Búsqueda de compuestos inhibidores de la enzima ...

Búsqueda de compuestos inhibidores de la enzima dihidroorotato

deshidrogenasa de Leishmania spp a través de estrategias de mecánica

molecular.

Diego Alexander Guerra Arias

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ingeniería, Departamento de Sistemas y Computación

Medelliín, Colombia

2018

Búsqueda de compuestos inhibidores de la enzima dihidroorotato

deshidrogenasa de Leishmania spp a través de estrategias de mecánica

molecular.

Diego Alexander Guerra Arias

Tesis o trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Bioinformática

Director:

Carlos Enrique Muskus López, Ph.D.

Codirector (a):

Emiliano Barreto Hernández, Ph.D.

Línea de Investigación:

Búsqueda in silico de medicamentos

Grupo de Investigación:

Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales - PECET

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ingeniería, Departamento de Sistemas y Computación

Bogotá, Colombia

2018

La mayoría de los mortales nunca llegamos a

conocer nuestro verdadero destino;

simplemente somos atropellados por él. Para

cuando levantamos la cabeza y lo vemos

alejarse por la carretera ya es tarde, y el resto

del camino lo tenemos que hacer por la cuneta

de aquello que los soñadores llaman la

madurez. La esperanza no es más que la fe de

que ese momento no haya llegado todavía, de

que acertamos a ver nuestro verdadero

destino cuando se acerque y podamos saltar a

bordo antes de que la oportunidad de ser

nosotros mismos se desvanezca para siempre

y nos condene a vivir de vacío, añorando lo

que debió ser y nunca fue.

Carlos Ruiz Zafón

Agradecimientos

A mi familia por su apoyo incondicional

Al programa de estudio y control de enfermedades tropicales por acogerme como

estudiante, especialmente a los docentes Carlos Muskus López, coordinador de la unidad

de biología molecular y computacional (UBMC) y Rodrigo Ochoa Deossa, por su asesoría

y apoyo académico en este proceso formativo.

Agradezco a mis compañeros de la unidad de biología molecular y computacional del

PECET Didier Tirado, Christian Bustamante y Daniela Arboleda por su apoyo profesional

y personal.

Al Drug Discovery TACC por permitirme trabajar con su base de datos de compuestos

sintéticos.

A mis colegas de las líneas de investigación del PECET, Carol Mesa, Andrea Trujillo,

Gustavo Blandón, Jessica Tabares y Luisa Ortega por su apoyo personal.

Al Dr. Isaías Lans por su orientación académica.

Resumen y Abstract IX

Resumen

La leishmaniasis es una enfermedad infecciosa causada por protozoos del genero

Leishmania, los cuales son parásitos intracelulares obligados, siendo endémica en zonas

tropicales y subtropicales. Esta patología se presenta en tres formas clínicas,

leishmaniasis cutánea (LC), mucocutánea (LMC) y visceral (LV), donde la de más

incidencia a nivel mundial es LC, con un reporte de 1,3 millones de casos nuevos al año.

Como objetivo principal en esta investigación se pretende identificar inhibidores de la

enzima dihidroorotato deshidrogenasa de Leishmania spp. involucrada en la biosíntesis

de novo de pirimidinas. Esta proteína se incluyó en un tamizaje virtual empleando docking

molecular contra una librería de aproximadamente 642.000 compuestos sintéticos. Del

resultado del tamizaje virtual se encontraron moléculas que presentaron un buen puntaje

en el docking. De este grupo de moléculas con buen puntaje, se seleccionaron cinco en

base a su energía libre, para realizar simulaciones de dinámica molecular, lo cual permite

generar complejos con una mejor ubicación y cálculos de energía libre de interacción por

MM/PBSA. De los resultados obtenidos se dedujo que los complejos fueron estables

durante las simulaciones y que el mejor compuesto, nombrado como CM4, tuvo una

energía libre de unión de -93.180 KJ/mol, casi el doble del obtenido para dihidroorotato

(DHO), el cual es el sustrato natural de esta enzima, con un valor de -50.653 KJ/mol. A

partir de esta metodología se logra proveer 4 moléculas para posteriores evaluaciones

experimentales in vitro e in vivo que sea más efectiva y menos toxica como alternativas

para el tratamiento de la leishmaniasis.

.

Palabras clave: Leishmaniasis, Docking Molecular, Dinámica Molecular, dihidroorotato

deshidrogenasa, MM/PBSA

X Búsqueda de compuestos inhibidores de la dihidroorotato deshidrogenasa de Leishmania sp.

a través de estrategias de mecánica molecular

Abstract

Leishmaniasis is an infectious disease caused by protozoa of the genus Leishmania, which

are obligate intracellular parasites. Leishmaniasis is endemic in tropical and subtropical

regions. There are three clinical forms of leishmaniasis: cutaneous leishmaniasis (LC),

mucocutaneous (CML) and visceral (LV), wherein the most common worldwide is LC, with

an incidence of 1.3 million new cases a year. The main objective of this research was to

identify inhibitors of the enzyme dihydroorotate dehydrogenase (DHO) of Leishmania spp,

which is an enzyme involved in de novo biosynthesis of pyrimidines. In order to achieve

the aforementioned aim, it was run a molecular docking with a library of approximately

642,000 synthetic compounds. Then, based on the results of docking, five compounds were

selected for their energy to perform simulations of molecular dynamics. The analysis of

molecular dynamics allowed to generate complexes with a better location and calculations

of interaction-free energy by MM/PBSA. Given the results of the MM/PBSA, it was possible

to determine that the complexes were stable during the simulations and that the best

compound was CM4 with a binding free energy of -93,180 KJ / mol, that it was almost twice

of the obtained for the DHO substrate of the enzyme, with a value of -50,653. The used

methodology provided more effective and less toxic molecules that can subsequently be

evaluated in both, in vitro and in vivo assays as alternatives for leishmaniasis’ treatment.

Keywords: Leishmaniasis, molecular docking, molecular dynamics, dihydroorotate

dehydrogenase, MM/PBSA.

Contenido XI

Contenido

Pág.

Resumen ........................................................................................................................ IX

Lista de figuras ............................................................................................................ XIII

Lista de tablas ............................................................................................................. XIV

Lista de Símbolos y abreviaturas ................................................................................ XV

Introducción .................................................................................................................. 17

1. Leishmaniasis ........................................................................................................ 21 Generalidades leishmaniasis ......................................................................... 21

1.1.1 Ciclo de vida ....................................................................................... 21 1.1.2 Formas clínicas ................................................................................... 23 1.1.3 Tratamiento ......................................................................................... 24

2. Dihidroorotato deshidrogenasa ............................................................................ 25 Importancia de la DHODH ............................................................................. 26

2.1.1 Ciclo catalítico de la DHODH .............................................................. 27 2.1.2 Intermediario entre la oxidación y reducción. ...................................... 30 2.1.3 Mecanismo cinético de DHODH .......................................................... 30

3. Herramientas Computacionales ............................................................................ 32 Docking Molecular ......................................................................................... 32 Dinámica molecular ....................................................................................... 34

3.2.1 Campos de fuerza ............................................................................... 35 3.2.2 Minimización energética ...................................................................... 37 3.2.3 Acoplamiento de temperatura ............................................................. 38 3.2.4 Acoplamiento de la presión ................................................................. 39 3.2.5 Condiciones periódicas de frontera (CPF) ........................................... 40

MM/PB(GB)SA............................................................................................... 40

4. Objetivos ................................................................................................................. 44 Objetivo general: ............................................................................................ 44 Objetivos específicos: .................................................................................... 44

5. Materiales y Métodos ............................................................................................. 45 Selección de complejos DHODH-compuesto de alta afinidad ........................ 45 Topología de los compuestos ........................................................................ 45 Simulación de complejos por Dinámica Molecular ......................................... 46

XII Búsqueda de compuestos inhibidores de la enzima dihidroorotato deshidrogenasa de

Leishmania spp a través de estrategias de mecánica molecular

Calculo de la energía de unión ...................................................................... 47 Análisis de datos ........................................................................................... 47

6. Resultados ............................................................................................................. 49 Complejos de alta afinidad por docking molecular ......................................... 49 Estabilidad de los complejos en la simulación ............................................... 52

6.2.1 Energía potencial y Temperatura del sistema ..................................... 52 6.2.2 RMSD y RMSF de los complejos ........................................................ 54 6.2.3 Comportamiento de la estructura secundaria de DHODH ................... 55

Interacciones energéticas .............................................................................. 56 6.3.1 Energías de Lennard-Jones y Coulomb .............................................. 56 6.3.2 Puentes de hidrogeno entre DHODH-ligandos ................................... 59 6.3.3 Energía libre de unión por el método PBSA ........................................ 60

Interacciones especificas .............................................................................. 62

7. Discusión ................................................................................................................ 68

8. Conclusiones ......................................................................................................... 75

9. Bibliografía ............................................................................................................. 77

10. Anexos ..................................................................................................................... 87

Contenido XIII

Lista de figuras

Figura 1. Representación del ciclo de vida del parásito Leishmania spp........................ 22

Figura 2. Metabolismo de pirimidina de leishmanis major. ............................................. 25

Figura 3. Metabolismo de pirimidina de Clostrisium oroticum. ....................................... 26

Figura 4. Reacción catalizada por CoDHODH ............................................................... 27

Figura 5. Ciclo catalítico de la enzima DHODH.............................................................. 28

Figura 6. Ilustración del potencial de Lennard-Jones. .................................................... 36

Figura 7. Comparación estructural del cristal 3GZ3. ...................................................... 50

Figura 8. Posición en el sitio activo del sustrato y los ligandos. ..................................... 51

Figura 9. Comportamiento de la temperatura del sistema durante la simulación. .......... 52

Figura 10. Energía potencial de los diferentes complejos simulados ............................. 53

Figura 11. Estabilidad de los complejos a partir de RMSD y RMSF. .............................. 54

Figura 12. Simulación de la estabilidad de la estructura secundaria de la proteína. ...... 55

Figura 13. Energías no enlazantes entre la proteína y los ligandos. .............................. 57

Figura 14. Comportamiento de las energías no enlazantes entre la proteína y el cofactor

FMN. .............................................................................................................................. 58

Figura 15. Comportamiento de las energías no enlazantes entre los ligandos y FMN. .. 59

Figura 16. Formación de los puentes de hidrógenos de los diferentes complejos .......... 60

Figura 17. Calculo de la energía libre de unión para cada ligando durante la simulación

de dinámica molecular .................................................................................................... 61

Figura 18. Promedio de la contribución energética de cada residuo a la energía libre de

unión con el ligando. ...................................................................................................... 62

Figura 19. Distancia entre átomos de CM1 y residuos de DHODH. ............................... 63

Figura 20. Distancia entre átomos de CM2 y residuos de DHODH ................................ 64

Figura 21. Distancia entre átomos de CM3 y residuos de DHODH. ............................... 65



Figura 24. Comparación del RMSF con la estructura proteica. ...................................... 70

XI

V

Búsqueda de compuestos inhibidores de la enzima dihidroorotato deshidrogenasa de


Lista de tablas

Tabla 1. .......................................................................................................................... 50

Tabla 2.. ......................................................................................................................... 61

Contenido XV

Lista de Símbolos y abreviaturas

DHODH: dihidroorotato deshidrogenasa

DHO: dihidroorotato

ORO: orotato

FMN: flavín mononucleotido

DM: Dinámica Molecular

MM: Mecánica Molecular

LC: Leishmaniasis cutánea

LM: Leishmaniasis mococutánea

LV: Leishmaniasis visceral

SD: steepest descent

GC: Gradiente conjugado

NVE: Conjunto microcanonico

NVT: Conjunto canónicos

CPF: Condiciones periódicas de frontera

PME: Particle-Mesh-Ewald

MM/PBSA: Molecular Mechanics/Poisson-Boltzmann Surface Are

GAFF: Campo de fuerza general de Amber

ME: minimización energética

O: Oxigeno

N: Nitrógeno

H: Hidrógeno

X

VI

Búsqueda de compuestos inhibidores de la enzima dihidroorotato deshidrogenasa de


Introducción

La leishmaniasis es una enfermedad infecciosa causada por protozoos del género

Leishmania. El parasito es trasmitido al hombre o reservorios animales, por la picadura de

insectos hembras del genero Phlebotomous en el Viejo Mundo y el género Lutzomyia en

el Nuevo Mundo ante la ingesta de sangre, la cual es necesaria para la maduración de sus

huevos [1]. Esta patología se presenta en tres formas clínicas, leishmaniasis cutánea que

es la forma más común de las tres presentaciones clínicas, se asocia con lesiones

ulcerativas principalmente, aunque en un porcentaje de pacientes se puede presentar

como lesiones nodulares que no se ulceran, lesiones verrugosas, o incluso en forma de

placas en piel. La leishmaniasis mucocutánea la cual genera lesiones que afectan las

mucosas de nariz, boca, garganta, y en el tejido circundante. El tejido y el cartílago de

estas mucosas se pueden destruir por la ulceración y la erosión que causa el parasito y

quizás por la respuesta inmune que se genera para contrarrestar la infección. Y finalmente

la leishmaniasis visceral, la cual afecta órganos profundos como bazo, hígado, medula

ósea y ganglios. Es la forma clínica más severa de la enfermedad y se caracteriza por

síntomas que incluyen fiebre, pérdida de peso, hepatomegalia y esplenomegalia, anemia

y si no es tratada oportuna y adecuadamente puede causar la muerte al paciente[1], [2].

Esta enfermedad es endémica en regiones tropicales y subtropicales [1], presentando una

incidencia anual de 1,3 millones de casos en aproximadamente 98 países al rededor del

mundo de todas las formas clínicas, convirtiéndola un problema de salud pública. Se

estima que cerca de 350 millones de personas están en riesgo a nivel mundial [3]. En

Colombia la leishmaniasis es una enfermedad endémica en la mayor parte del territorio

nacional y aproximadamente 11 millones de personas se encuentran en riesgo de contraer

la infección, principalmente en áreas rurales, aunque ya hay reportes de casos en algunas

ciudades [4].

18 Búsqueda de compuestos inhibidores de la enzima dihidroorotato deshidrogenasa de


A pesar de los esfuerzos en la búsqueda de terapias para la leishmaniasis, actualmente

solo se cuenta con pocos medicamentos para tratar esta enfermedad , entre estos están

los compuestos a bases de antimonio pentavalente, la anfotericina B, isotianato de

pentamidina y la miltefosina [2], [5]. Estos fármacos presentan serias dificultades,

relacionadas con toxicidad, altos costos, resistencia incrementada del parásito a varios de

ellos [6], [7] y a la fecha no se dispone de nuevas terapias efectivas, menos toxicas para

la leishmaniasis ni de una vacuna para su prevención y control [7].

Entre las estrategias para el desarrollo y descubrimiento de nuevos fármacos para uso en

la quimioterapia de enfermedades parasitarias como la leishmaniasis se encuentra la

búsqueda o predicción de blancos moleculares en el parásito, empleando estrategias

genómicas, proteómicas o computacionales combinadas con el diseño o búsqueda en

librerías de compuestos, de potenciales inhibidores para las moléculas blanco específicas

y esenciales del parásito. Adicionalmente, se ha hecho la búsqueda o predicción de

actividad leishmanicida en análogos de agentes o compuestos existentes que se usan para

el tratamiento de otras patologías (segundos usos) [8], [9].

Las proteínas del metabolismo han sido relevantes a la hora de buscar potenciales blancos

terapéuticos para el diseño de nuevos fármacos. La ruta de biosíntesis de novo de

pirimidinas cumple un papel importante en el correcto funcionamiento celular ya que los

nucleótidos son necesarias para la síntesis de RNA, DNA, glicosilación de proteínas,

biosíntesis de lípidos de membrana y en reparación. La enzima dihidroorotato

deshidrogenasa (DHODH) participa en el cuarto paso de esta ruta, catalizando la oxidación

del (S)-dihidroorotato en orotato reduciendo el cofactor flavín mononucleotido (FMN) y en

el segundo paso de la reacción el fumarato es reducido a succinato y el cofactor FMN es

reoxidado, siendo este el único paso redox en esta ruta. La DHODH se divide en las

familias 1 y 2 de acuerdo a su ubicación subcelular y preferencia por aceptores de

electrones; donde la familia 1 se encuentra en el citoplasma y la familia 2 en la membrana.

La familia 1 a su vez se subdivide en las subfamilias 1A y 1B debido a los aceptores de

electrones, fumarato y NAD+ respectivamente y la familia 2 requiere de quinonas para su

oxidación. Esta enzima ha mostrado ser importante en la supervivencia de

Trypanosomatidos, dado que experimentos de gene knock-out del gen que codifica por

esta proteína, hace que los parásitos de Trypanosoma cruzi, no sean viables. [10] [11]

Capítulo 1 19

Gracias al avance que se ha dado en la biología computacional, como la disponibilidad de

bases de datos, softwares y programas de libre acceso, se ha logrado un avance

importante en el desarrollo y la aplicación de nuevas estrategias en la búsqueda de

medicamentos para muchas enfermedades. Entre estos avances, se encuentran el

desarrollo de redes de interacción del proteoma de un microorganismo o célula, o incluso

de un set de proteínas involucradas en algunos procesos celulares, como proteínas del

metabolismo, proteínas asociadas con ciclo celular o las relacionadas con producción de

energías. Esta aproximación permite predecir o identificar proteínas esenciales en la

biología del microrganismo y por tanto evaluarlas luego como blanco de medicamentos o

vacunas e incluso en diagnóstico [12],[6]. Adicionalmente, se desarrollaron metodologías

para la detección de blancos moleculares y predicción de segundos usos de compuesto,

por análisis de homología,[13], predicción de potenciales inhibidores mediante docking

molecular [14], optimización de los inhibidores y estudio de interacción proteína-ligando a

partir de mecánica molecular. Todo esto permite lograr de una forma más eficiente el

descubrimiento y desarrollo de nuevos blancos y medicamentos.

Las estrategias in silico tiene como ventaja sobre los procedimientos experimentales, los

pocos o moderados recursos que se necesitan debido a que muchos de los programas

usados son de distribución libre y permiten seleccionar o diseñar moléculas o compuestos

con una muy buena probabilidad de éxito experimental, haciendo que el tiempo invertido

desde la predicción hasta la salida al mercado sea más corto [15].

Entre estos métodos bioinformáticos, la evaluación de la interacción ligando-proteína por

docking molecular se ha convertido en una herramienta muy útil en la búsqueda de nuevos

medicamentos. Lograr modelar las interacciones entre proteínas y pequeñas moléculas a

nivel atómico, permiten caracterizar el comportamiento de estas moléculas en el sitio activo

del blanco molecular así como procesos bioquímicos fundamentales [16]. Este método

envuelve dos pasos básicos, i) predicción de la conformación del ligando, así como su ii)

posición y orientación en el sitio activo y la evaluación de la afinidad de las uniones que se

dan[16]. Además, la existencia de librerías virtuales de pequeñas moléculas ha potenciado

la búsqueda de medicamentos por medio del docking molecular. Existe una gran variedad

de programas que realizan este proceso, entre los más destacados están las diferentes

versiones de AutoDock y AutoDock Vina[17].



Debido a que las estructuras 3D de las proteínas son “fotografías estáticas” y el docking

molecular se realiza sobre estas, se hace necesario estudiar su comportamiento dinámico

para llegar a mejores aproximaciones. La Dinámica Molecular (DM) genera simulaciones

donde el potencial energético es calculado por métodos de Mecánica Molecular (MM)

donde estas son establecidas con base en campos de fuerza desarrollados y

estandarizados para diferentes tipos de átomos, permitiendo estudiar el movimiento físico

por medio de la interacción de los átomos y moléculas para ver la evolución dinámica del

sistema, la trayectoria es determinada por la solución de la ecuación de Newton [18].

También da información sobre la energía de interacción entre la proteína y el ligando, la

cual es importante para entender la relación estructura-función del blanco y la esencia de

la interacción proteína-ligando ayudando en el proceso de descubrimiento y diseño de

nuevos medicamentos. Debido a esto la DM ha sido aplicada amplia y exitosamente en el

descubrimiento moderno de medicamentos [19].

Capítulo 1 21

1. Leishmaniasis

Generalidades leishmaniasis

La leishmaniasis es causada por un parásito intracelular del género Leishmania. La

clasificación taxonómica del parásito se dá por sus características bioquímicas y

moleculares, dividiéndose de esta manera en dos subgéneros: Leishmania y Viannia [3].

El parasito Leishmania presenta dos estadios de desarrollo en la naturaleza: El

promastigote y el amastigote. El promastigote es móvil, elongado y flagelado, y se

desarrolla y multiplica en el vector invertebrado [20]. Este se clasifica como promastigote

procíclico – que se multiplican en el intestino del insecto vector, luego pasa por una serie

de formas intermedias, para finalmente terminar como promastigote metacíclico, que es la

forma infectante del parásito [21]. El estadio de amastigote, tiene forma redondeada u

ovalada, el cual es la forma intracelular obligada del parásito y se divide dentro de los

macrófagos y otras células del sistema retículo endotelial del huésped vertebrado [22], [23].

1.1.1 Ciclo de vida

Para Leishmania spp. se producen dos ciclos: un ciclo silvestre, el parásito circula entre

los reservorios naturales y mantiene el ciclo con la participación de los vectores de la zona

endémica; y un ciclo urbano, donde los vectores infectados involucran al humano y a los

animales domésticos. Los insectos vectores de Leishmania spp. pertenecen a los géneros

Lutzomiya (en el Nuevo Mundo) y Phlebótomus (en el Viejo Mundo) [3], [20]. El ciclo inicia

a partir de la ingesta de sangre por hembras del insecto vector a partir de un organismo

infectado e ingiere macrófagos infectados con amastigotes,[3]. Posterior a la alimentación

del insecto, el parásito sale de los macrófagos y se pasa al estadio promastigote procíclico

dividiéndose por fisión binaria longitudinal [20]. Algunos de estos quedan libres en el lumen

intestinal y otros se adhieren a este por medio de hemidesmosomas [21]. Posteriormente

los promastigotes procíclicos se diferencian a promastigotes metacíclicos, que migran

hasta la parte anterior del aparato picador del insecto, los cuales son transmitidos al

próximo hospedero vertebrado que sea picado para una nueva ingesta sanguínea. Cuando

el insecto vector pica un ser humano o hospedero vertebrado, el insecto inyecta



promastigotes metacíclicos [21]; estos no entran inmediatamente a los macrófagos, si no

que permanecen en el espacio intercelular para activar el complemento por la vía

alternativa, iniciando la acumulación de macrófagos y neutrófilos, células que median la

destrucción de los parásitos; sin embargo, algunos al ser fagocitados resisten los

mecanismos destructivos y se logran diferenciar a amastigotes en un tiempo medio de 3-

4 horas, permaneciendo en fase estacionaria e iniciando su multiplicación a las 36 horas e

infectando a otros macrófagos y progresando de manera sucesiva el ciclo dentro del

huésped [3], [23].

Figura 1. Representación del ciclo de vida del parásito Leishmania spp. (tomada de https://www.cdc.gov/parasites/leishmaniasis/biology.html)

Capítulo 1 23

1.1.2 Formas clínicas

Las manifestaciones clínicas en que se presenta la leishmaniasis, están asociadas en gran

parte a la especie del parásito y a la respuesta inmunológica del huésped. Existen

básicamente tres presentaciones clínicas: la leishmaniasis cutánea (LC), con algunas

variantes, la leishmaniasis mucocutánea (LM), y la leishmaniasis visceral (LV) [3], [20]. La

leishmaniasis cutánea se caracteriza por la aparición de una o múltiples lesiones en piel

que aumentan de tamaño. Estas se localizan principalmente en regiones descubiertas del

cuerpo donde puede picar el insecto, como en las extremidades, superiores e inferiores y

la cabeza, normalmente cursa con linfadenopatía y lesiones satélites. Las especies del

parásito asociadas a estas lesiones son Leishmania mexicana, Leishmania braziliensis,

Leishmania guyanensis, Leishmania amazonensis, Leishmania peruviana, Leishmania

tropica, Leishmania aethiópica, y Leishmania major.

La leishmaniasis mucocutánea, la cual está presente en latinoamérica, puede ocurrir

meses o años después a la cicatrización de lesiones cutáneas, incluso sin el individuo estar

residiendo en zona endémica. Ocasionalmente se presenta conjuntamente con lesiones

activas en piel [3]. Esta lesión se caracteriza por inflamación granulomatosa de la mucosa

nasal, cavidad oral y faringe. Puede haber lugar a la destrucción del tabique nasal, y la

inflamación manifiesta del paladar genera el signo clínico conocido como “cruz palatina de

Escomel”. Las especies que pueden causar leishmaniasis mucocutánea son Leishmania

braziliensis, Leishmania panamensis, Leishmania guyanensis y Leishmania amazonensis

[24] .

La leishmaniasis visceral, la forma más complicada de la enfermedad, puede comprometer

la vida de las personas que la padecen, si esta no es diagnosticada a tiempo y tratada

adecuadamente. Las especies causantes de esta manifestación son Leishmania donovani,

Leishmania infantum y Leishmania chagasi. Clínicamente la leishmaniasis visceral se

caracteriza por la aparición de fiebre, hepato-esplenomegalia, linfadenopatía, pancitopenia

e hipergammaglobulinemia; y como consecuencia, existe deterioro progresivo del estado

general del huésped. [3], [24]



1.1.3 Tratamiento

El tratamiento de esta enfermedad es un poco complejo debido a las diferentes formas

clínicas que manifiesta, a las diferentes especies que la causan, incluida la resistencia a

los tratamientos por parte de las diferentes especies del parásito, e incluso por la

inmunocompetencia del huésped. Los tratamientos de primera línea para las formas

clínicas son las sales de antimonio pentavalente: antimoniato de N-metil glucamina

(Glucantime®) y el estibogluconato de sodio (Pentostam®). Antes de administrar el

tratamiento, se debe realizar una evaluación clínica y paraclínica para descartar la

existencia de cualquier alteración cardiaca, hepática, pancreática o renal, dado que los

antimoniales están contraindicados en presencia de algunas de estas alteraciones [25],

[26]. Adicionalmente, la mayoría de los tratamientos para Leishmaniasis está

contraindicado en mujeres en embarazo [27]. Conforme a lo establecido por la

organización mundial de la salud, el tratamiento óptimo recomendado es una dosis única

diaria de antimonio pentavalente de 20 mg/Kg de peso/día durante 20 días, lo que

normalmente garantiza curación del 90-95% de los casos. El tratamiento de la

leishmaniasis visceral debe ser de forma sistémica, antimoniales como el estibogluconato

sódico o antimoniato de meglumina (20mg de antimonio/Kg/día vía IV o IM durante 28 días)

o Anfotericina B como desoxicolato (0.5 –1mg/ /Kg/día vía IV) una vez al día hasta 8

semanas o en formulación liposomal 3mg/Kg/día vía IV durante 5 días repitiendo la misma

dosis a los días 14 y 21. Como alternativa está el uso de pentamidina vía parenteral

4mg//Kg/día vía IV una vez al día con un máximo de 15-30 dosis. La duración del

tratamiento depende de la respuesta clínica y del estado de inmunocompetencia del

paciente [26], [27]. En algunos casos se puede administrar también miltefosina, el único

medicameno de administración oral. Este medicamento, ha mostrado ser eficaz contra

algunas especies de Leishmania, y cuando el tratamiento con antimoniales está

contraindicado.

Alternativamente se han usado, tratamientos basados en calor como la termoterapia

empleando aparatos especializados para esto [28], [29], o basados en frio como la

crioterapia [30], [31]

2. Dihidroorotato deshidrogenasa

La flavoenzima dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH) cataliza la oxidación

esteroselectiva de (S)-dihidroorotato a orotato involucrada en el cuarto paso de la síntesis

de novo de pirimidinas (Figura 2). Esta enzima ha ganado gran interés tanto en

investigación básica como aplicada. La enzima DHODH es ampliamente usada como un

potencial blanco terapéutico en diferentes áreas como: oncología, reumatología y

enfermedades infecciosas y es un excelente modelo para el estudio de la catálisis

enzimática. [32]

Figura 2. Metabolismo de pirimidina de leishmanis major. En rojo se resalta la enzima

DHODH. Tomada de (https://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?lma00240+LMJF_16_0530)

https://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?lma00240+LMJF_16_0530


Leishmania spp a través de estrategias de mecánica molecular.

Importancia de la DHODH

La existencia del ácido uracil-4carboxilo (ácido orótico) fue evidenciada en la leche en el

año 1905 por Biscaro y Belloni, sin embargo, hasta finales de 1940 y principios de 1950 se

realizaron los primeros estudios que dieron muestra experimental de la importancia de este

como precursor de la síntesis de pirimidinas. [32] Liberman y Kornenber realizaron los

primeros estudios del metabolismo del orotato a partir de la bacteria Clostrisium oroticum

la cual fermenta el ácido orótico, identificaron el L-dihidroorotato, carbamol-L-aspartato y

aspartato como parte de la síntesis del orotato (Figura 3). Analizando los extractos del

crecimiento de E. coli en ausencia de orotato, Pardee y Yates demostraron que la

conversión de carbamilfosfato a orotato era necesaria para la biosíntesis de pirimidinas.

[33]

L-aspartato L -ureidosuccinato L-dihidroorotato orotato

[33]

La formación del ácido orótico es catalizado por enzimas esteroselectivas, en especial, la

reducción reversible del ácido a L-dihidroorotato, el cual se encontró que es catalizada por

la enzima dihidroorotato deshidrogenasa. [32] La DHODH fue aislada por primera vez de

extractos de Clostridium oroticum (CoDHODH) en 1953, años después fue completamente

purificada y cristalizada por Friedmann y Vannesland. [34] La CoDHODH fue caracterizada

como una metaloflavoproteína que oxida el dihidroorotato con la reducción del NAD+. A

partir de la caracterización de la enzima se evidenció por primera vez que esta contenía

FMN, FAD (flavin adenine dinucleotide) y hierro. Los grupos flavin son enzimáticamente

activos y están involucrados directamente en la oxido-reducción catalizada por DHODH.

Taylor y Taylor en 1964 luego de purificar la DHODH de Escherichia coli (EcDHODH)

mostraron que las DHODHs podían diferir en su localización sub-celular y propiedades

catalíticas ya que se encontró que EcDHODH estaba en la membrana citoplasmática y no

usaba NAD+ como co-sustrato, como si ocurre en otras DHODH [35].

Figura 3. Metabolismo de pirimidina de Clostridium oroticum

Capítulo 2 27

L-dihidroorotato + NAD+ orotato + NADH + H+

La biosíntesis y metabolismo de pirimidinas es muy conservada entre todos los organismos

y por esto la flavoenzima DHODH, ha sido explorada como blanco para el desarrollo de

medicamentos, dado que la depleción de pirimidinas a través de la inhibición de esta

enzima ha mostrado ser una buena opción para uso terapéutico. Se ha demostrado que la

reducción de L-dihidroorotato en mamíferos esta acoplada a la reducción de ubiquinona,

lo cual muestra un enlace de la biosíntesis de pirimidina con la cadena de respiración de

la mitocondria. La actividad de la DHODH del citoplasma esta acoplada a la actividad de

la fumarato reductasa, proceso importante para el balance redox celular. [32]

2.1.1 Ciclo catalítico de la DHODH

Las flavoenzimas DHODH catalizan el cuarto y único paso redox en la biosíntesis de novo

de pirimidinas, a partir de la oxidación de L-dihidroorotato (DHO) a orotato (ORO) con la

reducción de FMN. Este proceso depende de FMN el cual se compone de dos reacciones

independiente. La primera reacción la enzima unida al FMN es reducida por el DHO, en la

segunda es oxidada, la forma oxidada de FMN es regenerada por un sustrato oxidante.

Las enzimas de clase 2 usan quinona para regenerar el FMN, las de clase 1A fumarato y

las de clase 1B NAD+, como se ve en la figura 4. [36]–[38]

F FH2

F FH2

DHODH

DHODH

Figura 4. Reacción catalizada por CoDHODH, donde F y FH2 representan la forma

oxidada y reducida del grupo Flavino, respectivamente. [32]



Figura 5. Ciclo catalítico de la enzima DHODH. [32]

Capítulo 2 29

En la primera etapa de la reacción el DHO se une al sitio de unión de pirimidina presente

en todas las DHODH, la conversión de DHO a ORO se da junto con la reducción de la

enzima unida al FMN. La oxidación del DHO involucra una ruptura en el enlace entre CH.

El Carbono 5 (C5) de DHO es desprotonado, y tanto para la serina en la clase 2 como la

cisteína en la clase 1 se transfiere un equivalente de hidruro de C6 del DHO al N5 de la

isoaloxazina. Se pueden dar dos mecanismos por el cual se oxida el DHO, uno en el que

los enlaces se rompen simultáneamente y otro en el que los enlaces se rompen por pasos.

Diferentes estudios han mostrado que las enzimas clase 2 de homo sapiens y E. coli

emplean el mecanismo por pasos, mientras que las de clase 1A de L. lactis usa el

rompimiento simultáneo para la oxidación del DHO. Estos estudios muestran que ambas

clases de DHODH difieren en el mecanismo para realizar la misma reacción química [39].

A pesar que las enzimas de clase 1A y clase 2 difieren en el residuo catalítico, los cristales

de estas mostraron una alta conservación del bolsillo de unión del FMN y del sitio de unión

de la pirimidina. Las DHOHO’s comparten muchos residuos conservados que forman

puentes de hidrogeno con el sustrato y el producto en la biosíntesis de novo de pirimidinas.

Sin embargo, dos asparaginas se han reportado ser un sitio conservado e importante para

estabilizar el intermediario generado durante la reacción catalítica en las enzimas de clase

2. Mutantes de EcDHODH y LlDHODH de estos residuos han mostrado un impacto en la

reducción del FMN afectando la taza de este paso de la reacción [40].

El segundo paso en la reacción ha sido poco estudiado debido a que el sustrato de

oxidación de las DHODH’s clase ubiquinona es insoluble en agua, por lo cual se han

empleado análogos de la quinona. En este paso la catálisis cambia para las diferentes

DHODH’s; se han propuesto dos mecanismos para la oxidación de la flavina por la

ubiquinona: transferencia directa de un hidruro de la flavina a la quinona, o transferencia

de un solo electrón a través de una semiquinona-flavina. El N5 de la flavina es el sitio de

reacción donde se da la transferencia del hidruro, sin embargo, este no es accesible a la

quinona, por lo cual la oxidación debe ocurrir en dos transferencias de un electrón a pesar

de que no hay evidencia de un intermediario semiquinona-flavina. En las DHODH’s de

clase 1B las cuales no solo contienen FMN sino también FAD y como aceptor final de

electrones NAD+, se inicia la transferencia en el sitio de unión de FMN, pasa a través de

un grupo hierro-azufre a FAD y alcanza a NAD+. [41]–[43]



2.1.2 Intermediario entre la oxidación y reducción.

A pesar de la similitud en el sitio de unión de ORO entre las clases 1A y clase 2 de DHODH,

comparaciones a partir de ensayos de cinética ambas clases difieren en el mecanismo de

disociación del complejo DHODH-ORO. En la clase 2 la disociación de ORO del FMN

reducido es muy lenta para ser este el determinante en la tasa global del proceso catalítico.

De hecho, se predice que en las DHODH’s de clase 2 en la etapa de oxidación las quinona

se une al complejo reducido enzima-orotato en un sitio diferente al sitio de unión del ORO.

Por otro lado, la enzima LmDHODH de clase 1A ambos sustratos comparte el mismo sitio

activo. [44]

Esto se puede explicar debido a las diferencias estructurales relacionado a la flexibilidad

del loop catalítico para las clases 1A y 2. Las DHODH 1A, el movimiento del loop activo

juega un papel importante en el control del acceso al sitio activo tanto de DHO como del

aceptor de los electrones. En las de clase 2 no se requiere de este movimiento ya que hay

dos sitios de reducción, el sitio de unión para el agente oxidante y el sitio de unión para el

DHO [45].

2.1.3 Mecanismo cinético de DHODH

La cinética de las DHODH’s consiste en una reacción de doble desplazamiento, lo cual

genera una enzima temporalmente modificada luego del primer paso de la reacción. [46],

[47] En la primera fase de reducción, el DHO se une al sitio de unión de pirimidina el cual

se encuentra en todas las DHODH’s, y es convertido en ORO con la reducción del FMN

unido a la enzima. Este primer producto ORO debe ser liberado antes de que el segundo

sustrato esté listo para unirse. El FMN es regenerado en la segunda etapa de la reacción

la cual es diferente entre las clases 1 y 2. [48]–[51]

Análisis cinéticos de LmDHODH mostraron un comportamiento de cooperatividad positiva

para la unión de DHO un coeficiente de Hill de aproximadamente 2. Por otro lado, las de

Capítulo 2 31

clase 2 muestran un comportamiento tipo Michaelis-Menten para la unión de DHO,

independiente del agente oxidante empleado. Las medidas en la cinética realizadas a

LmDHODH indican que el producto de la primera etapa de la reacción el ORO, es un

inhibidor competitivo del DHO, y modula el grado de cooperatividad de la unión de DHO.

El comportamiento cooperativo de las enzimas de clase 1A se cree que depende de una

comunicación entre los sitios activos, a través del movimiento del bucle en el sitio activo lo

cual resulta en un re-arreglo de la interface dimérica. [52]–[55]



3. Herramientas Computacionales

Docking Molecular

El docking molecular es un método computacional para ubicar ligandos en el sitio activo

de un receptor, estos algoritmos y funciones de puntaje pueden generar complejos

estructurales proteína-ligando, generar una clasificación de compuestos, y estimar la

energía de unión [17].

Las interacciones proteína-ligando están descritas por combinación de diferentes fuerzas

intermoleculares como las electrostáticas, Van der Wals e hidrofóbicas. [56], [57] La

estructura del complejo proteína-ligando es de importancia para estudiar las interacciones;

métodos como Dock [58], Autodock [59], Gold [60] y Glide [61], son capacees de estimar

la posición más favorable energéticamente del ligando en el bolsillo de unión de la proteína.

[56] El docking molecular puede ser descrito como un modelo de llave-cerradura el cual

predice las conformaciones del ligando y la afinidad de unión por medio de uniones no

covalentes. Esta metodología ha sido empleada con éxito en diferentes áreas de

investigación. [57] La predicción de la unión de moléculas a proteínas cobra importancia

en la medida que permite realizar la búsqueda de compuestos con potencial para el

desarrollo de medicamentos en librerías de moléculas tipo fármaco.

Modelar las interacciones proteína-ligando requiere de dos pasos, la pose (modo de unión)

el cual predice la posición más favorable del ligando en el bolsillo de unión de la proteína

y estimar la afinidad de unión donde se calcula la energía de unión libre del ligando con la

proteína. Esta técnica ha sido exitosa en la predicción de la pose de unión, pero las

funciones de puntaje empleadas en la predicción de la afinidad de unión tienen un

rendimiento bajo y representan la mayor deficiencia en las aproximaciones por docking

molecular. La energía libre de unión es de mucha utilidad ya que mide que tan fuerte es la

interacción proteína-ligando; debido a lo costoso en tiempo y recursos que resulta medir

Capítulo 2 33

experimentalmente la afinidad de unión, el desarrollo de metodologías computacionales

con una mayor precisión es necesaria para estudios computacionales. [57] [62]

Esta herramienta ha jugado un papel importante en el diseño de medicamentos basado en

la estructura de proteínas. En este esquema se deben de considerar la precisión en la

predicción y la eficiencia del cálculo. Debido a que se debe evaluar la energía rápidamente,

se pre-calculan los potenciales de afinidad para cada átomo del ligando. [63] [64]

La proteína y el ligando inician a partir de una conformación donde no interactúan y

posterior al docking forman un complejo. La energía libre de unión (∆G) se calcula:

∆𝐺 = (𝑉𝑏𝑜𝑢𝑛𝑑𝐿−𝐿 − 𝑉𝑢𝑛𝑏𝑜𝑢𝑛𝑑

𝐿−𝐿 ) + (𝑉𝑏𝑜𝑢𝑛𝑑𝑃−𝑃 − 𝑉𝑢𝑛𝑏𝑜𝑢𝑛𝑑

𝑃−𝑃 )

+ (𝑉𝑏𝑜𝑢𝑛𝑑𝑃−𝐿 − 𝑉𝑢𝑛𝑏𝑜𝑢𝑛𝑑

𝑃−𝐿 + ∆𝑆𝑐𝑜𝑛𝑓) (Ec. 3.0)

Donde V representa la energía potencial, P la proteína, L el ligando, y ∆Sconf es el cambio

en la entropía sobre la unión del ligando. Cada termino de energía potencial incluye fuerzas

de Van der Waals, puentes de hidrogeno, electrostáticas y de solvatación:

𝑉 = 𝑊𝑣𝑑𝑊 ∑ (𝐴𝑖,𝑗

𝑟𝑖,𝑗12 −

𝐵𝑖,𝑗

𝑟𝑖,𝑗6 )𝑖,𝑗 + 𝑊ℎ𝑏𝑜𝑛𝑑 ∑ 𝐸(𝑡) (

𝐶𝑖,𝑗

𝑟𝑖,𝑗12 −

𝐷𝑖,𝑗

𝑟𝑖,𝑗10 )𝑖,𝑗 (Ec. 3.1)

+ 𝑊𝑒𝑙𝑒𝑐 ∑𝑞𝑖𝑞𝑗

휀(𝑟𝑖𝑗)𝑟𝑖𝑗

+ 𝑊𝑠𝑜𝑙 ∑(𝑆𝑖𝑉𝑗 + 𝑆𝑗𝑉𝑖)𝑒𝑥𝑝 (−𝑟𝑖𝑗

2

2𝜎2)

𝑖,𝑗𝑖,𝑗

Las cargas Wvdw, Whbond, Welec y Wsol se obtienen a partir de datos experimentales.

El primer término es 12-6 de la energía potencial de Lennard-Jones, Aij y Bij son

parámetros para las interacciones de repulsión y dispersión. El segundo término es la



interacción potencial de los puentes de hidrogeno, Cij y Dij, que se obtienen a partir de

datos experimentales de puentes de hidrogeno. E(t) representa la dirección de los puentes

de hidrogeno, y t es la desviación del puente de hidrógeno ideal. El tercer término es el

potencial electrostático con una constante dieléctrica E(rij). El ultimo termino es un cálculo

empírico de la desolvatacion usando el volumen (V) que rodea cada átomo, un promedio

de solvatación (S), y un factor de distancia promediado r.

Por último, los cambios de la entropía debidos a la unión del ligando (Sconf) se pueden

estimar por el número de torsiones activas en el ligando (Ntors) con un parámetro empírico

Wconf

∆𝑆𝑐𝑜𝑛𝑓 = 𝑊𝑐𝑜𝑛𝑓𝑁𝑡𝑜𝑟𝑠 (Ec. 3.2)

Dinámica molecular

La dinámica molecular (DM) son simulaciones in silico que estudian el movimiento de las

partículas, a partir de la solución paso por paso de la ecuación de movimiento de Newton.

Este método computacional permite calcular el comportamiento del sistema molecular en

función del tiempo, lo cual genera información de los cambios conformacionales del

sistema [65]. En una simulación de DM, las partículas pueden interactúan en un periodo

especifico de tiempo, esto produce una trayectoria que permite ver el comportamiento

dinámico del sistema. [66]–[68] Esta técnica permite simular cientos de átomos de un

sistema biológico, incluyendo proteínas completas en solventes, embebidas en

membranas o complejos macromoleculares como nucleosomas o ribosomas.

Capítulo 2 35

3.2.1 Campos de fuerza

En los modelos moleculares, la función de los campos de fuerza es modelar la energía

potencial del sistema. Incluye las formas funcionales de la energía potencial, un conjunto

de parámetros y es capaz de relacionar estructuras químicas o sus conformaciones con la

energía potencial. La forma funcional puede ser obtenida con métodos analíticos o

empíricos y los parámetros de los campos de fuerza, como las constantes de fuerza y

valores de equilibrio, se pueden obtener reproduciendo los datos experimentales o a partir

de cálculos de química cuántica. Los campos de fuerza más populares en su mayoría son

de forma par-aditivos, y el total de la energía potencial es la suma de los términos

energéticos de unión y no unión. [69]

En estas simulaciones de sistemas biomoleculares se pueden emplear diferentes tipos de

campos de fuerza, siendo los más populares CHARMM [70], AMBER [71], OPLS [72] y

GROMOS [73].

Para el campo de fuerza AMBER (ff99SB, ff99SB-ildn, ff03, ff14SB, etc.) [74], la energía

potencial V se calcula a partir de la ecuación:

𝑉 = ∑ 𝑘𝑏(𝑏 − 𝑏0)2

𝑏𝑜𝑛𝑑𝑠

+ ∑ 𝑘𝜃(𝜃 − 𝜃0)2 + ∑1

2𝑉𝑛[1 + cos (𝑛∅ − 𝛿]

𝑑𝑖ℎ𝑒𝑑𝑟𝑎𝑙𝑠𝑎𝑛𝑔𝑙𝑒𝑠

+ ∑ 𝑘𝜔(𝜔 − 𝜔0)2

𝑖𝑚𝑝𝑟𝑜𝑝𝑒𝑟𝑠

+ ∑ 휀𝑖𝑗 [(𝑅𝑚𝑖𝑛,𝑖𝑗

𝑟𝑖𝑗)

12

− 2 (𝑅𝑚𝑖𝑛,𝑖𝑗

𝑟𝑖𝑗)

6

𝑛𝑜𝑛𝑏𝑜𝑛𝑑𝑒𝑑

] + ∑𝑞𝑖𝑞𝑗

4𝜋휀0𝑟𝑖𝑗𝑛𝑜𝑛𝑏𝑜𝑛𝑑𝑒𝑑

(Ec. 3.3)



Los términos con el subíndice 0 son valores de equilibrio y kx (x=b, θ, ϕ y ω) son las

constates de fuerza para cada tipo de interacción.

El termino 1 explica la interacción de estiramiento utilizando el potencial armónico, donde

b es la longitud del enlace.

El termino 2 explica el potencial armónico del ángulo del enlace, donde θ es el ángulo de

enlace.

El termino 3 explica el potencial del ángulo diedro apropiado para cada periodo, donde n

es la multiplicidad, ϕ es el ángulo diedro y es el cambio de fase.

El termino 4 explica el ángulo diedro impropio para cada armónico, donde ω es el ángulo

diedro impropio.

El termino 5 explica el potencial de van der Waals (vdW) utilizando una función potencial

estándar de repulsión/dispersión 12-6 de Lennard-Jones (LJ). Como muestra la Figura 6,

εij es el potencial minimo, rij es la distancia entre particular, Rmin,ij es la distancia en la que

el potencial tiene el valor minimo y σ es el valor donde el potencial de LJ es cero.

Figura 6. Ilustración del potencial de Lennard-Jones.

Capítulo 2 37

El termino 6 explica la energía electrostática con un potencial Culumbico, qi y qj son cargas

parciales de las partículas i y j, respectivamente, rij es la distancia entre partículas y ɛ0 es

la permisividad eléctrica del espacio libre.

La mayoría de los campos de fuerza empleados en simulaciones biomoleculares solo

contienen los parámetros para proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos, así como

moléculas pequeñas, como ADP, ATP, NADP, entre otras. Los parámetros para los

campos de fuerza de moléculas orgánicas (ligandos) casi siempre están ausentes en

fuérzalos campos parametrizados para macromoléculas como proteínas, DNA y RNA. Por

lo cual, se necesitan herramientas adicionales para generar los campos de fuerza de estos

ligandos, para poder ser empleados en simulaciones proteína-ligando. El campo de fuerza

general de AMBER (GAFF) [75] se emplea para generar los parámetros de los ligandos.

3.2.2 Minimización energética

La minimización energética es el proceso que busca la disposición en el espacio de un

grupo de átomos, donde a partir de un modelo computacional la fuerza neta inter-atómica

de cada átomo es cercana a cero y la posición en la superficie de energía potencial es un

punto estacionario. Realizar una optimización geométrica de un sistema permite obtener

una estructura con una relevancia física, ya que estas optimizaciones a menudo se acercan

a un sistema tal como se encuentra en la naturaleza y la geometría de esta estructura

puede emplearse en diferentes estudios experimentales y teóricos [76].

La estructura inicial de un sistema molecular utilizado en las simulaciones puede tener

malas interacciones. Por ejemplo, dos átomos demasiado cerca pueden generar una gran

interacción repulsiva. Es necesario correr una minimización energética en la estructura

para remover los malos contactos antes de someter el sistema a una simulación de



dinámica molecular. En los sistemas biomoleculares se emplean generalmente dos

métodos para realizar una minimización energética el método del gradiente (steepest

descent, SD) y gradiente conjugado (GC). Para la mayoría de los procesos de minimización

el algoritmo SD es suficiente. SD en un algoritmo eficiente y robusto para la minimización

energética y el sencillo de implementar. Este algoritmo utiliza el potencial de energía y las

fuerzas para actualizar la posición de las partículas de forma interactiva y se detiene

cuando ha realizado un numero de iteraciones determinadas por el investigador, o cuando

la fuerza máxima es más pequeña que el valor especifico. GC comparado con SD es más

eficiente cuando el sistema está cerca al mínimo energético. [77]

3.2.3 Acoplamiento de temperatura

La implementación directa de una simulación de dinámica molecular para un sistema

aislado produce un conjunto microcanonico (NVE). Sin embargo, muchas cantidades en

las que se está interesado corresponden a conjuntos canónicos (NVT). Hay varios

esquemas de acoplamiento de temperatura, Berendsen, velocidades por cambio de

escala, Andersen y el termostato de Nosé-Hoover.

EL algoritmo de Berendsen fue propuesto inicialmente en 1984 por Berendsen. [78] En

este esquema, la desviación de temperatura del valor de referencia To es corregido por la

ecuación:

𝑑𝑇

𝑑𝑡=

𝑇0−𝑇

𝑡 (Ec. 3.4)

Donde Ƭ es el parámetro de acoplamiento.

Capítulo 2 39

El algoritmo de Berendsen es simple y fácil de implementar en muchos códigos de DM. Sin

embargo, la fluctuación de la energía cinética es suprimida en el termostato de Berendsen,

lo cual significa que no se genera un correcto conjunto canónico. [68]

El termostato de velocidades por cambio de escala es una versión mejorada del termostato

Berendsen. En este esquema, un término estocástico adicional es incluido, lo cual genera

una distribución energética cinética correcta y se produce un conjunto canónico correcto.

[79] El termostato de Andersen mantiene un conjunto termostable tomando un conjunto

NVE y reevalúa periódicamente las velocidades de los átomos que son generadas por la

distribución de Maxwell-Boltzmann [80]. El termostato Nosé-Hoover [81], [82] también es

adecuado para simulaciones de conjuntos canónicos. En este esquema el hamiltoniano

del sistema es extendido por el acoplamiento de un deposito térmico (Q) y por la adición

del termino de fricción (ξ):

𝐻 = ∑𝑝𝑖

2

2𝑚𝑖+ 𝑈(𝑟1, 𝑟2, … , 𝑟𝑁) +

𝑝ξ2

2𝑄+ 𝑁𝑓𝑘𝑇ξ

𝑁

𝑖=1

(Ec. 3.5)

3.2.4 Acoplamiento de la presión

Como en el punto anterior del acoplamiento de temperatura, la presión del sistema se

puede controlar utilizando un baróstato. El algoritmo de Berensen escala los vectores y las

coordinadas atómicas cada paso, el baróstato de Parrinello-Rahman utiliza un conjunto

extendido como en el termostato de Nosé-Hoover [83], y el método de MTTK (Martyna-

Tuckerman-Tobias-Klein) que se emplea especialmente en el algoritmo de integración

paras las velocidades de Verlet. [84]



3.2.5 Condiciones periódicas de frontera (CPF)

Los efectos de frontera (la interface con el vació) de un sistema finito en simulación de DM

pueden ser minimizados por las condiciones periódicas de frontera (CPF). CPF siempre

se implementa con convención de imágenes mínima, esto regula que solo la imagen más

cercana de la partícula sea seleccionada para calcular las interacciones cercanas y no

enlazantes con otras partículas, donde se establece un punto de corte para las

interacciones cercanas. Las interacciones lejanas como las de van der Waals más allá del

punto de corte son ignoradas, mientras que las interacciones electrostáticas se recuperan

usualmente con el método Particle-Mesh-Ewald (PME). Cuando se emplea CPF el sistema

se pone dentro de una caja, la cual es copiada en cada dirección para llenar el espacio

vació. Las cajas más empleadas con cubos, dodecaedros y octaedros. [85], [86]

MM/PB(GB)SA

Describir el efecto del solvente en las simulaciones biomoleculares es importante. En DM

las moléculas de agua usualmente son representadas de forma explícita por modelos como

TIP3P, SPC, SPC/E [87] [88]. Aunque la representación explicita del solvente es realística

y precisa para simular los efectos del solvente tiene algunas deficiencias. Es difícil simular

sistemas que pueden tener transiciones estructurales significativas, como el plegamiento

de proteínas, esto debido a las altas barreras energéticas entre los diferentes mínimos

conformacionales.

MM/PBSA (Molecular Mechanics/Poisson-Boltzmann Surface Area) y MM/GBSA

(Molecular Mechanics/Generalized Born Surface Area) son métodos que en la última

década se han vuelto más empleados. En estos métodos se combinan campos de fuerza

clásicos y modelos de solvatación continua para calcular la energía libre de unión en

sistemas moleculares grandes. Los métodos MM/PB(GB)SA permiten descomponer la

Capítulo 2 41

energía libre de unión en componentes que provienen de diferentes tipos de interacción.

[89]

La energía libre de unión de la interacción de una proteína (P) y un ligando (L) se calcula

a partir de las siguientes ecuaciones:

ΔGbind = G(PL) – G(P) – G(L). (Ec. 3.6)

Donde PL es el complejo entre proteína-ligando:

G(PL) = EMM(PL) + Gsolv(PL) – TS(PL). (Ec. 3.7)

EMM(PL) = Ebonded(PL) + Enonbonded(PL). (Ec. 3.8)

Ebonded(PL) = Ebond(PL) + Eangle(PL) + Edihedral(PL). (Ec. 3.9)

Enonbonded(PL) = Eelectrostatics(PL) + EvdW(PL). (Ec. 3.10)

ΔGbind = ΔEMM + ΔGsolv + TΔS. (Ec. 3.11)

ΔEMM = ΔEbonded + ΔEelectrostatics + ΔEvdW. (Ec. 3.12)

ΔGsolv = ΔGcav + ΔGvdW + ΔGelec = ΔGSASA + ΔGPB/GB. (Ec. 3.13)

ΔGSASA = γ . SASA + β. (Ec. 3.14)

Donde EMM es la energía total en el vació, la cual tiene presente las energías enlazantes

(Ebonded) y no enlazantes (Enonbonded). Las energías enlazantes constan de la energía de

enlace (Ebond), ángulo (Eangle) y diedro (Edihedral), y las no enlazantes constan de las energías

electrostáticas (Eelectrostatics) y de van der Waals (EvdW). T es la temperatura en Kelvin, S es

la entropía conformacional, Gsolv es la energía de solvatación esta consiste de tres

componentes; Gcav genera una cavidad en el solvente para el soluto, la energa de van der



Waals (GvdW) entre el solvente y el soluto, y la energía de interacción electrostática (Gelec).

Para cálculos prácticos, los primeros dos contribuciones se aproximan como un

componente (GSASA), la cual se estima por una combinación del área superficial accesible

al solvente (SASA) y dos parámetros empíricos γ y β. La contribución electrostática se

obtiene a partir de los modelos PB o GB.

En el modelo PB el potencial electrostático se calculó a partir de la siguiente ecuación [90]:

∇[휀(𝑟)∇∅(𝑟)] = −4𝜋𝜌(𝑟) − 4𝜋λ(r) ∑ 𝑧𝑖𝑐𝑖𝑒𝑥𝑝 (−𝑧𝑖∅(𝑟)

𝑘𝐵𝑇)

𝑖

(Ec. 3.15)

Donde ε(r) es la constante dieléctrica, y ϕ(r) es el potencial electrostático, λ(r) es la función

de capa de enmascaramiento de Stern, kB es la constante de Boltzmann, y T es la

temperatura del sistema.

En el modelo GB la contribución electrostática de solvatación de la energía libre se calcula

[91]:

∇𝐺𝐺𝐵 = −1

2(1 −

1

휀) ∑

𝑞𝑖𝑞𝑗

√𝑟𝑖𝑗2 + 𝑅𝑖𝑅𝑗exp (−𝛾

𝑟𝑖𝑗2

𝑅𝑖𝑅𝑗

𝑖,𝑗

(Ec. 3.16)

Capítulo 2 43

Donde ε es la constante dieléctrica, qi es la carga parcial atómica de la partícula i, rij es la

distancia entre partículas, Ri es el efecto Born en el radio del átomo i, y γ es una constante

empírica que generalmente tiene el valor ¼.

Cuando se emplea el método MM/PB(GB)SA para calcular la energía libre de la interacción

proteína-ligando, la conformación de la proteína, el ligando y el complejo se generan a

partir de simulaciones de DM utilizando solvente explícito. [92]



4. Objetivos

Objetivo general:

Identificar potenciales inhibidores de la enzima dihidroorotato deshidrogenasa de

Leishmania spp., a través de la caracterización de las interacciones proteína-ligando por

métodos computacionales.

Objetivos específicos:

1. Priorizar complejos de alta afinidad DHODH-compuesto a partir de los resultados

de docking molecular.

2. Refinar interacciones moleculares de los compuestos contra la DHODH de

Leishmania spp. para el filtro de las mejores moléculas a través de la predicción de

energías de unión por Dinámica Molecular.

3. Determinar los mejores complejos de alta afinidad a partir del cálculo de la energía

libre de unión por medio MM/PBSA.

Capítulo 2 45

5. Materiales y Métodos

Selección de complejos DHODH-compuesto de alta afinidad

A partir del docking molecular entre la enzima DHODH y su sustrato natural, el

dihidroorotato (DHO) se determinó el punto de corte del score para la selección de ligandos

de alta afinidad. Se realizó un docking masivo contra la proteína DHODH de Leishmania

major, cuyo cristal fue obtenido del Protein Data Bank con código 3TQ0, empleando el

servidor Drug Discovery TACC del centro de computo avanzado de Texas, el cual contiene

una librería de 642000 compuestos sintéticos extraída de la base de datos ZINC, la cual

solo contiene compuestos comercialmente disponibles. En el TACC se subió el archivo

pdbqt de la proteína el cual fue preparado en autodockTools. Utilizando los mejores

resultados según el cálculo energético dado por autodock-vina el cual emplea este servidor

con un error estándar de 2.75 Kcal/mol [17] y teniendo en cuenta la energía obtenida para

el sustrato natural, se seleccionaron las mejores moléculas dadas por el docking. Con el

fin de validar el programa se realizó una comparación estructural del cristal 3GZ3 el cual

contiene ORO con el resultado del docking para el DHO. Las mejores interacciones de los

complejos seleccionados generadas entre la enzima DHODH y el respectivo compuesto

(con fines de filtrado) se realizaron empleando paquetes como autodock Tools y Pymol.

Topología de los compuestos

Para la simulación por dinámica molecular se generaron las topologías y parámetros de

los compuestos empleando el servidor web ACPYPE [93] el cual se basa en

ANTECHAMBER de Amber. Los compuestos fueron parametrizados con el campo de

fuerza GAFF (Campo de fuerza general de Amber) y las cargas fueron calculadas

empleando AM1-BCC, una aproximación semi-empirica disponible en Antechamber. Para

parametrizar todas las moléculas se cargaron los archivos pdb en el servidor de ACPYPE



especificando el campo de fuerza y el modelo semi-empirico AM1-BCC, el resultado fueron

los diferentes archivos necesarios para la simulación por dinámica molecular.

Simulación de complejos por Dinámica Molecular

Posterior a la parametrización energética de cada compuesto se tomó el complejo y se

realizaron simulaciones de dinámica molecular en condiciones isobáricas/isotérmicas

empleando el software GROMACS. Como primer paso de la simulación se creó la

topología de la proteína con el campo de fuerza AMBER99SB, posterior a esto se generó

el archivo que contenía el complejo proteína-ligando y se unieron las topologías de la

proteína, inhibidor y FMN. A partir de estos archivos se agregó como solvente al complejo

moléculas de agua en una estructura geometría dodecaedro y se agregaron iones CL y

NA para neutralizar la carga del sistema, generando así sistemas con un promedio de

40000 átomos. Ya con el sistema finalmente construido se verifico que este no presentara

una geometría inapropiada o problemas estéricos, por lo cual se sometió a un proceso de

relajación conocido como minimización energética (ME). Para esto se empleó la

minimización por el método del gradiente en 50000 pasos, para evaluar si la ME fue exitosa

se tuvieron presentes dos factores, el primero fue que el potencial energético fuera

negativo y el segundo que la fuerza máxima no fuera más grande que 1000 KJ mol-1 nm-1.

El siguiente paso fue equilibrar a 310K el solvente y los iones alrededor de la proteína,

manteniendo el número de partículas, volumen y temperatura constante (NVT), proceso

llamado isotérmico-isocórico. Este equilibrio se realizó en 100 ps, utilizando el termostato

modificado de Berendsen (V-rescale), para luego de estabilizar la temperatura del sistema

se procedió a estabilizar la presión y la densidad, el equilibrio se condujo bajo la premicia

NPT (Número de partículas, presión y temperatura son constantes) llamado isotérmico-

isobárico. El equilibrio se realizó en 100 ps a 1.05 bar y una densidad aproximada de 998.3

Kg m-3, empleando el baróstato Parrinello-Rahman. Finalizadas las dos etapas de

equilibrio, estando el sistema a la temperatura y presión adecuadas, se ejecutó una

simulación de dinámica molecular por 50 ns. En los Anexos 1-5 se muestran todos los

archivos mdp los cuales contienen el total de las condiciones de la simulación de los

sistemas en las diferentes etapas de preparación. Las estructuras promediadas en el

Capítulo 2 47

tiempo fueron utilizadas para suministrar correlaciones de MM/PBSA para la estimación

del cambio de energía libre de unión proteína-ligando [34].

Calculo de la energía de unión

A partir de la simulación obtenida por GROMACS se realizó el cálculo de la energía de

unión de los complejos. Este cálculo se realizó por el método Mecánica Molecular/Área de

superficie Poisson-Boltzmann (MM-PBSA). Para esto son necesarios tres archivos

generados en la simulación: el xtc el cual contiene las trayectorias, tpr que contiene la

estructura inicial de la simulación, la topología y todos los parámetros moleculares y ndx

contiene el conjunto de átomos del complejo, a partir de estos archivos se realizaron los

cálculos en el vacío entre la proteína y el ligando, el archivo final contiene la energía de

van der Waals, interacciones electrostáticas y la energía potencial neta de no unión.

También se calculó la energía polar de solvatación para la proteína, los compuestos y el

complejo, y por último se calculó la energía apolar de la proteína, los compuestos y el

complejo. A partir de estos tres cálculos se obtuvo la energía libre de unión empleando el

algoritmo g_mmpbsa [94], [95].

Análisis de datos

A partir de las trayectorias arrojadas por gromacs, se realizaron análisis de la estabilidad

de los complejos por RMSD de los carbonos alfa usando como punto de partida la

estructura inicial, se evaluó la fluctuación de los residuos por RMSF a partir de los carbonos

alfa de cada residuo y el comportamiento de las estructuras secundarias (hélices, laminas-

B y giros) durante los 50 ns de simulación; se determinó la variación de los puentes de

hidrógeno generados entre la proteína y los ligandos graficando el número de estos en

cada punto de la simulación, para esto se tuvo como punto de corte una distancias máxima



de 3.5 A° y el ángulo entre el donador y el aceptor se restringió a un máximo de 30°, estos

análisis se realizaron empleando GROMACS y GRACE.

6. Resultados

Complejos de alta afinidad por docking molecular

El docking molecular fue realizado en el sitio activo de la enzima (ver Figura 2) y los

parámetros de la caja de simulación fueron: coordenadas x,y,z -43.014, -35.01 y 15.233

respectivamente y un tamaño de 18 x 18 x 18 Ao para cada eje. El docking realizado al

sustrato natural se comparó con el cristal 3GZ3 con el fin de evaluar si el programa y los

parámetros empleados se ajustaban al sistema a trabajar. En la Figura 7 se ve la

comparación estructural donde se aprecia que el docking se ajusta al cristal y el RMSD

calculado es de 0.259. Empleando estos parámetros, el docking molecular se ejecutó en

los servidores de Drug Discovery TACC a partir de una de las librerías de compuestos

sintéticos disponibles en este clúster y que contiene 642.000 compuestos

aproximadamente, proceso cuyo resultado arrojó un ranking con los mejores 1000

compuestos basado en su interacción energética. De estos se tomaron los mejores cinco

compuestos predichos por el docking, cuyas propiedades fisicoquímicas y energías de

unión a la enzima se muestran en la tabla 1, destacándose que cada uno de ellos presenta

teóricamente una mayor afinidad que el sustrato natural. Todos los compuestos cumplen

la regla de Lipinski a pH fisiológico. Los ID de estos se tomaron de la base de datos ZINC,

un repositorio no comercial, de aproximadamente 35 millones de compuestos. Se encontró

que los complejos podían formar varios puentes de hidrogeno dándole estabilidad. En la

Figura 8 se muestra la posición del sustrato natural y de los compuestos 1 al 5 en el sitio

activo evidenciando las posibles interacciones polares que forman.



Figura 7. Comparación estructural del cristal 3GZ3 (café) con el resultado de Autodock vina para

DHO (Azul).

Tabla 1. Los mejores compuestos arrojados por Autodock Vina en el servidor del Drug Discovery

TACC

Compuesto score Ki – nM Átomos Donador H Aceptor H MW (g/mol)

DHO -4,2 - 11 3 6 158,112

Compuesto 1 -7 7944,774495 11 3 6 152,113

Compuesto 2 -6,9 9395,881962 11 2 6 155,089

Compuesto 3 -6,9 9395,881962 11 3 7 157,085

Compuesto 4 -6,8 11112,03318 11 1 5 153,093

Compuesto 5 -6,8 25708,30343 11 1 6 150,121

Capítulo 6 51

Figura 8. Posición en el sitio activo del sustrato y los ligandos, en naranjado se muestran las

interacciones polares, A) DHO, B) Compuesto 1 (CM1), C) Compuesto 2 (CM2), D) Compuesto 3 (CM3), E) Compuesto 4 (CM4), F) Compuesto 5 (CM5).



Estabilidad de los complejos en la simulación

6.2.1 Energía potencial y Temperatura del sistema

Se examinó la estabilidad del complejo durante la simulación, donde inicialmente se evaluó

la energía potencial y la temperatura de los sistemas en función del tiempo; la temperatura

presenta una variación de 10 Kelvin (K) cerca al valor deseado de 310K y la energía

potencial no varía significativamente en el tiempo, asegurando una simulación estable

muestran el comportamiento de ambos parámetros (Figuras 9 y 10).

Figura 9. Comportamiento de la temperatura del sistema durante la simulación, la temperatura

se da en Kelvin a) DHO, b) Compuesto 1, c) Compuesto 2, d) Compuesto 3, e) Compuesto 4, f) Compuesto 5.

Capítulo 6 53

Figura 10. Energía potencial de los diferentes complejos simulados, la energía se da en KJ/mol A)

DHO, B) Compuesto 1, C) Compuesto 2, D) Compuesto 3, E) Compuesto 4, F) Compuesto 5.



6.2.2 RMSD y RMSF de los complejos

Otro indicador de la estabilidad de los complejos durante la simulación es el RMSD. La

figura 11 muestra el comportamiento del RMSD para cada complejo en función del tiempo.

Para las seis simulaciones el estado inicial se cambia rápidamente, mostrando un aumento

del RMSD de 0,1 a 0,15 nm en los primeros 5 ns. Luego se dá una fluctuación del RMSD

para el complejo DHO-DHODHD entre 0,15 y 0,2 nm, donde se observa una tendencia a

estabilizarse. Sin embargo, para tener seguridad de que el complejo permanecía estable,

se corrió una simulación de 100ns que evidenció que el complejo se mantiene estable de

acuerdo con los valores de RMSD después de los 50ns (ver Anexo 6). Para todos

compuestos se mantiene un RMSD de 0,1 a 0,15 nm excepto por el compuesto 4 que

presenta una variación a los 40 ns que alcanzó un RMSD de 0,175. Estas pequeñas

variaciones en el RMSD para los seis complejos indican simulaciones estables.

Figura 11. Estabilidad de los complejos a partir de RMSD en función del tiempo y RMSF para cada

residuo.

Capítulo 6 55

6.2.3 Comportamiento de la estructura secundaria de DHODH

Evaluar la estabilidad de las diferentes estructuras secundarias da evidencia de la

estabilidad de la proteína cuando interactúa con diferentes ligandos. En la figura 12 se

evalúa el comportamiento de hélices, laminas y giros. Durante la simulación para cada

complejo se evidenció que los cinco compuestos y el DHO no alteran el comportamiento

de las estructuras secundarias de la proetína, por lo cual la estructura proteica se mantuvo

estable durante los 50 ns simulados.

Figura 12. Simulación de la estabilidad de la estructura secundaria de la proteína acomplejada

con el sustrato natural y cada uno de los 5 compuestos. a) DHO; b) Compuesto 1; c) Compuesto 2; d) Compuesto 3; e) Compuesto 4 y f) Compuesto 5.



Interacciones energéticas

6.3.1 Energías de Lennard-Jones y Coulomb

Para comprobar si los diferentes ligandos y el co-factor FMN están unidos de forma estable

a la proteína, se evaluaron las energías de interacción entre los ligandos, la proteína y el

co-factor FMN. En la figura 13 se muestra el comportamiento energético para cada ligando

y la proteína, en la figura 14 se ve el comportamiento de las interacciones del FMN y la

proteína en presencia de los diferentes ligandos y finalmente en la figura 15 se muestra

las interacciones entre los ligandos y el FMN. En su mayoría se observa un

comportamiento estable, exceptuando el complejo con el compuesto 2, que presenta un

comportamiento variable tanto en la energía de Lennard-Jones como para Coulomb.

En la figura 13, CM2 presenta valores cercanos a cero para ambas energías indicando

inestabilidad en la interacción DHODH-CM2. Para el complejo formado con el DHO, se

presenta un cambio a los 5 ns aproximadamente en las energías de Coulomb, pero luego

alcanza una nueva conformación estable que se conserva durante el resto de la

simulación. El compuesto 3 presenta una variación en las energías de Coulomb a los 7.5

ns alcanzando estabilidad, la cual nuevamente entre los 30 y 40 ns presenta variación,

para posteriormente volver a un estado estable.

Para las interacciones FMN-DHODH todos los complejos muestran energías negativas

tanto para Lennar-Jones como para Coulomb. El complejo que interactúa con CM1 tiene

un leve periodo de inestabilidad en la energía Coulomb en el inicio de la simulación

alrededor de los 7.5 ns, alcanzando luego un estado estable que conserva durante toda la

simulación. Para el complejo del DHO se observa un comportamiento similar al CM1 donde

en el inicio de la dinámica muestra inestabilidad de la energía de Coulomb y posterior a los

Capítulo 6 57

10 ns alcanza un estado estable que mantiene durante el resto de la simulación como se

ve en la figura 14.

En las interacciones de los ligandos y el FMN (Figura 15) se ven variaciones para DHO,

CM1, CM2, CM3 y CM4. EN DHO se observa una disminución en la energía coulomb en

los primeros 5 ns después de lo cual conserva interacciones estables, comportamiento

similar al de CM1, aunque este alcanza la estabilidad a los 3 ns. CM3 conserva un

comportamiento estable en Lennerad-Jones hasta los 27 ns donde presenta un aumento

de la energía por 10 ns recuperando estabilidad a los 40 ns y para CM2 ambas energías

presentan un valor de cero hasta los 26 ns donde por un periodo de 10 ns muestra

inestabilidad en ambas energías para posteriormente volver a un valor de cero hasta el

final de la simulación.

Figura 13. Energías no enlazantes entre la proteína y los ligandos, en negro se grafica la energía

de Lennard-Jones y en rojo la de Coulmb, a) DHO, b) Compuesto 1, c) Compuesto 2, d) Compuesto 3, e) Compuesto 4, f) Compuesto 5.



Figura 14. Comportamiento de las energías no enlazantes entre la proteína y el cofactor FMN, en

negro se grafica la energía de Lennard-Jones y en rojo la de Coulmb. a) DHO, b) Compuesto 1, c) Compuesto 2, d) Compuesto 3, e) Compuesto 4, f) Compuesto 5.

Capítulo 6 59

Figura 15. Comportamiento de las energías no enlazantes entre los ligandos y FMN, en negro se

grafica la energía de Lennard-Jones y en rojo la de Coulmb. a) DHO, b) Compuesto 1, c) Compuesto 2, d) Compuesto 3, e) Compuesto 4, f) Compuesto 5.

6.3.2 Puentes de hidrogeno entre DHODH-ligandos

Entender como los ligandos se unen al sitio activo y que tipo de interacciones se dan ayuda

a determinar que compuesto es mejor para ensayos in vitro. La presencia o ausencia de

estos enlaces se infiere por la distancia entre el aceptor y el donador y el ángulo del

Hidrógeno (H). Los grupos OH y NH son donadores mientras que oxígeno (O) y Nitrógeno

(N) aceptores en la formación de los puentes de hidrógeno [96] [62]. El comportamiento de

los puentes de H entre los ligandos y la proteína en la simulación de cada complejo es

representado en la figura 16, donde se puede observar como el DHO inicialmente forma

entre 6 a 8 puentes, y que alrededor de los 5 ns cambia a una conformación donde

mantiene entre 1 y 3 puentes de H (figura 16a). Los compuestos que más puentes de H

forman durante su simulación son CM3 y CM4 (Figuras 16d y figura 16e, respectivamente),

alcanzando puntos de hasta 8 puente de H, sobre todo con CM3. En la mayoría de la



simulación estos compuestos presentan entre 4 a 6 puentes de H. Por el contrario, el

compuesto CM5 es el que durante la dinámica mantiene un comportamiento más bajo en

el número de puentes de H que forma en promedio 2 (Figura 16f).

Figura 16. Formación de los puentes de hidrógenos de los diferentes complejos, se tomó un punto

cada 100 ps. a) DHO, b) Compuesto 1, c) Compuesto 2, d) Compuesto 3, e) Compuesto 4, f) Compuesto 5

6.3.3 Energía libre de unión por el método PBSA

Por último, se determinó la energía libre de unión de cada ligando con DHODH, para esto

se empleó el método MM/PBSA. La figura 17 muestra el comportamiento de esta energía

en cada paso de la simulación para cada ligando, evidenciando que la menor energía la

presenta el compuesto 4 (Figura 17e) y la mayor energía el compuesto 2 (Figura 17c).

Capítulo 6 61

Figura 17. Calculo de la energía libre de unión para cada ligando durante la simulación de

dinámica molecular. a) DHO, b) Compuesto 1, c) Compuesto 2, d) Compuesto 3, e) Compuesto 4, f) Compuesto 5

En la tabla 2 se muestra el promedio calculado en los 50 ns de simulación de la energía

libre de unión, van der Waals y electrostática, comprobando que durante la simulación CM4

es el ligando más estable energéticamente.

Tabla 2. Energía libre de unión, de van der Waals y electrostática de los ligandos en KJ/mol.

Ligando Energía libre de unión Van der Waals Electrostática

DHO -50.653 +/- 10.188 -78.761 +/- 9.203 -24.736 +/- 10.899

Compuesto 1 -62.805 +/- 7.782 -80.976 +/- 7.070 -13.061 +/- 3.237

Compuesto 2 -36.521 +/- 11.959 -70.587 +/- 11.340 -48.034 +/- 8.962

Compuesto 3 -78.440 +/- 19.947 -88.093 +/- 13.800 -304.333 +/- 51.017

Compuesto 4 -93.180 +/- 15.830 -80.418 +/- 9.838 -325.150 +/- 22.740

Compuesto 5 -55.721 +/- 31.163 -80.870 +/- 28.834 -12.620 +/- 5.968



A partir del cálculo de las diferentes energías por MM/PBSA, se graficó la contribución de

cada residuo de la enzima a la energía libre de unión. La grafica 18 muestra esta energía

para cada complejo simulado, donde los compuestos CM3 y CM4 (Figuras 18d y 18e),

respectivamente, evidencia que son los compuestos que generan una mayor estabilidad

energética en el sitio activo, ya que la contribución de los residuos en estos son las

menores, alcanzando valores de – 31 KJ/mol.

Interacciones especificas

A partir de las trayectorias generadas para cada complejo se determinó el comportamiento

de los átomos que podían formar interacciones de los compuestos con respecto a átomos

Figura 18. Contribución energética de cada residuo a la energía libre de unión con el ligando. a)

DHO, b) Compuesto 1, c) Compuesto 2, d) Compuesto 3, e) Compuesto 4, f) Compuesto 5.

CM1 CM2

CM3 CM4 CM5

CYS131 PRO132

ASN68

MET70

CYS131

LYS44

MET70

ASN68

LEU72

LYS165

GLU126

ASN68

ASN133

LYS44

LYS165

GLU126

ASN133

CYS131

ASN133

PRO132

CYS131

LYS44

LYS165

GLU126

LEU72

DHO

LEU72

a b c

d e f

Capítulo 6 63

de la proteína. Esto se evaluó mirando la variación en la distancia entre estos átomos,

permitiendo establecer que tan estable puede ser la interacción presentada. Para el CM1

se tomaron 3 átomos, CM2 4 átomos, CM3 1 átomo, CM4 5 átomos y para CM5 4 átomos,

átomos que probablemente podrían formar puentes de hidrogeno, donde el oxígeno es O,

hidrógeno H y nitrógeno N. Las figuras 19 a la 23 muestran la variación en la distancia de

estos átomos.

Figura 19. Distancia entre los residuos ASN68, ASN128, CYS131, ASN133 Y ASN195 a CM1. Se evaluó la distancia entre los residuos y átomos específicos de CM1, las flechas rojas indican que la distancia entre esos átomos es lo suficientemente grande para que no se formen puentes de hidrogeno, las flechas azules indican que la distancia entre esos átomos permitiría la formación de puentes de hidrogeno.



Figura 20. Distancia entre los residuos GLY71, LEU72, ASN128, ASN133 Y ASN195 a CM2. Se evaluó la distancia entre los residuos y átomos específicos de CM2, las flechas rojas indican que la distancia entre esos átomos es lo suficientemente grande para que no se formen puentes de hidrogeno, las flechas azules indican que la distancia entre esos átomos permitiría la formación de puentes de hidrogeno

Capítulo 6 65

Figura 21. Distancia entre los residuos LYS44, GLY71, LEU71, ASN68, ASN128 Y ASN195 a CM3. Se evaluó la distancia entre los residuos y átomos específicos de CM3, las flechas rojas indican que la distancia entre esos átomos es lo suficientemente grande para que no se formen puentes de hidrogeno, las flechas azules indican que la distancia entre esos átomos permitiría la formación de puentes de hidrogeno.



Figura 22. Distancia entre los residuos LYS44, MET70, GLY71, LEU72, ASN128, CYS131, ASN133 Y ASN195 a CM4. Se evaluó la distancia entre los residuos y átomos específicos de CM4, las flechas rojas indican que la distancia entre esos átomos es lo suficientemente grande para que no se formen puentes de hidrogeno, las flechas azules indican que la distancia entre esos átomos permitiría la formación de puentes de hidrogeno.

Capítulo 6 67

Figura 23. Distancia entre los residuos ASN68, ASN133 Y ASN195 a CM5. Se evaluó la distancia entre los residuos y átomos específicos de CM5, las flechas rojas indican que la distancia entre esos átomos es lo suficientemente grande para que no se formen puentes de hidrogeno, las flechas azules indican que la distancia entre esos átomos permitiría la formación de puentes de hidrogeno.



7. Discusión

La enzima DHODH cumple un rol importante en la biosíntesis de novo de pirimidinas,

participando en el cuarto paso de esta ruta metabólica, la oxidación mediada de ubiquinona

de dihidroorotato a orotato. Diferentes estudios han mostrado lo crucial de esta proteína

en la supervivencia de los tripanosomas entre ellos Leishmania y Trypanosoma, e incluso

en otros parásitos; en experimentos donde se realizó gen knockout, se observa la perdida

de la capacidad de infección in vitro e in vivo de Trypanosoma cruzi y Plasmodium

falciparum [11], [97]

Dada la importancia o esencialidad de esta proteína en el parasito Leishmania, ésta fue

incluida en un tamizaje masivo de moléculas empleando docking. Los resultados del

docking inicial mostraron que muchas moléculas se unían con unos buenos valores de

energía libre. Sin embargo, aunque el docking ha sido una herramienta importante en el

descubrimiento de muchas moléculas que hoy día se comercializan para el tratamiento de

varias enfermedades [19], [98], [99], se conoce que la función de asignación de puntaje

aún tiene inconvenientes [17]. Por eso en este proyecto se pretendió priorizar o refinar

aún más cuales moléculas de las obtenidas por docking y que se unían a DHODH podrían

tener mejor energía de unión empleando mecánica molecular para ser evaluadas en

ensayos in vitro e in vivo. El docking en nuestro caso se corrió manteniendo el cofactor

FMN, en el sitio activo ya que este es necesario para la reacción en condiciones biológicas

[32] [10]. Debido a que el cristal de la proteína traía el cofactor, se procedió a preparar la

estructura de la proteína para el docking sin eliminar este cofactor. Esto ayudo a buscar

un inhibidor más específico para esta proteína ya que solo un limitado grupo de ligandos

con estructura similar a pirimidinas o purinas es capaz de entrar al sitio activo [10], [32].

Con base en los valores de energía de unión se seleccionaron los mejores ligandos, los

cuales tienen un peso molecular bajo y estructuras similares a las pirimidinas y purinas

(Figura 8). La energía calculada por Autodock Vina para el sustrato natural, el DHO, fue

de -4.2 Kcal/mol y esta se usó como referente para el filtro de los compuestos. Los

compuestos obtuvieron energía más negativa que el sustrato (Tabla 1) indicando una

Capítulo 6 69

mayor afinidad por la enzima, haciéndolos buenos candidatos para competir por el sitio

activo e inhibir la actividad enzimática de la DHODH.

Con el fin de asegurar un buen cálculo de la energía libre de unión entre los ligandos y la

proteína se evaluó la estabilidad de la simulación. Para asegurar que el sistema presentaba

una buena estabilidad se evaluaron varios parámetros como la energía potencial y

temperatura del sistema, el comportamiento de las estructuras secundarias durante la

simulación, el RMSD y RMSF, normalmente empleados en estos análisis [68]. La energía

potencial fue graficada para cada complejo en función del tiempo y como se muestra en la

figura 10, esta no varía significativamente para ninguno de los complejos. La temperatura

del sistema se estableció a 310K para la simulación, y se observó una variación de +/- 5 K

siendo una fluctuación mínima durante la dinámica molecular como se observa en la figura

9. Ambas mediciones presentaron un comportamiento deseable para el sistema,

asegurando inicialmente una simulación estable de los complejos, lo cual permite

establecer las condiciones iniciales adecuadas para el sistema en el procesos de

simulación[19], [88].

Antes de proceder con los análisis de interacción proteína-ligando se realizaron medidas

de estabilidad del sistema durante la simulación, que permitieron una depuración más

eficiente de los datos obtenidos para los complejos [68]. Como indicador de la estabilidad

de la proteína durante la dinámica molecular se evaluó el RMSD y RMSF en función del

tiempo (Figura 11). El RMSD en los seis complejos deja el estado inicial rápidamente

viéndose un aumento entre 0,1 a 0,125 nm para todos los complejos en los primeros 2 ns.

La conformación para el complejo con DHO es el que más variación presenta con un

comportamiento ente 0,15 a 0,2 nm, aunque simulación hasta los 100ns mostró que la

interacción de la DHO con la proteína se estabilizó. Para los cinco complejos, DHODH-

compuestos, el comportamiento fluctuó entre 0,1 y 0,15 nm con un incremento a los 40 ns

por encima de 0,15 nm para el complejo 4. Sin embargo, estas variaciones son mínimas e

indican que la proteína se mantiene estable durante la dinámica molecular con los

diferentes ligandos, lo cual indica que los complejos formados no se disocian durante la

simulación, mostrando una alta afinidad de los ligandos en el sitio activo, como sea

verificado en diferentes estudios de simulaciones proteína-ligando [100], [101].



La figura 11b muestra la flexibilidad de cada residuo durante los 50 ns simulados, indicando

cuales presentan un mayor desplazamiento. La mayor flexibilidad la presentan los residuos

del 50 a 60, 100 a 110, 130 a 140 y del 200 al 210. Esto concuerda con los resultados

mostrados en la figura 24, donde se puede observar que estas regiones son poco

estructuradas en la proteína, explicando este desplazamiento en estos residuos, como se

ha mencionado en estudios relacionados a proteínas con regiones poco estructuradas,

donde estas muestran una mayor tasa de desplazamiento durante la simulación [101]. Dos

de estas zonas flexibles contienen residuos que interactúan en el sitio activo con los

ligandos, lo cual puede estar asociado a variaciones energéticas en algunos complejos.

Aunque se presentan regiones flexibles, la enzima muestra un comportamiento estable de

los residuos en la dinámica molecular para cada complejo.

Figura 24. Comparación del RMSF con la estructura proteica, evidenciando que las regiones más

flexibles pertenecen a zonas no estructuradas de la enzima.

Capítulo 6 71

A partir de las interacciones de Lennard-Jones (LJ) y Coulomb se evaluó la estabilidad

energética entre los ligandos, la proteína y el FMN, lo cual permitió realizar optimizaciones

en los ligandos mejorando su capacidad inhibidora como se mostró en la búsqueda de

inhibidores para CDK2 [102]. Las figuras 13, 14 y 15 muestran que el total de las energías

fueron negativas con fluctuaciones en algunos casos. La energía coulombica es más

negativa para los complejos CM3 y CM4 figura 13 (d, e) respectivamente, indicando que

estos ligandos están más cerca de los residuos del sitio activo, aunque para CM3 se ven

fluctuaciones que pueden darse debido a la movilidad que presenta el residuo ASN133

como se ve en la figura 17a. Para CM4 la variación solo se presenta al inicio de la

simulación, lo puede sercausado por el residuo Lys44 al moverse a una nueva

configuración estable, residuo que ha mostrado ser importante en las interacciones de

ligandos con DHODH [10]. Para el DHO la energía coulomb inicia siendo más negativa que

LJ perdiendo energía de interacción a los 5 ns de la simulación (figura 13A), posiblemente

debido al residuo Cys131 que cambia su conformación alejándose de DHO, y se conserva

durante el resto de la simulación. CM2 presenta las interacciones más inestables ya que

durante la mayoría de la simulación tanto la energía de Lennard-Jones y Coulomb se

mantienen muy cerca a cero y de los 35 a 40 ns son cero, esto puede darse a causa de

que los residuos Met70, Cys131 y Asn133 se alejan de CM2, indicando que las

fluctuaciones en estos residuos generan inestabilidad en las interacciones. Para CM1 y

CM5 no hay fluctuaciones significativas mostrando que las interacciones en el sitio activo

se mantienen estables durante la simulación.

La Figura 14 muestra el comportamiento de las energías entre el FMN y la proteína en

presencia de los diferentes ligandos. La fluctuación en los primeros 7 ns del FMN en

complejo con CM1 (Figura 14b) puede deberse a los cambios geométricos que presentaron

los residuos MET70, SER45, THR273 y TYR59. Para el CM4 la fluctuación se presenta

después de los 5 ns (Figura 14e); este cambio energético puede darse a causa de una

reorganización del ligando en el sitio activo cambiando las interacciones con la Ser100 y

la Cys131 a un nuevo estado geométrico estable.



En la figura 15 se ve el comportamiento energético de la interacción de los ligandos con el

co-factor FMN, donde la interacción más inestable la presenta el CM2, la cual durante la

mayoría de la simulación toma valores energéticos de cero, comportamiento que es debido

probablemente a la distancia entre las dos moléculas, la cual es suficiente para que no se

generen interacciones energéticas entre ellas, aunque por un corto periodo de tiempo

(entre los 26 y 36 ns) se logran acercar mostrando una interacción inestable que se pierde

antes de los 40 ns, volviendo a la configuración inicial. CM3 y FMN muestra una fluctuación

en su interacción energética entre los 30 y 36 ns, esto debido a que el compuesto se mueve

alejándose del FMN haciendo que se pierdan interacciones entre ellos.

Como parte del análisis de las diferentes interacciones entre el ligando y la proteína se

evaluó el comportamiento de los puentes de hidrogeno formados entre estos. Como se

observa en la figura 16, los diferentes ligandos presentan variaciones en el número de

puentes que forman con la proteína. El CM4 es el compuesto con más interacciones a lo

largo de la simulación, mientras que los que menos presentan son el DHO, CM1 y el CM5

como se ve en la figura 16a, 16b y 16f, respectivamente. Este comportamiento en estas

interacciones ayuda a explicar las variaciones de las energías no enlazantes, ya que en

los tres últimos ligandos mencionados antes los valores energéticos son los más altos,

comportamiento similar al mostrado en otros estudios de DHODH, donde los ligandos que

interactúan por medio de puentes de hidrógeno con los residuos principales en el sitio

activo, dan una mayor estabilidad a los complejos [10], [44]. El CM3 muestra una

disminución entre los 30 y 40 ns, lo cual lo explica la variación que se presenta en la

energía de coulomb (Figura 13d). CM2 a pesar de las inestables interacciones no

enlazantes mencionadas anteriormente mantiene en la mayoría de la simulación entre 3 a

4 puentes de hidrógeno.

A partir de las trayectorias de los complejos se realizó un análisis de la estabilidad en las

interacciones entre los átomos de los compuestos con residuos específicos de la proteína,

lo cual permitió dar una visión más específica del comportamiento y estabilidad estructural

de estos en el sitio activo. Las figuras 19 a la 23 muestran este análisis para cada

compuesto, evidenciando la importancia de los residuos N68, N133 N195 y K44, ya que la

Capítulo 6 73

mayoría de los compuestos interactúan con ellos, mostrando estabilidad en la distancia a

lo largo de la simulación, residuos que ademas han sido reportados como relevantes en la

búsqueda y diseño de inhibidores para DHODH en Leishmania [10]. Estos resultados

permitiran proponer modificaciones en los diferentes compuestos con el fin de optimizar su

interacción en el sitio activo, para volverlos más afines a la enzima y así obtener una mayor

capacidad inhibidora. Estas modificaciones que se pueden realizar en los compuestos no

solo se limitan a estos cuatro residuos ya que el sitio activo dispone de otros residuos como

L72, N128, C131 y G71 que permiten optimizar la capacidad inhibidora de estos [10], [32].

Finalmente, se implementó la metodología MM/PBSA a las trayectorias arrojadas por la

dinámica molecular para calcular la energía libre de unión de los diferentes complejos, y

predecir cuál de los compuestos tiene mejor interacción con DHODH. Esta metodología ha

permitido realizar un cálculo más preciso en las interacciones proteína-ligando en la

búsqueda de inhibidores contra otros agentes infecciosos como Plasmodium falciparum

[99]. Las energías predichas por esta metodología muestran discordancia en el rango dado

por el docking, comparando los compuestos con el DHO. Como se ve en la tabla 2, el

compuesto con mejor energía es el CM4 con un valor de -93.180 KJ/mol y el único que

presenta una energía mayor al DHO (-50.653 KJ/mol) es el CM2 con -36.521 KJ/mol. Como

muestra la figura 17e, CM4 presenta la mayor contribución energética entre los residuos

del sitio activo y el compuesto, lo que explica la alta afinidad de este por DHODH y lo hace

un buen candidato para el diseño de un inhibidor. Por el contrario, de los cinco compuestos

evaluados, CM2 que es el que mayor energía presenta (figura 17c), es el compuesto con

menos interacciones favorables con el sitio activo, haciéndolo el menos indicado para

evaluarlo como un potencial inhibidor de la DHODH.

Esta metodología permitió generar un nuevo ranking entre los ligandos, lo cual aumenta la

probabilidad de éxito en la búsqueda de inhibidores, como se ha visto en otros estudios en

diferentes sistemas [103][104][105][106][107].

8. Conclusiones

A partir de la metodología implementada en esta tesis se logró estudiar las interacciones

generadas entre los ligandos y DHODH junto al cofactor FMN. Esto generó un ranking de

los compuestos del más efectivo al menos efectivo: CM4 > CM3 > CM1 > CM5 > CM2,

permitiendo determinar que de los cinco complejos estudiados solo el ligando CM2 no

mostró una afinidad favorable descartándolo como potencial inhibidor. Por el contrario CM4

es el compuesto con mejor comportamiento energético en el sitio activo haciéndolo viable

para el diseño de un nuevo inhibidor. Este estudio también logro identificar los residuos

más relevantes en el sitio activo, lo cual amplía las posibilidades de diseñar nuevos

inhibidores más efectivos para esta enzima la cual es esencial para la supervivencia del

parasito.

9. sugerencias

Como proyecciones de este trabajo se sugiere realizar simulaciones de permeabilidad de

las moléculas. También realizar simulaciones de dinámica molecular y MM/PBSA a más

compuestos de los arrojados por el servidor TACC. Con el fin de validar los resultados acá

obtenidos se sugiere evaluar in vitro los cinco compuesto como potenciales inhibidores de

DHODH.

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no. 10, pp. 2271–2278, 2018.

[99] M. Thillainayagam, K. Malathi, and S. Ramaiah, “In-Silico molecular docking and

simulation studies on novel chalcone and flavone hybrid derivatives with 1, 2, 3-

triazole linkage as vital inhibitors of Plasmodium falciparum dihydroorotate

dehydrogenase,” J. Biomol. Struct. Dyn., vol. 1102, no. November, pp. 1–17, 2017.

[100] H. Mohamadnejhadi, A. Beiramzadeh, M. Shadman Lakmehsari, K. Khalifeh, and

E. Heshmati, “Temperature dependent dynamics in highly homologous adenylate

kinases,” J. Biomol. Struct. Dyn., vol. 0, no. 0, pp. 1–24, 2018.

[101] M. Pola, S. B. Rajulapati, C. Potla Durthi, R. R. Erva, and M. Bhatia, “In silico

modelling and molecular dynamics simulation studies on L-Asparaginase isolated

from bacterial endophyte of Ocimum tenuiflorum,” Enzyme Microb. Technol., vol.

117, no. June, pp. 32–40, 2018.

[102] V. Bazgier, K. Berka, M. Otyepka, and P. Banáš, “Exponential repulsion improves

structural predictability of molecular docking,” J. Comput. Chem., vol. 028, pp.

2485–2494, 2016.

[103] L. C. Martins, P. H. M. Torres, R. B. de Oliveira, P. G. Pascutti, E. A. Cino, and R.

S. Ferreira, “Investigation of the binding mode of a novel cruzain inhibitor by

docking, molecular dynamics, ab initio and MM/PBSA calculations,” J. Comput.

Aided. Mol. Des., vol. 32, no. 5, pp. 591–605, 2018.

[104] P. Pandey, A. M. Lynn, and P. Bandyopadhyay, “Identification of inhibitors against

α-Isopropylmalate Synthase of Mycobacterium tuberculosis using docking-

MM/PBSA hybrid approach,” Bioinformation, vol. 13, no. 05, pp. 144–148, 2017.

[105] Z. Yang, F. Wu, X. Yuan, L. Zhang, and S. Zhang, “Novel binding patterns between

ganoderic acids and neuraminidase: Insights from docking, molecular dynamics

and MM/PBSA studies,” J. Mol. Graph. Model., vol. 65, pp. 27–34, 2016.

[106] Y. Xu, T. Zhang, and M. Chen, “Combining 3D-QSAR, docking, molecular

dynamics and MM/PBSA methods to predict binding modes for nonsteroidal


selective modulator to glucocorticoid receptor,” Bioorganic Med. Chem. Lett., vol.

19, no. 2, pp. 393–396, 2009.

[107] S. Genheden and U. Ryde, “The MM/PBSA and MM/GBSA methods to estimate

ligand-binding affinities,” Expert Opin. Drug Discov., vol. 10, no. 5, pp. 449–461,

2015.

Bibliografía 87

10. Anexos

10.1 Anexo 1

; ions.mdp - used as input into grompp to generate ions.tpr

; Parameters describing what to do, when to stop and what to save

integrator = steep ; Algorithm (steep = steepest descent

minimization)

emtol = 1000.0 ; Stop minimization when the maximum force <

1000.0 kJ/mol/nm

emstep = 0.01 ; Energy step size

nsteps = 50000 ; Maximum number of (minimization)

steps to perform

; Parameters describing how to find the neighbors of each atom and

how to calculate the interactions

nstlist = 1 ; Frequency to update the neighbor list

and long range forces

ns_type = grid ; Method to determine neighbor

list (simple, grid)

rlist = 1.0 ; Cut-off for making neighbor list (short

range forces)

coulombtype = PME ; Treatment of long range electrostatic

interactions

rcoulomb = 1.0 ; Short-range electrostatic cut-off

rvdw = 1.0 ; Short-range Van der Waals cut-off

pbc = xyz ; Periodic Boundary Conditions (yes/no)

Parámetros para generar una descripción atómica del sistema y obtener los

archivos necesarios para la simulación.


10.2 Anexo 2

; minim.mdp - used as input into grompp to generate em.tpr

; Parameters describing what to do, when to stop and what to save

integrator = steep ; Algorithm (steep = steepest descent

minimization)

emtol = 1000.0 ; Stop minimization when the maximum force <

1000.0 kJ/mol/nm

emstep = 0.01 ; Energy step size

nsteps = 50000 ; Maximum number of (minimization)

steps to perform

; Parameters describing how to find the neighbors of each atom and

how to calculate the interactions

nstlist = 1 ; Frequency to update the neighbor list

and long range forces

ns_type = grid ; Method to determine neighbor

list (simple, grid)

rlist = 1.0 ; Cut-off for making neighbor list (short

range forces)

coulombtype = PME ; Treatment of long range electrostatic

interactions

rcoulomb = 1.0 ; Short-range electrostatic cut-off

rvdw = 1.0 ; Short-range Van der Waals cut-off

pbc = xyz ; Periodic Boundary Conditions (yes/no)

Parámetros establecidos para la minimización energética del sistema, empleando

el algoritmo steepest descent.

10.3 Anexo 3

title = termostato

define = -DPOSRES ; position restrain the protein

; Run parameters

integrator = md ; leap-frog integrator

nsteps = 50000 ; 2 * 50000 = 100 ps

dt = 0.002 ; 2 fs

; Output control

nstxout = 100 ; save coordinates every 0.2 ps

nstvout = 100 ; save velocities every 0.2 ps

Bibliografía 89

nstenergy = 100 ; save energies every 0.2 ps

nstlog = 100 ; update log file every 0.2 ps

; Bond parameters

continuation = no ; first dynamics run

constraint_algorithm = lincs ; holonomic constraints

constraints = all-bonds ; all bonds (even heavy atom-H

bonds) constrained

lincs_iter = 1 ; accuracy of LINCS

lincs_order = 4 ; also related to accuracy

; Neighborsearching

ns_type = grid ; search neighboring grid cells

nstlist = 5 ; 10 fs

rlist = 1.0 ; short-range neighborlist cutoff (in nm)

rcoulomb = 1.0 ; short-range electrostatic cutoff (in nm)

rvdw = 1.0 ; short-range van der Waals cutoff (in nm)

; Electrostatics

coulombtype = PME ; Particle Mesh Ewald for long-range

electrostatics

pme_order = 4 ; cubic interpolation

fourierspacing = 0.16 ; grid spacing for FFT

; Temperature coupling is on

tcoupl = V-rescale ; modified Berendsen thermostat

tc-grps = Protein Non-Protein ; two coupling groups - more

accurate

tau_t = 0.1 0.1 ; time constant, in ps

ref_t = 300 300 ; reference temperature, one for each

group, in K

; Pressure coupling is off

pcoupl = no ; no pressure coupling in NVT

; Periodic boundary conditions

pbc = xyz ; 3-D PBC

; Dispersion correction

DispCorr = EnerPres ; account for cut-off vdW scheme

; Velocity generation

gen_vel = yes ; assign velocities from Maxwell

distribution

gen_temp = 300 ; temperature for Maxwell distribution

gen_seed = -1 ; generate a random seed

Parámetros empleados en el acoplamiento de temperatura empleando el

termostato modificado de Berendsen


10.4 Anexo 4

title = barostato

define = -DPOSRES ; position restrain the protein

; Run parameters

integrator = md ; leap-frog integrator

nsteps = 50000 ; 2 * 50000 = 100 ps

dt = 0.002 ; 2 fs

; Output control

nstxout = 100 ; save coordinates every 0.2 ps

nstvout = 100 ; save velocities every 0.2 ps

nstenergy = 100 ; save energies every 0.2 ps

nstlog = 100 ; update log file every 0.2 ps

; Bond parameters

continuation = yes ; Restarting after NVT



bonds) constrained



; Neighborsearching


nstlist = 5 ; 10 fs




; Electrostatics


electrostatics






accurate



group, in K

; Pressure coupling is on

pcoupl = Parrinello-Rahman ; Pressure coupling on in

NPT

pcoupltype = isotropic ; uniform scaling of box vectors

tau_p = 2.0 ; time constant, in ps

ref_p = 1.0 ; reference pressure, in bar

compressibility = 4.5e-5 ; isothermal compressibility of water,

bar^-1

refcoord_scaling = com


pbc = xyz ; 3-D PBC

Bibliografía 91




gen_vel = no ; Velocity generation is off

Parámetros empleados en el acoplamiento de presión empleando el baróstato de Parrinello-Rahman

10.5 Anexo 5

title = OPLS Lysozyme MD

; Run parameters

integrator = md

tinit = 0 ; Starting time

dt = 0.002 ; 2 femtosecond time step for

integration

nsteps = 25000000 ; Make it 10 ns

; Output control

nstxout = 100000 ; Writing full precision

coordinates every nanosecond

nstvout = 100000 ; Writing velocities every

nanosecond

nstxtcout = 1000 ; Writing coordinates every 5

ps

nstenergy = 1000 ; Writing out energy

information every step

nstlog = 1000 ; Writing to the log file every

step

energygrps = a_1-3307 a_3308-3580

; Bond parameters

continuation = yes ; Restarting after NPT



bonds) constrained



; Neighborsearching


nstlist = 5 ; 10 fs





; Electrostatics


electrostatics






accurate



group, in K

; Pressure coupling is on

pcoupl = Parrinello-Rahman ; Pressure coupling on in

NPT

pcoupltype = isotropic ; uniform scaling of box vectors

tau_p = 2.0 ; time constant, in ps

ref_p = 1.0 ; reference pressure, in bar

compressibility = 4.5e-5 ; isothermal compressibility of water,

bar^-1


pbc = xyz ; 3-D PBC




gen_vel = no ; Velocity generation is off

comm_grps = protein

Parámetros empleados para ejecutar una simulación de 50 ns de los 6 sistemas.

Bibliografía 93

10.6 Anexo 6

Simulación por 100 ns del complejo con el sustrato natural. Se comprueba que el

complejo alcanza la estabilidad a los 50 ns.

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