Blgo. Mg. CARLOS SCOTTO ESPINOZAgenesperu.minam.gob.pe/wp-content/uploads/2016/09/... · Hormonan...
81
Blgo. Mg. CARLOS SCOTTO ESPINOZA Facultad de Ciencias Naturales y Matemática de la Universidad Nacional Federico Villarreal TALLER: “LINEAMIENTOS METODOLÓGICOS PARA LA ELABORACIÓN DE LA LÍNEA DE BASE DE LA TRUCHA NATURALIZADA EN EL PERÚ” TRANSGÉNESIS EN ESPECIES ACUÍCOLAS
Transcript of Blgo. Mg. CARLOS SCOTTO ESPINOZAgenesperu.minam.gob.pe/wp-content/uploads/2016/09/... · Hormonan...
Blgo. Mg. CARLOS SCOTTO ESPINOZA
Facultad de Ciencias Naturales y Matemática de la Universidad Nacional Federico Villarreal
TALLER: “LINEAMIENTOS METODOLÓGICOS PARA LA ELABORACIÓN DE LA LÍNEA DE BASE DE LA TRUCHA NATURALIZADA EN EL PERÚ”
TRANSGÉNESIS EN ESPECIES ACUÍCOLAS
MÉTODOS PARA LA OBTENCIÓN DE UN
OVM HIDROBIOLÓGICO (OVMh)
Métodos para la obtención de un OVM
hidrobiológico (OVMh).
Métodos para la obtención de un OVM
hidrobiológico (OVMh). PASO 1: DECODIFICAR LA SECUENCIA DE LA
PROTEÍNA Y CONVERTIRLA EN DNA
COMPLEMETARIO (DNAc)
Proteína de interés DNAc (Transgen)
Métodos para la obtención de un OVM
hidrobiológico (OVMh).
Métodos para la obtención de un OVM
hidrobiológico (OVMh). PASO 2: INSERTAR TRANSGEN EN UN
CONSTRUCTOR
DNAc Gen Promotor Constructor
Métodos para la obtención de un OVM
hidrobiológico (OVMh).
Métodos para la obtención de un OVM
hidrobiológico (OVMh). PASO 3: INSERTAR PLÁSMIDO DENTRO DE
UNA BACTERIA PARA OBTENER MUCHAS
COPIAS DEL TRANSGEN
Métodos para la obtención de un OVM
hidrobiológico (OVMh).
Métodos para la obtención de un OVM
hidrobiológico (OVMh). PASO 4: AISLAR PLÁSMIDOS CON ENZIMAS
DE RESTRICCIÓN PARA OBTENER MUCHAS
COPIAS LINEALES DEL TRANSGEN
Métodos para la obtención de un OVM
hidrobiológico (OVMh).
Métodos para la obtención de un OVM
hidrobiológico (OVMh). PASO 5: INSERTAR LAS COPIAS LINEALES
DEL TRANSGEN EN UN OVOCITO O EMBRIÓN
DE PEZ
Métodos para la obtención de un OVM
hidrobiológico (OVMh).
Métodos para la obtención de un OVM
hidrobiológico (OVMh). PASO 6: ESPERAR EL CRECIMIENTO PARA
OBTENER PECES TRANSGÉNICOS CON LA
EXPRESIÓN DEL TRANSGEN
Métodos para la obtención de un OVM
hidrobiológico (OVMh).
Métodos para la obtención de un OVM
hidrobiológico (OVMh). PASO 7: SELECCIONAR LOS PECES
TRANSGÉNICOS Y FORMAR LOTES
Métodos para la obtención de un OVM
hidrobiológico (OVMh).
Métodos para la obtención de un OVM
hidrobiológico (OVMh). PASO 8: IDENTIFICAR MOLECULARMENTE EL TRANSGEN
ESPECIES ACUÍCOLAS TRANSGÉNICAS
PANORAMA DE DEL USO OVMs HIDROBIOLÓGICOS EN ACUICULTURA
PANORAMA DE DEL USO OVMs HIDROBIOLÓGICOS EN ACUICULTURA
PANORAMA DE DEL USO OVMs HIDROBIOLÓGICOS EN ACUICULTURA
PANORAMA DE DEL USO OVMs HIDROBIOLÓGICOS EN ACUICULTURA
PANORAMA DE DEL USO OVMs HIDROBIOLÓGICOS EN ACUICULTURA
PANORAMA DE DEL USO OVMs HIDROBIOLÓGICOS EN ACUICULTURA
PANORAMA DE DEL USO OVMs HIDROBIOLÓGICOS EN ACUICULTURA
PANORAMA DE DEL USO OVMs HIDROBIOLÓGICOS EN ACUICULTURA
PANORAMA DE DEL USO OVMs HIDROBIOLÓGICOS EN ACUICULTURA
EVENTOS EN OVMS HIDROBIOLÓGICOS
Aumento del tamaño
corporal
Resistencia a
enfermedades
Control de la
reproducción
Resistencia al
congelamiento y al frío
Resistencia a la salinidad Metabolismo más
eficiente
Bioreactores Coloración corporal
fluorescentes
Calidad (Textura, sabor
y color de la carne)
Reducción de la
agresión (Conductual)
¿Qué salmónidos transgénicos llegarian al Perú?
Con genes de la hormona
de crecimiento
Con genes de resistencia a
enfermedades
Maclean & Talwar en el año 1984 fueron los primeros en producir
peces transgénicos (Injection of cloned genes del gen
Metalotioneina de ratón en embriones de trucha arcoiris. Journ.Embryol and Exp. Morphol. 82 (Supp) 187)
Zhu, Li & Chen en el año 1984
fueron los primeros en producir
peces transgénicos (Goldfish
con hormona de crecimiento)
Hormona de crecimiento en Carpa
Hormonan de crecimiento en Tilapia transgénica
Pez Cebra Transgénico con
Hormona de crecimiento
Hormona de crecimiento en la Locha transgénica
Salmón transgénicoHormona de crecimiento en Salmón transgénico
Resistencia a enfermedades
Resistencia a enfermedades
CF-17
CecropinP1
CMV: región promotora decitomegalovirus.IgG: secuencia del péptidoseñal de inmunoglobulina decadena pesada de bagre.Cecropina P1.CF-17 Cecropina sintético.
• Producción de
Peces
Trangénicos
• Resistente a Aeromona salmonicida
(Bacteria).
• Necrosis hematopoyética infecciosa
(Virus).
Lesión de úlceras en la piel.
Microscópicamente, microcolonias de Aeromonas
presentes en varios tejidos, incluyendo hígado,
riñón y corazón.
Abdomen distendido. Hemorragias petequiales. Exoftalmía en alevines. Extensa necrosis en los órganos internos
incluyendo los riñones y el hígado
Aeromona salmonicida
Virus de la Necrosis Hematopoyética Infecciosa (IHNV)
Existe otros peces transgénicos!..
Resistencia al Estrés Salino
Con ADN de Lubina Con ADN de Artemia
Control
Los Peces transgénicos fluorescentes se empezaron a
producirse a principios del siglo 21 …!
Anémona de mar
OBTENCIÓN DE UN PEZ FLUORESCENTE (2003)
En el año 2003, la universidad nacional de singapur logró producir
pez Cebra Transgénico Fluorescente o TK-2 (Taikong)
Transgénicos
Silvestre
Los peces fluorescentes transgénicos
llegaron en el año 2006 al Perú
Laboratorio de Mejora Genética y Reproducción Animal de la
Facultad de Ciencias Naturales y Matemática de la Universidad
Nacional Federico Villarreal empezó en el año 2005 a investigar
a los GENES DE COLORES que poseían diferentes especies
ornamentales como el pez Cebra o Zebrafish (Danio rerio).
Proteina Fluorescente Verde (GFP)
Proteína Fluorescente roja (rFP)
Proteína Fluorescente Naranja (oFP)
Proteína Fluorescente rosado (PFP)
Desarrollo embrionario del TK-2
Embriones de 24 horas (Luz natural) Embriones de 24 horas (Luz U.V.)
Embriones de 48
horas
Obtención de crías de
pez Cebra rojo
Obtención de crías de
pez Cebra rosado
Obtención de crías de
pez Cebra verde
Apareamientos de pez cebra No Transgénico con pez cebra Tg
Crías
híbridas
Criadero ornamental en
el Distrito de Villa El
Salvador (Lima).
(Enero del 2011)
Mercado Central de
Lima
(Marzo del 2010)
Pez “Monjita” o Tetra (Gymnocorymbus ternetzi)transgénico con RFP (2008)
No Tg Tg Verde
Tg RojaNo Tg
Pez “Monjita” o Tetra (Gymnocorymbus ternetzi)transgénico con RFP (2012)
Tg Amarilla
Pez “Angel o escalar” ” (Pterophyllum scalare)
transgénico con RFP del coral Acropora (2013)
Pez “Angel o escalar” ” (Pterophyllum scalare)
transgénico con GFP de Medusa abisal (2010)
Tg Rosado
Tg VerdeNo Tg
Pez Nigro (Amatitlania nigrofasciatatransgénico con GFP (2011)
Tg Verde No Tg
Barbo tigre (Puntius tetrazona) transgénico con
GFP (2013)
Tg Verde No Tg
Pez Neón Chino (Tanichthys albonubes)
transgénico con RFP (2012)
Otros colores obtenidos por transgénesis en el
pez Cebra. (A) Amarillo, (B) Azul y (C) Violeta.
2010. Patente para la obtención de peces de
colores fluorescente en Goldfih (Japón)
IDENTIFICACIÓN CUALITATIVA
DETECCIÓN DE UN PEZ FLUORESCENTE CON LUZ
NATURAL
No TgTg Rojo Tg Naranja Tg Rosado
Peces Cebra analizados con luz natural: 1 = Pez de color
rojo transgénico; 2 = Pez de color naranja transgénico; 3 =
Pez de color rosado transgénico; 4 = Pez silvestre sin
fluorescencia no transgénico (Control -).
DETECCIÓN DE UN PEZ FLUORESCENTE CON U.V.
No TgTg Rojo Tg Naranja Tg Rosado
Peces Cebra analizados con luz ultravioleta (400nm): 1 = Pez
de color rojo transgénico; 2 = Pez de color naranja
transgénico; 3 = Pez de color rosado transgénico; 4 = Pez sin
fluorescencia no transgénico (Control -).
DETECCIÓN DE UN PEZ FLUORESCENTE CON U.V.
No Tg Tg Rojo
IDENTIFICACIÓN molecular
EXTRACCIÓN DE ADN DE TEJIDO MUSCULAR
Kit DNeasy Blood & TissueKit de QiagenTg
Corrida electroforética de las muestras de la extracción del ADN del tejido muscular en peces
Cebra (Concentración promedio de 170 ng/ul): 1 = Pez de color rojo transgénico; 2 = Pez de color
naranja transgénico; 3 = Pez de color rosado transgénico; 4 = Pez sin fluorescencia no transgénico
(Control -); M = Marcador de peso molecular de 100pb.
DETECCIÓN MOLECULAR DE LA FLUORESCENCIA A
NIVEL MOLECULAR DEL GEN RFP POR PCR
Corrida electroforética del amplificado del gen RFP en peces Cebra transgénicos fluorescentes. 1
= Pez de sin fluorescencia no transgénico (Control -); 2, 3 = Pez de color rosado transgénico; 4, 5
= Pez de color naranja transgénico; 6, 7 = Pez de color rojo transgénico; 8 = Sin muestra (Control
-). M = Marcador de peso molecular de 100pb.
Obtención y análisis filogenético de las secuencias de
aminoácidos y nucleotídicas de las protéinas fluorescentes (RFP y
GFP) en OVM hidrobiológicos
Lista de las ocho proteínas fluorescentes (RFP y GFP) reportados en el
UniProt (2013) extraídas de diferentes organismos hidrobiológicos marinos.
El producto amplificado tuvo un peso de 505 pares de bases acorde con
los reportes de Rehbein y Bogerd (2007) y Bielikova et al. (2012).
RESULTADOS PRELIMINARES CON GFP EN PECES
CEBRA FLUORESCENTES
!TODOS LOS PECES CEBRA FLUORESCENTES ROJOS, NARANJAS Y
ROSADOS DIERON POSITIVO PARA RFP?
RFP
Cortesía de BIOLINKS
RESULTADOS PRELIMINARES CON GFP EN PECES
CEBRA FLUORESCENTES
GFP
!HAY EN PECES CEBRA FLUORESCENTES ROJOS, NARANJAS,
ROSADOS Y GRISES QUE DIERON POSITIVO CON GFP?
GUÍA PARA LA INSPECCIÓN Y TOMA DE MUESTRAS
PARA PECES ORNAMENTALES TRANSGÉNICOS
FLUORESCENTES (R.M. 023-2015-MINAM)
GUÍA PARA LA INSPECCIÓN Y TOMA DE MUESTRAS PARA PECES ORNAMENTALES
TRANSGÉNICOS FLUORESCENTES (R.M. 023-2015-MINAM)
GUÍA PARA LA INSPECCIÓN Y TOMA DE MUESTRAS PARA PECES ORNAMENTALES
TRANSGÉNICOS FLUORESCENTES (R.M. 023-2015-MINAM)
FALTA UNA GUÍA PARA LA INSPECCIÓN Y TOMA DE
MUESTRAS PARA TRUCHA TRANSGÉNICA CON HORMONA DE
CRECIMIENTO Y GENES DE RESISTENCIA A ENFERMEDADES
...!
FALTA DESARROLLAR PROTOCOLOS PARA LA
DETECCIÓN DE TRANSGENESIS EN TRUCHA
Un método rápido de análisis molecular para la detección de ovas y adultos del pez
trucha (Oncorhynchus mykiss)
¿Y LA BIOSEGURIDAD?
¿Cuál es el Riesgo con peces transgénicos
?
Daño a la
Diversidad
Biológica ..!
Por una Reproducción Descontrolada e Hibridación con
especies naturales
Daño al Medio
Ambiente ..!
Por la posible alteración de los
sistemas naturales.
Daño a la Salud
Humana ..!
Por consumo de organismos
transgénicos (Alergias U otros efectos negativoas)
William Muir resumió los resultados de un estudio del que
había sido coautor en 1999. En él se examinaban, utilizando
un modelo teórico, las posibles consecuencias de que un
pequeño número de peces modificados genéticamente se
escaparan y aparearan con miembros de una especie afín en
libertad.
Si los peces transgénicos se introducen en una población
silvestre, el modelamiento y estudios experimentales dan
TRES POSIBLES ESCENARIOS HIPOTÉTICOS ambientales
después de varias generaciones de convivencia (Hedrick,
2001; Muir y Howard, 1999, 2002):
William Muir considera las siguientes 6 variables a tomarse en
cuenta con OVM hidrobiológicos que se introducen en poblaciones
emparentadas silvestres:
1. Viabilidad de los peces juveniles (Posibilidad de
sobrevivir y llegar a la madurez sexual).
2. Viabilidad de los adultos (Posibilidades de sobrevivir a
procrear).
3. Tasa de fecundidad (Número de huevos producidos por
una hembra).
4. Tasa de fertilidad (Número de huevos fertilizados con
éxito por el esperma masculino).
5. Tasa de apareamiento exitoso (Exito en asegurar
compañeros para procrear).
6. Edad de la madurez sexual.
ESCENARIOS POSIBLES
1. Eliminación: Después de algunas generaciones, el transgén asociado con
una gran desventaja se elimina gradualmente de la población híbrida y la
población de peces se compone finalmente sólo del genotipo silvestre. El
impacto en el medio silvestre sin embargo población puede ser más o
menos importante durante las pocas generaciones necesarias para la
‘'purga '' del transgén.
ESCENARIOS POSIBLES
2. Invasión: Debido a que se asocia con una gran ventaja, como por
ejemplo la madurez sexual, el transgén es progresivamente propagado
por los cruces regulares con la población silvestre para finalmente estar
presentes en todos los genomas silvestres (Híbridos). El genotipo silvestre
desaparecerá por completo.
ESCENARIOS POSIBLES
3. ''Gen Troyano'': El gen se propaga en la población silvestre durante
varias generaciones gracias, por ejemplo, a una ventaja reproductiva, sin
embargo las tasas de supervivencia de las larvas son tan bajas o son
inviables, entonces la tendencia es hacia la extinción de toda la población
tanto de la población silvestre como la transgénica.
La Trucha Transgénica podría cruzarse conuna trucha naturalizada?
Muchas Gracias…!
INFORMACIÓN REQUERIDA
Personal de Contacto: Blgo. Mg. CARLOS SCOTTO ESPINOZA
Email: [email protected]
Celular: 972520959 - 992044182
Dirección Institucional: Jr. Río Chepén s/n. El Agustino. Lima
