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BUSQUEDA DE GENES CODIFICADORES DE LIPASAS EN UNA BIBLIOTECA METAGENOMICA DE SUELO DE BOSQUE ALTO ANDINO MEDIANTE PCR

Andrés Anghelo Castelblanco Velandia

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial para optar por el título de

MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

DIRECTOR

José Salvador Montaña Lara MSc

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTADO DE CIENCIAS

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Bogotá, D.C.

2011

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BUSQUEDA DE GENES CODIFICADORES DE LIPASAS EN UNA BIBLIOTECA METAGENOMICA DE SUELO DE BOSQUE ALTO ANDINO MEDIANTE PCR

Andrés Anghelo Castelblanco Velandia

APROBADO

INGRID SCHULER Ph.D JANETH ARIAS M. Sc

Decana académica Directora de Carrera

BUSQUEDA DE GENES CODIFICADORES DE LIPASAS EN UNA BIBLIOTECA METAGENOMICA DE SUELO DE BOSQUE ALTO ANDINO MEDIANTE PCR

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Andrés Anghelo Castelblanco Velandia

APROBADO

__________________________

José Salvador Montaña MSc

Director

__________________________

Ziv Arbeli PhD

Jurado

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Tabla de Contenido

1. RESUMEN………………………………………………………………………………..6

2. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………......7

3. JUSTIFICACIÓN – PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA…………………............7

4. MARCO TEÓRICO

4.1 Enzimas lipolíticas………………………………………………………………….8

4.2 Bioprospección de enzimas lipolíticas……………………………………………8

4.3 Tamizaje por secuencia………………………………………………………......10

4.4 Ambientes extremos como reservorio de enzimas…………………………......11

4.5 Antecedentes……………………………………………………………………….11

5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo General……………………………………………………………………11

5.2 Objetivos Específicos.......................................................................................11

6. METODOLOGÍA

6.1 Optimización de la PCR………………..…………………………………………12

6.2 Tamizaje de la Biblioteca…………………………………………………………12

6.3 Clonación de bandas purificadas………………………………………………..14

6.4 Subclonación………………………………………………………………………..14

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

7.1 Optimización de la PCR…………………………………………………………15

7.2 Tamizaje de la Biblioteca……………………………………………………….16

7.3 Subclonación……………………………………………………………………..19

8. CONCLUSIONES………………………………………………………………………...22

9. RECOMENDACIONES………………………………………………………………….22

10. REFERENCIAS…………………………………………………………………………..23

11. ANEXOS…………………………………………………………………………………..26

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1. Resumen Con el fín de buscar genes codificadores de lipasas, se llevó a cabo el tamizaje de una biblioteca metagenómica de suelo de bosque alto andino (BAA) construída en el vector fósmido PCC1-Fos utilizando una aproximación basada en secuencia. Inicialmente se llevó a cabo la optimización de las condiciones de PCR empleando iniciadores degenerados previamente diseñados con base en regiones conservadas de enzimas lipolìticas caracterizadas. Para esto, se evaluaron diferentes concentraciones de ADN molde, MgCl2 e iniciadores y varias temperaturas de anillamiento de los iniciadores. La biblioteca metagenómica fue tamizada inicialmente con dos parejas de oligonucleótidos a través de dos rondas de amplificación, adicionalmente a la banda de interés (250pb) se observaron bandas de tamaños superiores hasta 1000pb lo cual se debe al grado de degeneración de los iniciadores. Se seleccionaron bandas entre los 250pb - 600pb y fueron purificadas y clonadas en los vectores pCR2.1 y pGEM®-T Easy y los plásmidos recombinados fueron transformados en células de E. coli para su posterior secuenciación. A partir de los resultados obtenidos en el tamizaje por PCR se construyeron 3 bibliotecas de insertos pequeños y se identificaron 3 clones (ClipF1, ClipF2, ClipF3) que mostraron actividad lipolítica en agar Luria Bertani con tributirina 1% como sustrato lipídico, después de la incubación a 4oC. Teniendo en cuenta que la temperatura promedio registrada en el suelo del bosque alto Andino en el momento del muestreo fue de (10oC) y que la hidrólisis del substrato ocasionada por los clones identificados en este trabajo se evidenció luego de la incubación a baja temperatura, se puede sugerir que los clones contienen secuencias que codifican por lipasas adaptadas a bajas temperaturas. Se recomienda realizar análisis de las secuencias clonadas con el fin de caracterizar los genes y ensayos de expresión adicionales.

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2. Introducción

Las lipasas son biocatalizadores que poseen propiedades bioquímicas particulares por lo que son ampliamente utilizadas en procesos industriales. Debido a la demanda constante de enzimas, la bioprospección de lipasas es un tema de importancia e interés para el sector biotecnológico. La identificación de estas enzimas estaba basada en métodos dependientes de cultivo, los cuales presentan limitaciones ya que solo permiten acceder a una fracción mínima de la diversidad microbiana. La metagenómica ha surgido en la última década como una nueva alternativa para el estudio de la diversidad y búsqueda de biomoléculas de interés biomédico e industrial. Por tratarse de una aproximación independiente de cultivo, permite tener acceso a toda la información genética presente en una muestra, de esta manera la metagenómica ha permitido identificar nuevos biocatalizadores, antibióticos y metabolitos con potencial biotecnológico. En el presente trabajo se propone el uso de una aproximación metagenómica basada en secuencia para identificar posibles genes que codifiquen enzimas lipolíticas en una biblioteca metagenómica de suelo de bosque alto andino. El propósito de implementar esta metodología es evitar los inconvenientes que se suelen presentar con los otros métodos de tamizaje de un metagenoma, los cuales limitan la identificación de nuevos genes que codifiquen alguna biomolécula de interés. Adicionalmente el tamizaje por secuencia es de gran utilidad cuando se buscan nuevos miembros de proteínas ampliamente conocidas como es el caso de las enzimas lipolíticas, de esta manera se puede crear una colección de enzimas similares pero con diferencias en sus propiedades biológicas para que puedan ser utilizadas en procesos industriales que requieran condiciones específicas. El tamizaje de una biblioteca proveniente de un ambiente extremo, permitiría identificar enzimas novedosas que posean características catalíticas particulares y que representen alguna utilidad industrial en el futuro.

3. Justificación y Planteamiento del Problema Las lipasas son enzimas útiles para diferentes sectores de la biotecnología, como el farmacéutico, alimentario, ambiental, industrial y químico, por esta razón, existe una demanda creciente por identificar nuevas enzimas lipolíticas para el desarrollo de bioprocesos. Los métodos tradicionales de identificación de enzimas se basan en métodos dependientes de cultivo con los cuales solo ha sido posible cultivar el <1% de los microorganismos, limitando la identificación de nuevas biomoléculas La metagenómica ha mostrado ser una alternativa efectiva para la identificación de nuevas moléculas de interés (enzimas, antibióticos, anti-tumorales, etc.), debido a que evita el sesgo del cultivo de los microorganismos y permite acceso a todo el contenido genético presente en una muestra.

Los ambientes extremos son ecosistemas poco explorados, los cuales por sus características físico-químicas representan una diversidad taxonómica y metabólica particular. El estudio de estos ecosistemas ha aportado información importante referente a biodiversidad, evolución, ciclos biogeoquímicos así como de enzimas útiles para la industria, por esta razón la bioprospección de estos ecosistemas es importante tanto para el sector académico como para el biotecnológico. El Bosque Alto Andino (BAA) es un ecosistema en el que predominan bajas temperaturas (9-16°C), por lo que es considerado un ambiente extremo psicrófilo. La diversidad en este ecosistema ha sido poco investigada por lo que la bioprospección en este ambiente es importante tanto para caracterizar la biodiversidad como en la identificación de enzimas con alguna utilidad biotecnológica.

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Con el presente trabajo se busca identificar en una biblioteca metagenómica de suelo de BAA genes que codifiquen enzimas lipolíticas como estudio enmarcado en la caracterización de biodiversidad y bioprospección de recursos genéticos que se está realizando actualmente el Centro de Genómica y Bioinformática de Ambientes Extremos (GeBiX) en el Parque Nacional de los Nevados. Para esto, se desea implementar una estrategia metagenómica basada en secuencia mediante PCR con iniciadores degenerados con el fin de evitar las limitaciones del tamizaje funcional. Adicionalmente, existen numerosos reportes sobre clonación e identificación de nuevas enzimas lipolíticas basadas en PCR, lo que demuestra que esta aproximación es una alternativa efectiva en la identificación de nuevas enzimas.

4. Marco Teórico

4.1 Enzimas Lipolíticas

Actualmente existe una creciente demanda por identificar nuevas biomoléculas de utilidad biotecnológica para el desarrollo de nuevos procesos o para la optimización de los ya existentes. En el amplio repertorio de enzimas empleadas en la industria se encuentran las lipasas, las cuales por sus propiedades bioquímicas constituyen uno de los biocatalizadores de mayor uso e interés biotecnológico(1).

Las lipasas son enzimas ubicuas producidas por animales, plantas, y microorganismos en general(2), que catalizan la hidrólisis de enlaces éster de los triacilglicerolesy liberan ácidos grasos y glicerol(2). Estas se dividen en lipasas verdaderas (Triacilglicerol hidrolasas EC 3.1.1.3) que actúan sobre sustratos de cadena larga insolubles en agua y esterasas (Carboxilester hidrolasas EC3.1.1.) que ejercen su actividad en sustratos de cadena corta solubles en agua (3,4). Arpigny & Jaeger en 1999 clasificaron estas enzimas con base a su secuencia y propiedades biológicas en 8 familias, entre las cuales la más representativa es la familia I a la cual pertenecen las lipasas verdaderas y a esta a su vez se divide en 6 sub-familias(5). Los géneros más reportados de microorganismos productores enzimas lipolíticas son Candida, Pseudomonas, Burkholderia, Thermomyces, Rhizopus, Bacillus, Staphylococcus,Geobacillus, Acinetobacter, Rasltonia(6,7,8,).

Las lipasas hacen parte de la superfamilia de las α/β hidrolasas, las cuales poseen un dominio que se compone de una hoja β central rodeada de un numero variable de hélices α(9), el sitio activo presenta una triada catalítica conformada por residuos de Ser, Asp, His y poseen el motivo conservado GxSxG (la x significa cualquier amino ácido). La Ser presente en el sitio activo se encarga de realizar el ataque nucleofílico sobre el carbonil presente en el sustrato en la hidrólisis del enlace éster(3,4).

Bioquímicamente las lipasas se destacan por su regio y enantio-selectividad, estabilidad en solventes orgánicos y la actividad no dependiente de cofactores(9,10). Estas propiedades hacen que las enzimas lipolíticas sean de utilidad para la industria ya que pueden ejercer su actividad catalítica óptima en un extenso número de procesos que requieren condiciones específicas (1,10,11), como la elaboración de farmacéuticos, papel, productos alimentarios, cosméticos, producción de biodiesel, síntesis de compuestos orgánicos, detergentes, biorremediación ambiental, tratamiento de aguas residuales y producción de biopolímeros de fácil degradación entre otros(2,3-7,10-13). 4.2 Bioprospección de Enzimas Lipolíticas El método tradicional de búsqueda e identificación de lipasas consiste en el aislamiento y purificación a partir de muestras ambientales (lodos activados, compost, suelo, sedimento, agua) (9,14) de microorganismos que tengan la capacidad degradar sustratos lipídicos. La identificación se realiza generalmente por visualización de halos

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de hidrólisis o por adición de un colorante (14,15). La mayoría de las lipasas reportadas provienen de microorganismos identificados mediante metodologías dependientes de cultivo, con las cuales se ha demostrado que solo es posible tener acceso a una mínima fracción de la diversidad de microorganismos (<1%)(16,17) razón por la cual, es recomendable implementar nuevas estrategias que permitan superar este inconveniente. Desde hace más de una década la metagenómica surgió como una alternativa para sortear las barreras que suponen los métodos tradicionales. La metagenómica o genómica ambiental se encarga del estudio de los genomas presentes en una comunidad microbiana con una metodología independiente de cultivo(18), para esto, el ADN total de una muestra ambiental es extraído y clonado con el fin de obtener una biblioteca metagenómica la cual puede ser tamizada de diferentes formas(18). Esta disciplina ha facilitado ampliar el conocimiento sobre la complejidad filogenética y metabólica presente en una comunidad microbiana, permitiendo de esta forma, elucidar nuevas estructuras, funciones e interacciones microbianas(16,19,20).

Los estudios metagenómicos tradicionalmente se han realizado desde tres enfoques distintos: tamizaje funcional, secuenciación en masa, y tamizaje basado en secuencia(16,20). El primero consiste en la construcción de bibliotecas metagenómicas y evaluación con sustratos específicos que buscan inducir la producción de enzimas o metabolitos deseados que son evaluados visualmente, por ejemplo: por la formación de halos de hidrólisis(21). Este enfoque ha sido el más empleado ya que permite recuperar la secuencia completa del gen y no requiere conocimiento previo de los genes de interés(20), sin embargo presenta varias desventajas como la dependencia del hospedero que se emplea para la expresión. En la mayoría de estudios se emplea Escherichia coli como sistema único de expresión; aunque esta bacteria ha mostrado expresar una extensa diversidad de genes de diversos orígenes, se encuentra documentado que E. coli solo está en capacidad de expresar correctamente el 40% de los genes cloinados(22) como consecuencia de las diferencias en los sistemas de regulación a nivel transcripcional, traduccional, post-traduccional entre E.coli y el organismo de donde proviene el transgen(22-24). A esto se suma que en algunos casos se presenta toxicidad por sobreexpresión del gen clonado. Adicionalmente el tiempo y costo que demanda analizar miles de clones reduce la eficiencia y limita la aplicación de este tipo de tamizaje(23-29).

El segundo método de análisis de un metagenoma se basa en la secuenciación masiva de ADN metagenómico o de una biblioteca empleando marcadores específicos(28,29). La aplicación de esa aproximación se facilita por el uso de tecnologías de secuenciación de alto procesamiento las cuales permiten obtener grandes cantidades de datos en corto tiempo a bajo costo y se evita la pérdida de información de microorganismos de baja abundancia en la muestra(19,20,29). A pesar de estas ventajas, la secuenciación en masa presenta varias limitantes que restringen su aplicación como: la poca longitud de las lecturas generadas por las distintas plataformas de secuenciación de segunda generación (50-250pb) que no representar una región importante o significativa de un gen por lo que no es posible asignarle una función. De igual manera, la mayoría de secuencias depositadas en las bases de datos de genes y proteínas están sesgadas hacia organismos modelo y microorganismos cultivados, los cuales no representan la totalidad de especies, genes y rutas metabólicas, por lo tanto se dificulta la clasificación taxonómica y funcional de las secuencias complicando el análisis de la información.(19,28,29).

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4.3 Tamizaje por Secuencia El tercer tipo tamizaje de un metagenoma es el basado en secuencia u homología; este emplea técnicas basadas en PCR e hibridización(19,31). A diferencia del tamizaje funcional no está sujetoa la expresión en un hospedero heterólogo, en cambio sí va a depender del conocimiento previo que se tenga de las proteínas a identificar ya que a partir de dominios o regiones conservadas se sintetizan sondas e iniciadores, por esta razón el uso de este enfoque se recomienda cuando se desea identificar nuevos miembros de familias de proteínas conocidas para obtener una colección de enzimas similares pero con variaciones en sus propiedades(20,28). El tamizaje basado en PCR en general se basa en el uso de oligonucleótidos degenerados diseñados a partir del alineamiento múltiple de secuencias de proteínas conocidas, con los cuales se hace una amplificación parcial del gen, este fragmento es secuenciado y a partir del mismo se diseñan iniciadores para recuperar las secuencias corriente arriba y corriente abajo mediante Genome walking hasta obtener el gen completo(25). Siguiendo esta metodología se han identificado y clonado diversos tipos de genes como esterasas, lipasas, quitinasas, xilanasas, celulasas, PKS sintetasa entre otros (16,18,25),

adicionalmente, distintos autores han propuestos diversas variantes para clonar genes por homología como el uso de DGGE (Electroforesis en Gel de Gradiente Denaturante) seguido de Gene walking(32), touchdown-PCR(48), PAI-PCR (Pre Amplified Inverse-PCR)(33) y IAN-PCR (Inverse Affinity Nested-PCR) (34). En lo que concierne a las enzimas lipolíticas, estrategias basadas en hibridización(35) y PCR han permitido clonar exitosamente genes de lipasas en microorganismos aislados (36-41), de ADN ambiental (42) y de bibliotecas metagenómicas (28,38,44). Para la búsqueda de genes de enzimas lipolíticases común emplear oligonucleótidos degenerados siguiendo el método CODEHOP (Consensus Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers) el cual se basa fundamentalmente en el diseño de cebadores con una región 3’ degenerada y una región clamp no degenerada en el extremo 5’ lo cual estabiliza la hibridización de la región degenerada con el ADN molde durante el anillamiento(46). Dada la baja similitud entre las lipasas, las regiones conservadas del sitio activo y el agujero oxianión son comúnmente utilizadas para diseñar los iniciadores(42). Con base en el principio CODEHOP se han clonado genes de lipasas y esterasas de diversos ecosistemas(47) y de bacterias aisladas pero cuyos genes de lipasas no habían sido caracterizados previamente(41,44). En un estudio previo, Bell et al en 2002 a partir de un alineamiento múltiple de 70 secuencias de lipasas de las familias I diseñaron un set de iniciadores degenerados siguiendo el principio CODEHOP con base en las secuencias conservadas del sitio activo y el agujero oxianión. De esta manera clonaron una nueva lipasa que posteriormente expresaron exitosamente en E. coli.(26). En otro trabajo Terahara y colaboradores en 2010, utilizando los mismos oligonucleótidos identificaron 13 nuevas esterasas a partir de diversas muestras ambientales, de las cuales lograron expresar 8 en un hospedero heterólogo(27). Adicionalmente Smith 2010, identificó nuevas lipasas empleando los iniciadores diseñados por Bell et al 2002 en muestras de suelo mineral de valle antártico(45). Estos reportes demuestran que el tamizaje por secuencia es una alternativa efectiva que se puede implementar en la búsqueda de genes de interés en metagenomas superando algunas limitacines que suponen los otros dos métodos de tamizaje

Hasta la fecha más de 80 enzimas lipolíticas nuevas han sido reportadas empleando metodologías basadas en metagenómica, varias de las cuales han aumentado el número de miembros en cada una de las familias propuestas por Arpigny(49-52). Sin embargo, algunas no logran ser clasificadas en ninguna de las 8 familias por lo que algunos autores sugieren la conformación de nuevas familias y/o la reestructuración de la clasificación(53-59).

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4.4 Ambientes Extremos como Reservorio de Enzimas Lipolíticas

Las lipasas identificadas mediante aproximación metagenómica provienen de diferentes ecosistemas como suelo, agua, lodos activados, rumen, compost, manglar y sedimentos entre otros(17,40,54,55,58,59). Adicionalmente los ambientes extremos llamados así por condiciones físico-químicas (temperatura, salinidad, pH, radiación, presión) extremas constituyen una fuente poco explorada de nuevos biocatalizadores útiles para la industria. Dadas las propiedades de estos ecosistemas no todos los microorganismos son capaces de subsistir, por lo que es usual encontrar una baja diversidad microbiana(20), sin embargo los microorganismos extremófilos desarrollan mecanismos que les permiten sobrevivir, adaptarse y reproducirse en estas circunstancias. Uno de los mecanismos proviene de las enzimas, las cuales presentan propiedades y adaptaciones particulares que les permiten tener una actividad catalítica óptima bajo estas condiciones, esto las hace útiles para procesos industriales donde se requieren de condiciones extremas que normalmente afectarían la actividad de una enzima. Por esta razón la bioprospección de ambientes extremos es de gran importancia para la biotecnología(20). Los ambientes psicrófilos como es el caso del Parque Nacional de los Nevados se caracterizan por su baja temperatura (<16ºC)(60)y han sido explotados recientemente en búsqueda de enzimas adaptadas a bajas temperaturas, las cuales tienen diversas aplicaciones industriales(60,61). En el caso de las lipasas adaptadas a frío (cold-adapted lipases) poseen una mayor flexibilidad alrededor del sitio activo, menor número de puentes disulfuro, mayor hidrofobicidad, menor interacciones electrostáticas, lo que hace que tengan una actividad catalítica óptima a bajas temperaturas(10,60,61). Procesos llevados a cabo en frío representan menos suministro de energía lo que implica menores costos de producción, así mismo se reduce la posibilidad de contaminación(61).

4.5 Antecedentes El Centro Colombiano de Genómica y Bioinformática de Ambientes Extremos (GeBiX) viene realizando desde hace 3 años en el Parque Nacional de los Nevados (PNN) un estudio con el fin de caracterizar la biodiversidad presente en los distintos ecosistemas y adicionalmente realizar bioprospección de enzimas con utilidad industrial como celulasas y lipasas. En un estudio previo se identificó una nueva esterasa a partir de una biblioteca metagenómica de bosque alto andino mediante tamizaje funcional(53). Por otro lado, en ensayos preliminares se intentó usar una aproximación por homología para clonar genes de lipasas en cepas lipolíticas aisladas de suelo del PNN, sin embargo no se logró amplificar satisfactoriamente una secuencia parcial de un gen lipolítico, razón por la cual se propuso en este trabajo, optimizar las condiciones de la PCR con el fin de utilizar esta metodología para la búsqueda de genes codificadores de lipasas en librerías metagenómicas.

5. Objetivos 5.1 Objetivo General Buscar genes codificadores de enzimas lipolíticas en una biblioteca metagenómica de Bosque Alto Andino mediante un tamizaje por secuencia.

5.2 Objetivos Específicos

5.1.1 Definir las condiciones de amplificación que permitan obtener el amplicón de interés. 5.1.2 Verificar que un producto de PCR obtenido corresponda a un gen de una lipasa 5.1.3 Determinar la afiliación filogenética de las secuencias obtenidas

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6. Metodología

6.1 Optimización de PCR

La optimización de la reacción de amplificación se realizó con base en el esquema propuesto por Terahara et al 2010 (27). Los parámetros seleccionados para optimizar en la PCR se seleccionaron según Roux(62) y Altshuler(63). Se evaluaron diferentes adyuvantes como: DMSO, Glicerol, Betaína, BSA y DTT, diferentes concentraciones de ADN molde, MgCl2 y oligonucleótidos, varias temperaturas de anillamiento y números de ciclos. Las condiciones evaluadas para cada parámetro se muestran en la tabla 1. La optimización se llevó a cabo utilizando ADN genómico de una cepa control de Bacilluspumilis(28) aislada del PNN que presentó actividad lipolítica en tributirina, trioleina y tricaprilina, y con ADN plasmídico de un clon con actividad lipolítica proveniente de una biblioteca metagenómica de suelo de bosque alto Andino (BAA) de un estudio anterior(56). Tabla 1. Parámetros evaluados durante la optimización de la PCR

*Los parámetros y condiciones evaluadas se tomaron de las refs. 62-65, DMSO: Dimetilsulfóxido, DTT: Ditiotreitol, BSA: Albúmina de Suero Bovino, Tm: Temperatura de anillamiento

6.2 Tamizaje de la Biblioteca

La biblioteca metagenómica a tamizar fue construida previamente a partir de ADN de suelo de Bosque Alto Andino el cual fue clonado en el fósmido pCC1FOS (Epicentre) e insertado en células de E.coli Epi300. La biblioteca consta de ~22.000 clones con un tamaño promedio de inserto de 35Kb y se encuentra almacenada en fracciones de 384 clones en el laboratorio del GeBiX de la Universidad Javeriana. El tamizaje primario se realizó sobre 12 fracciones (nombradas de P1 a P12) cada una conteniendo 1920 clones, que correspondes a los clones de 5 pozos de la placa. Para

PARAMETRO*

CONDICIONES EVALUADAS*

DMSO (%) 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2

Glicerol (%) 1, 2, 5, 10

Betaína (M) 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6

BSA (mg/ml) 0.5, 1, 2

DTT (mM) 0.1, 02, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2

Betaína + DTT + DMSO 1.6M, 3.2mM, 3.2%

DMSO + BSA +DTT 2%, 1mg/ml, 2mM

ADN molde (genómico y plasmídico) (ng) 5, 10, 20, 30, 50, 75, 100

Tm (ºC) 47 – 60

MgCl2 (mM) 1.5 – 5 (incrementos de 0.5)

Oligonucleótidos (µM) 0.5 - 5 (incrementos de 0.5)

Numero de ciclos 25,.30,35,40,45,50

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esto 5µL de cada pozo de la placa fueron transferidos a 1mL de caldo LB suplementado con MgSO410mM, Maltosa0.2% y Cloranfenicol 12.5ug/ml. Los cultivos fueron incubados por 12h a 37ºC con agitación de 150rpm, luego se les adicionó 1µl de Copy Control Fosmid Autoinduction Solution y se incubó por 6 horas más. Posteriormente se realizó extracción de ADN del fósmido mediante lisis alcalina siguiendo el método descrito por Sambrook et al(71). El ADN fue cuantificado en un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 Thermo y evaluado mediante electroforesis en gel de agarosa al 0.8%. Para la PCR se emplearon los iniciadores reportados por Bell y colaboradores en 2002 OXF1-ACR1, OXF1-ACR3(28) (tabla 2), el volumen de reacción fue de 25µl y la concentración final de los reactivos fue: Green Flexi Buffer(Promega) 1X, MgCl2 2mM, iniciadores 4.5µM de cada uno, GoTaq® Polimerasa (Promega) 0.04U/µL y ADN 1.2ng/µl. El esquema de amplificación consistió en un ciclo de denaturación inicial a 94ºC 3min, 45 ciclos de 94ºC 30s, 52.5ºC 30s 72ºC 90s y una extensión final de 72ºC 7 minutos. Los productos de amplificación fueron visualizados en gel de agarosa al 1.5% teñido con SYBRSafe 1X. Como control positivo se utilizó ADN genómico de B.pumilis(26) y ADN plasmídico de un clon lipolítico(53), el control negativo correspondió a toda la mezcla de reacción pero con agua en lugar de ADN.

Tabla 2. Oligonucleótidos utilizados en el estudio

a: Tomado de Bell et al 2002(28), b: inciadores para los vectores pGEM-T Easy/pCR2.1-TOPO, c: Iniciadores para el vectorpBlueScript SK. Y: T o C, K: T o G, S: C o G, N: A o T o C o G,R: A o G

Los productos de amplificación fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa 1,5%. Se buscó la presencia de una banda alrededor de ~250pb la cual podría corresponder a una fracción de un gen codificador de lipasa(26). De las fracciones que presentaron señal positiva de amplificación, se tomaron 3 al azar (P2, P7, P11) con las cuales se realizó una segunda ronda de amplificación. Para esto, cada fracción se diluyó y dividió en 5 partes cada una con 384 clones para un total de 15 sub-fracciones nombradas como P2a a P2e; P7a a P7e y P11a a P11e respectivamente. Las condiciones de cultivo, extracción de ADN de fósmido y amplificación fueron las mismas a las mencionadas anteriormente. 3 sub-fracciones (P2d, P7e, P11b) que mostraron señal positiva, fueron diluidas y divididas en 6 partes para obtener 18 mini-fracciones con 64 clones cada una. Las condiciones de cultivo, método de aislamiento de ADN y condiciones de amplificación con iniciadores degenerados se realizaron de acuerdo con la metodología descrita anteriormente.

Iniciador Secuencia

OXF1a 5’–CCYGTKGTSYTNGTNCAYGG–3’

ACR1a 5’-AGGCCNCCCAKNGARTGNSC-3’

ACR3a 5’-AGGCCRCCNTGNGARTGNSC-3’

M13Fb 5´-GTAAAACGACGGCCAG-3´

M13Rb 5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´

T7 promoterc 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'

T3c 5'-ATTAACCCTCACTAAAG-3'

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6.3 Purificación de Bandas y Clonación

Un total de 12 bandas con tamaños entre 250 y 600 pb fueron seleccionadas. (6 para los iniciadores OXF1-ACR1, 4 para OXF1-ACR3 y los 2 controles), La bandas fueron purificadas empleando el kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) y luego clonadas en el vector pCR®2.1-TOPO (Invitrogen) con modificaciones al protocolo recomendado por el fabricante (Anexo). Posteriormente 3µl del producto de ligación se transformaron en células quimiocompetentes de E.coli TOP10 mediante choque térmico siguiendo las instrucciones del manual. La selección de clones positivos se realizó en agar LB con ampicilina(Amp) 50µg/ml, kanacimina(Kan) 50µg/ml y X-gal 80µg/ml. Algunas bandas fueron clonadas en pGEM®-T Easy (Promega) con una relación (inserto:vector) 3:1 siguiendo las indicaciones del fabricante. La transformación se realizó por choque térmico en células quimiocompetentes de E.coli JM109. La selección de transformantes positivos se realizó en agar LB suplementado con Amp100µg/ml, IPTG 0.5mM y X-gal 80µg/ml. En ambos casos las cajas se incubaron por 24h. Las colonias blancas fueron seleccionas y transferidas a 5ml de caldo LB suplementado con Amp50µg/ml, Kan 50µg/ml para los clones en pCR®2.1-TOPO® y con Amp100µg/ml para los clones conpGEM®-T Easy, posteriormente se realizó extracción de ADN plasmídico mediante lisis alcalina (66), Con el fin de verificar la presencia de inserto en los clones, se llevó a cabo una reacción de amplificación empleando los iniciadores universales M13F y M13R (tabla 2).

El esquema de amplificación consistió de 1 ciclo 94ºC 2 min, 25 ciclos 94ºC 30s, 55ºC 30s, 72ºC 30s, con una extensión final de 72ºC 7min. Los productos fueron verificados en gel de agarosa 1.3% teñido con SYBRSafe. Adicionalmente, como segundo método de verificación de clones se realizó restricción del ADN plasmídico empleando las enzimas de restricción SacI (Promega) para los clones de pCR®2.1-Topo® y con RsaI (Promega) para los clones de pGEM®-T EASY. Los productos de PCR obtenidos con los iniciadores M13F/M13R fueron enviados a secuenciar en Macrogen (Corea del Sur).

6.4 Subclonación

Con el fin de comprobar si las prueba de PCR con iniciadores degenerados permitió amplificar una secuencia parcial de un gen lipolítico, las sub-fracciones P2d, P7e, P11b fueron seleccionadas para la construcción de una biblioteca de insertos pequeños que pudiera ser tamizada en medio LB con tributirina y así poder obtener un clon individual que incluya el gen completo. Para esto, se realizó la extracción del ADN de fósmido como se describió previamente. Posteriormente fue digerido con las endonucleasas KpnI (Promega) y SacI (Promega) por 3.5 horas a 37ºC. La digestión se verificó en gel de agarosa al 0.8% y los fragmentos localizados entre 2 y 8Kb fueron purificados desde el gel como se describió anteriormente y 100ng de ADN purificado fueron empleados para la subclonación. Como vector de clonación se utilizó el plásmido Bluescript SK (Stratagene), la ligación se realizó por 12h a 4ºC con relaciones (inserto:vector) 2:1 y 3:1,siguiendo las instrucciones del fabricante. La transformación se llevó a cabo por choque térmico con 2µl del producto de ligación en células quimiocompetentes de E.coli DH5α, se sembraron 100µl en agar LB con IPTG 0.5mM, X-gal 80µg/ml, Amp 100µg/ml para determinar el título de cada biblioteca. El contenido restante fue tamizado en agar LB con IPTG 0.5mM, X-gal80µg/ml, Amp 100µg/ml, Tributirina 1%(v/v), se incubó por 48h a 37ºC y posteriormente se llevó a 4ºC por 4 días. Los clones que mostraron el mayor halo de hidrólisis fueron repicados en caldo LB + Amp 100µg/ml, la incubación y extracción de ADN se realizó como se

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describió previamente. Se amplificó el ADN aislado con los iniciadores T7 promoter y T3 (tabla 2), el producto de PCR fue enviado a secuenciar en macrogen (Korea del sur).

7 Resultados y Discusión

7.1 Optimización de la PCR

Previo a realizar el tamizaje de la biblioteca fue necesario optimizar las condiciones de amplificación ya que en ensayos preliminares no había sido posible obtener amplicones. Los resultados obtenidos en los ensayos de optimización se presentan en el anexo 1. Las condiciones que permitieron obtener el amplicones del tamaño esperado fueron: MgCl2 (2 mM) oligonucleótidos (4.5 µM), ADN molde (1.2ng/µl) y el esquema de amplificación que se muestra en la tabla 3. Las condiciones definidas en el presente estudio difieren de las reportadas por Bell et al(26) y Terahara et al(27) quienes con los mismos iniciadores identificaron nuevos genes codificadores de lipasas. Si bien este perfil de amplificación permitió obtener amplicones del tamaño esperado, también produjo bandas inespecíficas Esto era de esperarse debido al grado de degeneración de los cebadores(63). La concentración de MgCl2 es uno de los factores más importantes que afectan la especificidad de la reacción, usualmente se utiliza a 1.5mM(62,63), sin embargo teniendo en cuenta que se utilizaron iniciadores altamente degenerados fue necesario incrementar la concentración a 2mM, con lo cual se disminuye la especificidad pero se favorece la amplificación(63). Por su parte la concentración del ADN molde también influye de manera importante en el éxito de una PCR, en ocasiones cuando se adiciona en exceso (>100ng) puede inhibir la reacción, ya que el tiempo de denaturación empleado puede no ser suficiente para separar completamente las dos cadenas, adicionalmente se pueden formar estructuras secundarias, estos dos eventos llevan a un anillamiento deficiente de los iniciadores por lo tanto se afecta negativamente la amplificación(63). El exceso de ADN molde también contribuye a que se produzca ruido de fondo (background), además si se emplea un elevado número de ciclos en el esquema de amplificación (>35), el ADN molde junto con los amplicones generados pueden empezar a degradarse haciendo que en el gel se vea un degradado (smear)(63), por esta razón se estableció usar 30ng de ADN por reacción. Con el incremento del tiempo de denaturación inicial en 1 minuto con respecto a Terahara et al, se buscaba lograr una denaturación completa del ADN que favoreciera el anillamiento del mayor número de iniciadores presentes en la mezcla. Por otro lado, empleando de 25 a 40 ciclos de amplificación no se observó banda o ésta era muy tenue, con 50 ciclos se produjo una banda intensa pero adicionalmente se presentó bastante degradado por lo que con la reducción a 45 ciclos se redujo en lo posible el degradado y así mismo la intensidad de bandas inespecíficas. Otro factor importante que se modificó respecto a los otros estudios fue la temperatura de anillamiento(Tm) la cual incide fundamentalmente en la especificidad(62,63). Cuando se emplean iniciadores degenerados generalmente la Tm utilizada es baja (40-50ºC), esto favorece el anillamiento de la mayor cantidad de iniciadores individuales presentes en la mezcla. En este trabajo la Tm se incrementó en 2.5ºC con lo cual se logró reducir el número de bandas inespecíficas sin alterar la amplificación del fragmento de interés por lo que se logró incrementar la especificidad de la reacción. El último parámetro modificado fue la concentración de oligonucleótidos. Si bien, a medida que el grado de degeneración incrementa, la concentración de cada iniciador presente en la mezcla disminuye por lo que es necesario incrementar el volumen empleado para tratar de contrarrestar esta disminución(68,69). Los iniciadores empleados en este estudio tienen un grado de degeneración de 512, exediendo el grado recomendado(46,67), lo que podría favorecer el incremento de productos

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inespecificos en la reacción. Este grado de degeneración que corresponde al total de oligonucleótidos individuales presentes en la mezcla(67,69) significa para este caso que la frecuencia con la que un iniciador presente en la mezcla hibrida con una secuencia en el ADN molde disminuye de 1 a 1.95x10-3

(46), razón por la cual es muy complicado lograr obtener un solo producto de amplificación. Adicionalmente estos iniciadores al ser diseñados con base en el sitio activo de las lipasas, el cual está presente en otras proteínas de la superfamilia de las α/β hidrolasas como β_lactamasas podrían estar amplificando genes distintos a los que codifican lipasas, por ejemplo el gen de resistencia a la ampicilina presente en el vector de clonación. Por esta razón se podría esperar la aparición de bandas inespecíficas, lo importante es que la amplicón que predomine corresponda al tamaño esperado. Por otro lado, con la adición de adyuvantes (BSA, DMSO, DTT, Glicerol, Betaina) a la mezcla de reacción no se observó ningún efecto positivo en la amplificación, por lo tanto no se consideró finalmente su uso en el momento del tamizaje de la biblioteca.

Tabla 3. Parámetros y condiciones de amplificación utilizados en este estudio.

Parámetro Bell et al(26) Terahara et al(27) Este estudio MgCl2 (mM) 5.0 1.5 2.0

Iniciadores (µM) 1.3 4.0 4.5

ADN templado (ng) 1.75 1.2 1.2

Perfil de amplificación

94ºC 1s 94ºC 1min 37ºC 1s

37ºC 30s 72ºC 2min20seg

72ºC 1min 35ciclos de: 95ºC 1min 50ºC 1min

72ºC 1min

94ºC 2min 50 ciclos de:

94ºC 30s 50ºC 30s 72ºC 90s

72ºC 7min

94ºC 3min 45 ciclos de:

94ºC 30s 52.5ºC 30s 72ºC 90s

72ºC 7min

7.2 Tamizaje de la Biblioteca

A partir de 12 fracciones cada una con 1920 clones se realizó una primera ronda de amplificación, el patrón de bandeo con los iniciadores OXF1-ACR1 fue similar en la mayoría de carriles, de igual manera se observó la banda de interés (~250pb) en todos las fracciones (figura 1). Esto puede deberse al número de clones presentes en el mismo medio, los cuales tienen inserto promedio de 35Kb lo que significa que en cada fracción se tamizaron 67.2Mb; si se tiene en cuenta que cada gen procariota es de aproximadamente 1Kb(70) la diversidad presente en cada fracción es muy amplia por lo que es posible que en cada una se encuentren 1 o más genes codificadores de lipasas.

17

Figura 1. Primera ronda de amplificación con los iniciadores OXF1-ACR1. Carriles 2-13: Fracciones 1-12 respectivamente, carril 14: control positivo B. pumilis, carril 15: control positivo Clon lipolítico, carril 16: control negativo carriles 1 y 17: Marcador de talla molecular 100pbladder (Invitrogen). La flecha indica una banda de ~250pb

Con respecto a los cebadores OXF1-ACR3 el patrón de bandeo fue más heterogéneo con respecto al anterior (figura 2), a pesar de que se obtuvieron varias bandas positivas, en la mayoría de carriles las bandas más definidas e intensas se observaron por encima de los 250pb, las cuales probablemente no corresponden a genes de enzimas lipolíticas. Es posible que al implementar un iniciador antisentido diferente, este no haya encontrado una secuencia en el gen de interés donde anillar, por lo que podría haberse unido a secuencias inespecíficas. Es importante tener en cuenta que los oligonucleótidos empleados en este estudio fueron diseñados a partir de lipasas de la familia I y algunos miembros de las familias II y III, por lo tanto es probable que en la muestra se encuentren genes de las familias restantes, los cuales no van a ser amplificados con estos cebadores.

Figura 2. Primera ronda de amplificación con los iniciadores OXF1-ACR3. Carriles 1-12: fracciones 1-12 respectivamente, carril 13 control positivo B. pumilis, carril 14: control positivo Clon lipolítico, carril 15: control negativo carril 16: marcador de talla molecular 100pb (Invitrogen). La flecha indica una banda de ~250pb

Para la segunda ronda de amplificación se tomaron al azar las fracciones P2, P7 y P11, cada una divida en 5 sub-fracciones para un total de 15(384 clones c/u). En esta amplificación con los iniciadores OXF1-ACR1, se observó banda positiva en 9 carriles (figura 3), así mismo, al igual que en la primera amplificación se observaron bandas

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

1500

600

200

1500

600

200

18

por encima de los 600pb. Sin embargo en este caso ya se observa ausencia de amplicón en algunas muestras lo que demuestra el efecto de la dilución. Es de resaltar que algunos carriles que provienen de distintas sub-fracciones tienen un patrón de bandeo idéntico, esto podría sugerir la abundancia de una especie en la muestra, lo que conlleva a que algunas secuencias se encuentren sobre representadas en la biblioteca, sin embargo para poder confirmar esto tendría que realizarse un análisis de biodiversidad (ej: análisis de 16S)

Figura 3.Segunda ronda de amplificación con los iniciadores OXF1-ACR1. Carriles1-5 (sub-fracciones

P2a-P2e), carriles 6-10 (sub-fracciones P7a-P7e), carriles 12-16 (sub-fracciones P11a-P11e), carril 17: B. pumilis, carril 18: clon lipolítico, carril 19: control negativo, carril 11: marcador de talla molecular: 100pb (BioRad), La flecha roja sobre el marcador indica una banda de 200pb, la flecha en el carril 18 indica una banda de ~250pb. Las flechas azules indican las bandas que fueron purificadas

Para los iniciadores OXF1-ACR3 el patrón de bandeo fue diverso al igual que en la primera amplificación (figura 4), sin embargo solo se observó una banda de ~250pb en un carril, por su parte bandas de mayor tamaño predominaron en la mayoría de carriles. Esto resultados podrían indicar el oligonucleótido ACR3 no tiene alta especificidad por genes de lipasas, ya que a pesar de tener un grado de degeneración similar al de ACR1 el número de bandas presuntivas de genes de lipasas fue menor al obtenido con ACR1, adicionalmente las bandas que predominaron fueron de tamaños superiores a 250pb. A pesar de esto, se clonaron los amplicones de estos tamaños (350 y 600pb) debido a que las lipasas poseen un rango de tamaño amplio (entre 20 y más de 100KDa)(2) por lo que es posible que algunas lipasas tengan el sito activo y el agujero oxianión más separados que los de las lipasas reportadas, si embargo para poder confirmar esto es indispensable secuenciar el inserto y realizar el análisis respectivo. Adicionalmente se intentó realizar una tercera ronda de amplificación diluyendo las sub-fraccionesen 6 partes, cada una de 64 clones pero no se obtuvo ninguna señal positiva. Esto puede deberse a que dependiendo del inserto clonado algunos clones pueden crecer más rápido inhibiendo así el crecimiento de otros(31), entre los cuales pueden estar los clones que tienen el inserto de interés. Esto conlleva a que estén en baja proporción en el medio y consecuentemente se pueden perder durante la extracción de ADN. Algunos autores sugieren para evitar este inconveniente el uso de medios semilíquidos adicionando compuestos gelificantes al medio como agarosa, esto disminuye el sesgo de crecimiento de los clones con lo que se evita la posible pérdida de alguno que pueda contener un gen de interés(31,71).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

19

Figura 4. Segunda ronda de amplificación con los iniciadores OXF1-ACR3. carriles 1-5 (sub-fracciones

P2a-P2e), carriles 6-9,11 (sub-fracciones P7a-P7e), carriles 12-16 (sub-fracciones P11a-P11e), carril 17: clon lipolitco, carril 18: B. pumilis, carril 19: control negativo, carril 10: marcador de talla molecular:

100pbladder (Invitrogen), la flecha en el carril 18 indica una banda de ~250pb. Las flechas azules indican las bandas que fueron purificadas

Los resultados obtenidos en el presente estudio sugieren que la optimización de la PCR fue adecuada ya que permitió obtener distintos amplicones que podrían corresponder a regiones de genes de lipasas, sin embargo una mejora en el cultivo de los clones podría incrementar la eficiencia del tamizaje. Luego de purificar y clonar las bandas, se seleccionaron los clones positivos (colonias blancas) los cuales se verificaron amplificando con los iniciadores universales M13F/R. Como se observa en las figuras 5 y 6. La clonación fue exitosa excepto para un clon que inicialmente había mostrado fenotipo blanco pero no poseía inserto. Este hecho puede explicarse por el tiempo de incubación. Algunos autores recomiendan transferir las cajas con los clones a frío, de esta manera colonias que inicialmente eran blancas se tornan azules, por consiguiente se evitan los falsos positivos(66).

7.3 Subclonación

Partiendo del hecho de que las sub-fracciones P2d, P7e y P11b mostraron una banda definida de ~250pb la cual podría corresponder a una fracción de un gen codificador de lipasas, el ADN de estas fracciones fue extraído y subclonado en el vector pBluescript SK para construir tres bibliotecas de insertos pequeños y buscar clones individuales que presenten actividad lipolítica. Luego de la digestión con KpnI y SacI los fragmentos entre 2-8kb fueron purificados, clonados en pBluescript SK y transformados en E.coli DH5α. En la figura 7, se muestra la digestión parcial de la sub-fracción P2d.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

20

Figura 5. Verificación de insertos clonados en pCR2.1-TOPO. Carriles 1-6,8: clones con inserto de

~425pb (250pb del producto clonado+ 175pb del vector)carril 6: clon sin inserto(falso positivo), carril 9:

control negativo, carril 10: marcador de talla molecular 100pb ladder (BioRad). Las flechas de arriba hacia

abajo indican 400pb y 200pb respectivamente.

Figura 6. Verificación de insertos clonados en pGEM T-Easy. Carriles 1,3,4: clones con inserto de ~565pb

(~350pb del producto clonado+ 215pb del vector) carril 2: cloncon inserto de ~815pb (600pb del producto

clonado + 215pb del vector)carril 5: control negativo, carril 6: marcador de talla molecular 100pb

ladder(BioRad). Las flechas de arriba hacia abajo indican 800pb y 600pb respectivamente.

Las tres bibliotecas fueron tamizadas en agar LB+Tributirina 1%(v/v) y luego de la incubación se seleccionaron tres clones (uno de cada biblioteca) que presentaron el mayor halo de hidrólisis. Estos clones fueron repicados individualmente y designados como: ClipF1, ClipF2 y ClipF3.

400pb

200pb

400pb

200pb

21

Figura 7. Digestión de ADN de fósmido (P2d). Carril 1: ADN sin digerir, carril 2 y 3: ADN digerido, carril 4:

Marcador de peso molecular1kb ladder (BioRad). La flecha indica la banda de 8Kb. El recuadro muestra

la zona que se purificó

Como se observa en la figura 8 se evidenció actividad lipolítica en los tres clones, sin embargo todos presentaron crecimiento distinto y morfología atípica, lo cual puede deberse a características inherentes al inserto(66). Teniendo en cuenta que el sustrato sobre el que se evidencio la hidrólisis fue tributirina la cual posee 4 átomos de carbono en principio podría corresponder a una esterasa(4,7,14),sin embargo dado que los oligonucleótidos empleados para la amplificación fueron diseñados con base al grupo de las lipasas verdaderas(26) es esperaría que la enzima correspondiera a la familia I.

Figura 8. Clones en agar LB + tributirina 1%(v/v). A: Clon ClipF1, B: ClipF2, C:ClipF3.

Para determinar si la enzima que le confiere actividad lipolítica al clon corresponde a una esterasa o una lipasa verdadera es necesario realizar ensayos cualitativos (prueba de ρ_nitrofenil-esteres) y cuantitativos en sustratos lipídicos de diferentes extensiones de átomos de carbono como caprilato (C8), decanoato (C10), palmitato (C12) y trioleina (16) entre otros, así mismo es de vital importancia disponer de la secuencia del gen con el fin de identificar las características propias de las lipasas como los el pentapéptido GxSxG y la triada catalítica Ser, Asp, His presente en el sitio activo(3,4), adicionalmente con la secuencia se puede determinar la afiliación filogenética de la enzima para establecer si se trata de una enzima lipolítica reportada o corresponde a una nueva.

A C B

22

Como se mencionó anteriormente, el suelo de Bosque Alto Andino es un ecosistema psicrófilo (9-16ºC)(72), por lo que la mayoría de microorganismos que lo habitan poseen sistemas adaptativos como enzimas que les permiten sobrevivir a bajas temperatura(60), por lo que numerosas lipasas adaptadas a frio han sido identificadas en distintos suelos de bajas temperaturas(10,61). De esta manera, y considerando que el halo de hidrólisis en medio sólido fue observado después de realizar una incubación a 4ºC, podría intuirse que la actividad lipolítica es conferida por una enzima lipolítica adaptada a frio, sin embargo para confirmar esto en necesario realizar una caracterización bioquímica con la enzima purificada, adicionalmente es indispensable el análisis de la secuencia nucleotídica del gen con el fin de comparar con secuencias de enzimas lipolíticas adaptadas a frio.

De esta manera en el presente estudio empleando una estrategia basada en secuencia se tamizó una biblioteca metagenómica en búsqueda de genes codificadores de lipasas. A partir del análisis por PCR se identificaron regiones de genes presuntivos de lipasas los cuales luego de ser sublclonados permitieron obtener clones que mostraron actividad lipolítica en medio sólido, esto sugiere que efectivamente se trata de una enzima lipolítica lo que confirma la eficiencia de esta aproximación metagenómica.

8. Conclusiones

8.1 Se establecieron las condiciones de PCR adecuadas para amplificar fracciones de

genes codificadores de lipasas empleando iniciadores degenerados.

8.2 Se tamizó una biblioteca metagenómica de suelo de BAA mediante un tamizaje

basado en secuencia

8.3 Se construyeron tres librerías de insertos pequeños derivadas del tamizaje por

PCR que permitieron recuperar clones individuales con actividad lipolítica.

9 Recomendaciones

9.1 Es necesario optimizar las condiciones de cultivo de los clones para incrementar

la eficiencia del tamizaje

9.2 Se debe disponer de la secuencia de los insertos de los clones con actividad

lipolítica para confirmar que se trate de un gen codificador de lipasa así mismo para

caracterizarlo y determinar su afiliación filogenética

9.3 Es necesario caracterizar bioquímicamente la enzima con el fin de establecer su

potencial uso industrial.

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11. Anexos

Anexo 1. Parámetros evaluados en la optimización de la PCR

PARAMETRO Condiciones evaluadas

Señal positiva de amplificación

DMSO (%)

0.2 X

0.4 X

0.8 X

1.6 X

3.2 X

GLICEROL (%)

1 X

2 X

5 X

10 X

BETAINA (M)

0.1 X

0.2 X

0.4 X

0.8 X

1.6 X

BSA (mg/ml)

0.5 X

1 X

2 X

DTT (mM)

0.2 X

0.4 X

0.8 X

1.6 X

3.2 X

BETAINA+DTT+DMSO 1.6M 3.2mM 3.2% X

DMSO +BSA+DTT 2% 1mg/ml2mM X

ADN MOLDE (ng)

5 X

10 +

20 +

30 ++

50 ++

75 ++

100 +

MgCl2

1.5 x

2.0 ++

2.5 ++

3.0 ++

3.5 ++

4.0 ++

4.5 ++

5.0 ++

Oligonucleótidos

1.0 X

1.5 X

2.0 X

2.5 X

3.0 X

3.5 +

4.0 +

4.5 ++

5.0 ++

Numero de Ciclos (con y sin reamplifiación)

25 X

30 X

35 X

40 +

45 ++

50 +

X: Ausencia de Banda, +: presencia de banda, ++: presencia de banda intensa.

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Anexo 2. Protocolo de clonación con pCR®2.1-TOPO (modificado)

Componente Volumen (µl)

Producto de PCR 1.5

Solución de Sales 0.5

Agua milliQ 0.5

Vector TOPO® 0.5

Volumen final 3.0

Se homogeniza la mezcla y se incuba por 20 minutos a 22ºC, posteriormente se procede a

realizar la transformación por choque térmico de acuerdo a lo sugerido por el fabricante

Anexo 3.1Preparacion Agar LB + tributirina 1% (v/v)

1. Pesar 40 g de agar LB por cada litro a preparar, disolver en agua destilada y esterilizar

a 121ºC, 15lb, 15 minutos.

2. Adicionar 1ml de tributirina por cada 100ml de medio

3. Adicionar 10µl de Triton X-100 por cada 100ml de medio

4. Homogenizar

5. Sonicar a 70ºC durante 30 minutos homogenizando periodicamente

6. Dejar enfriar, adicional antibiotico si lo requiere y servir

Anexo 3.2Composicion Medio SOC ( medio de inducción despues de la

transformación por choque termico)

Medio SOC (formula /litro)

Triptona 20g

Extracto de Levadura 5g

NaCl0.5g

1. Mezclar hasta disolver por completo los componentes y adicionar10ml de KCl 250mM

2. Ajustar el pH a 7 con NaOH 5N

3. Ajustar el volumen a 1L con agua destilada

4. Esterilizar a 121ºC, 15lb por 15 minutos

5. Dejar que la temperatura del medio baje hasta 60ºC y adicionar 18ml de solución de

glucosa 20% (p/v)

6. Adicionar 5ml de solución de MgCl2 2M

Anexo 4 Marcadores de talla empleados en el estudio

100bp (Invitrogen) 100bp (BioRad) 1Kb (BioRad)

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Anexo 5. Protocolo de Extraccion de ADN Plasmídico según Sambrook 2001.

(modificado)

1. Inocular 2ml de caldo LB (Luria-Bertani) con el respectivo antibiotico con una

colonia bacteriana

2. Incubar a 37ºC de 16-18h a 150 rpm

3. Transferir 1.5ml del cultivo a un tubo de 1.5ml y centrifugar a maxima velocidad

por 1 minuto a 4ºC.

4. Descartar el sobrenadante y remover el medio restante

5. Resuspender completamente el pellet en 100µl de solucion de lisis I fria

mediante vortex

6. Adicionar 200µl de solucion de lisis II fresca. Mezclar cuidadosamente por

inversion 5 veces

7. Incubar en hielo por 5 minutos

8. Adicionar 150µl de solucion de lisis III. Mezclar cuidadosamente por inversion

5 veces

9. Incubar en hielo 3-5 minutos

10. Centrifugar a maxima velocidad por 5 minutos a 4ºC

11. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo

12. Adicional 4µl de RNAsa (20mg/ml) e incubar por 30 minutos a 37ºC

13. Adicionar un volumen de fenol:cloroformo: isoamil alcohol (25:24:1), mezclar

vigorosamente y centrifugar a maxima velocidad por 3 minutos a 4ºC

14. Precipitar adicionando 2 volumenes de etanol absoluto

15. Dejar precipitando 12h a -20ºC

16. Centrifugar a maxima velocidad por 5 minutos

17. Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 500µl de etanol 70%

18. Centrifugar a maxima velocidad por 5 minutos

19. Descartar el sobrenadante y dejar los tubos en posicion invertida hasta que

todo el etanol se evapore

20. Resuspender en 50µl de agua milliQ

21. Almacenar a -20ºC

Solución de Lisis I

Glucosa 50mM

Tris-Cl (pH 8.0) 25mM

EDTA (pH 8.0) 10mM

Solución de Lisis II

NaOH 0.2N

SDS 0.1% (p/v)

Solución de Lisis III

Acetato de Potasio 5M 60.0ml

Ácido acético glacial 11.5ml

Agua 28.5ml