ISSN 0373-580 X

Bol. Soc. Argent. Bot. 37 (1-2): 87 - 91. 2002

CALIBRACIóN DE AMARANTHUS CRUENTUS CV. DON GIEM COMO

TESTIGO PARA EVALUAR TAMAñO DEL GENOMA

LAURA DOPCHIZ1'2, EDUARDO J. GREIZERSTEIN12 y LIDIA POGGIO12

Summary: Calibration of Amaranthuscruentuscv. Don Glem as standard to evaluate the genome slze.TheDNA content of Amaranthus cruentus L. cv. Don Giem was calibrated using the Opaco 2 maize line asstandard. The data showed that A. cruentuscM. Don Giem does not have Intraspecific variation, its calibratedaverage being 2C = 1.29 +0.012 pg. This species is easily grown in laboratory and in natural conditions; eachplant produces many seeds that germinate easily. Therefore, A. cruentus cv. Don Giem could be used asstandard to evaluate genome size in an ample range of Angiosperm species, when 2C values are suspected

to be low.

Key words: DNA content, calibration standards, Amaranthus cruentus CM. Don Giem.

Resumen: Se calibró el contenido de ADN de Amaranthus cruentus L. cv. Don Giem, utilizando la línea demaíz Opaco 2 como testigo. Los datos obtenidos indican que A. cruentus cv. Don Giem no posee variaciónintreaespecífica y que el valor promedio calibrado es de 2C = 1,29 ±0,012 pg. Esta especie es fácilmentecultivable tanto en laboratorio como en condiciones naturales; cada planta produce numerosas semillas quegerminan fácilmente. Por lo tanto, A cruentuscM. Don Giem podría ser utilizado como testigo para evaluar eltamaño del genoma en un amplio rango de especies de Angiospermas, cuando se sospeche que el valor 2Csea bajo.

Palabras clave: Contenido de ADN, calibración, Amaranthus cruentus cv. Don Giem.

Los hechos mencionados llevaron a consideraral valor C (contenido de ADN del genoma haploide

no replicado) como un enigma que fue resuelto, en

gran parte, cuando se descubrió que la variación enel contenido de ADN (inter e intraespecífica)involucra un aumento en la cantidad y proporciónde secuencias repetidas de ADN en el genoma nu¬clear (Flavell et al., 1974), muchas de las cualesson no génicas y no transcriben (Orgel & Crick,

1980). Muchos autores consideran que las secuen¬cias repetidas son ADN egoísta, parasítico, igno¬rante (Orgel & Crick, 1980; Doolittle & Sapienza,

1980). Por otro lado, varios autores han sugeridoque las secuencias repetidas podrían contribuir alpotencial evolutivo de las poblaciones (ver revisiónen Bennett & Leitch, 1995). Se ha encontrado quela variación intra e interespecífica del tamaño delgenoma está correlacionada en muchos organismoscon caracteres fenotípicos a nivel cromosómico,celular, nuclear, y organísmico, así como con fac¬tores ecológicos, geográficos y fenológicos(Bennett 1972, 1987; Bennett & Smith, 1976;

Bennett & Leitch,1995; Bottini et al., 2000;Grime & Mowforth 1982; Grime et al., 1985;

CONICET-CIC) C. C. 4, 1836, Llavallol, Buenos Aires, Ar- Grime, 1998; Laurie & Bennett, 1985; Tito et al.,1991; Poggio et al., 1998; Porter& Rayburn, 1990;

INTRODUCCIóN

Las diferencias en el contenido de ADN puedenreflejar disimilitudes en la complejidad organísmicasi se comparan virus, bacterias y plantas superiorres. Si embargo, existen grandes variaciones entre

grupos (animales y vegetales) que no difieren encomplejidad ni requieren mayor número o tipo degenes (Bennett & Leitch, 1995). Las angiospermasposeen un amplio rango de variación en el conteni¬do de AND nuclear en el genoma básico (indepen¬dientes del nivel de ploidía), mostrando una grandiversidad entre géneros y especies pertenecientesa una misma familia (Bennett & Smith, 1976;Bennett & Leitch, 1995; Poggio & Naranjo, 1990;Poggio & Hunziker, 1986; Bottini et al., 2000). Eneste grupo, el contenido de ADN varia entre 0,2 pgen Arabidopsis thaliana L. (Heynh.) a 127,4 pg enFritillaria assyriaca Baker.

'Laboratorio de Citogenética y Evolución. Departamento deCiencias Biológicas, FCEN, UBA.J428, Buenos Aires, Ar¬gentina.

Instituto Fitotécnico de Santa Catalina (IFSC) (FCAF,UNLP), Centro de Investigaciones Genéticas (UNLP-

gentina.

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Price et al, 1998; Reeves et al, 1998; Rosato et al,1998, entre otros). Esto indicaria que el tamaño delgenoma posee valor adaptativò y que el ADN nu¬clear influencia el fenotipo por la expresión de sucontenido génico y también por los efectos físicosde su masa y volumen.

Para medir el contenido de ADN se han usadonumerosos métodos siendo la citometría de flujo yla microdensitometría con tinción de Feulgen losmétodos más ampliamente utilizados en la actuali¬dad (Bennett & Leitch, 1995). La tinción de Feulgenes específica para el ADN y los errores inherentesa la técnica pueden ser fácilmente controlados sise cuenta con un testigo cuyo valor de ADN seaconocido. Además, la utilización de un testigo ade¬cuado permite que los valores obtenidos en unida¬des arbitrarias (UA) puedan ser convertidos en uni¬dades absolutas (picogramos) (Bennett & Smith,1976). Por otro lado, Bennett & Leitch (1995) se¬ñalan que se debe elegir un testigo que posea untamaño del genoma con un valor lo más cercanoposible al de la muestra que se desea evaluar. En elpresente trabajo se recalibra el contenido de ADNde un cultivar de Amaranthus (Amaranthacear) quefue creado por el Ing. G. Covas en la Estación Ex¬perimental Agropecuaria INTA Anguil (Santa Rosa,La Pampa, Argentina) y que posee bajo contenidode ADN (2C = 1,26 pg: Greizerstein & Poggio,1994). Amaranthus cruentus L. cv. Don Giem re¬úne las características enunciadas por Bennett &Smith (1976) con respecto a la elección de un tes¬tigo y será de gran utilidad para ser utilizado al me¬dir especies con muy bajo contenido de ADN.

de ADN: (2C = 6,658 pg). Esta línea fue teñida ymedida simultáneamente con A. cruentus cv. DonGiem. En cada preparación se coloca, en un extre¬mo, un ápice del testigo y en el otro extremo unápice de la muestra a analizar, colocando distintoscubreobjetos para evitar que se mezclen ambasmuestras. De esta manera se controlan errores de¬bidos a problemas inherentes a la preparación talescomo mayor exposición a la luz de ese particularportaobjeto, distinta calidad del vidrio, etc. Si ocu¬rren eventos que den bajas medidas en la muestratambién se detectarán en el testigo. Ambos fueronmedidos el mismo día.

El contenido de ADN fue medido en núcleostelofásicos (2C) de ápices de raíces de semillasrecién germinadas. Las raíces, de una longitud de0,5-1 cm fueron fijadas en alcohol absoluto-ácidoacético glacial (3:1) durante 24 hs a temperaturaambiente (20 ± 2°C) y luego conservadas durante 3días a 5 °C. Las raíces fueron lavadas en agua desti¬lada durante 30 minutos (3 lavados de 10 minutoscada uno). La hidrólisis fue realizada con H Cl 5N a20 °C. Para la determinación del tiempo óptimo dehidrólisis se construyó una curva analizándose losvalores obtenidos con distintos tiempos dehidrólisis (20 a 90 minutos con intervalos de 10minutos entre cada uno de ellos). Se determinó, apartir de dicha curva, que el tiempo óptimo (tiem¬po en el cual se obtuvo el mayor valor de ADN) fuede 40 minutos para amaranto y el testigo. Luego dela hidrólisis las raíces se lavaron tres veces en agua

destilada durante períodos de 10 - 15 minutos cadauno. La tinción con el reactivo de Schiff pH 2.2(Teoh & Rees, 1976) se realizó durante dos horas a20° C en oscuridad. El material coloreado fue lue¬go lavado en agua sulfurosa preparada en el momen¬to (Cl H 5N y bisulfito de sodio 10%) tres vecesdurante 20 minutos cada vez. De esta manera, seelimina el Feulgen que hubiera quedado retenidoen el citoplasma. Dado que el citoplasma se utilizacomo zona testigo en las mediciones es importan¬te que se elimine todo el colorante no unido alADN, Los preparados fueron realizados por aplas¬tado del ápice radical en una gota de ácido acéticoglacial 45 %. Luego se removió el cubreobjeto me¬diante congelación con hielo seco y se deshidratócon alcohol absoluto; los preparados se montaronen Euparal.

El contenido de ADN por núcleo, expresado enunidades arbitrarias (U. A.), es medido a una longi¬tud de onda de 570 nm utilizando el método de ba-

MATERIALES Y MéTODOS

Amaranthus cruentus cv. Don Giem material lega-'do por el Ing. Agr. G. Covas y mantenido bajocultivo en la E. E. de Anguil, La Pampa y en elIFSC desde 1990.

Zea mays ssp. mays línea Opaco - 2 (Línea delIFSC).

Para calibrar el contenido de ADN deA. cruentuscv. Don Giem, se realizaron 3 experimentos (repe¬ticiones) en diferentes días en 3 sepianas sucesi¬vas, manteniendo constantes las condiciones, utili¬zando como testigo la línea Opaco 2 de maíz cali¬brada por Rosato et al (1997) y que posee, en rela¬ción a otros testigos disponibles, bajo contenido

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L. Dopchiz et a/., Calibración de Amaranthus cruentus como testigo para evaluar el tamaño del genoma

rrido en un microespectrofotómetro UniversalZeiss (UMS 30). El contenido de ADN es expresa¬do en pg (10‘12.gr.) transformando las U. A. en pg(contenido de ADN de la muestra expresada en pg= contenido de ADN (pg) del testigo x absorbanciade la muestra (U. A.) / absorbancia promedio deltestigo (U. A). Cada experimento fue realizado enforma independiente. Para evaluar las diferenciasde contenido de ADN en los diferentes experimen¬tos se realizó un análisis de la varianza, utilizandoel programa Statistica, subprograma ANOVA.

Smith, 1976). Cuando el ADN es medido por estemétodo los resultados se expresan en unidades ar¬bitrarias (U. A.). Mediante el uso de una especietestigo cuyo contenido de ADN es conocido, estasunidades pueden ser convertidas en unidades abso¬lutas (picogramos, dalton o en términosmoleculares, tales como pares de nucleótidos(1 pg = 10-12 gr. = 965 Mb; lMb=106 pares denucleótidos). Bennett & Leitch (1995) sugieren quelos testigos deben ser especies, líneas o variedadesen las que se haya corroborado fehacientemente queposeen un tamaño constante del genoma.

Bennett & Smith (1976) calibraron varias es¬pecies utilizando Allium cepa L. cv. Ailsa Craig(2C = 33,5 pg) como testigo. Por otro lado, Bennett& Leitch (1995) señalan que al evaluar un nuevotaxón se debe elegir un testigo que posea un tama¬ño del genoma lo más semejante posible.

En la Tabla 1 se muestran los datos del conteni¬do de ADN expresado en U. A. y en pg calculadosmidiendo como testigo en cada muestra Zea maysssp. mays, línea Opaco 2 (2C = 6,658 pg). El análi¬sis de la varianza muestra que no hay diferenciassignificativas dentro y entre los ensayos realizadosen diferentes días (F = 0,551; P< 0,01). Los datosobtenidos indican que A. cruentus cv. Don Giemno posee variación intraespecífica y que el valor pro¬medio calibrado es 2C = 1,290 ± 0,012 pg. (Tabla 1).Este valor no difiere del obtenido por Greizerstein& Poggio (1994), siendo levemente mayor, aunquedel mismo orden de magnitud, que el informado porBennett & Smith (2C = 1,1 pg, Bennett & Smith,1991). Esta especie es fácilmente cultivable en con¬diciones de campo, cada planta produce numerosassemillas y los ápices radiculares se encuentran dis¬ponibles durante todo el año. Por lo tanto, A.cruentus cv. Don Giem podrá ser utilizado como tes¬tigo en un amplio rango de especies de angiospermasen las que datos previos sugieren que poseen'valoresrelativamente bajos del tamaño del genoma.

RESULTADOS Y DISCUSIóN

El conocimiento del tamaño del genoma es útilen diversos campos de la ciencia tales como biolo¬gía celular, biología molecular, ecología,fitogeografía y sistemática, siendo numerosos losejemplos en los cuales este dato aporta valiosa in¬formación en estudios de evolución, con especialreferencia a mecanismos de aislamiento repro¬ductivo y modos de especiación. En estudiosmoleculares conocer el tamaño del genoma permi¬te estimar el número de clones necesarios para crearuna librería genómica y fue un factor determinanteen la elección de Arabidopsis thaliana y Oryzasativa para secuenciar genomas completos. Portodo lo expuesto, se considera que el valor C es uncarácter de importancia biológica fundamental ytiene valor predictivo en numerosos campos(Bennett & Leitch, 1995).

La medición de ADN por densitometría se basausualmente en núcleos teñidos con Feulgen. Estatinción es específica para el ADN y una vez que seha eliminado el ARN por medio de la hidrólisis áci¬da existe proporcionalidad entre la densidad detinción y el contenido de ADN. La luz absorbidapor un núcleo teñido con Feulgen es una medidacuantitativa del contenido de ADN (Bennett &

Tabla 1. Estimación del contenido deADN (2C) deAmaranthus cruentus cv Don Giem expresado en pg de cada experimento utilizando. como testigo Zea mays ssp. mays, línea Opaco 2 (2C = 6,658 pg) medido el mismo día.

Media de cada día corregidacon Zea maysssp. mays ±

E.S. (en pg)

.Media de cada-día de Zea maysssp. mays± E.S. (en U.A.)

N° de núcleos medidos(N° de individuos)

Media de cada día ±E.S. (en U.A.)Experimento

1,268 ±0,0291 3,166 ±0,0705 40(2) 16,616 ±0,181

2 3,223 ± 0,034 40(2) . 16,423 ± 0,093 1,291 ±0,014

1,313 ±0,01160(3)3 3,213 ±0,0381 16,133 ±0,142

3,200 ±0,0175 1,290 ±0,012

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Disponer de especies con amplio rango en elcontenido de ADN minimiza errores inherentes ala técnica de microdensitometría con tinción deFeulgen. Cuando se desea utilizar una especie comotestigo esta debe ser estable y no presentar varia¬ción intraespecífíca. Existen numerosos trabajosinformando la existencia de variación intra¬específíca en el contenido de ADN de varios taxa.Muchos de estos casos han sido verificados o hanpodido ser explicados sobre la base de variación enheterocromatina o cromosomas accesorios(Cavallini & Natali, 1991; Poggio et al., 1998;Porter & Rayburn, 1990; Bennett & Leitch, 1995).

Otros autores en cambio, postulan que en variosgrupos la variación intraespecífíca sería el resulta¬do de errores metodológicos (Greilhuber, 1998).Los errores inherentes a la técnica pueden ser fá¬cilmente controlados si se cuenta con un testigocuyo valor de ADN sea conocido, utilizado por másde un laboratorio y en varios grupos taxonómicos.Identificar especies con tamaño del genoma cons¬tante, calibrarla para que pueda ser utilizada como.testigo y cultivarla para tener semillas disponiblespara su distribución es un aporte importante para elestudio del tamaño del genoma.

AGRADECIMIENTOS

Los autores desean expresar el profundo agra¬decimiento al Prof. Ing. Agr. Guillermo Covas porsu constante apoyo y por el entusiasmo que nostransmitió por los estudios sobre Amarantos. A laAgencia Nacional de Promoción Científica y Tec¬nológica (ANPCyT) por su apoyo por medio de losPICT 01-04443 y 01-06583. Al CONICET por losfondos de funcionamiento del C1GEN. A la UBApor el subsidio TW01.

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Recibido el 10 de Diciembre de 2001, aceptado el 15 de Abrilde 2002.