quitan los peines, sujetándolo con ambas manos y jalando cuidadosamente hacia arriba.

Posteriormente se translada el soporte para el gel hasta la cámara de electroforesis, colocando los pozos mas cercanos al borde hacia el polo negativo (de color negro) debido a que las muestras migrarán hacia el ánodo (de color rojo) durante la electroforesis. Se agrega TBE hasta sumergir el gel unos 2 a 6 mm.

Para preparar las muestras añada en un tubo de 1.5 ml:

5 µl de agua destilada desionizada

5 µl de su preparación de plásmido

2 µl de amortiguador de la muestra

Para preparar el marcador del peso molecular, añada en un tubo de 1.5 ml:

7 µl de agua destilada desionizada

3 µl del marcador de peso molecular (MPM)

2 µl de buffer de la muestra

Con una micropipeta de 20 µl con punta aspirar la muestra preparada previamente. Colocar la micropipeta en forma perpendicular al gel de agarosa, e introducirla hasta el fondo del pozo liberando su contenido mientras se va sacando lentamente la punta del pozo. Tome nota del orden en que se colocaron las muestras y el marcador de peso molecular.

Para iniciar la corrida electroforética, colocar la tapa, asegurándose que los electrodos estén en contacto y conectados a la fuente de poder. Encienda la fuente de poder. La Se electroforesis se realiza a 100 V, 50 miliamperios durante 30 minutos aproximadamente.

Finalizada la electroforesis, apagar la fuente de poder, se destapa la cámara y se retira el soporte para gel de la cámara, sosteniendo con los dedos los bordes para evitar que el gel se caiga. Examine el gel bajo la lámpara de luz ultravioleta para determinar la posición de las bandas en el gel.

Referencias:

BioRad. Manual de instrucciones de la cámara mini sub cell para electroforesis en geles de agarosa. Rev A


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Resultados:

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Conclusiones:


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Practica 13: Reacción en Cadena de la Polimerasa (demostrativo)

Objetivo:

Que el estudiante comprenda el fundamento y aplique los conceptos teóricos en los cuales se basa la reacción en cadena de la polimerasa.

Introducción:

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) fue descrita por primera vez en 1985 por Kary B. Mullis. Esta invención lo hizo acreedor en 1993 del Premio Nobel en Química, debido al gran impacto que ha tenido esta técnica en el área de la bioquímica. Su objetivo y función es la de obtener mediante amplificación in vitro cantidades “masivas” de ADN incluso a partir de muestras de ADN muy pequeñas. Para realizar el PCR más sencillo, se requiere conocer las secuencias que rodean la región a amplificar, luego se producen oligonucleótidos complementarios a estas secuencias mediante síntesis química automatizada y estos son utilizados como cebadores (primers) en una reacción de polimerización cíclica catalizada por la ADN polimerasa.

Material:

Gradilla para tubos de 0.5ml y un tubo de 0.5ml

Muestra que contenga ADN

Micropipetas de 10 µl y 100 µl con sus respectivas puntas

Mezcla maestra que contenga: amortiguador de reacción en cadena de la polimerasa, mezcla de nucleótidos (dNTPs), Taq polimerasa y cebadores.

Agua libre de ADNasas

Termociclador

Procedimiento:


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En un tubo de 0.5 ml, agregue las siguientes cantidades en el orden indicado (volumen final de reacción: 50 µl):

1. Agua libre de ADNasas: 18.9 µl

2. Muestra: 5 µl (sobrenadante del lisado de colonias de Escherichia coli, muestras de ADN obtenido en prácticas anteriores.).

3. Mezcla maestra (Fermentas buffer + primers): 27µl

Con la ayuda de su instructor, programe el termociclador según las condiciones requeridas.

Cuando la reacción haya finalizado, analice el producto obtenido mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2%.

Referencias:

Mathews, C.K, Van Holde, K.E y Ahern, K.G. Bioquímica. Pearson Educación. Tercera edición, España, 2003.


Griffith. 2002. Genetica. McGraw-Hill.

Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 14. Secuenciador ADN (documental).

Objetivo:

Describir el uso del secuenciador para fines prácticos de la biotecnología en la medicina.

Introducción:

La secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un oligonucleótido de ADN. La secuencia de ADN constituye la información genética heredable del núcleo celular, los plásmidos, la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. Así pues, determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales, así como en campos aplicados, como la investigación forense.

Material:

Acceso a internet

Acceso a bases de datos

Acceso a Journals

Procedimiento:

Describir y desarrollar la utilización del secuenciador para análisis.

Describir y analizar la utilización del mismo en la actualidad.


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Referencias:



Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 15. Pruebas diagnostico, ELISAS

Objetivo:

Que el estudiante se familiarice con una técnica básica en los estudios de inmunología y que con ella se ha dado pauta a los avances biotecnológicos en la medicina como ensayo de prueba.

Introducción:

Los ensayos inmunoenzimaticos, por su especificidad, sensibilidad y sencillez de manipulación, son una técnica muy habitual en los laboratorios de investigación y de análisis clínicos. En este ensayo, el anticuerpo que reconoce al antígeno esta unido a una enzima con capacidad para catalizar una reacción que da un producto coloreado. La técnica ELISA (enzyme linked immunodsorbent assay) en el ensayo se utiliza, generalmente una membrana de nitrocelulosa sobre la que se fija el antígeno. Posteriormente se anade sobre la membrana el anticuerpo que reconoce específicamente a ese antígeno. Este anticuerpo tiene unida una enzima que al anadir su sustrato generara un producto coloreado. Este procedimiento se denomina método directo de detección.

Material:

Cajas de elisa. Soporte solido

Anticuerpo anti-albumina bovina

Ovoalbumina

Tampón fosfato salino

Sustrato cromógeno (4-cloro-1-naftol)


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Cubeta de lavado

Micropipetas

Puntillas

Frasco lavador

Control positivo de albumina bovina

Control negativo de albumina ovina

Muestras m1, m2. M3

Procedimiento:

Tomar la caja de ELISA, aplicaar sobre cada pocillo una muestra de 2 microlitros de muestra y de control positivo y negativo. Uno por cada división. Dejar secar de 5 a 10 min.

Durante ese tiempo se prepara la solución de bloqueo. Para ello anadir 2.5 gr de ovoalbúmina en 100ml de tampón salino. Aguitar la mezcla hasta conseguir una dilución homogénea 5%

Una vez pasado el tiempo de la solución de los pocillos, introducir la solución de bloqueo y se deja durante 15 min.

Retirar la solución de bloqueo y lavar la caja elisa con agua destilada.

Anador sobre cada punto 20 microlitos de anticuerpo anti-albumina bovina conjugando con peroxidasa, e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.

Lavar con agua destilada.

Anadir sobre cada pocillo 10 microlitros del sustrato cromógeno y dejar desarrollar el color.

Referencias:




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Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 16. Bioinformatica y Biotecnología.

Objetivo:

Introducir las bases de datos accesibles a través de Internet de importancia en el área biológica. Comprender la utilidad de las mismas como herramientas de acceso a información y programas de cómputo actualizados.

Introducción:

En las últimas décadas, científicos alrededor del mundo se han dedicado a obtener las secuencias tanto proteínas como de ácidos nucleicos. Aunque en sus inicios estos esfuerzos fueron aislados, poco a poco la cantidad de datos generada se hizo excesiva para ser manejada por laboratorios aislados. Además, con el advenimiento de nuevas tecnologías de secuenciación, se generaron proyectos conjuntos entre laboratorios cuyo objetivo único era la secuenciación de un genoma en particular. Se hizo entonces necesaria la organización de bancos de datos donde las secuencias generadas pudieran ser depositadas. Desde el inicio, la comunidad científica estuvo de acuerdo en que estos bancos de datos deberían tener acceso libre a nivel mundial. Mucho antes de que el genoma humano se completara en el año 2003, (http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml), existían ya decenas de este tipo de bancos de datos. Actualmente, existen bancos de datos definidos, sumamente extensos de los cuales se derivan “secciones” donde se puede tener acceso a información más específica.

Materiales:

Acceso a internet

Acceso a las bases de datos geneticos


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Procedimiento:

Se visitarán diferentes sitios en Internet y su instructor le indicará las principales características de los mismos. Dependiendo del tiempo y el acceso a Internet, se revisarán los siguientes sitios:

Dirección de la página web Descripción

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?DB=pubmed

Base de datos general, no solo de secuencias de macromoléculas sino también acceso a libros y revistas en el área de ciencias de la salud. Además, acceso a programas de cómputo para análisis de secuencias de proteínas, genes o genomas.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ Programa de cómputo que encuentra secuencias similares en proteínas y ácidos nucleicos

http://www.genome.jp/kegg/ Base de datos de Japón http://www.ebi.ac.uk/embl/ Base de datos Europeo http://www.webact.org/WebACT/home Banco de datos de comparación

de genomas de procariotas, que permite la visualización “on line” de hasta cinco genomas de forma simultánea, utilizando el herramienta de comparación Artemis, desarrollada por el Instituto Sanger.

http://www.sanger.ac.uk/Software/ACT/ Herramienta de comparación de ADN Artemis

Referencias:

Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry: Theory and exercises in


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fundamental methods. 3rd edition, Freeman and Company, New York 1999 Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 345 pp.

Conclusiones:

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Practica 17. Fundamentos de la Biorremediacion (documental)

Objetivo:

Que el estudiante comprenda las bases teoricas y practicas de la Biorremediacion.

Que el estudiante explore las posibilidades de la biorremediacion, que se familiarize con los aspectos quimicos y bioquimicos y que escriba y ejecute en manera de las posibilidades una propuesta basica de biorremedicaion de suelo y agua.

Introducción:

La biorremediación es el uso de seres vivos para restaurar ambientes contaminados. Es un concepto que no se debe de confundir con depuración. La depuración es la eliminación, ya sea por métodos físico/químicos o biológicos, de un contaminante antes de que éste alcance el medio ambiente. Cuando la contaminación ya se ha producido, se precisa restaurar el ecosistema contaminado, para lo que se pueden utilizar diversas estrategias. Una de ellas es la biorremediación. Se pueden emplear diversos organismos en los procesos de biorremediación. Los más usados son los microorganismos (tanto bacterias, como algas y hongos) y las plantas (en procesos llamados fitorremediación), pero también se pueden utilizar otros seres vivos tales como los nemátodos (vermiremediación). Entre los microorganismos destacan especialmente las bacterias, los seres vivos con mayor capacidad metabólica del planeta. Las bacterias pueden degradar prácticamente cualquier sustancia orgánica. Si la sustancia se degrada completamente se habla de mineralización; este es el proceso ideal, pero no siempre ocurre. Algunas sustancias no son degradadas sino transformadas en otras (biotransformación). La biotransformación puede ser peligrosa, ya que la nueva sustancia formada puede ser tan nociva o más que la de partida. Finalmente hay sustancias que no son degradadas y se las denomina recalcitrantes. Éstas se acumulan durante mucho en el medio ambiente, especialmente si además son


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resistentes a procesos físico/químicos como la radiación ultravioleta o la oxidación. Las bacterias además pueden eliminar los contaminantes en ambientes donde hay oxígeno (llamados aeróbicos), pero también en ambientes sin oxígeno (llamados anaeróbicos), ya que pueden respirar otras sustancias diferentes al oxígeno (aceptores de electrones), como por ejemplo el nitrato, el sulfato, el hierro (III), el manganeso, el selenio y un largo etcétera.

Materiales:

Arituclos cientificos acerca dela Biorremediacion.

Acceso a las bases de datos.

Acceso a internet.

Trabajo en equipo.

Procedimiento:

La practica se llevara a cabo en equipo de 3 personas, las cuales se organizaran para la busqueda de informacion y genracion de un miniproyecto.

Se utilizara el uso de las bases de datos donde los estudiantes elegiran 4 articulos deacuerdo al tema (sin repetir). Se discutiran los articulos en clase y posteriormente realizaran el proyecto escrito y una presentacion.

Referencias:

Breedveld, G.D and Sparrevik, M. 2001. Nutrient‐limited biodegradation of PAH in various soil strata at a creosote contaminated site. Biodegradation 11: 391‐399 García H D, Sosa A, CR y Sánchez‐Yáñez, 2007. Biorremediación de agua domestica contaminada con aceite residual automotriz. Revista Ingeniería Hidráulica de México. 17:208‐219 Sánchez‐Yañez, JM et al., 2008. Biorremediación (Antología). Secretaría de Difusión Cultural y Extensión Universitaria. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Centro de Investigación y Desarrollo del Estado de Michoacan, Bionutra, SA de CV. Morelia, Mich, México. ISBN:978‐970‐95424‐2‐4. Resultados:

Ensayos de los articulos.

Proyecto escrito.

Presentacion del proyecto.


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Conclusiones:

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Practica 18. Fitorremediacion (documental).

Objetivo:

Que el estudiante comprenda las bases teoricas y practicas de la Fitorremediacion. Que el estudiante explore las posibilidades de la fitorremediacion, que se familiarize con los aspectos quimicos y bioquimicos y que escriba y ejecute una propuesta basica a medida de sus posibilidades.

Introducción:

La fitorremediación podría ser definida como el conjunto de métodos para degradar, asimilar, metabolizar o detoxificar metales pesados, compuestos orgánicos, radioactivos y petroderivados por medio de la utilización de plantas que tengan la capacidad fisiológica y bioquímica para absorber, retener, degradar o transformar dichas sustancias a formas menos tóxicas. Asimismo, podría definirsela como la capacidad de ciertas plantas (terrestres, acuáticas, leñosas, etc.) y los cultivos in vitro derivados de ellas con el fin de remover, contener o transformar productos contaminantes del entorno. Las bases conceptuales de la fitorremediación provienen de la identificación de plantas que hiperacumulan metales. Existen vegetales que tienen esta capacidad intrínseca pero también pueden obtenerse plantas con estas capacidades por técnicas propias de la Ingeniería Genética. Promisoriamente, las plantas pueden ser utilizadas como bombas extractoras de bajo costo para depurar suelos y aguas contaminadas, además, algunos procesos degradativos ocurren en forma más rápida con plantas que con microorganismos. Es un método apropiado para descontaminar superficies grandes o para finalizar la descontaminación de áreas restringidas en plazos medianamente largos. Sin embargo, es preciso considerar que el proceso se limita a la profundidad de penetración de las raíces o aguas poco profundas.


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Materiales:

Arituclos cientificos acerca dela Biorremediacion.

Acceso a las bases de datos.

Acceso a internet.

Trabajo en equipo.

Procedimiento:

La practica se llevara a cabo en equipo de 3 personas, las cuales se organizaran para la busqueda de informacion y genracion de un miniproyecto.

Se utilizara el uso de las bases de datos donde los estudiantes elegiran 4-5 articulos deacuerdo al tema (sin repetir).

Se discutiran los articulos en clase y posteriormente realizaran el proyecto escrito y una presentacion.

Referencias:

García H D, Sosa A, CR y Sánchez‐Yáñez, 2007. Biorremediación de agua domestica contaminada con aceite residual automotriz. Revista Ingeniería Hidráulica de México. 17:208‐219 Sánchez‐Yañez, JM et al., 2008. Biorremediación (Antología). Secretaría de Difusión Cultural y Extensión Universitaria. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Centro de Investigación y Desarrollo del Estado de Michoacan, Bionutra, SA de CV. Morelia, Mich, México. ISBN:978‐970‐95424‐2‐4.

Resultados:

Ensayos de los articulos.

Proyecto escrito.

Presentacion del proyecto.

Conclusiones:

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Practica 19. Biodiesel a partir de aceite nuevo

Objetivo:

Aprender la metodología general para la obtencion de biodiesel a partir de aceite vegetal nuevo de cocina.

Introducción:

El biodiésel es un biocombustible que se fabrica a partir de cualquier grasa animal o aceites vegetales, que pueden ser ya usados o sin usar. Se suele utilizar girasol, canola, soja o jatropha, los cuáles, en algunos casos, son cultivados exclusivamente para producirlo. Se puede usar puro o mezclado con gasoil en cualquier proporción en motores diésel. El principal productor de biodiésel en el mundo es Alemania, que concentra el 63% de la producción. Le sigue Francia con el 17%, Estados Unidos con el 10%, Italia con el 7% y Austria con el 3%.

El sistema más habitual es la transformación de estos aceites a través de un proceso de transesterificación. De este modo, a partir de alcohol metílico, hidróxido sódico (soda cáustica) y aceite vegetal se obtiene un éster que se puede utilizar directamente en un motor diesel sin modificar, obteniéndose glicerina como subproducto. La glicerina puede utilizarse para otras aplicaciones.

Material:

Papel filtro

Termometro

Varita

Matraz de 500 ml

Vaso de precipitados


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Probeta

Mechero bunsen

Aceite nuevo de girasol

Hidroxido de sodio

Metanol

Agua destilada

Procedimiento:

1. medimos el numero de litros de aceite con los cuales queremos experimentar (en este caso 1 litro).

2. Vertimos el aceite vegetal en el vaso de precipitados donde preparamos la mezcla.

3. Si la temperatura es inferior a 21ºC o si el aceite vegetal se encentra en estado solido o espeso, será necesario calentar los reactivos antes de mezclarlos.

4. Introducimos con mucho cuidado 3.5g de sosa caustica y 0.2 litros de metanol dentro de un vaso de precipitados.

5. Removemos la mezcla hasta que la sosa haya disuelto en el metanol (se produce metoxido sódico)

6. Vertimos seguidamente el metoxido de sodio dentro del aceite vegetal. 7. Mezclamos el conjunto de forma vigorosa durante una hora, manteniéndolo a

una temperatura constante de aproximadamente unos 4-50ºC. Para esto lo colocamos sobre el bunsen siempre controlando la temperatura con un termómetro.

8. Dejamos que la mezcla repose durante 12 horas. 9. Separamos las dos capas con ayuda de un embudo de decantación. 10. Dejamos que la glicerina, que aparece como capa oscura y espesa en la parte

inferior del recipiente, se deposite en el fondo durante una semana. Pasado este tiempo se habrá evaporado el resto de metanol y se obtendrá un jabon de gliceria.

11. Luego procedemos al lavado del biodiesel para eliminar cualquier resto de glicerina u otras impurezas. Añadimos agua y agitamos, dejamos que esta se asiente en el fondo y desaguamos.

12. Medimos el pH y repetimos el proceso hasta que el pH sea de 6-7. 13. Al final se ha de calentar lentamente para evaporar restos de agua.

Referencias:


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Aguejas D.L. 1996. Biocombustibles.ministerio de cultura, pesca y alimentacion. Madrid.

Jarabo F.F.1999. La energia de la biomasa. SAPT Publicaciones tecnicas. Madrid.

Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 20. Análisis de contaminación de Agua

Objetivo:

Que el estudiante comprenda el concepto microbiologico de indicador de contaminacion. Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante el recuento de mesofilos aerobios y la busqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y E. Coli Aplicar tecnicas de cuantificacion de microorganismos totales y comparar con las tecnicas de determinacion de viables.

Introducción:

La determinación de la calidad bacteriológica reviste gran importancia en el ámbito de la salud pública ya que permite garantizar la inocuidad del agua destinada al consumo evitando así epidemias gastrointestinales. El agua destinada al consumo humano puede ser contaminada por las agua residuales o por desechos humanos y animales que pueden contener microorganismos patógenos (principalmente intestinales) como son los causantes de la tifoidea (Salmonella typhi), la disentería (Shigella dysenterieae) o el cólera (Vibrio cholerae) entre otros). Sin embargo, la detección de microorganismos patógenos es poco práctica por las siguientes razones: a) No siempre están presentes en la fuente de contaminación (material fecal), pero pueden aparecer repentinamente b) Al diluirse en el agua, pueden quedar en concentraciones no detectables por los métodos de laboratorio c) Sobreviven relativamente poco tiempo en el agua, por lo que pueden desaparecer antes de ser detectados d) Los resultados del análisis bacteriológico del agua se obtienen después que ésta ha sido consumida por lo cual si hay patógenos, la población habrá estado expuesta a la infección.


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Materiales:

Agua almacenada Material por equipo Frasco de boca ancha con tapón esmerilado Papel Kraft 1 pipeta de 1mL Solución de tiosulfato de sodio 10% Etanol Algodón Hielo raspado (sin sabor) Bolsa de plástico con cierre (ziploc)

1 pipeta de 1mL Solución de tiosulfato de sodio 10%

Material por equipo para el análisis 2 mecheros Tripié y tela de asbesto Gradilla Equipo Millipore estéril Accesorios de equipo Millipore 1 matraz de 250mL con 150mL de Agar Cuenta Estándar. 5 tubos con 10.0mL de caldo lauril sulfato de sodio (CLSS) triple concentración (3X) 1 caja con Agar Bilis Rojo Violeta 3 tubos con 9mL de solución salina estéril Pipetas serológicas de 10, 5 y 1mL estériles 10 cajas petri estériles de vidrio o plástico estériles Agua de sabor (10mL) Hielo raspado (600mL) Procedimiento 1:

a) Preparación de los frascos 1. Lavar perfectamente el frasco, eliminando todo resto de jabón o detergente 2. Agregar 0.1mL de tiosulfato de sodio al 10% (0.5mL para frascos de 500mL) 3. Colocar una tira de papel kraft de 1 x 5cm entre tapón y cuello (frascos refractarios con tapón esmerilado) 4. Cubrir el tapón y el cuello del frasco con papel kraftin 5. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

b) Toma de la muestra 1. Lavarse las manos y desinfectarlas con etanol al 70% 2. Para grifos lo primero es desinfectar el grifo con algodón y etanol y dejar correr el agua por 3 minutos.


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3. Generar zona aséptica cuando sea posible hacerlo. 4. Destapar el frasco, llenar hasta 2/3 del recipiente y tapar inmediatamente. 5. Para la recolección de agua a partir de depósitos naturales y cuerpos receptores, retirar la cubierta de papel y sostener el frasco por la base e introducirlo en el agua 30cm. 6. Destapar y llenar contra corriente o moviéndolo al frente, llenar hasta 2/3 del recipiente y tapar inmediatamente. 7. En cada caso etiquetar el frasco y elaborar una hoja de registro de datos. 8. Llevar las muestras al laboratorio lo más pronto posible, para analizarlas antes de que transcurran 2 horas, o 5 horas si se transportan en hielo.

Procedimiento 2:

a) Toma de la muestra

1. Comprar con un día de anterioridad 3 vasos de hielo raspado (1.5L) o granizado de los carritos y colocarlo en la bolsa plástica. 2. Cerrar inmediatamente y refrigerar (no congelar). 3. Llevar las muestras al laboratorio lo más pronto posible, para analizarlas antes de que transcurran 2 horas, o 5 horas si se transportan en hielo. Procedimiento para análisis de las muestras: a) Determinación de mesófilos aeróbios 1. Homogenizar la muestra de agua de sabor. 2. Realizar 2 diluciones decimales en SSI. 3. Depositar con pipeta 1mL de muestra o dilución en cada caja de Petri estéril. Realizar cada dilución por duplicado. 4. Verter en cada caja aproximadamente 20mL del medio agar cuenta estándar, fundido y enfriado a 45°C, homogenizar y dejar solidificar. 5. Etiquetar cada una de las cajas. 6. Verter una en una caja medio de cultivo sin muestra como control. 7. Una vez solidificadas, incubar las placas a 35°C durante 24 horas. 8. Contar todas las colonias presentes, en las cajas que contengan de 25 a 250. b) Prueba presuntiva. Determinación del NMP de coliformes en agua y hielo potables: 1. A partir de la muestra de agua inocular 20mL en cada uno de 5 tubos con caldo lauril sulfato de sodio (CLSS) triple concentración. Rotular. 2. Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 h., observar si hay formación de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se


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observa producción de gas, incubar 24 h. más. c) Técnica de filtración: 1. Etiquetar la caja con Agar Bilis Rojo Violeta. 2. Colocar dos mecheros encendidos y crear entre ellos un área estéril. En condiciones de asepsia instalar el equipo Millipore estéril. Antes de instalar el vaso y las pinzas de pato, colocar una membrana de 0.45mm estéril sobre la base del filtro conector. Las pinzas de punta roma se esterilizan con alcohol y a la flama antes de tomar la membrana. 3. Retirar la tapa de aluminio del vaso y transferir el contenido de la muestra líquida solicitada, si presenta partículas en suspensión filtrar previamente con algodón y gasa. 4. Abrir la llave de vacío y filtrar el medio a través de la membrana. Una vez que hubo pasado todo el medio cerrar el vacío. 5. Retirar las pinzas de pato y el vaso. 6. Con ayuda de las pinzas de punta roma, retirar la membrana y colocarla en la caja de Petri con Agar Bilis Rojo Violeta. Presionar ligeramente la superficie para favorecer la adherencia de la membrana. 7. Sellar con dos tiras de masking tape la caja de Petri recién inoculada e incubar a 37ªC durante 24 horas. 8. Transcurrido el tiempo de incubación revisar los resultados y guardar en refrigeración.

Referencias:

Standard Methods for the examination of water and wastewater. 1998. American Public Health Association. 20th edition. Washington. Norma Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa. Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número más probable. Norma Oficial Mexicana NOM-201-SSA1-2002, Productos y servicios. Agua y hielo para consumo humano, envasado y a granel. Especificaciones sanitarias


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Resultados:

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Conclusiones:

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BIOTECNOLOGIA

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