Biotecnologa Vegetal.docx

TEMA 1A: ASPECTOS BSICOS DEL CULTIVO IN VITRO DE CLULAS Y TEJIDOS VEGETALES1. Plasticidad vegetal2. Totipotencia3. Diferenciacin y desdiferenciacin celular4. Mtodos de propagacin invitro4.1. Morfognesis indirecta4.2. Embriones adventicios4.3. Yemas axilares preexistentes5. AsepsiaTEMA 1B. FACTORES QUE DETERMINAN EL CRECIMIENTO IN VITRO1. Caractersticas del material vegetal1.1. Genotipo1.2. Edad de la planta, rgano, tejido1.3. Tipo de explanto1.4. Posicin del explanto1.5. Estado fisiolgico y fitosanitario1.6. Origen1.7. Tamao del explanto2. Factores nutricionales y hormonales2.1. Agua2.2. Azcares2.3. Micronutrientes y macronutrientes2.4. Reguladores del crecimiento2.4.1. Auxinas2.4.2. Citoquininas2.4.3. Giberelinas2.4.4. cido abscsico2.4.5. Balance Auxinas/Citoquininas2.5. Otros compuestos2.6. Agar2.7. Potencial osmtico y pH3. Factores ambientales3.1. Interaccin de factoresTEMA 1C: TRASPLANTE A CONDICIONES EXVITRO1. Condiciones de cultivo invitro1.1. Movimiento del agua en la planta2. Causas del fracaso en el trasplante de las plantas obtenidas invitro2.1. Factores que afectan a las relaciones hdricas de las plantas2.2. Factores que afectan a la fotosntesis invitro.2.2.1. Factores internos2.2.2. Factores externos3. Aclimatizacin previa al trasplante3.1. Procesos de la aclimatizacinTEMA 2A: POTENCIAL BIOQUMICO DE LAS PLANTAS. CULTIVO CELULAR1. Introduccin2. Iniciacin y establecimiento de una suspensin celular3. Cultivo de clulas en suspensin3.1. Sistemas estticos o cerrados3.1.1. Dinmica del crecimiento en cultivos estticos3.2. Sistemas dinmicos o abiertos4. Cultivos a gran escala: Biorreactores4.1. Factores a considerar cuando una suspensin celular se cultiva en grandes volmenes4.2. Componentes de un biorreactor4.3. Medio de cultivo5. AplicacionesTEMA 2B: POTENCIAL BIOQUMICO DE LAS PLANTAS1. Introduccin/Historia2. Regulacin de la produccin invitro de metabolitos secundarios2.1. Factores biolgicos2.1.1. Crecimiento2.1.2. Diferenciacin2.1.3. Compartimentacin2.1.4. Variacin en la actividad biosinttica2.2. Factores ambientales3. Optimizacin de la produccin invitro de metabolitos secundarios3.1. Seleccin clonal3.2. Precursores3.3. Elicitores3.4. Cultivo de clulas inmovilizadas4. Transformacin gentica5. Biotransformacin5.1. Obtencin de rendimientos industriales6. Avances y perspectivasTEMA 3A: CULTIVO DE PROTOPLASTOS E HIBRIDACIN SOMTICA1. Introduccin2. Aislamiento y purificacin2.1. Material inicial2.2. Mtodos de aislamiento2.3. Purificacin2.4. Comprobacin de la viabilidad3. Cultivo y desarrollo3.1. Medio de cultivo y condiciones fsicas3.2. Cultivo de protoplastos4. Mtodos de hibridacin somtica4.1. Fusin qumica4.2. Electrofusin4.3. Factores que determinan la fusin4.4. Productos de fusin5. Seleccin tras la fusin6. Limitaciones de la hibridacin somticaTEMA 3B: PLANTAS GENTICAMENTE MODIFICADAS PARA LA OBTENCIN DE COMPUESTOS DE INTERS FARMACUTICO, BIOSANITARIO O INDUSTRIAL O CULTIVOS CON VENTAJAS AGRONMICAS Y NUTRICIONALES1. Introduccin2. Origen y evolucin de las plantas genticamente modificadas3. Plantas biofactoraTEMA 3C: PROTENAS RECOMBINANTES1. Eleccin de la especie hospedadora2. Transformacin2.1. Genes caracterizados2.2. Promotores potentes2.3 Marcadores2.4. Construccin del vector de transferencia2.4.1. Transferencia indirecta de genes2.4.2. Transferencia directa de genes2.4.3. Mtodos indirectos vs mtodos directos2.5. Transformacin nuclear2.6. Transformacin plastidial2.6.1. Ventajas respecto de la transformacin nuclear2.6.2. Inconvenientes de la transformacin de cloroplastos:3. Seleccin y regeneracin de la planta4. PurificacinTEMA 3D: INGENIERA METABLICA1. Introduccin1.1. Estrategias que emplea la ingeniera metablica1.2. Factores condicionantes2. Manipulacin del metabolismo de carbohidratos3. Manipulacin del metabolismo lipdico4. Manipulacin del metabolismo secundario5. Aspectos legales, ticos, sociales y de mercado

La biotecnologa, de forma general, es el empleo de clulas vivas para la obtencin y mejora de productos tiles tales como alimentos y medicamentos.

La asignatura se divide en 3 grandes bloques: 1. Aspectos bsicos de cultivo invitro en plantas: factores que influyen, aclimatizacin de esas plantas2. Potencial bioqumico de las clulas vegetables que nos pueden interesar para obtener metabolitos secundarios. 3. Transformacin gentica: transformando genticamente las plantas, podemos hacer que sinteticen compuestos de inters industrial. TEMA 1A: ASPECTOS BSICOS DEL CULTIVO IN VITRO DE CLULAS Y TEJIDOS VEGETALES

1. Plasticidad vegetalExisten importantes diferencias entre las clulas animales y vegetales que hacen que a partir de una clula vegetal pueda surgir un individuo completo (esta es la diferencia bsica). Esto ocurre siempre que cultivemos esa clula en un determinado medio y con unos estmulos adecuados.

Las plantas son organismos inmviles, aguantan lo que les caiga: nieve, sequa, viento. Al no poder moverse, no les queda ms remedio que adaptarse a cualquier cambio que haya por medio. Aqu es donde entra el concepto de plasticidad. La plasticidad fenotpica se define como la capacidad que tienen las plantas de alterar su estructura, alterar su metabolismo y su desarrollo para poder adaptarse a cualquier cambio que se produzca en el medio.

Las plantas son seres con propiedades plsticas porque pueden alterar sus rutas metablicas y su desarrollo en respuesta a estmulos.Las clulas cultivadas invitro son enormemente plsticas: nos permiten regenerar una planta a partir de una clula.

2. TotipotenciaOtro concepto importante relacionado con el tema de la plasticidad es la totipotencia vegetal: es la capacidad que tiene una clula de crecer y multiplicarse y diferenciarse dando lugar a un individuo concreto. NO todas las clulas animales son totipotentes, en el caso de las plantas todas las clulas son totipotentes, es decir, todas las clulas vegetales tienen la informacin gentica necesaria para poder desarrollar un individuo concreto a partir de ellas aunque no lo manifiesten.

Cmo regenerar o generar una planta a partir de una clula? Aislamos una clula de una zanahoria (por ejemplo) que dar lugar a un embrin y producir, al cabo de un tiempo, una nueva zanahoria (Fig. 1). Para que esa clula se transforme en una planta entera es necesaria la presencia de estmulos (por lo general son compuestos: cules deben ser y a qu concentracin tienen que estar)

Fig. 1: Organognesis a partir de callo de zanahoria

3. Diferenciacin y desdiferenciacin celularCmo una clula da lugar a una planta entera? Principalmente ocurren dos procesos: para que una clula se transforme en un individuo tiene que dividirse (multiplicacin/proliferacin celular) y en segundo lugar tiene que diferenciarse

La diferenciacin celular es un proceso por el cual una clula adquiere unas propiedades estructurales, metablicas, funcionales, distintas a las de la clula madre que la origin. El proceso de diferenciacin es un proceso reversible en el caso de las plantas (en el caso de los animales es irreversible ya que una neurona no puede dejar de ser neurona).

Sin embargo, la planta puede sufrir el efecto contrario, es decir, desdiferenciacin: es un proceso de rejuvenecimiento en el que la planta adquiere capacidad de multiplicacin y comienza a hacerlo. Cuando un tejido se rejuvenece y se multiplica, se obtiene como resultado un callo (es una masa amorfa o un conjunto de clulas desdiferenciadas). Una vez que tenemos el callo se puede inducir una diferenciacin (una rediferenciacin), que puede ir dirigida a la formacin de rganos (organognesis) o a la formacin de un embrin (embriognesis).

Si aislamos la clula diferenciada y la colocamos en un medio adecuado, empezar a dividirse y rejuvenecerse (se dice que vuelve al estado meristemtico) y el nuevo conjunto de clulas formar el callo. A partir de aqu puede iniciarse una rediferenciacin; la planta se regenera, volvemos a aislar una clula y se cierra el ciclo.

4. Mtodos de propagacin invitroLos principales mtodos de micropropagacin que existen son 3: 1. Un primer grupo consiste en la propagacin a partir de yemas axilares o apicales (situadas en la base de las hojas).2. Otro gran grupo consiste en la propagacin a travs de la formacin de tallos u rganos adventicios (un rgano adventicio es aquel que se desarrolla en un lugar que no es el habitual para ese rgano en concreto). La formacin de tallos u rganos adventicios se divide en dos: va directa (tambin llamada de embriones adventicios; sin paso previo por callo) o va indirecta (implica proceso de diferenciacin a callo y posterior rediferenciacin). 3. Propagacin mediante morfognesis indirecta (es la va indirecta de la formacin de tallos u rganos adventicios, pero en este caso, implica un proceso de diferenciacin a callo): a partir de un fragmento de la planta (se denomina explanto) se induce una desdiferenciacin de ese tejido de modo que se forma un callo (tejido desdiferenciado) a partir de este callo se induce una rediferenciacin, o bien hacia la formacin de tallos y races (formacin de rganos u organognesis indirecta), o bien hacia la formacin de embriones (embriognesis somtica).

Existen dos posibles vas implicadas en la diferenciacin de novo de brotes (vas morfognicas), stas son: organognesis y embriognesis. En la organognesis se parte de un grupo de clulas del explanto inicial que se desdiferencia inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un rgano vegetal. En la embriognesis se parte de una nica clula que se asla y constituye el punto de partida para la formacin de un embrin somtico. El resultado es una planta completa.

4.1. Morfognesis indirectaLa micropropagacin vegetal mediante morfognesis indirecta presenta una desventaja y es que existe una probabilidad alta de que se produzca variacin gentica (suelen aparecer mutaciones que no interesan). Por tanto el producto final puede no ser igual al inicial. En los mtodos indirectos no se conserva la fidelidad genotpica.

La morfognesis indirecta, como hemos dicho, puede estar encaminada a la organognesis o a la embriognesis. Procedimiento para la organognesis: sobre la superficie celular del callo encontramos clulas meristemticas superficiales, a partir de stas clulas se desarrollan las yemas y tallos. En la organognesis indirecta, en funcin de lo que se desarrolle, hablamos de: caulognesis o formacin de tallo, y rizognesis o formacin de races.

Ej: A partir de mdula de tabaco, la sembramos y al cabo de un tiempo tenemos un callo que producir un tallo (caulognesis)

Caulognesis en tabaco

La embriognesis somtica es la otra variacin morfolgica, adems de la organognica. En las plantas no se forman de manera natural embriones, pero podemos obtener embriones a partir de una clula somtica (esto es lo que se conoce como embriognesis somtica).

La nica diferencia entre la embriognesis cigtica y la somtica es el choque inductor (de esa embriognesis): para los animales el choque es la fusin de gametos y para las plantas la presencia de auxinas en el medio de cultivo, que har que un callo se convierta en un embrin somtico.

Por lo dems son idnticas y las fases de desarrollo son iguales (Fig 2): a partir de una clula, sta se multiplica y se forma un agregado celular que dar lugar a un embrin globular, ste a su vez sufre un proceso de polarizacin (va madurando y se distinguen dos polos: pice radicular y caulinar - se dice que est en fase de corazn por la forma que tiene). Posteriormente el embrin sigue desarrollndose y la parte que est debajo de los cotiledones se alarga (fase de torpedo: aqu se empiezan a diferenciar los diferentes tejidos: como los vasculares, que darn lugar al xilema y floema). Finalmente se nos formar una planta.

Fig. 2: Fases de desarrollo de embriognesis

La presencia de auxinas en el medio induce la formacin de masas proembrinicas (son unos agregados celulares en cuyo interior se han empezado a desarrollar los embriones) en el tallo. Estas masas presentan 2 tipos de clulas: unas vacuoladas (grandes) en el exterior y otras en el interior ms pequeas (con citoplasma ms denso) que darn lugar a los embriones. Se encuentran rodeadas (las masas) de una capa de cutina. Las masas proembrinicas se degradan porque en el medio de cultivo hay auxinas que son inductoras del etileno (hormona gaseosa), que producir enzimas (cutinasas, pectinasas, celulasas) que van a degradar las masas proembrinicas (la degradacin y regeneracin constituyen el ciclo de las auxinas). Hay un momento en el cual la auxina ha producido el choque inductor y comienza el crecimiento, en este momento hay que retirarlas para que no destruyan las masas. Al eliminar las auxinas del medio de cultivo conseguimos que los embriones puedan seguir su desarrollo completo.

4.2. Embriones adventiciosSegunda ruta de micropropagacin a travs de embriones adventicios: Es normal que un embrin salga de un tallo? NO, por eso se llaman embriones adventicios: surgen de rganos o tejidos (y esto no es normal). No necesariamente necesitamos pasar por una fase de callo (podemos coger un explanto, cultivarlo y que se desarrollen tallos que se enraizarn; o bien que a partir del explanto se desarrolle un embrin). La ventaja es que las probabilidades de mutaciones no son altas (se conserva algo ms la fidelidad genotpica).

4.3. Yemas axilares preexistentesEl tercer gran bloque de mtodo de micropropagacin invitro es la propagacin a partir de yemas axilares: aqu ya no cogemos un explanto cualquiera (hay que coger un explanto que contenga una yema).

Hay 3 modalidades posibles: segmentos nodales (1), pices o yemas (2) y meristemos (3). Segmentos nodales (1): a partir de un tallito de la planta podemos obtener una yema que se siembra en el agar y va a desarrollarse para dar lugar a una parte area y una raz que posteriormente dar lugar a una planta entera. No necesariamente tenemos que sembrar el tallo entero, podemos sembrar la yema. No se debe sembrar toda la yema sino una parte llamada tomo meristemtico (que es lo que est entre las 2 pequeas hojas de la yema). La principal ventaja es que las plantas obtenidas son clones idnticos de la planta madre (no hay apenas variacin gentica).

El mtodo anterior es adecuado para los que tienen entrenudos separados. Para plantas con entrenudos juntos es mejor el cultivo de pices o yemas (2).

El cultivo invitro de meristemos (3) comprende el aislamiento de los mismos y se introducen en un medio de cultivo, con nutrientes, en el cual crecern.

5. AsepsiaLa asepsia es uno de las aspectos ms importantes del cultivo invitro. La contaminacin que nos podemos encontrar en cultivo invitro se debe, fundamentalmente, a hongos y bacterias. Estos seres son omnipresentes. Si una bacteria cae sobre un tubo o cultivo, se encontrara en condiciones ideales para crecer, va a proliferar y va a acabar con nuestra planta (no permiten que el explanto se desarrolle correctamente). Por eso es muy importante mantener condiciones de asepsia: hay que esterilizar los instrumentos y todo el material con el que trabajamos: esterilizar el medio de cultivo, esterilizar el rea de trabajo (cmara de flujo laminar) y finalmente desinfectar el material antes de empezar a trabajar con l. Se suele emplear hipoclorito sdico como agente desinfectante: la concentracin y tiempo de desinfeccin depende del explanto, del tejido (si es sensible o no) y tambin depende de su origen (los rganos subterrneos tienen mayor contenido microbiano y hay que esmerarse ms en desinfectar)

TEMA 1B. FACTORES QUE DETERMINAN EL CRECIMIENTO IN VITRO

1. Caractersticas del material vegetal1.1. GenotipoHace referencia a qu especie se est cultivando in vitro. No es lo mismo cultivar una patata que una zanahoria. Las especies dicotiledneas tienen una capacidad regenerativa mucho ms alta que las monocotiledneas (cebada, maz..). Las conferas tienen una muy baja capacidad regenerativa, salvo que se empleen explantos muy jvenes. Generalmente, una especie que tiene una buena capacidad morfognica ex-vitro tambin la tiene in-vitro (hiedras, geranios..), pero hay excepciones como la Calanchoe farinacea, que en ex-vitro tiene poca capacidad regenerativa pero in-vitro esta capacidad es mucho mayor (se debe a su gran capacidad de absorcin de sustancias del medio).

1.2. Edad de la planta, rgano, tejidoLos individuos jvenes tienen habitualmente una mayor capacidad morfognica. Es un aspecto muy importante cuando se trabaja con especies arbustivas. Hay que tener en cuenta tambin que si un tejido es viejo y se cultiva in-vitro, ste no se vuelve joven sino que mantiene las caractersticas de tejido adulto. Siempre es mejor emplear tejidos jvenes (embrionarios, meristemticos..), aunque existen subcultivos que pueden hacer que los tejidos adultos rejuvenezcan.

1.3. Tipo de explantoSe denomina explanto a aquel fragmento de la planta que se asla y se cultiva in-vitro. El tipo de explanto va a condicionar su desarrollo en estos tipos de cultivo, y adems su eleccin se realizar en funcin del objetivo de dicho cultivo. Tipos de explanto: Semillas. Embriones. Microesporas: Granos de polen, son haploides y se emplean para programas de mejora gentica. A partir de ellos crecen plantas haploides. Ovarios. pices de tallo: Para propagar una determinada planta y obtener clones. Meristemos: Para propagar especies libres de virus, ya que los meristemos son una parte interna protegida de las yemas de la planta. pices de raz. Callo. Clulas: Para obtener compuestos de inters, metabolitos secundarios. Protoplastos: Son las clulas vegetales sin pared celular. Se emplean para hacer transformaciones genticas.

1.4. Posicin del explantoHace referencia a dnde est situado dentro de la planta. Existe un fenmeno llamado topfisis, que es el fenmeno por el cual la posicin de un explanto dentro de la planta condiciona su desarrollo in-vitro. Por ejemplo: si se toma un explanto desde la base de la planta, ser mucho ms fcil formar una raz que una parte area.

1.5. Estado fisiolgico y fitosanitarioCon estado fisiolgico se hace referencia a la fase de desarrollo de la planta (vegetativa, reproductiva...). Si se toma un explanto en la fase de desarrollo vegetativo, la capacidad de desarrollo del explanto es mayor in-vitro que la de un explanto en fase reproductiva.

1.6. OrigenHace referencia a si ha crecido en un invernadero o en el campo. Se ha visto que las plantas de invernadero tienen una mayor capacidad regenerativa que las que vienen del campo. Tambin afecta la historia de la planta, es decir, si anteriormente sufri estrs hdrico o nutricional, etc.

1.7. Tamao del explantoCuanto ms pequeo sea el explanto, ms difcil ser su desarrollo. Las reservas endgenas que tiene ese explanto (energticas, hormonales) van a facilitar su cultivo. Por eso, explantos de rganos de reserva son mucho ms fciles de cultivar que otros tipos. Adems, cuanto ms pequeo es el explanto, se desecar con ms facilidad; y tambin hay que tener en cuenta las superficies de corte, que son muy importantes porque son zonas a travs de las cuales el explanto va a absorber las sustancias del medio, pero por otro lado por esas mismas superficies se pueden producir sustancias que no interesan (como el etileno) y que pueden pasar al medio, afectando al cultivo.

2. Factores nutricionales y hormonales2.1. AguaEl agua es la base del medio de cultivo, supone el 95% de la composicin del mismo. Tiene que ser agua purificada, que haya sido tratada para eliminar contaminantes con mtodos como la destilacin o la smosis inversa, entre otros. Sobre esta base se van aadiendo los otros componentes del medio de cultivo.

2.2. AzcaresLos hidratos de carbono son esenciales porque las clulas no pueden realizar la fotosntesis mientras estn siendo cultivadas in-vitro, son hetertrofas en ese estado porque:- Puede que se est cultivando un explanto que no es fotosintticamente activo (grano de polen, raz). Por tanto requiere un aporte exgeno de glcidos.- Aunque sea un segmento fotosintticamente activo (hoja), en las condiciones in-vitro la fotosntesis est muy limitada: el CO2 se agota rpidamente, la intensidad de luz es muy baja, etc.

Los tipos de azcares que se aportan al medio, as como su concentracin, dependen del tipo de explanto. El azcar ms empleado es la sacarosa porque es el que usan las plantas normalmente. La concentracin en el medio de cultivo suele ser al 5% m/v, y hay que tener en cuenta que un explanto jven va a necesitar ms cantidad de azcares que uno viejo, etc.

Con la sacarosa hay que tener cuidado porque puede degradarse en el medio de cultivo en dos puntos:- En la esterilizacin del medio de cultivo, ya que se autoclava y en esas condiciones puede tener lugar el desdoblamiento o la caramelizacin de la sacarosa.- El explanto puede segregar enzimas (invertasas) que pueden degradar la sacarosa.

2.3. Micronutrientes y macronutrientesEn el medio de cultivo hay que aportar estos nutrientes en forma de sales solubles. Una misma sal puede aportar varios elementos (Nitrato potsico aporta nitrgeno y potasio), o un mismo elemento puede ser aportado en forma de diferentes sales (Nitrgeno en forma de nitrato o sales de amonio). Las sales se preparan en forma de soluciones stock, es decir, soluciones muy concentradas de las cuales se emplean diluciones segn se necesite. Existen muchas recetas que pueden emplearse y funcionar bien para la mayora de cultivos, aunque la ms comn es la receta Murashige Skoog porque es la que mejor funciona para todas las especies aunque se puede modificar dependiendo de la sensibilidad de cada especie vegetal respecto de un nutriente. Es muy importante tambin cuidar la absorcin de nitrgeno, que comnmente se hace en forma de nitrato, pero existen especies que lo absorben mejor en forma de sal de amonio (ms raro).

2.4. Reguladores del crecimientoLos reguladores son compuestos clave que van a permitir el desarrollo del cultivo hacia una ruta morfognica u otra.

Las hormonas (citohormonas) son compuestos orgnicos que se encuentran presentes de forma natural en las plantas y que regulan el crecimiento y el desarrollo de sus rganos. Habitualmente se encuentran en una concentracin muy baja en la planta, y normalmente ejercen su funcin en un lugar distinto al de su sntesis.

Existen compuestos sintticos con las mismas propiedades que las hormonas pero que adems tienen otras ventajas: son mucho ms estables (no se degradan con facilidad) y ms activos (se requiere menos concentracin), y por ello son mucho ms usados en los cultivos in-vitro que las hormonas naturales.

El conjunto de hormonas y estos compuestos sintticos anlogos a ellas se denominan reguladores de crecimiento, y los dos grupos ms empleados son las auxinas y las citoquininas.

Por otro lado, ya en desuso, se empleaban mezclas indefinidas de sustancias (zumo de pomelo, leche de coco..) para aadirlas al medio de cultivo porque vean que funcionaban bien. Son compuestos de composicin desconocida y muy variable, y por eso su uso no es prctico.2.4.1. AuxinasEl cido 3-Indolactico (AIA) es la auxina natural que se encuentra en las plantas (generalmente en el tallo pero ejerce su efecto a nivel de la raz), mientras que en el cultivo in-vitro se suelen emplear las sintticas (IBA, NAA). El AIA es muy sensible a las peroxidasas, al pH bajo, etc. sin embargo las sintticas son mucho menos sensibles y adems son ms eficaces a menor concentracin. Habitualmente se suelen preparar en soluciones stock. Son insolubles en agua, por lo que es necesario disolverlas en etanol o agua bsica (con NaOH). Funciones:- Inducen el crecimiento de la raz.- Inducen la dormancia apical. La dormancia es el perodo del ciclo biolgico en el que las funciones de crecimiento, desarrollo y actividad fsica cesan temporalmente.- Inducen la divisin y la elongacin celular.

2.4.2. Citoquininas La Zeatina es la citoquinina natural que se sintetiza en la raz (pero ejerce su funcin a nivel del tallo). El resto son sintticas y se emplean muchsimo ms (BAP o 6-BenzilAminoPurina). Tambin se preparan en soluciones stock y son insolubles en agua, por lo que hay que disolverlos en agua cida (HCl) a diferencia de las auxinas.Funciones:- Inducen la formacin de los tallos adventicios.- Inhiben la dormancia apical.- Inducen la divisin celular (especialmente en combinacin con auxinas)

2.4.3. GiberelinasNo son muy habituales en los medios de cultivo. Se emplean en cultivos especficos.

Funciones:- Elongacin del tallo.- Rompen la dormancia de embriones y semillas.

2.4.4. cido abscsicoSu diminutivo es ABA, suele sintetizarse por el explanto, y si se sintetiza en gran cantidad, junto al etileno, llega a ser perjudicial para el cultivo.

2.4.5. Balance Auxinas/Citoquininas

Gracias a la plasticidad fenotpica y la totipotencia, manipulando el balance hormonal entre auxinas y citoquininas se puede modular el desarrollo del explanto. Dependiendo de la proporcin de estas hormonas, se inducir la formacin de un determinado tejido u otro.2.5. Otros compuestosDiversos aminocidos se han empleado como fuente orgnica de nitrgeno. El nitrgeno se aporta al medio a partir de sales.Vitaminas: suele ser habitual aadir inositol (mioinositol, constituyente de la vitamina B), cido flico (vitamina B9), la tiamina (B1), el cido ascrbico (C, se aade por su capacidad antioxidante). Los explantos suelen tener capacidad para sintetizar vitaminas y por eso se aaden en cantidades muy bajas. A veces suele aadirse carbn activo: el carbn activo es un compuesto que tiene una enorme cantidad de poros capaces de absorber gases, lquidos e incluso sustancias slidas. Es interesante su adicin porque a veces cuando sembramos un explanto, cuando envejece o si tiene falta de nutrientes, suele excretar compuestos fenlicos al medio. Estos compuestos cuando se oxidan (al estar en contacto con el oxgeno) adquieren un color marrn (reaccin de pardeamiento). El carbn activo retira estos compuestos fenlicos que son txicos para la planta.2.6. AgarLos medios de cultivo pueden ser lquidos, semislidos o slidos. El agar es un ejemplo de un medio de cultivo slido. Necesitamos aadir al medio de cultivo un agente gelificante: uno muy comn es el agar (es un polisacrido de origen natural, en concreto lo sintetizan las algas) y tiene como ventajas que es un buen agente gelificante porque: no reacciona con el medio de cultivo (no reacciona con hormonas, vitaminas ni sales minerales), es muy estable (no se degrada fcilmente a altas temperaturas: ni cuando se esteriliza, ni por enzimas) y no es citotxico (ni para las clulas ni para los tejidos). El agar es insoluble a temperatura ambiente. Para disolverlo es necesario calentarlo: se disuelve a vapor fluente (el autoclave se deja abierto y el vapor que sale es el que lo calienta). Una vez caliente se deja enfriar y forma una red tridimensional capaz de retener el agua, las sales minerales y todos los componentes del medio de cultivo; los retiene pero adems los pone a disposicin de la planta.La concentracin de agar es importante ajustarla porque si ponemos poco agar, el medio no nos va a solidificar. Hay que poner la cantidad mnima pero sin pasarse porque si ponemos altas concentraciones de agar el medio queda extremadamente slido. El contacto entre el medio y el explanto va a ser ms difcil (porque no penetra) y adems nos va a retener con demasiada fuerza el agua y el explanto va a sufrir deficiencias. Cada proceso invitro tiene sus propias necesidades especficas (No existe un medio satisfactorio/universal para todo tejido o proceso)Los requerimientos nutricionales son funcin de la especie vegetal (si es sensible a las sales no podremos poner sales en concentracin elevada; hay especies que para un mismo proceso requieren ms concentracin de hormonas que otras), el tipo de explanto (si es fotosintticamente activo o no), la edad de la planta, el rgano a partir del cual obtenemos el explanto (el jven requiere ms sacarosa que los adultos al tener mayor actividad metablica y suelen tener un menor requerimiento hormonal para desarrollarse), y el tamao del explanto (dependiendo de si es grande o pequeo tendr mayor o menor reserva).2.7. Potencial osmtico y pHLo habitual es esterilizar el medio de cultivo por los procedimientos normales, pero existen otros mtodos como la filtracin: ideal cuando el medio de cultivo es sensible a la alta temperatura.

Dentro de los factores nutricionales y hormonales, estudiamos dos factores que realmente son ambientales, pero como estn tan relacionadas con el medio de cultivo lo explicamos en este apartado: El pH: no se conoce demasiado el efecto del pH sobre el crecimiento de la planta. Solo se sabe que hay un rango ptimo entre 5 y 6.5. El pH cido (raz>tallo>hojas>atmsfera (se cuantifica siempre el valor absoluto del potencial, es decir, segn ese orden de potenciales, la atmsfera tiene el potencial hdrico ms bajo, pero no quiere decir que sea cercano a 0 sino todo lo contrario, que es muy negativo. Por el contrario el suelo tendr el potencial hdrico ms cercano a 0)Cuanto mayor sea la diferencia entre el potencial hdrico entre el suelo y la atmsfera, mucho ms fcil se mover el agua a travs de todo el sistema.

A travs de los estomas, el agua sale a la atmsfera. Este proceso se llama transpiracin. Es necesario que los estomas estn abiertos.En un ambiente exvitro la diferencia de potencial hdrico entre el aire y el suelo (es decir, la diferencia entre el potencial hdrico del aire menos el potencial hdrico del suelo) es de casi 100 megaPascales. En un ambiente invitro, el potencial hdrico del medio de cultivo no es 0: es 0.4 megaPascales. Hay -1.4 MPa en la parte area (invitro) y -1 MPa en el medio de cultivo, por tanto: . Como el gradiente de potencial es muchsimo ms pequeo que en exvitro, hay muy poca transpiracin y hay dificultad para absorber nutrientes a travs de las races.

Podemos concluir que cuanto mayor es la humedad relativa, menor es la transpiracin. A menor CO2, menor actividad fotosinttica. A menor intensidad de luz, menor actividad fotosinttica. La presencia de sacarosa hace que la fotosntesis se vea inhibida. El potencial osmtico es negativo e inhibe la absorcin de agua y nutrientes (esta dificultad de absorcin tambin viene favorecida por un bajo tirn transpiratorio). El tirn transpiratorio se traduce en la velocidad con la que circula el agua a travs del sistema sueloplantaatmsfera. Cuanto mayor sea el tirn respiratorio, es decir, cuanto mayor sea la diferencia de potencial hdrico, tanto mayor ser la velocidad con la que circule el agua.2. Causas del fracaso en el trasplante de las plantas obtenidas invitroAspectos morfolgicos y fisiolgicos que se ven afectados:2.1. Factores que afectan a las relaciones hdricas de las plantasCuando traspasamos una planta invitro a un ambiente exvitro, lo primero que le ocurre es que se deshidrata. Esta rpida deshidratacin se debe a la apertura de estomas (ms que a la apertura es que los estomas no se cierran)Estructura del estoma: son poros que se encuentran en el envs de las hojas. El poro u ostiolo es por donde entra el agua. Presenta 2 clulas oclusivas en forma de rin. Rodeando a estas clulas oclusivas puede haber clulas acompaadas (sin importancia). Un estoma se abre o se cierra porque las clulas oclusivas cambian su turgencia: hay un paso de iones al interior de la clula oclusiva y con el paso de iones, tambin hay un paso de agua (debido a la diferencia de potencial osmtico que se genera) y se abren. Cuando el estoma se cierra lo que ocurre es que los iones salen y el agua tiende a salir por diferencia de potencial osmtico.

Baja funcionalidad estomtica: las plantas invitro tienen baja funcionalidad estomtica. No se cierran porque no responde ante estmulos externos ni internos para que los estomas se cierren, por tanto, estn permanentemente abiertos: se traduce en una salida masiva de agua.

Morfolgicamente el estoma invitro y exvitro son diferentes:Invitro: Son mas redondeados, prominentes y grandes (a diferencia del exvitro que es elptico y pequeo). No acumulan potasio y cloro que hace que aumente la turgencia de la clula (las funciones inicas estn alteradas). El sistema de microfibrillas (tiene que estar organizado para una buena apertura del ostiolo) no est bien organizado.

Adems de los estomas: las ceras epicuticulares son diferentes. Encima de la epidermis existe una capa de cera llamada cera epicuticular. La planta no slo pierde agua a travs de los estomas (es por donde ms transpira pero no es el nico mtodo de transpiracin), tambin puede perder agua por toda la superficie de la epidermis. Para evitar esto, se cubre con una capa de cera. Esta capa de cera epicuticular es prcticamente inexistente invitro mientras que en exvitro si que existe y cumple su funcin de evitar la salida del agua. Tambin hay cambios en la composicin de las ceras: las invitro tienen una enorme proporcin de lpidos polares en relacin a una exvitro donde la proporcin de grupos polares es menor. Esto indica que los lpidos invitro son menos hidrfobos y por tanto ms permeables al agua.2.2. Factores que afectan a la fotosntesis invitro2.2.1. Factores internosCaractersticas del material vegetal. El material vegetal afecta a la fotosntesis invitro. Hay genotipos que sintetizan ms que otros y el grado de diferenciacin va a afectar a la capacidad de realizar la fotosntesis. Si el material es muy desdiferenciado (callo) tendr un aparato fotosinttico poco estructurado (no estar bien formado y por ello su capacidad fotosinttica va a ser baja).

La clorofila tambin influye: los niveles de clorofila de una planta invitro suelen ser bastante parecidos a una exvitro, pero cuando la transferimos a condiciones exvitro, sus pigmentos son ms sensibles a la intensidad lumnica natural (sol) y se degradan con facilidad.

Modificaciones anatmicas: morfolgicamente tambin son diferentes. La estructura de una hoja en corte transversal de una exvitro presenta: cutcula, epidermis, parnquima o mesfilo foliar (es lo mismo), parnquima en empalizada, parnquima esponjoso, epidermis y cutcula. En la planta invitro se observan diferencias: no tiene parnquima en empalizada (slo tiene el esponjoso), las clulas epidrmicas son ms irregulares, el mesfilo esponjoso tiene menor densidad celular (hay mucho ms espacio intercelular). Esto afecta a la fotosntesis de la siguiente forma: los espacios intercelulares disminuye la disponibilidad de CO2. La fotosntesis se desarrolla en el mesfilo, si est disminuido (el mesfilo) la fotosntesis tambin lo estar. A nivel celular tambin existen diferencias: invitro vemos grandes vacuolas y muchos espacios intercelulares, la membrana interna del cloroplasto no est ordenada y no tiene agrupamientos granales.

Rubisco: es la enzima que cataliza la fijacin de CO2 en una primera molcula de 6 carbonos. Est demostrado que en plantas invitro, la concentracin de rubisco es menor a la concentracin de rubisco de plantas exvitro. Adems tienen la rubisco menos activa (su estado de activacin es menor). Estas plantas con menos rubisco y poco activa darn lugar a una baja actividad fotosinttica. Les falta sustrato (por bajo CO2 durante el da) y las estamos haciendo crecer con sacarosa (la presencia de sacarosa en el medio se ha visto que produce una retroalimentacin del ciclo de krebs; les damos el producto del ciclo de calvin, que se traduce en una disminucin en la fotosntesis).2.2.2. Factores externosEl primero de los factores invitro es la luz (intensidad luminosa): se saturan a muy baja intensidad luminosa. La fotosntesis neta ex-vitro: conforme aumenta la intensidad luminosa, aumenta la fotosntesis hasta que se satura (hasta 1200). En una invitro: conforme aumenta la intensidad luminosa, aumenta la saturacin pero se satura mucho antes (mucho menos de 1200). Este inconveniente no es reparable puesto que si aumentamos mucho la luz la planta invitro se achicharra y adems su aparato fotosinttico no est preparado para recibir tanta luz. El exceso de energa canaliza la formacin de especies reactivas de oxgeno (dainas para la planta).

El CO2 invitro por la noche es muy alto, pero al comienzo del da disminuye hasta ser un factor limitante (se agota rpidamente y escasea en todo el da)

La sacarosa es otro factor limitante de la fotosntesis invitro: si a una planta invitro se le da carbohidratos ya no necesita la fotosntesis. Los carbohidratos disminuyen la rubisco y aumentan el producto del ciclo de calvin. 3. Aclimatizacin previa al trasplanteConclusin de todo lo anterior: se necesita adaptar la planta al medio exvitro. La aclimatacin es la adaptacin de una planta a un nuevo ambiente. La aclimatizacin consiste en el proceso por el cual el hombre favorece/acelera la adaptacin al nuevo ambiente.3.1. Procesos de la aclimatizacin Incrementar la intensidad luminosa (diferentes bandas) Eliminar los restos de agar (aumentaremos la diferencia de potencial hdrico entre el suelo y la atmsfera. Eliminar la sacarosa del medio que incita a la planta a activar su fotosntesis) Reduccin de la humedad relativa (para favorecer la activacin de estomas)

TEMA 2A: POTENCIAL BIOQUMICO DE LAS PLANTAS. CULTIVO CELULAREn este bloque nos centramos en el potencial bioqumico de las plantas. Se estudia qu aplicacin se le puede dar al cultivo invitro. El sistema de cultivo habitualmente empleado para explotar el potencial bioqumico es el cultivo celular.1. IntroduccinEl primer cientfico que intent obtener cultivos celulares fue Haberlandt en 1902 (principios del siglo XX). Este cientfico fue el primero en estudiar esto y fracas porque empez por lo ms difcil: el cultivo celular (es ms fcil cultivar un callo o un tejido que iniciar un cultivo celular). No obstante los intentos que realiz sirvieron de experiencia para el resto de cientficos.No fue hasta los aos 70 que no se logr obtener el primer cultivo celular.

Aplicaciones (Para qu sirve un cultivo?): Puede ser un sistema para realizar estudios bsicos de metabolismo celular. Puede servir como mtodo de micropropagacin de plantas (obtencin de rganos y plantas) Puede ser empleado con fines industriales (obtencin de sustancias de alto valor aadido). Nos vamos a centrar en esta aplicacin.2. Iniciacin y establecimiento de una suspensin celularCmo empezamos? Partimos de un explanto (trozo de zanahoria por ejemplo). Inducimos la formacin de un callo, para lo cual hay que cultivarlo en un medio con auxinas y citoquininas (equilibrado). Existen dos tipos de callos: los callos compactos (aquel en el que las clulas estn fuertemente unidas entre s; con pocos espacios intercelulares) y los friables (callo en el cual las clulas estn formando agregados mucho ms laxos, con ms espacios intercelulares).

Seleccionamos un callo friable, el cual se introduce en un medio lquido. Por las caractersticas (por la propia estructura) de ese callo, si se agita, se va a ir disgregando en ese medio de cultivo lquido. La suspensin que se nos forma la filtramos. Una vez filtrada tendremos la suspensin celular lista.

Slo es posible obtener suspensiones celulares a partir de un callo? NO, se puede partir directamente de un tejido diferenciado y obtener la suspensin directamente (pero en este caso hay que emplear un tejido apto para ello, no vale cualquiera). Para iniciar directamente la suspensin a partir de un tejido se requiere de una serie de materiales: *mesfilo foliar (parnquima), *fragmento de cotiledn, callo friable, protoplastos y granos de polen*El mesfilo foliar y el fragmento de cotiledn requieren un mayor tiempo para establecer el cultivo y tambin requieren tratamientos enzimticos (celulasas y peptidasas)

Las suspensiones son bastante heterogneas. La proliferacin celular en cultivo celular es elevadsima. Puede duplicarse el nmero de clulas en cuestin de 20-60h (esto tiene una consecuencia: mutagnesis, es decir, alta variabilidad gentica, incluso mayor que la que encontramos en los callos)3. Cultivo de clulas en suspensinQu sistemas de cultivo podemos emplear para cultivar clulas? 3.1. Sistemas estticos o cerradosEn un cultivo esttico o cerrado, el crecimiento de las clulas se da en un volumen fijo de cultivo (con agitacin: el hecho de que sea esttico no es que est quieto; la agitacin no falta nunca en un cultivo celular: primero porque si no se agita, las clulas se agregan; y en segundo lugar porque la agitacin evita las condiciones de anoxia, es decir, favorece el contacto del medio de cultivo con el oxgeno). Principales caractersticas de este sistema: Como es cerrado no entra ni sale ningn componente del sistema. El crecimiento es limitado: no se puede tener un sistema cerrado indefinidamente. Las clulas agotarn los nutrientes y las toxinas se acumularn El cultivo no es equilibrado.3.1.1. Dinmica del crecimiento en cultivos estticosSe observa el peso fresco y el volumen que ocupa. Una primera fase inicial (o fase de latencia) en la cual todava no ha comenzado a aumentar el nmero de divisiones mitticas (se mantiene constante). En esta fase las clulas se adaptan para la siguiente fase: comienzan a sintetizar protenas (sntesis proteica elevada), enzimas (implicadas en sntesis de pared celular). Posteriormente se inicia una segunda fase de crecimiento exponencial en la cual se inician las divisiones mitticas. En esta fase el metabolismo celular que predomina es el metabolismo primario (destinado a sntesis de protenas, hidratos de carbono, lpidos). En esta fase las clulas estn desdiferenciadas hasta que llega un momento en el que comienza la tercera fase o fase estacionaria.Durante la fase estacionaria las divisiones celulares cesa. Es una fase en la cual el metabolismo primario deja paso al secundario (es lo habitual) y las clulas comienzan a diferenciarse.Esquema de las 3 fases (representadas en rojo):

Cmo se puede controlar el crecimiento de un cultivo esttico? Mediante una serie de mtodos: contar el nmero de clulas (por microscopio), se puede calcular el peso fresco o seco celular (en microgramos/mililitro), el volumen despus de la centrifugacin, se puede estudiar la actividad celular (viabilidad celular: respiracin, fotosntesis), conductividad elctrica y densidad ptica (meterlo en un espectrofotmetro: a mayor clulas, mayor absorbancia)3.2. Sistemas dinmicos o abiertosEn los sistemas dinmicos o abiertos se produce una renovacin del medio de cultivo y de clulas sin interrumpir el cultivo. La dinmica del cultivo esttico durante la tercera fase era en cada (con respecto a la segunda fase - realmente no cae sino que disminuye la tasa de crecimiento). En este sistema dinmico abierto podemos mantener cualquiera de las 3 fases en el tiempo (la que ms nos interese).

Los cultivos dinmicos o abiertos pueden ser de dos tipos: semicontinuos o continuos.En los semicontinuos la renovacin se realiza en intervalos regulares de tiempo. Tenemos un erlenmeyer con nuestro cultivo, cuando estimamos que estamos en la fase que nos interesa, cada 10 das (X tiempo), cogemos una alcuota de esa suspensin celular y la llevamos a un nuevo medio de cultivo lquido, de esta manera no se agotan los nutrientes, la densidad celular no aumenta continuamente, no se acumulan los compuestos txicos, etc. Esto se hace cada semana.

En los cultivos continuos hay un sistema automatizado: un bombeo continuo de medio de cultivo. Si aadimos un nuevo medio de cultivo tenemos que desplazar un volumen igual (de cultivo viejo) al que introducimos (puesto que sino se acumula). Se puede ajustar la velocidad de crecimiento celular con mucha ms precisin que en un semicontinuo. Es necesario tener una monitorizacin de la cantidad de clulas (es lo que determina la velocidad con la que metemos medio nuevo y con la que extraemos clulas viejas).

Para determinar la frecuencia con la que renovamos el cultivo acudimos al clculo de dos parmetros: En el caso de que determinemos un parmetro qumico (pH, conductividad elctrica), los cultivos continuos reciben el nombre de quimiostatos. Son parmetros proporcionales a la cantidad de clulas del medio. Si monitorizamos la turbidez del medio de cultivo, en ese caso hablamos de turbidostatos: son sistemas de cultivo continuos en los que controlamos la densidad celular para saber con qu frecuencia renovamos el cultivo.4. Cultivos a gran escala: BiorreactoresPara aplicaciones industriales, los sistemas de cultivo que se han estudiado anteriormente no son vlidos. Cmo se aumenta la escala de cultivo? Cultivando en biorreactores. Al aumentar la escala, comienzan a aparecer problemas que antes no aparecan cuando la escala es pequea: el aporte de nutrientes es ms o menos homogneo (la homogeneidad es difcil de conseguir si la cantidad es muy grande), se necesita un aporte ptimo de oxgeno y de CO2, aparecen problemas de sedimentacin y de contaminacin.

La viscosidad del cultivo depende de la composicin del medio, de la densidad celular y de la excrecin de polisacridos (proporcionalmente). Las espumas aparecen cuando se agitan polisacridos y protenas. Aparecen generalmente en la superficie, van decantando, provocan agregados celulares y las clulas sedimentan. La formacin de espumas supone un problema. Existen mtodos para evitar esto: variar la composicin del medio de cultivo (la cantidad de carbohidratos usados, la concentracin de calcio, etc), o bien aadir agentes antiespumantes.4.1. Factores a considerar cuando una suspensin celular se cultiva en grandes volmenesEn lo que respecta a las condiciones de la suspensin celular, considerar: el grado de dao fsico inducido a las clulas, el grado de transferencia de oxgeno desde la bombona hasta el medio lquido (para que este bien oxigenado), el intercambio de sustancias, el grado de difusin de los componentes disueltos (de oxgeno, de nutrientes y productos de desecho).

En lo que respecta a las condiciones de cultivo: la densidad celular debe ser tan alta como sea posible (pero dentro de unos mrgenes), tener en cuenta los procesos de crecimiento y produccin, composicin del medio de cultivo, consumicin de los nutrientes, materiales del reactor (inerte/ estable), la estabilidad de los productos.4.2. Componentes de un biorreactorEl biorreactor tiene una entrada de medio de cultivo (que lo renueva) y una salida (por donde sale el medio viejo). Como hay que controlar la temperatura, se circula agua fra o caliente por tubos en funcin de la que se quiera mantener). Tambin se controla la presin de oxgeno, de CO2 y el pH (puede ir variando en funcin de cmo crezcan las clulas o como est el metabolismo secundario - esta regulacin se hace a tiempo real). Dado que tenemos el problema de las espumas, siempre habr que controlar la formacin de espumas aadiendo agentes antiespumantes con el fin de evitar la sedimentacin celular y la formacin de agregados celulares. Para que esto no ocurra es necesario agitar (mediante un sistema de paletas o de difusin de aire). Finalmente, antes hablbamos de turbidostatos y quimiostatos. Cmo sabemos cada cunto se renueva el medio? Se controla mediante, por ejemplo, la determinacin de la densidad ptica (determinamos la concentracin de clulas).4.3. Medio de cultivo Qu composicin debe tener un medio de cultivo? La composicin depende de una serie de factores: del genotipo (de la especie, unas requieren ms o menos concentracin de sales), de la densidad celular (alta/baja), caractersticas del reactor, dinmica del crecimiento (abierto o cerrado), manipulacin del metabolismo (si queremos tener un cultivo celular para obtener metabolitos secundarios deberemos optimizar la composicin del medio para que sea la ms adecuada para estimular la sntesis de esos metabolitos secundarios).

Sobre la densidad celular: hay veces en las que cuando la densidad es baja, es complicado hacer que funcione el cultivo y que las clulas se dividan. Para paliar esto y que comience a funcionar y se dividan las clulas se emplean lo que se llaman medios acondicionados: estos medios son medios de cultivos que adems de los componentes habituales de un medio (sales, hormonas, vitaminas), presentan compuestos que ayudan a que la suspensin celular comience a proliferar (algunos compuestos como el cido nicotnico suelen emplearse como medios acondicionados).Incluso empleando medios acondicionados no se logra que el cultivo sea totalmente funcional. En estos casos, introducimos en el medio un fragmento de un callo (colgado de un hilo se sumerge en el medio), tambin se puede suspender una suspensin de alta densidad celular. Ese fragmento de tejido sumergido en la suspensin celular exuda una serie de compuestos muchas veces de naturaleza desconocida, pero que favorecen y estimulan la divisin y el crecimiento celular. 5. AplicacionesUna vez que tenemos nuestro cultivo, se realiza una seleccin de lneas celulares (seleccionamos la que nos interese) y la seleccin debe realizarse en base a distintos criterios (en funcin del objetivo que tengamos):Un objetivo puede ser obtener plantas con significacin agronmica: obtener plantas con tolerancia al estrs o para mejorar sus caractersticas nutricionales.Otro objetivo (ms interesante) es disear lneas celulares aptas o adecuadas para aplicaciones industriales.

Con la suspensin celular seleccionamos la lnea celular adecuada para obtener un producto de inters o para que realice biotransformaciones (se ve en el tema siguiente).

A partir de un explanto, va callo, obtenemos la suspensin celular. Las suspensiones celulares tienen el inconveniente de que en ellas la probabilidad de que ocurran variaciones somaclonales es alta (la alta tasas de divisin produce elevadas alteraciones genticas y obtendremos lneas celulares de todo tipo). Por tanto, despus de la suspensin necesitamos hacer una seleccin o un cribado y posteriormente, o bien obtenemos plantas de significacin agronmica o bien obtenemos plantas con aplicaciones industriales.

La seleccin no es lo mismo que el cribado. La seleccin es un proceso activo, es decir, se ejerce una presin que favorece el crecimiento de una determinada lnea celular. El cribado es un proceso pasivo: analiza las clulas visualmente o mediante otro tipo de tcnicas: analizamos por HPLC todas las lneas y nos quedamos con la que produzca un determinado compuesto en mayor cantidad.

TEMA 2B: POTENCIAL BIOQUMICO DE LAS PLANTASEn este tema vamos a ver para qu nos sirve el cultivo celular obtenido. Estudiaremos qu factores regulan la produccin invitro de metabolitos secundarios (factores biolgicos o ambientales), estos factores como veremos, controlan la produccin de metabolitos secundarios.Veremos cmo podemos optimizar la produccion invitro de metabolitos secundarios (se ven diferentes tipos). Se hablar de la biotransformacin (no confundir con transformacin gentica que es la optimizacin de la produccin invitro; en la biotransformacin no hay modificacin gentica). Por ltimo se vern los avances sufridos y las perspectivas de cara al para el futuro.1. Introduccin/HistoriaLas plantas se han empleado para curar enfermedades desde la antigedad (2500 a.C, el chino Pen tsao). En 1500 apareci el papiro de Ebers con 500 remedios basados en plantas medicinales. A principios de siglo XX la industria farmacutica se encontraba dominada por la sntesis qumica de compuestos. En la dcada de los 70 irrumpe la biologa molecular en la industria farmacutica mediante la ingeniera gentica. Gracias a sta se obtienen compuestos que eran muy complicados de extraer o de sintetizar. En este momento se desarrollan sistemas de cultivo de levaduras y hongos para la sntesis de estos compuestos. Ms recientemente se emplean cultivos vegetales para la obtencin de estos productos. Estos productos vegetales presentan ventajas frente a los animales: no presentan contaminacin por priones, ventajas en determinados sistemas microbianos... En los ltimos aos se utiliza el concepto de plantas como biorreactores para la sntesis de un amplio abanico de compuestos como vacunas, productos teraputicos, nutrientes, etc.

Qu tipo de molculas podemos obtener? Por un lado tenemos compuestos sintetizados de forma natural por las plantas (metabolitos secundarios). Adems de estos metabolitos secundarios, mediante transformacin gentica (produciendo genes exgenos a las especies vegetales), podemos hacer que la planta sintetice protenas recombinantes para vacunas, anticuerpos, frmacos, etc), as como otro tipo de compuestos como carbohidratos, lpidos de inters biosanitario e industrial (todo esto se ve en el tema 3). Nos centramos en la obtencin de metabolitos secundarios. El metabolismo secundario es aquel que no es primario. El metabolismo primario es aquel que va dirigido a la sntesis de aminocidos, protenas, nucletidos, cidos nucleicos, azcares simples, cidos grasos, etc.En los metabolismo secundario se sintetizan: alcaloides, terpenos, polifenoles, etc, estos compuestos tienen la particularidad de que son especficos de cada especie, es decir, no todas las especies vegetales sintetizan los mismos metabolitos secundarios. Adems tienen una clara funcin ecolgica, esto quiere decir que la planta lo sintetiza en respuesta a un estrs (como mecanismo de adaptacin a un estrs), como respuesta a la presencia de un patgeno (un hongo), etc.

Se han identificado unos 25000, de los cuales un 30% se han descrito con aplicaciones teraputicas (codena, morfina, diosgenina). La sntesis de metabolitos secundarios est estrechamente ligada a la diferenciacin celular. Esto supone un inconveniente para los cultivos celulares puesto que estos compuestos estn regulados espacialmente (en diferentes sitios) y temporalmente (en periodos determinados): un cultivo celular no es adecuado para la produccin de estos compuestos ya que no hay diferenciacin celular (y por tanto no habr produccin de metabolitos secundarios (existe una correlacin entre diferenciacin y presencia de metabolitos secundarios)

Ventajas in vitro de estos metabolitos secundarios: Obtener in vitro un compuesto es independiente de adversidades climticas y econmicas. Se incrementa el rendimiento (mayor produccin). Nos permite buscar nuevos compuestos (cuando cultivamos una planta invitro nos podemos encontrar con que no sintetiza el compuesto que esperbamos y en su lugar sintetiza otro que es ms interesante). Nos permiten biotransformar. Gracias a la ingeniera gentica podemos transformar genticamente estas clulas para aumentar el rendimiento (transformacin gentica). Nos permite conservar especies en vas de extincin. Finalmente se emplean en investigacin para estudiar las rutas biosintticas y su regulacin.2. Regulacin de la produccin invitro de metabolitos secundariosQu factores afectan a la produccin de metabolitos secundarios?2.1. Factores biolgicos2.1.1. CrecimientoLa dinmica de crecimiento celular afecta a la produccin de metabolitos secundarios. Existen diferentes patrones de sntesis para un metabolito secundario: Hay metabolitos secundarios que siguen un factor de sntesis paralelo a la dinmica de crecimiento que sigue un cultivo esttico (lnea roja), es decir, es parecido al crecimiento celular (por ejemplo la nicotina). Hay otro comportamiento en el cual la mayor produccin de metabolitos secundarios se da en la fase estacionaria (en la ltima fase, como es el caso de los polifenoles). Existen otros bifsicos (se producen en diferentes fases de desarrollo, en azul). Es importante que uno conozca bien cul es la pauta de produccin o de sntesis de un metabolito porque de esta manera podemos fijar la fase de desarrollo en la que sea altamente productiva.

2.1.2. DiferenciacinLa diferenciacin celular est estrechamente ligada a la sntesis de metabolitos secundarios. No obstante, podemos iniciar una suspensin celular de una especie vegetal y observar que el metabolito secundario que buscbamos no aparece (invitro no sintetiza el metabolito que buscbamos).

Por qu ocurre esto? En primer lugar, hablbamos de que muchas veces este tipo de compuestos se sintetizan en rganos especializados (los azcares se sintetizan en las glndulas; los alcaloides aromticos en la raz...) y en un cultivo celular no hay rgano ni tejido ni nada.

Las clulas, cuando se encuentran formando parte de un tejido, se encuentran en un ambiente muy particular y diferente al ambiente que rodea a una clula en un cultivo celular. Ese cambio de ambiente pueden provocar que el cultivo celular no sintetice el metabolito que estemos buscando.

La sntesis de metabolitos secundarios est ligada a la diferenciacin celular, en un cultivo celular no disponemos de tejido diferenciado y esto afecta a nuestra sntesis.

Uno de los retos actuales es poder desacoplar los mecanismos tan complejos que regulan o que conexionan la diferenciacin celular con la produccin de metabolitos secundarios. Una vez desacoplado, podremos cultivar clulas y obtener los metabolitos que buscamos.2.1.3. CompartimentacinLa ruta de sntesis de muchos metabolitos secundarios est compartimentada celularmente e incluso tisularmente, es decir, que parte de la ruta (o toda) puede darse en varios tejidos. Ejemplo: los alcaloides indlicos tienen su importancia por su accin tumoral. Su ruta de biosntesis es compleja y se da en el citosol, en la vacuola, en los cloroplastos y en otros orgnulos. 2.1.4. Variacin en la actividad biosintticaEl cultivo celular es altamente inestable desde el punto de vista gentico. Podemos tener un cultivo que comience muy bien pero que luego decaiga por tener afectaciones genticas.2.2. Factores ambientales1. Condiciones fsicasa. Luz, temperatura, pH, aireacin y agitacin (especialmente importante en los biorreactores).b. Densidad de cultivo: en funcin de la densidad de clulas en el cultivo el CO2 estar ms o menos limitado, la densidad afecta al exudado de compuestos al medio y a la disponibilidad de nutrientes (a mayor nmero de clulas, menor disponibilidad)2. Formulacin del medio de cultivoa. Reguladores del crecimiento: influye el tipo y la concentracin de auxinas y de citoquinas. La sntesis de nicotina est inhibida por la presencia de auxina, pero est estimulada por la presencia de citoquinas.b. Nutrientes presentes en el medio, nitrgeno, carbohidratos, fsforo.3. Optimizacin de la produccin invitro de metabolitos secundariosCmo podemos aumentar el rendimiento de un sistema celular? 3.1. Seleccin clonalSeleccionar dentro del cultivo celular aquellas lneas celulares que sean ms productivas. Elegiremos una especie altamente productora del metabolito de inters. Procedimiento a seguir: a partir del explanto altamente productivo iniciamos la formacin de un callo, a partir del callo generamos una suspensin celular que tendr muchas lneas celulares y mediante un cribado analtico vemos cules son las productivas y cules no. Es caro y va ligado a la variacin gentica: podemos tener lneas altamente productivas que pueden dejar de funcionar con el tiempo. La seleccin clonal puede llegar a aumentar la produccin del metabolito 7 veces.3.2. PrecursoresUn precursor es un compuesto que est ms arriba en la va metablica. Empleando estos precursores se puede multiplicar el rendimiento por 4 e incluso por 100. Tenemos que emplear un precursor que no sea muy caro (de nada vale aumentar mucho el rendimiento si no se puede costear). El precursor debe ser cercano al metabolito secundario a obtener (no puede estar muy arriba de la va metablica).3.3. ElicitoresLos metabolitos secundarios suelen tener una funcin ecolgica (se sintetizan frente a un estrs, frente al ataque de un patgeno, etc). Los elicitores son compuestos o factores que interactan con receptores de la planta, activando en ella respuestas de defensa (generalmente metabolitos, que sern de inters) y la reaccin de hipersensibilidad. Pueden ser:1. Agentes abiticos: metales pesados, radiacin UV, presin osmtica (aadir alta concentracin de sales), ultrasonido, metil violgeno (es una molcula qumica que se emplea en investigacin porque provoca estrs oxidativo). 2. Agentes biticos: extractos de paredes de hongos o bacteria. Los metabolitos secundarios se sintetizaban frente al ataque de una bacteria (la bacteria o un extracto de la misma sera el elicitor); si aadimos al medio un extracto de un componente de la bacteria, la planta reconoce esa parte y sintetiza el metabolito de inters, que ser un antibitico natural frente a esa bacteria. La ventaja que tiene es que el extracto del componente del hongo o bacteria no es daino para la planta. Ancdota: el revidox es un complemento alimenticio que est compuesto a base de resveratrol (es un compuesto fenlico, es decir, es un metabolito secundario y lo sintetizan pocas especies vegetales como el cacahuete: Arachis hypogaea). La planta sintetiza el resveratrol frente al ataque de hongos. Un elicitor potente del resveratrol es la radiacin UV: la radiacin UV aumenta la produccin de resveratrol.3.4. Cultivo de clulas inmovilizadasEste tipo de cultivo no es una suspensin celular. Los hay de dos tipos: Cultivo en lecho plano: un recipiente con una membrana permeable sobre la que se disponen las clulas; el medio de cultivo cae por la parte superior y es recogido en la parte inferior de la membrana (membrana basal). En el cultivo en columna las clulas se encuentran retenidas en un gel (funcionamiento similar al anterior. En el cultivo en columna se pueden usar dos tipos de materiales: Polimerizacin activa de geles: se emplean geles como el agar, alginatos, poliacrilamida y agarosa. Se aade agar en polvo a la suspensin celular y una vez que se disuelve se deja enfriar y solidifica con las clulas embebidas dentro de l. Polimerizacin pasiva: se utiliza una espuma de poliuretano o una membrana de fibra hueca, es decir, un soporte con poros en los que las clulas van a quedar retenidas.

Ventajas de la inmovilizacin de clulas Facilidad de manipulacin (el intercambio de medio de cultivo se produce apenas sin prdidas: no se pierden clulas al ser un sistema cerrado). Adems permite hacer tratamientos secuenciales de forma ms sencilla (cuando interesa que las clulas crezcan ponemos medio de cultivo; cuando interesa que crezca un metabolito concreto se cambia el cultivo, etc. Todo segn lo que se necesite) Contacto entre clulas: en estos cultivos de clulas inmovilizadas las clulas estn en contacto unas con otras y puede haber una comunicacin (imita mucho ms a un tejido que un cultivo de clulas en suspensin), Tienen una mejor respuesta a los estmulos del medio Se ampla el perodo de productividad Se facilita la liberacin y extraccin de compuestos (metabolitos secundarios) al medio Permite realizar co-inmovilizaciones con otras lneas celulares: diferentes lneas celulares en un mismo cultivo (por ejemplo, una lnea fotosintticamente activa que aporte oxgeno para que pueda ser empleado por otra lnea celular presente en el medio). Todo ello conlleva a la mayor produccin de metabolitos secundarios4. Transformacin genticaQu estrategias se pueden seguir para aumentar el rendimiento mediante transformacin? Podemos completar rutas metablicas mediante insercin de genes heterlogos: insertamos el gen que codifica enzimas necesarias para el metabolito. Amplificar rutas normales (con esto se aumenta el nivel de expresin de las enzimas de la ruta) Bloquear rutas alternativas para maximizar el rendimiento (se evita ramificacin de la ruta principal de inters). Bloquear rutas de degradacin o catablicas. Neutralizar mecanismos de retroalimentacin negativa por acumulacin de producto. Modificar los mecanismos de secrecin y exportacin: favorecer que el metabolito salga de la clula.5. BiotransformacinNo tiene nada que ver con la transformacin gentica. La clula vegetal posee una maquinaria bioqumica muy compleja de tal manera que puede producir una gran cantidad de compuestos qumicos. Algunas de las rutas son imposibles de realizar en el laboratorio (de forma sinttica) como la glucosilacin. Con la biotransformacin se pretende aprovechar este potencial bioqumico de la planta que no se puede mimetizar en el laboratorio.La biotransformacin consiste en la transformacin por parte de la planta (de las clulas vegetales) de un compuesto orgnico en otro compuesto orgnico ms complejo y con un mayor valor aadido. Lo interesante de la biotransformacin es que cuando biotransformamos un compuesto orgnico, ste no tiene porqu estar presente en la planta (podemos glucosilar un compuesto qumico sinttico, es decir, que no sea conocido por la planta). La Papaver somniferum puede transformar codeinona en codena mediante una hidroxilacin. Si este sistema se realiza en un sistema de clulas inmovilizadas, se aumenta el rendimiento en un 73%. La Mallotus japonicus permite transformar el cido saliclico en la salicina mediante glucosilacin. La salicina tiene una accin mucho ms potente.5.1. Obtencin de rendimientos industrialesCuando estamos pensando en aumentar la escala (rendimiento industrial), debemos mirar que la tasa de crecimiento celular sea alta (no interesa tener un biorreactor para un compuesto que no se sintetiza con buen rendimiento)Es necesario tratar de mantener la mayor estabilidad gentica posible (es imposible en al actualidad). Podemos ayudarnos de la criopreservacin: cuando tenemos la lnea la podemos guardar una solucin stock del cultivo a -180C (criopreservacin). Esto ayuda a mantener la estabilidad gentica con el tiempo pero no una vez que est en el biorreactor.Otro aspecto a tener en cuenta es la liberacin de compuestos al medio de cultivo: debe ser muy elevada: para evitar el catabolismo de la clula (si el metabolito se queda dentro de la clula puede sufrir su degradacin), para evitar la retroalimentacin de la ruta biosinttica (feedback) y para favorecer la purificacin.El coste del biorreactor debe ser minimizado al mximo: podemos ahorrar en el medio de cultivo (componentes y precursores baratos), ahorrar energticamente: acortando la fase productiva de crecimiento (tener siempre el cultivo en la fase productiva). 6. Avances y perspectivas El cultivo de clulas vegetales permite la obtencin de compuestos de inters biosanitario con un rendimiento igual o superior al cultivo invitro. Se han descubierto nuevas sustancias (no se produce el metabolito que esperbamos pero se produce otro nuevo que puede ser mejor). Se ha conseguido obtener compuestos en ausencia de organizacin celular. La biotransformacin es una de las reas ms prometedoras de la biotecnologa vegetal.

A da de hoy podemos encontrar plantas como biofactoras para la sntesis de compuestos de inters.

TEMA 3A: CULTIVO DE PROTOPLASTOS E HIBRIDACIN SOMTICA1. IntroduccinEl protoplasto es una clula vegetal que carece de pared celular. Es esfrica y un poco ms grande que la clula vegetal normal. Qu aplicaciones tienen los protoplastos?:1. Fundamentalmente se utilizan para la hibridacin somtica. El cruzamiento entre dos individuos est restringido a individuos dentro de una misma especie (no podemos cruzar una amapola con un girasol porque existen barreras de compatibilidad gentica). Sin embargo, acudiendo a tcnicas como la hibridacin somtica podemos cruzar o combinar el material gentico de dos clulas que pertenezcan a especies diferentes.2. Estudios de biosntesis y deposicin de la pared celular: en los cultivos de protoplastos, ellos solos comienzan a fabricar su propia pared celular de forma espontnea.3. Endocitosis: los protoplastos, mediante estos procesos, pueden incorporar material gentico del exterior y convertirse en un protoplasto transgnico.4. Ingeniera gentica: podemos emplear protoplastos como material de partida para insertan genes en una determinada especie.2. Aislamiento y purificacin2.1. Material inicialEl material inicial puede ser diverso: tejido, callo o un cultivo celular. El mejor tejido para obtener protoplastos es la hoja, en concreto el mesfilo lagunar (esponjoso), tiene una alta densidad celular (a mayor densidad celular, mayor nmero de protoplastos tendremos), sus clulas son muy homogneas (similares) y adems tiene una estructura bastante laxa (muchos espacios intercelulares, facilita la obtencin de protoplastos).Tambin podemos obtener protoplastos a partir de un callo. Cmo debe ser el callo para obtener protoplastos? Recordar que haba dos tipos de callos, los friables y los compactos. Se ha demostrado que los callos friables son los ms adecuados, y es importante que sean jvenes.En cuanto a la produccin de protoplastos a partir de cultivos celulares. Deben ser jvenes y es importante que estn en la fase de crecimiento exponencial.2.2. Mtodos de aislamientoQu mtodos podemos emplear para obtener protoplastos? Pueden ser de dos tipos: mecnico o enzimtico. En el mtodo mecnico primero se esteriliza, se lava y se incuba la hoja (o el tejido que sea) en un medio plasmolizante para provocar una plasmlisis incipiente. En un estado de hidratacin normal de una clula vegetal, la membrana plasmtica est adherida a la pared celular. Con este medio plasmolizante, con alta concentracin de solutos como el PEG (polietilenglicol) o sacarosa, se pretende despegar la membrana de la clula. Al introducirse el medio plasmolizante, el agua tiende a salir por diferencial osmtico perdiendo su turgencia y, progresivamente, la membrana plasmtica comienza a separarse de la pared celular. El siguiente paso requiere de bistur, se realizan cortes en el tejido para romper las paredes celulares (de ah que el mtodo se denomine mecnico) y liberar los protoplastos (es verdad que se pueden romper algunas clulas). Es un mtodo muy artesanal, con una eficiencia muy baja (10%).

El segundo mtodo es el enzimtico: es muy rpido y exitoso, aunque tiene el problema de que los compuestos (enzimas) que digieren la pared celular pueden ser citotxicos (evitar usar este mtodo con especies muy sensibles). Se parte de un tejido (hoja limpia) a la cual se le elimina la epidermis. Luego se sumerge la hoja en un medio plasmolizante y se les aaden las enzimas para digerir la pared celular. La adicin de las enzimas puede hacerse de dos maneras: en un solo paso (se aaden pectinasas, celulasas y hemicelulasas) o en dos pasos, aadiendo primero las pectinasas y posteriormente las celulasas y las hemicelulasas. La adicin de enzimas en dos pasos consiste en digerir la lmina media (compuesta por pectinas, se sita entre las clulas: es una capa intermedia que separa las paredes celulares de dos o ms clulas vegetales) y posteriormente aadir el resto de enzimas que degradarn la pared celular directamente. Se deben aadir al medio elementos estabilizantes (azcares, sales minerales, polietilenglicol) porque, al eliminar la pared celular y con ella el potencial de pared, el protoplasto podra estallar por el potencial de turgencia (es una fuerza que ejerce la clula hacia el exterior y para contrarrestar esta fuerza, la pared vegetal ejerce una fuerza de igual intensidad pero sentido contrario, denominada potencial pared. Si no hay pared vegetal, el protoplasto explota porque el potencial de turgencia no est siendo contrarrestado).La mayora de enzimas son de origen bacteriano (T. viride). Los estabilizadores son solutos.Qu condiciones de incubacin deben respetarse en el mtodo enzimtico? Para que la incubacin de la solucin enzimtica se pueda dar correctamente, se deber utilizar un medio de cultivo nutritivo lquido (no podemos utilizar agua como medio) con un estabilizador osmtico, a una temperatura de 26-30 grados, pH ligeramente cido, en agitacin para que no se formen agregados (velocidad de agitacin baja porque son sensibles), y con iluminacin baja.2.3. PurificacinTras la digestin se debe pasar por filtros e incubaciones para eliminar restos de tejido y de pared.2.4. Comprobacin de la viabilidadSe debe comprobar si tenemos protoplastos viables o si se han destruido en el proceso. Para ello existen diferentes formas: 1. Mediante tinciones vitales: para diferenciar entre clulas vivas y muertas. El FDA (Diacetato fluorescena) tie protoplastos vivos (protoplastos viables); fenilsafranina y azul evans tien clulas muertas (protoplastos no viables)2. Test de actividad metablica: medicin de niveles de oxgeno consumidos (electrodos) o de CO2 producido para ver la actividad celular.3. Observacin de ciclosis: la ciclosis son las corrientes citoplasmticas. La visualizacin de estas corrientes a microscopio indican protoplastos viables.3. Cultivo y desarrollo3.1. Medio de cultivo y condiciones fsicasSe cultivan en medios con las sustancias nutritivas tpicas (sales minerales, nutrientes, vitaminas, carbohidratos, hormonas) y sobre todo el estabilizador osmtico (se emplea manitol entre otros): que no puede desaparecer hasta que no se regenere la pared celular.El cultivo se realiza en unas determinadas condiciones fsicas como la baja intensidad luminosa. Siempre hay que procurar mantener la menor densidad posible de protoplastos.3.2. Cultivo de protoplastosUna vez dentro del cultivo, comienzan a regenerar su pared celular porque sin ella no pueden dividirse (es vital para la mitosis), y posteriormente comienza su divisin. Conforme se van multiplicando se forman colonias (microcallos), y luego se puede regenerar la planta mediante la estimulacin de la formacin de embriones (embriognesis) y rganos (organognesis). Existen muchas especies, muy variadas, a partir de las cuales se pueden obtener protoplastos.4. Mtodos de hibridacin somtica4.1. Fusin qumicaConsiste en desestabilizar la membrana plasmtica de los protoplastos, alterando sus cargas negativas (que impide que se unan) de manera que se permita un acercamiento mucho ms ntimo entre las membranas de los dos protoplastos. Aadiendo un fusgeno (producto) qumico se pueden eliminar esas cargas negativas de repulsin. Una vez eliminadas las cargas, se forman unos puentes interprotoplastos (poros citoplasmticos) a travs de los cuales se puede intercambiar el contenido celular. Algunos ejemplos de fusgenos: PEG, nitrato sdico, etc. Problema: hay especies sensibles a los fusgenos que no aguantan este procedimiento, y el rendimiento es muy bajo (1-10%).4.2. ElectrofusinConsiste en la fusin de los protoplastos mediante descargas elctricas.Se colocan los protoplastos en una cmara de fusin, con dos electrodos que van unidos a dos generadores de corriente: uno de corriente alterna y otro de corriente contnua. En primer lugar se produce una descarga de corriente alterna de baja intensidad, con esto se consigue que los protoplastos comiencen a migrar dentro de la cmara de fusin (como en una electroforesis) y se alinean uno detrs de otro formando una estructura de collar de perlas. Luego se aplica un pulso de corriente continua de alta intensidad, y eso va a provocar que en las membranas plasmticas se formen unos pequeos poros a travs de los cuales se va a dar la fusin de los protoplastos. Esos poros son reversibles y se forman puntualmente (despus de la fusin se regeneran). Es mucho ms efectivo que la fusin qumica (40-50%), no hay problemas de citotoxicidad pero es necesario tener la cmara de fusin.

4.3. Factores que determinan la fusin Material parental: hay genomas de ms fcil aislamiento que otros. Tamao del protoplasto: a mayor tamao, mejor fusin. Medio de electrofusin Potencial osmtico del medio: debe ser muy bajo, va a favorecer la fusin. Enzimas empleadas en la digestin de la pared celular (pueden a veces provocar daos en la membrana plasmtica).4.4. Productos de fusinCuando se produce la fusin, tenemos un compuesto que contiene los dos ncleos parentales y los orgnulos. Si el material gentico fusionado es diferente se habla de heterocarionte. Si los protoplastos que se han fusionados son de genotipos idnticos, se habla de homocarionte.3 posibles productos:El siguiente paso es la hibridacin: el material gentico de los dos ncleos se mezcla (se hibrida). Los productos obtenidos tras la hibridacin son muy variables: hbrido completo (contiene todo el material gentico). Si uno de los dos ncleos pierde cromosomas, la hibridacin no es total: se habla de hibridacin parcial (ideal cuando hibridamos protoplastos de un tejido joven con otro viejo). Puede suceder que aparezcan protoplastos con material gentico de uno de los parentales y los orgnulos del otro parental (o de los dos): cbrido (son particularmente interesantes cuando nos interesa transferir una caracterstica, que est modificada por el genoma mitocondrial o cloroplasto, de un protoplasto a otro). Existen tcnicas exclusivas para obtener cbridos. Un citoplasto es un protoplasto que slo contiene el orgnulo de inters. Un protoplasto puede incorporar un orgnulo por endocitosis.5. Seleccin tras la fusin1. Manualmente: separar con micropipeta uno a uno (si hay diferencias visuales).2. Seleccin por complementacin gnica de resistencias o de deficiencias: se realiza un cultivo entre dos especies que presenten: uno resistencia frente a al germicida1 y otro resistencia al germicida2. En un medio que presente los 2 germicidas, solo sobrevivirn los recombinantes totales.

Resumen del tema: partimos de una planta, se esteriliza, se elimina la epidermis, se coloca en un medio para plasmolizar las clulas, se aplican las enzimas para digerir la pared celular (con esto se asla el protoplasto), se colocan los protoplastos en un medio para que se produzca la fusin, se cultivan para que regeneren su pared, se dividen y forman agregados, posteriormente se forma callo y luego se diferencia para regenerar la planta.6. Limitaciones de la hibridacin somtica Regenerar una planta a partir de protoplastos es muy complicado. Es habitual que las plantas obtenidas presenten malformaciones. Cuando regeneramos una planta a partir de protoplasto es habitual que sea estril (no se reproduce y por tanto no se podr micropropagar) Ausencia de una seleccin eficiente Quimeras: aquellos individuos que tienen material gentico distinto (en la misma clula o en el mismo tejido). La fusin de protoplastos produce quimeras: si una vez que se forma el heterocarionte no se produce la correcta fusin de los ncleos, cada uno de los dos ncleos empiezan a dividirse independientemente: tendremos un callo que va a contener mezcladas clulas de un parental y de otro parental. El carcter de inters que se transfiere de un protoplasto a otro, a veces, no se expresa. Presentan baja estabilidad gentica (variaciones genticas)

TEMA 3B: PLANTAS GENTICAMENTE MODIFICADAS PARA LA OBTENCIN DE COMPUESTOS DE INTERS FARMACUTICO, BIOSANITARIO O INDUSTRIAL O CULTIVOS CON VENTAJAS AGRONMICAS Y NUTRICIONALES1. IntroduccinLa seleccin gentica de plantas existe desde tiempos ancestrales (antiguos agricultores despus de una plaga o un invierno duro, recogan las semillas de las plantas que haban resistido para cultivarlas de nuevo). Ms tarde llega la revolucin verde, que consiste en cultivar variedades vegetales mejoradas aplicando riego y fertilizantes.En 1950 se descubre el ADN. En el 60 los plsmidos. Ms tarde se intentan aplicar tcnicas para regenerar una planta. En 1985 llega la revolucin gentica (diapositiva 3 con los logros)2. Origen y evolucin de las plantas genticamente modificadas1. La primera generacin de plantas transgnicas se estudiaban con el fin de conseguir ciertas ventajas agronmicas: tolerancia a herbicidas, resistencia a plagas y patgenos, tolerancia a condiciones adversas como salinidad o sequa, maduracin retardada. O bien para obtener mayor rendimiento y menor coste de produccin. Principalmente se transformaban alimentos destinados al consumo humano y animal.2. En la segunda generacin de plantas transgnicas se intent obtener cultivos que presentaran aspectos cualitativos mejorados: valor nutricional adicional, mejor digestibilidad, propiedades funcionales. En este caso se trataba de modificaciones ms complejas (estas caractersticas estn gobernadas por un gran nmero de genes: polignicas). 3. Tercera generacin de plantas transgnicas: plantas modificadas genticamente para producir compuestos de alto valor aadido. En este punto se piensa en la planta como una biofactora para la produccin industrial de compuestos. Aplicaciones en la ingeniera metablica (alterar rutas metablicas presentes en la planta o insertar nuevas rutas con el fin de obtener el producto de inters) y agricultura molecular (empleo de las plantas para obtener protenas recombinantes: para vacunas, anticuerpos, frmacos, etc).3. Plantas biofactoraDentro de la tercera generacin hablamos de plantas como biofactora que tiene como objetivo la obtencin de protenas u otro tipo de productos de inters teraputico o industrial. Presenta una serie de ventajas: un alto rendimiento (se puede producir una enorme cantidad de biomasa), permite obtener protenas animales con modificaciones postransduccionales (mediante glicosilaciones), hay ausencia de contaminacin microbiolgica (ventaja frente a animales), presenta una fcil distribucin y administracin (se puede incorporar la vacuna a una patata e ingerir la patata para vacunarse), alta relacin coste/beneficio Inconvenientes: presenta diferentes patrones de glicosilacin (frente a animales), deficiencia en la expresin (a veces la expresin de la protena no es muy alta), presenta riesgo de contaminacin ambiental.

Las molculas de inters pueden ser protenas recombinantes (de inters biosanitario industrial) o ingeniera metablica (modificacin de rutas enzimticas o introduccin de nuevas rutas).En la modificacin de rutas se alteran los niveles de expresin de los genes endgenos.En la introduccin de nuevas rutas y en la produccin de vacunas, anticuerpos y frmacos es necesario la introduccin de genes heterlogos (diapositiva 13).

TEMA 3C: PROTENAS RECOMBINANTES1. Eleccin de la especie hospedadoraHay que tener en cuenta una serie de aspectos a la hora de elegir: el tipo de protena recombinante que quiero obtener (dependiente de la especie vegetal), el ciclo de vida de la especie vegetal (ciclos cortos: crecimiento rpido), si tenemos protocolos que nos permitan la transformacin (se puede o no transformar la especie?), el rendimiento del cultivo y de la protena (que tengamos mucha biomasa en poco tiempo y que la protena tambin sea en grandes cantidades), que presente un coste bajo (a escala de laboratorio y a nivel industrial), procesamiento posterior de la protena (especies de tipo oleaginoso son adecuadas para producir una protena recombinante: podemos hacer que las especies acumulen las protenas en las semillas y as se facilita la purificacin posterior), riesgos ambientales posteriores (escape de genes a travs del polen: ser mejor acumular la protena en las hojas en vez de en las semillas. El escape de genes es que se transfiere el gen a travs del polen a otras especies y esto esto hay que evitarlo por el efecto medioambiental que podra causar)2. TransformacinElementos bsicos para la obtencin de plantas transgnicas: genes caracterizados, promotores potentes, marcadores, construccin del vector y la propia tcnica de transformacin.2.1. Genes caracterizadosEn el extremo 5 existe una regin promotora que contiene los elementos que regulan la transcripcin del gen que viene despus (que es la regin codificante), contiene elementos potenciadores o silenciadores de esa transcripcin; la caja TATA que marca el inicio de la transcripcin. A continuacin viene la zona codificadora, con un punto de inicio, un codn de inicio de la traduccin y una serie de exones e intrones (los exones son secuencias que van a traducirse). En el extremo 3 estn los elementos que finalizan la traduccin.2.2. Promotores potentesLos promotores son los elementos que regulan espacial y temporalmente la expresin de un gen. Los hay de tres tipos: 1. De tipo constitutivo mediante el cual la expresin del gen se produce en todos los tejidos de la planta en cualquier momento. y de forma permanente.2. Promotores especficos de tejidos: nos permiten que el gen se exprese en un tipo de tejido concreto (un rgano determinado)3. Inducibles: son aquellos que permiten la expresin tras la aplicacin de un determinado factor que los induce. A su vez pueden ser de tipo fsico o qumico.

Los interesantes son los especficos de tejido (que la protena est en un fruto que luego ser comestible) y los inducibles. 2.3 MarcadoresNo todas las clulas del tejido incorporan la transformacin. Debemos incluir un elemento en la transformacin para que podamos distinguir los que se han transformado de los que no.Tipos: seleccionables e informadores. 1. Los seleccionables son genes confieren a la clula la capacidad de resistir a un antibitico o germicida (las clulas que resistan a un medio con el antibitico sern las que nos interesen). El principal problema que presenta es el escape de genes: puede transferir el gen marcador al ecosistema (problemas de bioseguridad) por eso muchos de ellos estn prohibidos. A veces se incorporan los genes y luego se eliminan una vez que se ha producido la transformacin para evitar estos problemas2. Los genes informadores son genes que codifican un compuesto coloreado. Ej: genes que codifican protenas fluorescentes.2.4. Construccin del vector de transferenciaUno de los vectores de transferencia ms empleados es el plsmido. Se replican de forma independiente al DNAg. Se introduce el mdulo de expresin en el plsmido obtenindose un plsmido recombinante. ste se introduce en una bacteria y se transforma la planta mediante diferentes tcnicas de transformacin.2.4.1. Transferencia indirecta de genesAgrobacterium tumefaciens: es una bacteria que est presente de forma natural en el campo y que infecta las plantas (es un parsito de las plantas). Penetra a travs de las heridas de las plantas y provoca tumores. Presenta un cromosoma bacteriano y un plsmido, que tiene el nombre de plsmido Ti (inductor de tumores). La bacteria es capaz de transferir un fragmento del plsmido Ti a la clula vegetal, ese fragmento de plsmido se inserta al azar, pero de forma estable, dentro del genoma del ncleo de la planta. La planta comienza a expresar toda la informacin que contiene ese fragmento del plsmido dando lugar a tumores.Estructura del plsmido TiQu contiene el plsmido Ti para producir tumores? Tiene una regin virulenta, que contiene unos genes llamados vir, que son los responsables de insertar un segmento de ese plsmido (en la regin de T-DNA) en el genoma vegetal, y en concreto unos genes vir clave van a reconocer los dos bordes (izquierdo y derecho) del T-DNA que son secuencias de restriccin. El T-DNA tambin tiene genes que codifican la sntesis de hormonas (auxinas y citoquininas) y opinas, que son unos aminocidos que van a servir como fuente de C y N para la bacteria.

Agrobacterium, gracias a la regin de virulencia, va a cortar el plsmido Ti por el borde derecho e izquierdo (ver en la imagen la lnea fina superior dibujada en azul) para comenzar a sintetizar de forma masiva los genes del inserto. Cuando comienzan a expresarse los genes y a sintetizarse auxinas y citoquininas, las clulas de la planta comienzan a dividirse formando un callo. Adems se sintetizan opinas, que servirn de alimento a las clulas.

Cuando la planta tiene una herida, comienza a sintetizar compuestos como la acetosiringona y la excreta al suelo. Este compuesto es una molcula seal que desencadena todo el proceso, y provoca que se vayan expresando en cascada todos los genes vir que contiene el plsmido Ti y en concreto, el primero en activarse es el gen VIR-A que va a codificar una protena que es un receptor de la acetosiringona, se inicia la expresin del gen VIR-D que codifica unas endonucleasas que reconocen los bordes izquierdo y derecho del T-DNA, se corta a ese nivel, y otras protenas VIR-D sintetizan una hebra-T (sencilla) complementaria al T-DNA. Luego se expresa el gen VIR-E2, que codifica la protena E2 y va a ir unindose a la hebra T formndose el complejo hebraT-protena E2 para proteger la hebra de la degradacin. A continuacin entran en accin los vir-B, estos genes van a controlar la transferencia del complejo desde Agrobacterium a la clula vegetal a travs de canales transmembrana (muy complejos). Ahora la hebra T se encuentra en el ncleo de la clula vegetal, y se incorpora dentro del genoma vegetal tras la sntesis de la hebra complementaria a la hebra-T. La planta comienza a expresar el DNA recin incorporado y sintetiza opinas para la manutencin de Agrobacterium, ms hormonas que provocarn la aparicin del tumor.Aplicacin biotecnolgicaPodemos utilizar Agrobacterium como un vector natural de genes. Como podemos aprovechar esta capacidad de Agrobacterium? Cogemos el plsmido Ti de Agrobacterium y se desarma, es decir, se elimina toda la regin de T-DNA manteniendo los bordes derecho e izquierdo. A continuacin, en esa regin ocupada por el T-DNA se inserta el gen que se desea expresar en la planta, con su gen marcador y sus promotores (mdulo de expresin). As se obtiene un plsmido Ti recombinante. Posteriormente se vuelve a incluir en Agrobacterium para que infecte la planta mediante el mecanismo anteriormente descrito.Vector cointegradoCmo se integra el plsmido Ti y se le incluye el gen de inters? Lo que puede hacerse es emplear vectores cointegrados, es decir: se parte del plsmido Ti (FALTA) en el cual se ha incluido el trasgen. Por recombinacin homloga se puede combinar ambos plsmidos creando un vector cointegrado, es decir, un plsmido que contiene la regin de virulencia del plsmido Ti, el borde izquierdo y derecho, el origen de replicacin; y entre los dos bordes: el promotor, el gen de inters, etc.Tiene un tamao muy grande que lo hace inestable y difcil de manejar. Por ello, es una tcnica complicada.Existe otra alternativa: a raz de que se descubriera que la regin VIR y la zona del T-DNA del plsmido Ti podan operar perfectamente sin estar en un mismo plsmido, se desarrollaron los vectores binarios. Tenemos dos plsmidos, que se insertan en Agrobacterium: el primero es un plsmido Ti desarmado (solo tiene la regin vir, que es lo que interesa), y por otro lado se tiene un plsmido ms pequeo en el que se incluye el transgn flanqueado por los bordes i