“AÑO DE LA INVERSION PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD

ALIMENTARIA”

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURAUNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURAFACULTAD DE INGENIERÍA INDUSTRIAL

Escuela Profesional de Ingeniería Agroindustrial

PRACTICA DE LABORATORIO Nº 02

TEMA : MEDICION DE CRECIMIENTO MICROBIANO

CURSO : BIOTECNOLOGIA

DOCENTE : JORGE BERMEJO BENITES

ALUMNOS : ANCAJIMA CHERO JOSE CRISANTO CARDOZA YANCARLO

ELERA ERAZO JORDIN LOPEZ RAMIREZ EDGAR QUILLILLI AZURIN ALEX

GUERRA GALDO LEO BALLONA SHEYLA

CICLO : I- 2013

PIURA PERU 2010

PRACTICA Nº 02“MEDICION DE CRECIMIENTO MICROBIANO”

I.- INTRODUCCION:

La cinética de crecimiento microbiano constituye una de las operaciones más utilizadas

por la ingeniería alimentaria y la biotecnología, por lo tanto, es menester conocer los

diferentes mecanismos de crecimiento, así como, la forma de cuantificación de los

mismos, sus formas de aplicación, las ventajas y desventajas de los diferentes métodos,

y sobre todo el monto económico de cada uno de ellos. Por tanto, el siguiente

documento trata de proporcionar una información general acerca de los diferentes

mecanismos de reproducción bacteriana, así como de dar una idea acerca de la

utilización de los mismos, sus características, especificaciones, y un análisis de las

ventajas y desventajas de cada uno de ellos.

Podemos definir el crecimiento de cualquier sistema biológico como el incremento

ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un

aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicación celular. En

organismos pluricelulares dicha multiplicación se traduce en un aumento del tamaño del

individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisión o por gemación, lo que

ocurre es un aumento de la población. En los microorganismos cenocíticos (en los que

la duplicación del genoma no se acompaña de división celular) el crecimiento se traduce

en aumento de tamaño de la “colonia” cenocítica. El crecimiento bacteriano podemos

estudiarlo desde dos puntos de vista: a escala individual y escala poblacional.

Objetivo General:

Conocer los distintos métodos directos e indirectos utilizados para determinar el

crecimiento bacteriano.

Objetivo específico:

Determinar el número de levaduras viables en la preparación de inóculos para

bebidas alcohólicas y durante el proceso de fermentación.

II.- FUNDAMENTO TEORICO

II.1.- METODOS DIRECTOS

Los métodos directos se basan en la medida de la evolución del número de células vivas

(técnicas de plaqueo) o del número de partículas (técnicas microscópicas y de

contadores de partículas).

a) Cuantificación del número de células

Se trata de conocer el número total de microorganismos presentes en el alimento. Este

número no guarda relación con el de microorganismos patógenos por lo que no puede

usarse como índice de su presencia y sólo debe considerarse un indicador de las

características higiénicas generales del alimento.

Dependiendo de las características del medio utilizado (medio rico, medio limitado en

nutrientes para medida de la flora no láctica de alimentos fermentados) y de las

condiciones de incubación (mesofilos, psicrófilos) los microorganismos analizados

serán miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de

microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas

situaciones (alimentos envasados al vacío), puede ser de interés hacer recuentos de

anaerobios totales.

b) Contaje de células viables:

Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un equipamiento fácilmente

disponible en un laboratorio de microbiología. Para estos recuentos se utilizan

generalmente cámaras de recuentos, aunque también pueden realizarse a partir de

muestras filtradas en membranas y transparentizadas o teñidas con colorantes

fluorescentes (Naranja de acridina).

La mayor dificultad del recuento en cámara es obtener reproductibilidad en el llenado

de la cámara con líquido. Otra dificultad es la adsorción de las células en las superficies

del vidrio, incluyendo pipetas.

Esta adsorción es crítica en el proceso de dilución de la muestra y se minimiza al

realizar las diluciones en medios de alta fuerza iónica (solución fisiológica o medios

mínimos sin fuente de carbono).

Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley, Petroff-Hausser y la de Neubauer.

La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersión, aunque

la mayoría de los recuentos se realizan con objetivos secos.

Fig. Cámara de recuento de Petroff-Hausser

Fig. Cámara de recuento de Neubauer

Limitaciones:

•Es muy tedioso, no es práctico para un gran número de muestras.

•No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bacterias/mL para que sean observadas

al microscopio.

•No distinguen células vivas de muertas.

c) Contaje en placa

En muchos casos conviene contar las células vivas, y esto en laboratorio se suele hacer

mediante el recuento de viables. (Una célula se define como viable cuando, colocada en

un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El método habitual de

lograr esto es sembrar pequeñas alícuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original

sobre placas de Petri con medio sólido (con agar). Cada célula viable dará origen a una

colonia visible después del tiempo adecuado de incubación. Contando las colonias

visibles, teniendo en cuenta la dilución de la que proceden y el volumen de alícuota

utilizado, es fácil deducir el número de células viables en la suspensión original.

Precauciones:

o Para minimizar los errores estadísticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas

de cada dilución.

o Hay que usar pipetas nuevas en cada dilución

o Contar las placas donde existan entre 30 y 300 colonias.

Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de más de un individuo (y

esto es especialmente cierto para bacterias que forman agrupaciones de 2 o más células),

el recuento se refiere no a “células viables reales sino a unidades formadoras de colonias

(UFC). Por lo tanto, una UFC corresponde, como mínimo, a una bacteria, pero sobre

todo en bacterias con agrupaciones, la medida por siembra en placa infravalora el

número real de individuos, porque cada UFC puede corresponder a dos o más

individuos que estaban juntos al ser sembrados en placa.

II.2.- METODOS INDIRECTOS

Los métodos indirectos se basan en la medida de algún parámetro del cultivo que nos

permite deducir información sobre la evolución del número de microorganismos.

a) Determinación del peso húmedo

Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación

de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes

de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio

intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de líquido retenida puede

ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas muy empaquetadas puede

contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la

forma y deformación celular. Para corregir el peso húmedo se determina la cantidad de

líquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugación, para

ello se utilizan soluciones de polímeros no iónicos (como el Dextran) que pueden

ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.

Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya cuantía

depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del

empaquetamiento, etc.

b) Determinación del peso seco

El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una

suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso

constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que

diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran número de

bacterias. La desventaja de este método es que componentes volátiles de la célula

pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradación. También la muestra

seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una

humedad relativa alta.

El aumento de volumen con la humedad tiene un límite. Este va creciendo hasta que la

célula alcanza un porcentaje de humedad que corresponde al punto de saturación de la

pared celular, aproximadamente del 30 % para todas las especies en cálculos técnicos. A

partir de éste valor el volumen permanece constante, ya que el agua que penetra en el

volumen de las células no produce hinchamiento de la pared celular. Por lo tanto, el

valor del 30 % es un valor para utilizarlo prácticamente, si bien cada especie tiene su

punto de saturación de la pared celular.

Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es

difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1

mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.

III.- MATERIALES:

- 1.5 litros de suero leche

- Cámara de Neubauer

- 1 bombilla acuática

- Microscopio

- Cocina eléctrica

- Pipeta volumétrica

- Azul de metileno

IV.- PROCEDIMIENTO:

IV.1.- Contaje de células viables

Homogenizar el suero de leche y luego Pasteurizarlo a 90°C por 2 minutos.

Enfriarlo hasta una temperatura de 40 °C con agua fría

Verter el suero de leche al biorreactor

En un vaso precipitado tomar 10-20ml de suero de leche del reactor en

funcionamiento.

Aspirar el suero de leche con la pipeta para glóbulos blancos hasta la marca

0.5 y limpiar cualquier exceso con algodón o papel filtro.

Llenar la pipeta con la solución de azul de metileno hasta la marca 11. La

dilución es de 1/20. Todos estos pasos de diluir y medir deben ser realizados

con el máximo de exactitud. Taponar con los dedos, los extremos de la

pipeta y mezclar el contenido muy cuidadosamente.

Descartar las primeras gotas del suero de leche antes de llenar la cámara que

debe estar perfectamente limpia y seca.

Poner en contacto una gota, en el borde del cubreobjetos que se ha colocado

sobre la cámara de manera que el líquido difunda por debajo, llenando la

cámara.

Colocar la cámara bajo el microscopio y localizar el campo con pequeño

aumento, pasando después a un mayor aumento (40X). Contar las células en

los 4 cuadrados de 1mm2 de las esquinas y luego sumarlos.

Repetir todo el procedimiento después de 24 horas de incubación y

determinar el incremento del número de bacterias.

Calcular el número promedio de bacterias.

Las dimensiones de la cámara y el grado de dilución, constituyen las bases del

cálculo. Como las bacterias se han contado en cuatro mm cuadrados, la altura de la

cámara es de 0.1 mm, el grado de dilución es 1/20; para el cálculo del número de

bacterias/mm3 se efectuará la siguiente operación:

(N/4)(20x10)

Donde

N: número de bacterias contadas en los 4 mm2.

Observaciones:

Las observaciones en el microscopio fueron las siguientes a 40X:

PRIMER CONTEO: (viernes 9:00 am)

3er Cuadrante 2do Cuadrante (2276/4) (20x10)=113800 bacterias/mm3

4to Cuadrante 1er Cuadrante

SEGUNDO CONTEO: (Lunes 10:00 am)

2083 2071 (8279/4) (20x10)= 413 950 bacterias/mm3

2065 2060

TERCER CONTEO (Martes 9:10 am)

2524 2465 (9991/4) (20x10) = 499550 bacterias/mm3

35 52 47 31

43 49 45 38

38 36 27 49

31 34 52 54

31 45 63 55

33 39 58 38

44 34 54 57

49 47 48 32

- - - -- - -- -

- - -

- -- -

-- -

- - - -- - - -- - - -- - - -

- - - -- - - -- - - -- - - -

2492 2510

V.- DISCUSION

Transcurrieron algo más de 73 horas para realizar el conteo de células luego de la primera anotación, notándose en la segunda toma de resultados que la población de bacterias se triplico.

VI.- CONCLUSIONES

Se pudo conocer que el cálculo del número de células que existen en una suspensión se puede llevar a cabo mediante el recuento celular (microscopía, número de colonias), masa celular (peso seco, peso húmedo) Todos estos métodos se clasifican en dos apartados: métodos directos y métodos indirectos.

El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran número de bacterias. La desventaja de este método es que componentes volátiles de la célula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradación.

El crecimiento de una población bacteriana puede ser entendido desde diferentes perspectivas y de acuerdo a éstas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas metodologías.

VI.- RECOMENDACIONES

El recuento debe hacerse tan pronto como sea posible después de realizada la dilución y si esto no es posible, debe agitarse nuevamente antes del recuento ya que las bacterias tienden a decantar dentro de la pipeta.

La cámara de Neubauer debe estar completamente limpia, seca y sin ninguna alteración en la estructura que pueda afectar nuestros resultados.

VII.- BIBLIOGRAFÍA

http://www.biol.unlp.edu.ar/alimentos/ASIGNFERMEN.htm

http://www.uib.es/depart/dba/microcore/

VII.- ANEXOS

Pasteurizado de la muestra (suero de leche)

Reactor en funcionamiento, de donde se tomará la muestra

Toma de muestra para llevar a la cámara de Neubauer