BOLETIN TRIMESTRAL ABAC Nº 54

Junio de 2003

ASOCIACION BANCOARGENTINO DE CELULASPers. Jur. N°1.530.80617 años de actividad

INDICE

1 ........... ANUNCIOS Curso Teórico - Práctico

2 - 8 ......... ARTÍCULO Clonación en Bovinos

Daniel F Salamone y Claudio B Santos

9 - 12 ....... SERVICIOS ABAC

Asociación Banco Argentino de Células

Módulo IIIEQUIPOS e INSTRUMENTOS :VALIDACIONES

Fecha octubre 2003 de 9:00 a 17:30 hs.Aranceles :no socios teórico $ 30 Práctico $ 30socios $ 25 $ 25

Lugar: Aula de la Federación Bioquímica ArgentinaViamonte 1167. 3 pisoBuenos Aires

Informes e Inscripción : ABACabac_informes@yahoo.com.arJulián Alvarez 1218 (C1414DRZ)Ciudad Autónoma de Buenos Aires

GARANTIA DE CALIDAD EN CULTIVOS CELULARES

Clonación en BovinosDaniel F Salamone y Claudio B Santos

El presente artículo tiene comoobjetivo describir los resultadospreliminares de clonación y transgénesisbovina parcialmente publicadosrecientemente como resumen (Salamoneet al 2003). En primer término semencionará algunos de los aspectosgenerales de la clonación bovina, parauna revisión detallada recomendamosartículos de Renard et al., 2002 y Dinnyéset al., 2002. El principio básico deltransplante o la transferencia nuclearconsiste en remover el núcleo de unovocito maduro no fertilizado (ovoplastorecipiente) y transferirle un núcleo o unacélula entera (núcleo o célula donante).

Las células somáticas sereproducen in vitro con gran facilidad ycomo toda célula diploide no reproductivade un individuo, tiene la mismainformación genética; por transplantenuclear teóricamente se pueden producirtantos animales idénticos como se deseen.Este grupo de animales idénticos sedenomina clon y el procedimiento paragenerarlos clonación.

La extracción del núcleo delovocito se realiza generalmente pormicro-manipulación y aspiración conpipetas de vidrio, controladas por equiposde movimiento de precisión denominadosmicromanipuladores. El núcleo delovocito madurado in vitro y nofertilizado, normalmente se detiene luegode la primera división meiótica en elestadio de metafase II, hasta el momentode ser fertilizado por un espermatozoide.Luego de la fertilización será elespermatozoide mediante un procesollamado “activación” el que inicia una

serie de sucesivas divisiones celulares.Con las técnicas más difundidas declonación la activación debe ser realizadaartificialmente por la aplicación dediversos métodos químicos o físicos.

La tecnología básica paraclonación por transplante nuclear enmamíferos fue desarrollada en los años 80usando como donante células deembriones (blastómeros) de ratón, perolos resultados en esta especie fuerondesalentadores. Sin embargo, Willadsenen 1986, produjo los primeros corderosclonados usando como donanteblastómeros de embriones tempranos. Unaño después Robl et al., 1987 produjeronlos primeros terneros clonados con elmismo tipo de células.

La técnica de clonado con célulasembrionarias no logró tener granaceptación debido a numerosos factoresque llevaron a los investigadores yprofesionales no la implementaran. Entreestos factores se encuentra el hecho quese debía trabajar con células embrionariascuyo mérito genético es desconocido,además los embriones tempranos tienenun reducido número de células. Sumado aesto las bajas tasas de preñez ydificultades en el parto producidas por elexcesivo peso de las crías desalentaron laaplicación comercial de la técnica. Elentusiasmo inicial fue disminuyendo yprácticamente ninguna compañía estabausándola comercialmente hasta 1997. Eneste año Wilmut et al. (1997) publicaronel nacimiento de la oveja Dolly la cualfue producida por clonación de célulasprovenientes de un animal adulto. Comoinicialmente los resultados de clonacióncon células donantes adultas eran poco

eficientes, se considero entonces laposibilidad de usar células fetales. Conestas como donantes los grupos delInstituto de Roslin (Schnieke et al., 1997)y de la Universidad de Massachusetts(Cibelli et al., 1998) produjeron losprimeros ovinos y bovinosrespectivamente clonados y transgénicos;demostrándose así que la técnica detransplante nuclear es extremadamenteeficiente para producir animalestransgénicos. Las células fetales puedenmultiplicase in vitro por períodos másprolongados que las adultas lo quepermite realizar modificaciones genéticascon mayor facilidad y además llega atérmino y sobrevive luego del nacimientoun mayor número de clones (Heyman etal. 2002).

Wakayama et al., 1998 repitieronlos resultados de clonación con animalesadultos y produjeron numerosos ratonesclonados, utilizando como donantescélulas del cúmulus. Investigadoresjaponeses tuvieron aun resultados másalentadores dado que produjeron variosterneras clonadas a partir de adultosusando también células del cúmulus(Kato et al., 1999). Dado el tipo de céluladonante utilizada nadie había producidomachos adultos por clonación hasta quese logró en el ratón (Wakayama andYanagimachi, 1999).

En Dolly se descubrió que eltamaño de los cromosomas, en la partellamada telómero era más corta y nocorrespondían a la edad real de Dolly sinoque a la edad de la célula donante(Ashworth et al., 1998) ; esto causó granestupor en la comunidad científica. Enotras palabras sus telómeros eran los deuna oveja varios años más vieja que laque correspondía a la edad de Dolly. Lostelómeros se encuentran en los extremosde los cromosomas y se van acortando

cada vez que las células se dividenllegando hasta un determinado tamaño, apartir del cual las células no se dividenmás. Normalmente este mecanismoprotege al organismo de que semultipliquen en exceso célulaspotencialmente peligrosas. Sin embargoinvestigadores de la compañía ACT conbase en Massachusetts han demostradoexactamente lo contrario (Lanza et al.,2000), y por clonación podría elongarselos telómeros y en términos celularesrejuvenecer las células.

Algunos de los grandes problemasdel clonado, incluso descriptos en lostrabajos de neozelandeses y japoneses(Wells et al., 1999; Kato et al., 1999),siguen siendo las numerosas pérdidasdurante la preñez como así la altamortandad perinatal, que fuerza acuidados intensivos de los recién nacidos.La causa aparente de este problema sedebe a anomalías placentarias. Una de lashipótesis es que la expresión de los genesde los animales clonados es incorrecta yque la célula dadora del adulto fue re-programada ineficientemente por elovocito enucleado.

Breve descripción de la técnicautilizada en nuestros experimentos

La técnica utilizada con a la que se aplicósólo pequeñas variantes fue descriptapreviamente (Salamone et al., 2001). Obtención de ovocitos recipientes: Losovarios bovinos fueron obtenidos en elmatadero local, llevados al laboratorio ensolución fisiológica y por aspiraciónfolicular se extrajeron los complejosovocito-cúmulus.Remoción de las células del cúmulus:Luego de un período de maduración de18-24 horas los ovocitos se denudarontratándolos por 3 min con 1 mg/ml dehialuronidasa y por agitación con vortex.

Posteriormente se seleccionaron losovocitos que habían liberado su segundocorpúsculo polar y se encontraban enmetafase II. Enucleación: La enucleación fuerealizada por microcirugía. Para observarel núcleo se teñó el ovocito con elcolorante vital Hoechst 33342 y seobservó con luz ultravioleta por unperíodo menor a 10 segundos. Preparación de la célula donante: Lascélulas adultas de la granulosa fueronobtenidas de una vaca Jersey poraspiración de folículos guiada porecografía y por vía transvaginal. Losfibroblastos fueron obtenidos de un toroAngus a partir de un explante de la oreja.Para las células fetales todas las célulasdonantes fueron subcultivos obtenido dela zona del ijar de un feto hembra de laraza Jersey de 75 días. Todas las líneascelulares fueron cultivadas en medio α-MEM con 5% SFB.Transplante Nuclear PropiamenteDicho: se introdujo el núcleo, con unamicropipeta y se incorporo la célulacompleta, debajo de la zona pelúcida y encontacto con la oolema. Luego se realizóla fusión por un pulso eléctrico. Elprocedimiento de fusión consistebásicamente en la aplicación de un pulsoeléctrico, lo suficiente como para causaruna rotura transitoria de las membranas afusionar. Esta rotura es de muy cortaduración y es reparada rápidamente, perosi ambas membranas están en perfectaoposición se forman pequeños canalesentre ambas células. Debido a lainestabilidad termodinámica estaspequeñas aberturas se hacen mayores ylas dos células se transforman en unaluego de un cierto periodo de tiempo. Activación: Se indujo por tratamientocon ionósforo por 4 minutos seguido por3 hs de incubación en DMAP.Cultivo embrionario in vitro,transferencia de los embriones: se

utilizaron diversos sistemas de cultivoque luego se describirán, todos ellosfueron llevados a cabo en 500 microlitrosde medio cubierto por 200 microlitos deaceite mineral en placas marca Nunc de 4celdas. Se cultivaron por 7 días de maneratal que los embriones pudieron serimplantados en forma no quirúrgica enuna vaca recipiente previamentesincronizada a la edad del embrión.

Resultados de Clonación con célulasadultas

Diferentes tipos de células(granulosa, fibroblastos) y de sistemas decultivo embrionario fueron probadas enun experimento destinado a incrementarla tasa de sobrevivencia de embrionesproducidos por clonación a partir decélulas somáticas adultas. Luego deltransplante nuclear, fusión y activacióntres sistemas de cultivos fueron utilizadoscuando las células donantes fueronfibroblastos adultos: TCM-199+5% FCSy Menezo+5% FCS (ambos con célulasVero como co-cultivo y atmósfera con 5% de CO2 en aire) y SOF sin co-cultivopero con una baja concentración de O2(5 % O2, 5% de CO2 y 90 % de N2).También se utilizaron células de lagranulosa como donantes y los embrionesproducidos se cultivaron con Menezo+5%FCS y células Vero como co-cultivo y 5% de CO2 en aire. Los resultados sedescriben en la tabla 1.

El grupo tratamiento SOF tuvoclivaje y desarrolló hasta blastocisto enmayor proporción que los otrostratamientos, además se simplificó eltrabajo de laboratorio dado que entreotras ventajas no se necesitaba preparar lalínea celular para el co-cultivo por lo quese decidió su utilización en el siguienteexperimento. Sin embargo el únicoanimal que llego a término fue producido

a partir de TC199 + VERO y pero muriódurante el parto. Se observó que pesar dehaber producido numerosas preñeces (verTabla 1) una sola prosperó hasta la fechade parto. En coincidencia con otrosautores (Wells et al., 1999; Kato et al.,

1999) hubo numerosas pérdidas durantela preñez. Estos autores tambiénobservaron una alta mortandad perinatal ycon nuestra experiencia se demostró lanecesidad de incrementar los cuidadosintensivos de recién nacidos.

Tabla 1. Clonación con células adultas

Tratamiento n Clivaje(%) Blastocisto(%) Preg.(%) Nacimientos

Granulosa C199+VERO 92 59 (64) 26 (28)b 11 (12) 0Fibroblasto TC199+VERO 294 53.9 a 22(7.5)a 5(38.4) 1Fibroblasto Menezo+VERO 324 72.3 bc 29(8.9)a 5(29.4) 0Fibroblasto SOF 108 75.0 bc 24(22.2)b 5(45.4) 0

Clonación utilizando células donantes fetales transgénicas

Con la finalidad de desarrollar un sistemapara producir animales transgénicos seutilizaron como células donantesfibroblastos fetales, transfectados o no.Para la línea transfectada también sedetermino si la roscovitina podíaincrementar la disponibilidad de ovocitosrecipientes a lo largo de la semana. Laroscovitina es un inhibidor de MPF yMAPK dos complejos reguladores de lamaduración ovocitaria. Luego de iniciadala maduración normal todos los eventosson regulados por un rápido incrementoen MPF y MAPK citosólicos. Estosprevienen la reconstrucción de lamembrana nuclear y la entrada del núcleoen fase de síntesis de ADN hasta lafertilización o activación. La maduraciónnuclear se puede detener con roscovitinadado que mantiene MPF y MAPK bajos.Esto permite retrasar la maduración 24horas. La combinación del uso o no usode esta droga posibilita trabajar por 2 díasluego de un viaje al frigorífico. Si no se

tratan los ovocitos con roscovitina un díadespués se tendrán numerosa metafases IIpara enucleación y el transplante nuclear.Por el contrario si son tratadas conroscovitina recién podrá realizarse eltransplante nuclear 48 hs después, dadoque las primeras 24 hs en roscovinainhiben la maduración manteniendo elovocito como vesícula germinal y luegose requiere 24 horas más para llegar ametafase II.

Los embriones producidos en los todoslos tratamientos fueron cultivados en SOFsin co-cultivo pero con una atmósfera de5% de O2, 5 % de CO2 y 90 % de N2. Paralas transfección se utilizo unaconstrucción con el gen neomicina, unpromotor y el gen de la hormona delcrecimiento humana (GH) la construcciónse introdujo a las células donantes porliposomas. Luego se realizo la seleccióncon geneticina por 10-15 días. Losresultados se describen en la tabla 2.No se observaron diferencias entretratamientos. La transfección no afectó lacapacidad de desarrollo de los animales

clonados, tampoco afectó el tratamientode la recipiente con roscovitina,sorprendentemente con este últimotratamiento se observo una tendenciapositiva en el desarrollo. Se produjerontrece animales transgénicos en menos deun año de trabajo lo que demuestra elpotencial de esta técnica.

Aplicaciones científicas y comercialesde la transferencia nuclear

En la Argentina se han adoptadomuchas de las llamadas “Biotecnologíasde la Reproducción” con relativa rapidez,tanto por la acción de profesionales de laactividad privada como la realizada porinvestigadores de organismos oficiales.Prueba de esto es la realización en 1978de las primeras transferencias quirúrgicasde embriones por el doctor RodríguezDubra y colaboradores, los primerasnacimientos por fertilización in vitro(Salamone et al. 1995), y el recientenacimiento de terneras por clonación ytransgénesis (Salamone et al. 2003).Todos estos hechos fueron producidospocos años después de generadas estastecnologías en los países desarrollados.Lo que nos permite ser optimistasrespecto a las posibilidades futuras para eldesarrollo y aplicación de estas técnicasen nuestro país.

El clonado ha tenido un desarrollotan vertiginoso y un interés general tangrande que ha sido fácil seguir suevolución por los medios de divulgación

masiva. Sin embargo, ha prevalecido elenfoque alarmista debido a su potencialaplicación en humanos. Por el contrarioes nuestra opinión que esta técnicaayudará a generar conocimientos básicospara descubrir las bases de latotipotencialidad celular y larediferenciación de los tejidos,permitiendo su aplicación terapéutica,para regenerar tejidos lesionados,incluyendo el tejido nervioso y elpancreático entre otros.

A la pregunta ¿cuáles serán susaplicaciones agropecuarias en nuestrosistema de producción? La respuesta esque están libradas a nuestra capacidad deimaginación e innovación. La aplicaciónmás inmediata será la multiplicación derodeos de elite. La utilización de animalesclonados facilitará la producción ydifusión de animales transgénicos. Porejemplo, existe interés en Europa enreemplazar el gen PrP que torna a losbovinos susceptibles al virus de la vacaloca por otro que le otorgue mayorresistencia. Numerosas compañías ya hanproducidos animales transgénicos yclonados especialmente expresandonuevas proteínas en leche de valorfarmacéutico (Baguisi et al., 1999,Salamone et al. 2003). La producción deórganos y tejidos animales humanizadospara ser utilizados en transplante hadespertado también un interés enorme.Esto implicará la expresión de ciertasproteínas humanas y el silenciamiento dealgunas proteínas de origen animal.

Tabla 2. Clonación utilizando como células donantes fibroblasto (F.) fetales transgénicas o no y recipientes tratados con roscovina.

Tratamiento n Clivaje (%) Blastocisto (%) implantes Preñez Nacidos

F. no transfectado 197 122(62) 33(16.7) 16 5(31) 1F. transfectado 646 476(74) 128(19.8) 56 25(44.6) 7 F. transfectado roscovitina 228 191(84) 51(22.3) 30 16(53.3) 6

Agradecimientos

A la empresa Biosidus por la financiacióntotal del proyecto y facilidades pararealizar los experimentos mencionados. AL Baranao y L Bussman por lastransfecciones de las células donantes. A

los integrantes de Munar y asociados porla colaboración en las transferenciasembrionarias. A Jorge Artuzo por elcuidado de los terneros y Dr G Berra porsu ayuda durante los nacimientos.

Referencias

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