Ingeniería de proteínas

L.B.G. José Eduardo Almeyda CarbajalAsesor en el desarrollo de nuevos productos. CEMEX-México

17 de mayo de 2014

Índice

Diseño Racional Diseño No RacionalDiseño guiado por datos o

información

$50 por contar todos los puntos rojos

¿De qué estamos hablando?

Producto Producción Anual

(Tons)

Producto Producción Anual

(Tons)Bioetanol 26,000,00 L-Hydroxifenilalanina 10,000

Ácido L-Glutámico 1,000,000 Ácido 6-

aminofocelanico

7000

Ácido cítrico 1,000,000 Nicotinamida 3000

L-Lisina 350,000 D-p-hidroxifenilglicina 3000

Ácido láctico 250,000 Ácido 7-

aminocefalosporinico

1000

Enzimas de

procesamiento de

alimentos

100,000 Aspartame 600

Ácido glucónico 50,000 L-metioninca 200

Antibióticos 35,000 Dextran 200

Enzimas para

alimentación animal

20,000 Vitamina B12 12

L-Treonina 10,000 Provitaina D2 5

Producto Mercado

(Millones US$)Eritropoyetina 6803

Insulina 4017

Factores de coagulación sanguínea 2585

Factor estimulador de colonias 2181

Interferon b 2087

Interferon a 1832

Anticuerpos monoclonales (Cáncer) 1751

Hormona de crecimiento 1706

Antircuerpo monoclonal 1152

Activador de plasminógeno 642

Interleucina 184

Factor de crecimiento 115

Vacunas 50

Otros 2006

Necesaria y divertida introducción

Catálisis Reguladoras Estructural

Defensa Transporte Receptoras

Necesaria y divertida introducción

Necesaria y divertida introducción

¿Y la introducción era para?

Ingeniería de proteínas

La ingeniería de proteínas, como un sub-disciplina de laingeniería genética, consiste en el diseño de nuevasproteínas o en la generación de proteínas con funcionesnuevas o deseadas.

Solvente Proteínamágica

Mezcla mágica

Exceso deproteínamágica

Lindo, muy lindo ¿Cómo se hace?

Diseño racional

Diseño No Racional

(Evolución Molecular Dirigida)

Diseño de proteínas dirigido por datos o información

Diseño racional

Resonancia Magnética Nuclear Difracción de rayos X

La visualización de determinados dominios o estructuras en las proteínas nos permitedeterminar cuales podrían convertirse en sustituciones candidatas a ser realizadas en lamisma, además del posible efecto sobre la característica a modificar en nuestra proteína.

Microscopía electrónica

Circulo de la racionalidad

Pero ¿Cómo le hacemos para racionalizar?

Variante: Proteína de novo

Algunas estructuras de usocomún en esta estrategiaincluyen el uso de los motivoscomo “Ramillete de cuatrohélices a” (Generación decanales de protones), “Hélice-bucle-hélice” (reducción detamaño del dominio de uniónde inmunoglobulina G) y dedode zinc.

Método racional: Casos de la vida real

Proteína nativa Modificación MotivoIsomerasa de triosafosfato Mutación puntual de ácido

glutámico a glutamina

Termoestabilidad de 37oC a

26oC

Fitasa con estructura de

hélice de Bacillus sp. MD2

Mutaciones punctuales

E229V y S283R)

Incremento de actividad

específica

Proteína de unión a

ribosoma

Rediseño completo Cambio de actividad

(Isomerasa de triosafosfato)

- Usos de péptidos

helicoidales

Proteínas diiron

El problema con el diseño racional es su dificultad de

aplicación si se carece de la estructura tridimensional dela proteína.

Diseño NO racional

Simula el proceso Darwiniano deevolución, mediante lacombinación de mutagénesis alazar y/o técnicas derecombinación de DNA contécnicas de screening o selecciónde variantes de proteínas quehayan incorporado laspropiedades deseadas

Pasos no racionales

1„ Introducción de mutaciones en la

secuencia

2„ Screening y selección de variantes

identificadas con el fenotipo necesario.

3

„ Recombinación entre variantesseleccionadas para producir nuevascombinaciones

Recomendaciones del tío Darwin

Función físicamente posible

La función debe ser biológica o evolutivamente factible.

Debe ser posible construir librerías de mutantes lo suficientemente complejas

Método rápido para el screening o selección de las proteínas

Darwin’s ways

Método Descripción Mutagénesis por

saturación

Un aminoácido en determinada posición de una proteína es

cambiado por cada uno de los aminoácidos naturales a fin de

encontrar cual de ellos otorga propiedades de interés a la proteína

analizada.

Mutagénesis aleatoria

localizada o de región

específica”

Representaría una combinación entre las estrategias Racional y no

Racional, en el que los cambios aleatorios se realizan en regiones

específicas de una proteína.

DNA shuffling Un grupo de genes con un DNA de doble cadena o secuencias

similares son obtenidos por varios organismos o producidos por la

técnica de PCR propenso a error

Duplicación de genes Se vale de los mecanismos de divergencia naturales que se ejercen

sobre aquellos duplicados bajo una presión selectiva más laxa

Aplicaciones (Si, otra tabla)

Objetivo Enzima Resultado Método Referencia

Enantioselectividad Epóxido

hidrolasa

Incrementada 13

veces

epPCR; DNA

shuffling

van Loo et al.

(2004)

Incremento en la

promiscuidad de la

actividad

Anhidrasa

carbónica

Incrementada 4

veces con 2-naftil

acetato

Mutagénesis-

Recombinación

Gloud & Tawfik

(2005)

Eficiencia catalítica N-

acetiltransferasa

de glifosato

Incrementada

10,000 veces

11 rondas de DNA

shuffling

Castle et al. (2004)

Termoestabilidad Xilanasa Tm incrementada

35oC

Mutación por

saturación de sitio

Palackal et al.

(2004)

Estabilidad en

solventes orgánicos

Subtilisina E Incrementada 170

veces en 60% de

dimetilformamida

Error-prone

PCR+Screening

Chen & Arnold

(1993)

Resistencia contra

cetotaxima

b-lactamasa Incrementada

32,000 veces

DNA shuffling Stemmer (1994)

Diseño guiado por datos o información

Utiliza secuencias aminoacídicas de las bases de datos ybusca coincidencias entre las proteínas de una mismafamilia u homólogas, donde, se afirma que el aminoácidoen la secuencia original debe ser mutado al aminoácidocompartido por la mayoría de las secuencias homólogas

Vamos a mezclar a ver que sale

Concepto consenso guiado por estructura

Diseño Racional

Diseño de proteínas dirigido por datos o

información

Formula mágica

Determinacióndeaminoácidosdel sitio deinterés amodificar

Búsqueda desecuenciasde proteínascon eldominio deinterés enbases dedatos

Construcciónde matricesdefrecuenciasde losaminoácidos del sitio deinterés

Introducciónde lasmodificacionesmediante eluso de lastécnicas delDiseñoRacional

No más “tablas”

„ Glucosa deshidrogenasa„ Fitasas procedentes del género

Aspergillus y BacillusTermoestabilidad

„ Fitasas del tipo ácidas de histidinade hongos o de fitasas con estructura de hélice de bacterias

Actividad de enzima

„ Cambio en la dependencia de NAD a NADP de lactato deshidrogenasa

Cambio de cofactor

Momento de entrar ainternet procurando nocaer en Facebook

Base de Datos de Proteínas o PDB

Depósito de información de la estructura tridimensionalde macromoléculas biológicas obtenida de maneraexperimental (Resonancia Magnética Nuclear,Microscopio electrónico y Rayos X).

Archivo PDB

RCSB-PDB

MSD-EBI PDBj BMRB

Adivinen qué… UNA TABLA

Método

experimental

Proteínas Ácidos

nucléicos

Complejos

ácidos

nucléicos

proteínas

Otros Total

Difracción de

rayos X

82537 1517 4296 4 88354

NMR 9139 1078 206 7 10430

Microscopía

electrónica

523 52 173 0 748

Híbrido 59 3 2 1 65

Otro 155 4 6 13 178

Total 92413 2654 4683 25 99775

Sandra digo, BRENDA

BRaunschweig ENzyme DAtabase” o BRENDA consiste enuna base de datos se ofrece una visión representativa de lascaracterísticas y variabilidad de cada enzima, a partir de lacual el usuario puede referirse a la literatura original para unestudio más detallado

Pfam: Su familia

Amplia colección de familias de proteínas

(14831 familias de proteínas hasta marzo del

2013).

Componentes

Pfam A

Pfam B

BioEdit

Consiste en una herramienta para el análisis,alineamiento, edición y manipulación de secuenciasde aminoácidos y nucleótidos

Visualización de códigos de colores

Generación e impresión de

cromatogramas

Generación de dibujos de plásmidos

Agrupación de secuencias

Vsualización rudimentaria de

arboles filogenéticos

Construcción de secuencias consenso integradas

Como en show de cocina

Swiss-PDB-Viewer

Herramienta de visualización y análisis de laestructura de proteínas y ácidos nucléicos.

HotSpot Wizard

¿Cómo ocurre magia?

Aún no es todo automático

Asignación de los residuos catalíticos.

Interacción de subunidade

Datos insufientes

Se puso caprichoso el Java

Muchas gracias por su atención

Presentación con certificación de: