CALIBRACION Y ESTIMACION DE LA SENSIBILIDAD …

CALIBRACION Y ESTIMACION DE LA SENSIBILIDAD TOXICOLÓGICA DE

Lemna valdiviana Phil (Araceae) EN LA REALIZACIÓN DE BIOENSAYOS DE

TOXICIDAD CRÓNICA MEDIANTE DICROMATO DE POTASIO Y SULFATO

DE COBRE COMO TOXICOS DE REFERENCIA

PROFESOR PATROCINANTE

DR. JORGE NIMPTSCH MAASS

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

PROFESOR CO-PATROCINANTE

DR. FRANCISCO ENCINA

UNIVERSIDAD CATOLICA DE TEMUCO

PROFESOR INFORMANTE

DR. STEFAN WOELFL

UNIVERSIDAD AUTRAL DE CHILE

Tesis presentada como requisito para

Optar al título de Biólogo Marino.

JOSÉ TOMÁS VALENZUELA PÉREZ

Valdivia, Octubre 2013

i

Agradecimientos

A mi profesor patrocinante Dr. Jorge Nimpstch por tomar el desafío de tenerme bajo su

tutela siendo su primer tesista y confiando plenamente en mi trabajo realizado hasta hoy

y en lo que puedo seguir aportando a futuro. Por todo el inmenso conocimiento que

transmite de manera honesta y desinteresada, sus viernes de desayuno y todos los

momentos compartidos hasta el momento. Al Dr. Stefan Woelfl por aquellas

intervenciones precisas y llenas de sabiduría en las que me corrigió siendo un verdadero

cable a tierra durante mi formación. También para Ana Lorca por toda su disposición en

enseñarme lo que no aprendí en las aulas, ese servicio militar de laboratorio tan

necesario para lograr datos, y toda esa paciencia que tuviste conmigo aquella semana

que tuvimos que lavar material que contaminé en lo que sería mi tesis en un comienzo.

Fueron días muy agradables de verdad.

Por supuesto también van mis agradecimientos a mis amigazos, los Skapitanes quienes

a pesar de los años y la distancia que nos separa, siempre se han dado el tiempo de

celebrar cerveza en mano una nueva posibilidad de vernos, y en especial a mis amigazos

valdivianos, los BIMAS, que fue con ellos con quienes formé mi familia, crecí, viví y

compartí cada plato de fideos, arroz y cualquier bajón disponible en la sencillez de cada

una de sus casas; por todos esos carretes épicos que nos pusieron a prueba en encuentros

y desencuentros…gracias!

Y por último al Colo-Colo, porque a pesar de estos 4 años de sufrimiento que hemos

tenido, fue la compañía cada fin de semana en que me tocaba visitar el laboratorio

revisando mis experimentos, gritando y sufriendo por sus actuaciones…

…Gracias a todos!

ii

Le dedico este trabajo a mi familia, los Valenzuela Pérez y los Molina-Pineda,

quienes han sido desde los primeros días hasta esta última etapa de mi formación

el pilar, contención y apoyo fundamental para lograr lo que hoy en día soy,

en especial a mi papá Pedro Valenzuela.

Y aunque nuestros caminos ya dejaron hace tiempo de compartirse,

para ti también la dedicatoria, Viexa.

iii

Resumen

Para evaluar los efectos tóxicos tanto de sustancias con potencial de toxicidad como

también mezclas complejas como son las descargas de aguas residuales - ya sean de

origen doméstico o industrial - se utilizan bioensayos para detectar y cuantificar efectos

que estas sustancias y/o sus mezclas puedan tener sobre la biota acuática. Dentro de la

normativa chilena se han incorporado en el año 1999 el bioensayo que utiliza los

crustáceos acuáticos Daphnia pulex y Daphnia magna (decreto N° 152). En el año 2002

se incorporó el bioensayo de inhibición del crecimiento mediante la utilización de la

microalga Pseudokirchneriella subcapitata (decreto N° 250/02). Sin embargo las

normativas ambientales más exigentes (Europa y EEUU) exigen bioensayos que

involucren todos los niveles tróficos de ecosistemas acuáticos. La comunidad científica

también ha manifestado la necesidad de incorporar especies nativas a ser utilizadas en

bioensayos para evaluar el potencial tóxico de sustancias y efluentes en las distintas

regiones del mundo ya que en diversas ocasiones se ha encontrado que las especies

nativas presentan una sensibilidad mayor a las especies utilizadas en bioensayos

estandarizados y estos últimos no protegen necesariamente la biota nativa. Bajo estas

circunstancias se ocupó la macrófita acuática endémica de la región de Los Ríos (Chile)

Lemna valdivina como un potencial organismo en la utilización de bioensayos para la

evaluación ecotoxicológica de efluentes y compuestos tóxicos. Se evaluó la sensibilidad

de 4 puntos finales (número de frondas NF, área de las frondas AF, peso húmedo PH y

contenido de clorofila total CTC) que posee la planta frente a dos tóxicos de referencia:

Dicromato de potasio (K2Cr2O7) y Sulfato de cobre (CuSO4 5H2O). Se efectuaron 5

ensayos de exposición utilizando dicromato de potasio y 3 ensayos de exposición

utilizando sulfato de cobre. En ambos casos se buscó un rango de sensibilidad

preliminar para luego acortar la amplitud de las concentraciones a evaluar.

iv

Los resultados fueron expresados como EC50, que en otras palabras corresponde a la

concentración efectiva utilizada que inhibe el 50% del crecimiento de la población

expuesta a un tóxico determinado. Estos valores mostraron una correlación positiva

entre la cantidad de toxico utilizado y la inhibición en el crecimiento mostrado por la

planta medido según los 4 puntos finales de evaluación. De estos, el parámetro más

sensible al cromo ordenados de mayor sensibilidad al de menor sensibilidad fue: CTC

(0,073 mg/L Cr(VI))>PH (0,66 mg/L Cr(VI))>AF (0,171 mg/L Cr(VI))>NF (0,91 mg/L

Cr(VI)).

La sensibilidad de la planta frente a la exposición de sulfato de cobre quedó presentada

por los siguientes valores de EC50, desde el más sensible al menos sensible: PH (0,489

mg Cu(II)) > AF (0,512 mg Cu(II)) > CTC (0,623 mg Cu(II)) > NF (0,716 mg Cu(II).)

Se concluye que Lemna valdiviana posee buena sensibilidad y parámetros de evaluación

ecotoxicológica, frente a metales pesados, respondiendo de manera proporcional a la

cantidad de toxico empleado en este trabajo

v

Índice

1 Introducción

1.1 Evaluación de la calidad ambiental del agua……………………….…….…1

1.2 Métodos biológicos para la estimación de calidad de aguas……….……….2

1.3 Bioensayos de toxicidad………………………………………….…………3

1.4 Estado actual de la utilización de bioensayos en Chile………………….….4

1.5 Utilización de plantas acuáticas en bioensayos de toxicidad………………..5

1.6 El incipiente uso de lemnáceas en ensayos de toxicidad……………………7

2 Hipótesis…………………………………….………………………………………10

3 Objetivo general…………………………………………………………………….. 10

3.1 Objetivos específicos…………………………………...………………11

4.1 Materiales y métodos

4.1.1 Elección del material biológico…………………………………………..11

4.1.2 Características de las Lemnáceas…………………………………………12

4.1.3 Lemna valdiviana………………………………………………….…...…12

4.1.4 Recolección y mantención del material biológico………………………..14

4.1.5 Preparación del medio de cultivo…………………………………………15

4.1.6 Toxico de referencia……………………………………………………...15

4.2 Diseño experimental……………………………………………………………….16

4.2.1 Inoculación de los organismos…………………………………………..18

vi

4.2.2 Tasa de crecimiento………………………………………………………18

4.2.3 Número de frondas (NF)…………………………………………………18

4.2.4 Área de las frondas (AF)…………………………………………………19

4.2.5 Peso húmedo (PH)……………………………………………………….20

4.2.6 Contenido de clorofila total (CTC)………………………………………20

4.2.7 Evaluación de los puntos finales…………………………………………21

5 Resultados

5.1 Evaluación toxicológica del Cr (VI)……………………………………….23

5.1.2 Tasa de crecimiento e inhibición de crecimiento………………....24

5.1.3 Efecto fitotóxico del Cr (VI) en Numero de frondas (NF)……….28

5.1.4 Efecto fitotóxico del Cr (VI) en el área foliar (AF)………………32

5.1.5 Efecto fitotóxico del Cr (VI) en peso húmedo (PH)……………...36

5.1.6 Efecto fitotóxico del Cr (VI) en el contenido total de clorofila

(CTC)……………………………………………………...……………39

5.2 EC50, NOEC y LOEC en el número de frondas de Lemna valdiviana…….42

5.2.1 Parámetros del análisis de regresión PROBIT para el punto final NF

en el experimento de calibración A……………………………………..44

5.2.2 Parámetros del análisis de regresión PROBIT para el punto final

NF en el experimento de calibración B…………………………………44


en el experimento de calibración C……………………………….…….45


en el experimento de calibración D……………………………………..46

vii


en el experimento de calibración E……………………………..………47

5.3 EC50, NOEC y LOEC en el área de las frondas de Lemna valdiviana

5.3.1 Parámetros del análisis de regresión PROBIT para el punto final AF

en el experimento de calibración A……………………………………..49


en el experimento de calibración B…………………………………..…50


en el experimento de calibración en C………………………………….51


en el experimento de calibración D……………………………………..52


en el experimento de calibración E……………………………………..53

5.4 EC50, NOEC y LOEC en el peso húmedo de Lemna valdiviana


PH en el experimento de calibración A…………………………………55

5.4.2 Parámetros del análisis de regresión PROBIT de Biomasa en el

ensayo B………………………………………………………………...56


ensayo C………………………………………………………...………56


ensayo D………………………………………………………………..57

viii


ensayo E………………………………………………………………...58

5.4.6 Respuestas de inhibición en CTC y EC50 para los ensayos A, B, C,

D y E……………………………………………………………………60

5.5. Evaluación toxicológica del Cu (II)…………………………………….64

5.5.1 Tasa de crecimiento e inhibición de crecimiento…………………66

5.5.2 Efecto fitotóxico de Cobre (Cu2+

) en número de frondas (NF)…..68


) en área foliar (AF)……………70


) en peso húmedo (PH)………...73


) en contenido de clorofila total

(CTC)……………………………………………………….…………..75

5.6. EC50, NOEC y LOEC en el número de frondas en L. valdiviana……...77


NF en el experimento de calibración P…………………………………79


NF en el experimento de calibración Q………………………………...80


NF en el experimento de calibración R…………………………………81

5.7. EC50, NOEC y LOEC en el área de las frondas de Lemna valdiviana


AF en el experimento de calibración P…………………………………83

ix


en el experimento de calibración Q…………………….……………….84


AF en el experimento de calibración R…………………………………85

5.8. EC50, NOEC y LOEC en peso húmedo de Lemna valdiviana

5.8.1Parámetros del análisis de regresión PROBIT para el punto final AF

en el experimento de calibración P……………………………………..87


AF en el experimento de calibración Q………………………….……..88


AF en el experimento de calibración R…………………………………89

5.8.4 Respuestas de inhibición en CTC y EC50 para los ensayos P, Q y

R……………………………………………………………….………..91

6. Discusión………………………………………………………………...…………..94

7 Conclusiónes….……………………………………………………………………..102

8 Referencias Bibliográficas…………………………………………………...……...103

9.- Anexos…………………………………………………………………………….110

1

I. Introducción

1.1.- Evaluación de la calidad ambiental en agua

La preocupación por la contaminación acuática surge como consecuencia del

indiscriminado vertido de efluentes industriales, urbanos y contaminantes de origen

agrícola hacia cauces naturales. Este hecho ha propiciado un auge en el desarrollo de

metodologías para valorar mediante biocriterios los niveles de exposición a compuestos

químicos, llegando incluso a establecerse límites permitidos de sus concentraciones

tanto en agua como en sedimentos (Di Toro et al., 1991; Bro-Rasmussen et al., 1994).

La evaluación de la calidad del agua se ha realizado principalmente en base a análisis

físicoquímicos. Los Métodos fisicoquímicos son una medida instantánea del momento

en que se realizan las mediciones y no permiten explicar con claridad períodos previos a

la muestra. Con estos análisis fisicoquímicos se puede determinar los niveles exactos de

los contaminantes dentro del agua, por lo tanto estos análisis se restringen en verificar la

presencia de algún compuesto específico en el agua, y permite detectar las fuentes

puntuales de los mismos. Sin embargo, el carácter contaminante de un elemento

químico viene definido principalmente por los daños o efectos biológicos que pueda

causar. Por otra parte la cantidad y diversidad de sustancias que pueden llegar a los

sistemas acuáticos son muy numerosas, lo que hace imposible el control de todas ellas;

además la complejidad que alcanzan los medios acuáticos por su propia dinámica, por

las sustancias que contienen y sus interacciones o efectos sinérgicos, hacen más

ineficientes a las medidas fisicoquímicas puntuales.

A pesar del gran desarrollo de metodologías analíticas y la avanzada tecnología

instrumental disponible en la actualidad para el monitoreo físicoquímico de efluentes y

2

cuerpos de agua receptores, este enfoque, aunque muy valioso, sólo permite identificar

y cuantificar los diferentes constituyentes descargados en el sistema (APHA-AWWA-

WEF, 1998; Manahan, 2007). Estimar los efectos en la biota basándose exclusivamente

en este tipo de datos es incompleto por diferentes razones. Por un lado, conocer la

composición química de un efluente no proporciona información sobre sus efectos

biológicos en el cuerpo de agua receptor. Por otra parte, cuando una sustancia se

incorpora en un sistema acuático, las reacciones químicas que puedan ocurrir al

producirse esta mezcla pueden modificar significativamente la biodisponibilidad de la

sustancia, aumentando o disminuyendo su toxicidad. Para el caso de mezclas de

diferentes compuestos, no es posible predecir su toxicidad con exactitud, aun

conociendo las toxicidades de sus componentes individuales, dada la posibilidad de que

se generen efectos sinérgicos, aditivos o antagónicos de los contaminantes en los

sistemas vivos. Todo esto sin considerar que monitorear todos los constituyentes en un

efluente o cuerpo de agua superficial puede implicar costos elevados además de su baja

practicidad (Burton, 1990; Cairns & Mount, 1990; Newman & Jagoe, 1996; Castillo,

2004).

1.2.- Métodos biológicos para la evaluación de la calidad de aguas

Por otro lado, los métodos biológicos permiten determinar la toxicidad de agentes

físicos y químicos sobre un organismo de prueba bajo condiciones experimentales

específicas y controladas. Se basan en los efectos que tienen los componentes del agua

sobre los organismos, por ello pueden dar cuenta de eventos ocurridos con anterioridad

o efectos a largo plazo sobre el sistema biológico. Sus efectos estarán condicionados por

las características del efluente o toxico empleado así como de la concentración y tiempo

3

de exposición a la que sea expuesto, teniendo como resultado en una exposición aguda

la muerte del individuo y en una exposición crónica efectos subletales tales como

alteraciones bioquímicas, cambios a nivel morfológico y fisiológico, efectos en el

crecimiento, cambios en su tasa de descendientes, entre otros.

1.3.- Bioensayos de toxicidad

Así es como se han implementado los bioensayos, los cuales se definen como la

medición experimental de cualquier perturbación de un sistema biológico determinado

causado por un agente químico o físico (Brown, Bay y Thompson, 1986). En forma más

precisa, se les puede definir como la cuantificación de la relación concentración-efecto

(y/o dosis-efecto) de una sustancia contaminante que provoque un efecto adverso o

alguna lesión sobre un sistema biológico determinado, bajo condiciones controladas de

terreno o laboratorio. Si bien un determinado factor no afecta algunas especies, puede

tener marcados efectos sobre otras. Los efectos se miden directamente en los

organismos a través de la muerte de éstos, efectos en el crecimiento individual o

poblacional, cambios en la dinámica del ecosistema, etc., llegando incluso a determinar

efectos a niveles de modificaciones o alteraciones genéticas producto de adaptaciones o

daños a ese nivel en una escala de tiempo mayor como parte del proceso natural de

evolución, siendo los cambios producidos por efectos de la polución mucho más rápidos

que los que se producen en forma natural, por lo que si no se controlan los efectos de los

contaminantes muchas especies que no puedan adaptarse tendrán mayor probabilidad de

desaparecer.

4

Existe en la actualidad una gran variedad de bioensayos de toxicidad estandarizados,

que utilizan plantas, invertebrados y vertebrados acuáticos para evaluar los efectos

biológico-ambientales de efluentes complejos (totales) o de compuestos o elementos

específicos sobre cuerpos acuáticos receptores. El desarrollo de los respectivos

protocolos ha estado relacionado principalmente con la APHA (American Public Health

Association), EPA (Environmental Protection Agency) y ASTM (American Society for

Testing of Materials) de Estados Unidos, y la oficina ambiental de la Comunidad

Europea. La FAO con su Manual de Métodos de Investigación del Medio Ambiente

Acuático da algunos criterios tendientes a regular y dar a conocer estas técnicas

tendientes a proteger el medio acuático continental, marino, y las áreas costeras. La

manera de evaluación es a través de respuestas crónicas y agudas dependiendo del

organismo utilizado y objetivo del análisis.

1.4.-Estado actual de la utilización de bioensayos en Chile

La evaluación de toxicidad de agua dulce a través de métodos biológicos se encuentra

normalizada en Chile desde el año 1999 tras incorporarse dentro de la legislación

chilena 3 tipos de bioensayos. El primero para la estimación de la toxicidad en aguas

residuales de origen industrial (RILES) mediante el bioensayo de inhibición en el

crecimiento de la bacteria Bacillus subtilis (Nch2313/26. Of1999), el segundo para la

determinación de la calidad del agua mediante el cálculo de la inhibición en la

movilidad en el microcrustáceo de agua dulce Daphnia magna y Daphnia pulex. (Nch

2083/1999) y por último el bioensayo para la determinación de la calidad del agua

mediante la inhibición de crecimiento en la microalga Selenastrum capricornutum

(Raphidocelis subcapitata) (Nch2706/2002). Sumado a estos, se han estandarizado el

5

uso del bioensayo con el cladócero Daphnia obtusa (Silva et al 2003) debido a sus

ventajas de sensibilidad y prolificidad respecto de las especies Daphnia magna y

Daphnia pulex que actualmente conforman la norma chilena para determinación de

toxicidad aguda con este tipo de organismos.

Es recomendable que cada país tenga estandarizado diversos métodos de ensayo donde

las especies autóctonas estén, en lo posible, representadas. Por lo mismo en nuestro país

se han utilizado varias especies autóctonas tanto de agua dulce como de agua salada

como organismos de ensayo en evaluaciones de toxicidad. Entre ellas está el erizo de

mar Arbacia spatuligera (Larrain et al. 1999), el anfipodo marino Ampelisca araucana

(Larrain et al. 1998), el pejerrey Odontesthes regia (Silva et al. 2001) y los copépodos

Tisbe longicornis (Larrain et al. 1998) y Eucyclops neumani neumani (Soto et al. 2003).

Algunas especies de bivalvos marinos como Argopecten purpuratus (Troncoso et al.

2000), Aulacomya ater, Choromytilus chorus, Perumytilus purpuratus, Semimytilus

algosus (Zúñiga et al. 2003) y el bivalvo de agua dulce Diplodon chilensis (Silva at al

2007) también han sido usadas como organismos de ensayo. Sin embargo para el

ambiente acuático continental de Chile no se dispone de un protocolo estandarizado de

bioensayo de ecotoxicidad que incorpore plantas vasculares como prueba de ensayo.

1.5.-Utilización de plantas acuáticas en bioensayos de toxicidad

Las plantas acuáticas están representadas por una gran variedad de especies presentes en

distintos hábitats. Tienen un importante rol en la producción de oxígeno, reciclaje de

nutrientes, control de la calidad de agua, estabilización de los sedimentos y además

proveen de protección a los organismos acuáticos y a distintos tipos de fauna asociada

en general (Mohan and Hosetti, 1998). Adicionalmente el fitoplancton, epifitas adjuntas

6

a algas, y macrófitas son la principal fuente de energía primaria para muchos

ecosistemas acuáticos.

El uso de plantas acuáticas como biomonitores in-situ (organismos centinelas) para la

evaluación de la calidad de agua ha sido una práctica cada vez más común a lo largo de

los años ya tempranamente presentada por Whitton (1979), Schubert (1984) y Dixit et al

(1992). Las plantas acuáticas también han estado siendo ocupadas para remover sólidos

suspendidos, nutrientes, metales, bacterias y compuestos tóxicos desde el drenaje de las

mineras y escorrentías de aguas provenientes de vertederos agrícolas y urbanos. Sin

embargo, no son comúnmente utilizados como organismos de prueba en ensayos de

toxicidad que buscan evaluar el riesgo potencial de ciertas mezclas o efluentes. El status

secundario de las plantas acuáticas en la estimación de la contaminación mediante

bioensayos no es consistente con la importancia ecológica que presenta en el

ecosistema.

Se considera, erróneamente, que los resultados de los ensayos de toxicidad con especies

animales pueden ser extrapolados para la protección de especies vegetales (Mohan &

Hosetti, 1999; Lytle & Lytle, 2001) sin embargo el efecto de agentes tóxicos sobre

cierto tipo de organismo puede variar considerablemente de acuerdo al nivel trófico y el

tipo de especie.

Entre las plantas vasculares acuáticas, los antecedentes bibliográficos indican que varias

especies de Lemnáceas se han venido utilizando desde hace más de 20 años para la

realización de estudios fisiológicos así como toxicológicos (Landolt & Kandeler, 1987;

Wang, 1990; Subhandra et al., 1991; Huebert et al., 1993a,b; Sinha et al., 1994; Lewis,

1995; Mazzeo et al., 1998; Samardakiewicz & Woźny, 2005). Organismos oficiales de

protección ambiental, tanto europeos como americanos, sugieren el uso de las especies

7

de Lemnáceas en la aplicación de protocolos estandarizados de ensayos para la

evaluación de efectos fitotóxicos de compuestos puros y de muestras ambientales

complejas, además de su uso en la certificación y registro de nuevas sustancias

(USEPA, 1985; ASTM, 1991b; Boutin et al., 1993; Boutin et al., 1995; USEPA, 1996;

Environment Canada, 1999b; OECD 2002; Environment Canada, 2007). Esto debido a

la amplia variedad de ambientes en el que pueden desarrollarse este tipo plantas y su

gran sensibilidad a sustancias tenso-activas, compuestos hidrofóbicos o aquellas

sustancia concentradas en la interface aire-agua.

1.6 El incipiente uso de Lemnáceas en ensayos de toxicidad

Las Lemnáceas se caracterizan por ser plantas pequeñas (intervalo de tamaño entre 1 a

60 mm), no arraigadas (flotantes o sumergidas), y de crecimiento rápido, duplicando su

biomasa via multiplicación vegetativa entre cada 24 y 72 horas, dependiendo de la

especie y de las condiciones del medio (Landolt, 1986). Estas características hacen a

estos organismos ideales para su cultivo en el laboratorio en condiciones controladas de

intensidad de luz, fotoperiodo y temperatura, utilizando medios nutritivos de

composición definida. Esto posibilita mantener poblaciones monoclonales

indefinidamente permitiendo disponer de manera continua de material homogéneo para

la realización de bioensayos. Por otra parte, al ser plantas de tamaño tan reducido, los

requerimientos de espacio y volumen de solución necesarios para el mantenimiento de

biomasa y para la realización de los ensayos de toxicidad, son reducidos. Esto se traduce

en la disminución de costos de cultivo, en la ejecución de los bioensayos y posibilita

realizar un mayor número de repeticiones (Landolt, 1986; Wang, 1990; Huebert &

Shay, 1993a; Lewis, 1995). Desde el punto de vista ecológico, la importancia del uso de

Lemnáceas radica en la variedad de ambientes acuáticos en los que estas plantas

8

vasculares se desarrollan, abarcando desde lagos, lagunas, charcas y otros cuerpos de

agua lenticos con diferentes estados tróficos, encontrándose también en aguas

estuariales salobres. Por otro lado, Lemnaceae es una familia de distribución geográfica

mundial, desde zonas tropicales hasta zonas templadas (Hillman & Culley, 1978;

Wetzel, 1981; Landolt, 1986; Landolt, 1996).

Dentro del género Lemna, las especies más difundidas y recomendadas para el uso en

los bioensayos de toxicidad son Lemna minor y Lemna gibba, entre las flotantes

(ASTM,1991b, Wang, 1992; Boutin et al., 1993; Peterson et al., 1994; Singh et al.,

1994b; Lewis, 1995; USEPA, 1996; Mazzeo et al., 1998; Environment Canada, 1999b;

Lytle & Lytle, 2001; OECD, 2002; Environment Canada, 2007) y Lemna trisulca como

especie sumergida (Huebert & Shay, 1993a; Huebert et al., 1993; Lewis, 1995; Prasad

et al., 2001). Otras especies como L. perpusilla, L. paucicostata, L. valdiviana y L.

polyrrhiza también se han aplicado a estudios ecotoxicológicos aunque su uso no se

encuentra ampliamente difundido (Wang, 1992; Lewis, 1995). Para el caso de Lemna

valdiviana la literatura disponible muestra que su sensibilidad se ha puesto a prueba a

través de la exposición de metales pesados cadmio (Cd) y cobre (Cu2+

) tomando como

punto final su número de frondas (Mohan & Hosseti 1999) (Tabla 1)

Este género ha sido utilizado ampliamente como indicador de contaminación en el

hemisferio norte (i.e. Lemna minor) y en menor grado en el hemisferio sur como

organismo fitodepurador de efluentes domiciliarios. La caracterización del efecto es

medido principalmente en las variaciones producidas en la tasa de crecimiento, área de

las frondas y biomasa final todos relacionados y normalizados con el control negativo.

9

Toxico empleado Especie Días de

exposición IC50/EC50

mg/L Referencia

Cr(VI) L. minor 4 35 Wang (1986a)

Cr(VI) L. minor 14 6 Mangi et al. (1978)

Cr(VI) Spirodela polyrhiza 14 >10 Mangi et al. (1978)

Cr(VI) L. minor 7 0,052 Landolt & Kandeler (1987)

Cr(VI) L. minor 7 35 Mohan & Hosetti (1999)

Cr(VI) L. minor 14 6 Mohan & Hosetti (1999)

Cu L. minor 4 1.1 Wang (1986a)

Cu L. minor 7a 0.119 Wallbridge (1977)

Cu L. minor 7a 0.8 Bishop and Perry (1981)

Cu L. minor 7 1,1 Mohan & Hosetti (1999)

Cu L. valdiviana 21 0.14 Hutchison and Czyrska (1975)

Cu L. gibba 7 0,9 - 1,3 Mohan & Hosetti (1999)

CuSO4 L. gibba 7c 2.21 Davis (1981)

CuSO4 L. gibba 7a.c 3.51 Davis (1981)

Tabla 1: Valores de EC50 obtenidos por diferentes autores en 4 distintas especies de lemnáceas

para cromo y cobre. Se observa que el número de días de exposición no siempre es el mismo por lo

que los valores pueden no ser del todo comparables.

10

2. Hipótesis

En la realización de esta tesis se ponen a prueba las siguientes hipótesis:

1. Existen parámetros fisiológicos medibles más representativos que indiquen la

condición de salud en la lenteja de agua que el predominante hasta ahora

mediante la evaluación del número de frondas.

2. Las respuestas fisiológicas halladas son constantes y repetibles a lo largo del

tiempo en condiciones de laboratorio, lo que permite su utilización en la

estimación de la toxicidad con respuestas ajustadas a la acción del toxico y no

producto del azar.

3. Objetivo General

El objetivo principal de este trabajo de tesis es evaluar la sensibilidad de distintos

parámetros y/o indicadores considerados como puntos finales ecotoxicológicos del

crecimiento en lemnáceas y estimar sus valores de EC50 como respuesta a la exposición

de Dicromato de potasio (K2Cr2O7) y Sulfato de cobre heptahidratado (CuSO4·5H2O)

11

3.1 Objetivos específicos

Aislar y mantener un monocultivo de la planta endémica Lemna valdiviana en

condiciones de laboratorio bajo condiciones estandarizadas.

Estimar el rango de concentración efectiva (EC50) que inhibe el crecimiento de

Lemna valdiviana en el 50% de la población como respuesta a la exposición

diferentes tóxicos de referencia: Dicromato de Potasio (K2Cr2O7) y Sulfato de

cobre (CuSO4 5·H2O)

Comparar la sensibilidad que posee Lemna valdiviana con sus símiles de otros

lugares.

4. Material y metodología

4.1.1 Elección del material biológico: Se decidió ocupar la especie Lemna valdiviana principalmente porque en Chile no se

utilizan plantas acuáticas para ensayos ecotoxicológicos y por sus ventajas en el fácil

manejo en laboratorio, rápido crecimiento, la abundancia en su ambiente natural, por

representar un nivel trófico importante dentro del ecosistema acuático y por ser un

organismo endógeno de nuestra región (Valdivia, Chile). Además la lenteja de agua ha

resultado ser un buen organismo para utilizar en bioensayos, pues la prueba de

inhibición del crecimiento es simple, sensible y económica. Este tipo de análisis ha sido

recomendado por las agencias estatales de los Estados Unidos (USEPA) y por la

Organización Internacional para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE).

Además, en la lenteja de agua se agrupan condiciones de una especie ecológicamente

relevante (EER) en sistemas con bajo o mediano conocimiento ecológico. Condiciones

cualitativas tales como dominancia numérica en biomasa dentro de un sistema,

distribución amplia y su significativo tamaño hacen que este organismo interactúe e

4.1 Material y metodología

12

influya de mayor manera que otras especies potencialmente aptas para bioensayos. Esto

en el marco de la implementación de la evaluación de riego ecológico (ERE) en la

legislación chilena (Ramos et. al.2013)

4.1.2 Características de las lemnáceas

Las lemnáceas son plantas vasculares que flotan libremente sobre la superficie del agua,

son de pequeño tamaño y se componen de estructuras similares a las hojas llamadas

frondes. Son de forma elíptica desde la cual emerge una raíz. Prosperan en ambientes de

agua estancadas o corriente lenta. La producción de nuevas frondes es muy rápida

alcanzando en condiciones óptimas de luz, temperatura y nutrientes un crecimiento

exponencial duplicando su número de frondes en un período de 2 a 4 días. Su tamaño

por lo general no supera los 5 mm de diámetro.

Se reproducen por vía vegetativa a partir de yemas que nacen desde cavidades laterales

ubicadas en la región basal de la fronda, las cuales permanecen unidas a la fronda

progenitora hasta alcanzar el tamaño suficiente, formándose así grupos clonales de la

planta. Se distribuyen alrededor de todo el mundo existiendo 4 géneros: Spirodela,

Lemna, Wolffia y Wolffiela y abarcan cerca de 40 especies.

4.1.3 Lemna valdiviana

Es una de las lemnáceas más difíciles de reconocer. Pueden ser distinguidos de otros

congéneres por sus cuerpos muy delgados, a veces transparentes. Estas plantas pueden

estar en grupos de 4-8 frondas con textura de superficie translúcida uniforme y alargada.

El cuerpo de la planta presenta una sola vena larga (generalmente visible en plantas

vivas o muertas con retroiluminación). Ésta característica parece ser la más fiable para

13

distinguir esta especie de otras. Generalmente suele confundirse a L.valdiviana con L.

minuta dada sus similares características y sus problemas para distinguirlas (Landolt

1986), incluso sus nombres son considerados por el Proyecto DAISIE Europea (2008)

como sinónimos.

Tabla 2: características generales para la identificación taxonómica entre 3 tipos de lemnáceas:

Lemna minuta, Lemna valdiviana y Lemna minor.

Lemna minuta

(Kunth) Lemna valdiviana

(Philippi) Lemna minor

(Linnaeus) Raíz Una raíz Una raíz Una raíz

Forma del cuerpo

Aplanada, ovalada,

simétrica. Levemente

engrosado en su centro

y delgadez en su

margen

Aplanada y ovalada. A

menudo asimétrica (oblicua o

curvada lateralmente) verde

pálido en la base.

Aplanada y ovalada. A

menudo asimétrica (oblicua

o curvada lateralmente)

verde pálido en la base.

Tamaño 1-3 mm longitud

(generalmente sólo 1

mm)

2-4 mm de largo 2-4 mm de largo

Venas

Una vena tenue que se

extiende desde el nodo

hasta el ápice (a

menudo no discernible)

Una vena (a menudo visible a

contraluz). Se extiende 3/4 de

distancia entre el nodo y el

ápice

3 venas

Posición bolsa de

florecimiento

2 bolsas laterales en

cada lado del extremo

basal

2 bolsas laterales en cada lado

del extremo basal

2 bolsas laterales en cada

lado del extremo basal

Posición de la flor

Dentro de membranas

en forma de vasos

Dentro de membranas en

forma de vasos

Dentro de membranas en

forma de vasos

Disposición de los

clústeres clonales

Solitario o conectados

en pares (especialmente

en condiciones de

hacinamiento y plena

luz)

Usualmente conectados entre

4 a 8

Solitarios o en conjunto

(3-5)

Hábitat Estanques de agua

dulce, pantanos y

arroyos tranquilos

Estanques de agua dulce,

pantanos y arroyos tranquilos.

También presentes bajo otra

vegetación acuática

Estanques de agua dulce,

pantanos y arroyos

tranquilos

Distribución

Desde EE.UU hacia el

sur a través de México a

América del sur. Europa

y Rusia

Desde el este de EE.UU, a

través de México a América

central y Sur.

Hemisferio Norte (América,

Europa, Rusia y Asia)

También en el Hemisferio

Sur (Australia y Nueva

Zelanda)

14

Figura 1: Morfología externa de Lemna valdiviana utilizada en los

experimentos de calibración a tóxicos de referencia.

4.1.4. Recolección y cultivo del material biológico:

Se colectaron plantas desde aguas apozadas del sector de El Bosque (39°84’S, -

73°23’W aprox.) en la ciudad de Valdivia las que fueron transportadas en botellas junto

con agua del mismo sector al laboratorio de Bioensayos y Limnología Aplicada de la

Universidad Austral de Chile (Valdivia). En el laboratorio se seleccionaron a pulso las

colonias de mejor aspecto visual para ser inoculadas con la misma agua traída

esperando su aclimatación en una cámara de cultivo JSPC-300C. Luego de una semana

se modificó el medio por una preparación salina (preparación de Steinberg modificado

por Altenburger, (Tabla 3) según DIN EN ISO20079 (2006), el cual les provee

nutrientes necesarios para su crecimiento óptimo en condiciones controladas. El medio

nutritivo de Steinberg fue recambiado 3 veces por semana para evitar efectos

alelopáticos que pueden provocar la aparición de microalgas (Van Vierssen and Prins

1985; Kemp et. al., 1988), eutrofización y/o ataque bacteriano. Se busca lograr que los

individuos alcancen un crecimiento sostenido en el tiempo libre de factores estresores y

contaminantes para ser utilizados en los bioensayos.

15

4.1.5. Preparación del medio de cultivo:

El agua reconstituida se preparó a partir de 5 soluciones salinas mezcladas según

protocolo DIN EN ISO/20079 y diluidas en 1 Litro de agua destilada. Esta mezcla

nutritiva se utiliza tanto para la mantención de las colonias de plantas como para la

exposición al tóxico.

Tabla 3: Soluciones nutritivas para el cultivo de lemna

valdiviana según medio de Steinberg (modificado por

Altenburger)

4.1.6 Tóxico de Referencia

Se utilizó una solución madre del toxico Dicromato de Potasio (K2Cr2O7- Merck) a

partir de su sal anhídrica y Sulfato de cobre (CuSO4·5H20 - Arquimed). Para nuestra

experimentación se hizo una preparación de una solución madre de 250 mg/l de

K2Cr2O7 y una solución de 50 mg/l de CuSO4·5H20 las que fueron diluidas

posteriormente en la preparación de los ensayos.

Macronutrientes mg/l

KNO3 350

Ca(NO3)2·4H2O 295

KH2PO4 90

K2HPO4 12,6

MgSO4·7H2O 100

Micronutrientes µg/l H3BO3 120

ZnSO4·7H2O 180

NaMoO4·2H2O 44

MnCl2·4H2O 180

FeCL3·6H20 760

EDTA Disodium-

dihydratado 15000

16

4.2. Diseño Experimental

Se estudió de manera comparativa la fitotoxicidad de 2 metales pesados: Cr(VI), a

través de su sal anhídrida dicromato de potasio (K2Cr2O7), y cobre (Cu2+

) a través de su

sal pentahidratada Sulfato de cobre (CuSO4∙5H2O) ambas sales de calidad analítica.

Para estos dos tóxicos de referencia se evaluó la sensibilidad fitotoxica de Lemna

valdiviana según 4 parámetros como puntos finales para la estimación de los efectos de

inhibición del crecimiento (IC): Área foliar (AF), Número de frondas (NF), Biomasa

según su peso húmedo (PH) y el contenido de clorofila total (CTC) por cada

tratamiento.

Los experimentos fueron realizados entre Octubre del 2012 hasta Agosto del 2013. Los

bioensayos se realizaron con 6 réplicas para el control negativo y 7 concentraciones por

triplicado para la evaluación de fitotoxidad tanto para dicromato de potasio como en el

caso de sulfato de cobre. Para dicromato se ensayaron concentraciones que fueron desde

los 0,04 mg/l a 2,8 mg/l de Cr(VI).

En el caso de la evaluación de toxicidad con cobre, se ensayó concentraciones que

fueron desde los 0,01 a los 2 mg/l de Cu2+

.

El volumen final de preparación por cada recipiente de exposición fue de 100 ml cada

una que incluye además un porcentaje de medio de cultivo concentrado y agua destilada

para la dilución final. La preparación se realizó siguiendo el protocolo estandarizado

DIN EN ISO 20079 (2006).

En el caso de dicromato de potasio las concentraciones preparadas fueron evaluadas

espectrofotométricamente para verificar su concentración final. Para lograrlo se realiza

un espectro de absorción de la solución del tóxico preparado para conocer el peak de

absorción de la solución preparada. Las concentraciones preparadas a las que fueron

17

expuestas las lemnáceas fueron medidas previamente utilizando un fotómetro

(Spectroquant® Pharo 300 MERCK) donde a través de los valores de absorción

medidos a diferentes concentraciones se logra conocer la linealidad y eficiencia en la

preparación de las diluciones.

Figura 2: Curva de calibración de las distintas soluciones

preparadas con dicromato de potasio, las que

fueron medidas a 331 nm de longitud de onda

En el caso de la preparación del sulfato de cobre y debido al bajo contenido de color en

cada una de las diluciones no fue posible evaluar por fotometría la concentración final

de los tratamientos a ensayar.

La cantidad de tóxico a utilizar, así como también la cantidad de agua de dilución en los

tratamientos, se calcularon de la siguiente manera:

V1* C1 = V2* C2 (1)

Donde V1: volumen de toxico a añadir; C1; concentración inicial; V2: volumen final; C2:

concentración final.

La duración del experimento fue de 7 días en condiciones controladas de laboratorio.

Para lograr esto, se ocupó una cámara crecimiento para plantas modelo JSPC-300C

18

programada con una temperatura de 20°C ± 2°C, fotoperiodo de 14 horas luz/10 hrs

oscuridad y una luminosidad de 5000 lúmenes.

En este trabajo se realizaron 5 calibraciones con dicromato de potasio las que fueron

categorizadas como A, B, C, D & E respectivamente.

En el caso del Sulfato de cobre pentahidratado se realizaron 3 repeticiones de la

calibración las que fueron categorizadas como P, Q & R.

4.2.1 Inoculación de los organismos

En cada uno de los vasos se inocularon 20 frondas (10 colonias de Lemna valdiviana),

las cuales son previamente pesadas (peso húmedo). El criterio de elección de los

organismos es que cada colonia tenga 2 frondas de similar tamaño y sin evidentes

rasgos de división vegetativa para evitar sesgos que puedan producirse por una mala

estimación del crecimiento.

4.2.2 Tasa de crecimiento

Para realizar la estimación del crecimiento de la lenteja de agua se llevó registro

fotográfico diario de cada una de las réplicas ensayadas en las distintas concentraciones

con el fin de evaluar por conteo el número total de cada replica ensayada así como

también el aumento de la superficie foliar total cada 24 horas.

4.2.3 Numero de frondas (NF)

El conteo de las frondas se realizó mediante la observación de fotografías que se

capturaron día tras día a la misma hora. Se consideró como criterio para la

19

discriminación entre una yema interna y una hoja nueva la línea perimetral de la fronda

progenitora.

Utilizando los datos de número de frondas en el comienzo, durante la exposición y al

final de ésta, se calcula la curva de crecimiento para cada control y cada concentración.

La tasa de crecimiento (frondas en número de días) se calcula con la siguiente fórmula:

µ= ( Ln χt2 – Ln χt1) / tn (2)

Dónde: χt1 y χt2 representan los parámetros de observación (número de frondas) en el

tiempo tn de duración del test.

4.2.4 Área de las frondas (AF)

Usando un programa computacional - “image-j”- se evaluó cada una de las fotografías

tomadas a lo largo del test para estimar el aumento o disminución de su área. Como

resultado se obtuvo información individual de cada replica ensayada en centímetros

cuadrados (cm2) que fué comparada con el control. La estimación de la tasa de

crecimiento para este parámetro fue calculada según la formula (2)

Figura 3: Metodología de estimación del área foliar de

L.valdiviana mediante desfase de contraste utilizando Image-J

20

4.2.5 Peso húmedo (PH)

Las frondas fueron pesadas antes y después del bioensayo teniendo especial cuidado en

mantener el mismo criterio del tiempo de secado y manejo de las frondas. La estimación

de la tasa de crecimiento para este parámetro fue calculada según la formula (2).

4.2.6 Contenido Total de Clorofila (CTC)

Finalizados los 7 días de exposición, todas las frondas se incubaron durante 48hrs en 3

ml de acetona al 90% (MERCK) a temperatura ambiente y en absoluta oscuridad.

Completado este periodo de extracción se midió su coeficiente de absorción de luz a en

espectrofotómetro Spectroquant® Pharo 300 MERCK, a tres longitudes de onda: 647,

664 y 645. El contenido de clorofila a, b y total se calculó según Inskeep y Bloom

(1985).

Chl a = 12,63 A 664,5 - 2,52 A 647

Chl b = 20,47 A 647 - 4,73 A 664,5

Chl Total = 17,95 A 647 + 7,90 A 664,5

Fig. 4: Cubeta con extracto de clorofila post-ensayo lista para ser medida

en espectrofotómetro.

21

4.2.7 Evaluación de los puntos finales.

La respuesta toxica en los puntos finales mencionados frente a la exposición a los

contaminantes se expresó como IC50 (concentración de tóxico que produce el 50% de

inhibición en el parámetro considerado como punto final) Para este cálculo se utilizó el

programa ToxRat® el cual estima el IC50 mediante un método no paramétrico de

interpolación lineal, obteniendo los límites de confianza mediante “bootstrapping” por

remuestreos al azar de los datos ingresados.

Además, se estimó el porcentaje de inhibición con respecto al control para los

parámetros utilizados como puntos finales mediante la siguiente formula:

Ii= (Vc - Vsi)/Vc • 100 (3)

Dónde: Ii es la inhibición resultante al final del test. Si Ii< 0 ocurre inhibición; si Ii > 0

ocurre estimulación, VC Clorofila total en el control y Vsi Clorofila total en cada

concentración de la muestra testeada.

Además, se calculó el coeficiente de variación a partir de todas las calibraciones para

cada punto final por separado utilizando la siguiente fórmula:

C.V=σ/ (4)

23

5. Resultados

5.1. Evaluación toxicológica del Cr (VI)

Los efectos fitotóxicos del dicromato de potasio sobre Lemna valdiviana durante los 7

días del experimento pueden verse en las figura 10, donde se compara el estado final de

las plantas expuestas para solo dos concentraciones con respecto al grupo control (Fig

10). Se observa claramente el efecto de clorosis de sus frondes en la concentración más

alta ensayada (1,76 mg/l Cr(VI)) y los primeros síntomas de clorosis ya en los 0,23 mg/l

Cr(VI). La reducción en el área foliar en las colonias expuestas y la declinación en

contenido de clorofila evidenciados por el amarillento color en algunas de sus hojas se

hacen significativas entre 0,35 mg/l de Cr(VI) y los 1,76 mg/l de Cr(VI). Entre estas

concentraciones además se visualiza un desprendimiento o abscisión de las frondes que

forman las colonias, el cual es proporcional al aumento de las concentraciones de

dicromato de potasio. La cantidad de clorofila en las frondas progenitoras en las

concentraciones sobre 0,35 mg/l de Cr(VI) es mayor en comparación a las frondas hijas

formadas las que crecen entorno a un color más cercano al amarillo que al verde.

24

Fig. 10: Efectos fitotóxicos del dicromato de potasio (K2Cr2O7) al séptimo dia en 3

calibraciones distintas. Sean A1,A2,A3 los tratamientos Control; B1, B2, B3

corresponden a una exposición de 0,63 mg/l de Cr(VI); C1,C2,C3 son las

concentraciones más concentradas, donde se observa clorosis y necrosis en C1.

5.1.2.- Tasa de crecimiento e inhibición de crecimiento

Los resultados obtenidos para la tasa de crecimiento en las distintas calibraciones con

K2Cr2O7 se muestran en la Tabla 3. En promedio, la tasa de crecimiento para cada uno

de los tratamientos ensayados con dicromato de potasio, presentaron valores similares a

lo largo del crecimiento tanto en número de frondas, peso y especialmente en área de

sus frondas con una leve disminución a medida que la concentración aumenta (Tabla 3),

la que se hace evidente en las dos últimas concentraciones más altas del tóxico (1,06 y

1,77 mg/L de Cr(VI)) tanto para el número de frondas, peso húmedo y área foliar en

comparación con el tratamiento control.

25

Lemna valdivina presentó un factor de multiplicación que bordea los 0,18 para AF y

NF, lo que significa la planta duplicó su área y número de frondas respectivamente en

promedio entre el tercer y cuarto día del experimento. La tasa de multiplicación o factor

de crecimiento de la lenteja de agua según su PH, fue en promedio 0,20 lo que al igual

que el AF y NF sitúa una duplicación del peso entre el tercer y cuarto día de

experimentación.

En de la concentración más alta (1,77 mg/L de Cr(VI)) estimado según el número de

frondas (NF) alcanzó a un factor de prácticamente cero frondas/día, en cambio para el

mismo parámetro en el grupo control el factor de incremento fue en promedio de 0,170

frondas/ día (Tabla 4). El mismo efecto de inhibición fue medido según el área foliar.

En general el efecto de inhibición en el crecimiento medido por NF y AF se presenta a

los 0,63 mg/L de Cr (VI).

Tasa

crec. NF

Inhibición

frondas

(%)

Tasa

crec.AF

Inhibición

Área (%)

Tasa

crec.PH

Inhibición

peso (%)

Inhibición

CTC (%) A

Control 0,18 0,0 0,18 0,0 0,20 0,0 0

0,04 mg/L 0,19 -5,1 0,23 -24,3 0,21 -6,4 22,9

0,08 mg/L 0,20 -10 0,19 -2 0,20 -7,4 21,1

0,17 mg/L 0,18 -2,5 0,19 -2,2 0,19 -4,3 59,1

0,35 mg/L 0,16 8,1 0,16 11,5 0,16 12,1 77,1

0,7 mg/L 0,14 23,0 0,11 40,9 0,10 49,9 76,7

1,4 mg/L 0,04 77,9 0,03 84,2 0,06 73,3 76,3

2,8 mg/L 0,00 100,5 -0,01 108,1 0,01 94,6 75,5

Tabla 4: Tasa de crecimiento promedio y porcentaje de inhibición en el crecimiento de 4 puntos

finales en el bioensayo de calibración A: NF (número de frondas), AF (área foliar), PH (peso

húmedo) y CTC (contenido total de clorofila) utilizando dicromato de potasio como tóxico de

referencia. Concentraciones medidas como Cr (VI).

26

Tasa

crec. NF

Inhibición

frondas

(%)

Tasa

crec.AF

Inhibición

Área (%)

Tasa

crec.PH

Inhibición

peso (%)

Inhibición

CTC (%) B

Control 0,21 0,0 0,22 0,0 0,24 0,0 0

0,08 mg/L 0,22 -3,2 0,23 -2,7 0,25 -4,5 24,0

0,13 mg/L 0,20 5,8 0,19 12,6 0,21 13,3 22,4

0,22 mg/L 0,21 2,4 0,20 12,3 0,21 10,8 49,5

0,38 mg/L 0,18 14,2 0,15 30,4 0,16 35,3 54,4

0,63 mg/L 0,14 32,2 0,12 44,7 0,12 49,2 64,6

1,06 mg/L 0,04 79,0 0,05 78,8 0,05 80,4 70,8

1,76 mg/L 0,00 98,9 0,02 92,7 0,02 92,2 70,9


finales en el bioensayo de calibración B: NF (número de frondas), AF (área foliar), PH (peso



Tasa

crec. NF

Inhibición

frondas

(%)

Tasa

crec.AF

Inhibición

Área (%)

Tasa

crec.PH

Inhibición

peso (%)

Inhibición

CTC (%) C

Control 0,15 0,0 0,17 0,0 0,16 0,0 0

0,08 mg/L 0,16 -9,2 0,14 16,2 0,14 10,4 58,3

0,13 mg/L 0,17 -17,8 0,16 7,6 0,16 -1 69,8

0,22 mg/L 0,16 -7,2 0,16 8,8 0,15 6,9 84,5

0,38 mg/L 0,17 -16,9 0,13 23,2 0,12 21,6 88,1

0,63 mg/L 0,11 21,8 0,10 39,7 0,05 70,8 70,9

1,06 mg/L 0,05 65,6 0,05 68,3 0,02 86,0 56,6

1,76 mg/L 0,06 61,2 0,03 83,6 0,02 89,1 69,8


finales en el bioensayo de calibración C: NF (número de frondas), AF (área foliar), PH (peso



Tasa

crec. NF

Inhibición

frondas

(%)

Tasa

crec.AF

Inhibición

Área (%)

Tasa

crec.PH

Inhibición

peso (%)

Inhibición

CTC (%) D

Control 0,15 0,0 0,17 0,0 0,16 0,0 0

0,08 mg/L 0,17 -18,3 0,17 0,7 0,17 -17,8 47,4

0,13 mg/L 0,20 -36 0,18 -7,6 0,19 -52,1 72,6

0,22 mg/L 0,16 -7,8 0,15 9,1 0,16 -14,8 81,2

0,38 mg/L 0,14 4,7 0,12 27,1 0,15 -1,9 78,5

0,63 mg/L 0,09 38,5 0,10 42,8 0,10 26,0 76,5

1,06 mg/L 0,07 51,5 0,06 62,2 0,05 47,7 70,0

1,76 mg/L 0,04 72,0 0,06 62,9 0,06 55,6 71,0 Tabla 7: Tasa de crecimiento promedio y porcentaje de inhibición en el crecimiento de 4 puntos

finales en el bioensayo de calibración D: NF (número de frondas), AF (área foliar), PH (peso



27

Tasa

crec. NF

Inhibición

frondas

(%)

Tasa

crec.AF

Inhibición

Área (%)

Tasa

crec.PH

Inhibición

peso (%)

Inhibición

CTC (%) E

Control 0,148 0,0 0,15 0,0 0,18 0,0 0

0,04 mg/l 0,17 -14,4 0,16 -4,2 0,18 -4,4 47,4

0,08 mg/l 0,16 -9,3 0,15 5,3 0,19 -7,2 72,6

0,17 mg/l 0,16 -8,1 0,13 15,2 0,16 10,2 81,2

0,22 mg/l 0,15 -2,4 0,13 16,8 0,15 5,4 78,5

0,35 mg/l 0,15 -0,6 0,12 23,7 0,14 17,4 76,5

1,06 mg/l 0,03 79,9 0,04 74,3 0,04 70,1 70,0

1,76 mg/l 0,01 95,3 0,02 89,3 0,01 75,6 71,0


finales en el bioensayo de calibración E: NF (número de frondas), AF (área foliar), PH (peso



Para el número de frondas (NF) la concentración que alcanza o supera el 50% de la

inhibición en el crecimiento de éstas, se encuentra en promedio a los 1,04 mg de Cr(VI).

Este parámetro resulto ser el menos sensible en la estimación de la toxicidad por

inhibición del crecimiento. La estimulación en el crecimiento con respecto al grupo

control se manifiesta en promedio hasta los 0,13 mg de Cr(VI) alcanzando hasta un 36%

de aumento en el crecimiento de frondas.

En cuanto a la inhibición según el área foliar de las plantas ensayadas el promedio de

tóxico utilizado para alterar el crecimiento en el 50% con respecto al control es menor a

1,06 mg de Cr(VI). La estimulación del crecimiento en este parámetro se hace visible en

las primeras concentraciones (0,08 mg/l de Cr(VI) en promedio) y hasta las 0,17 mg/l de

Cr(VI)se manifiesta la estimulación (tablas 5, 6, 7 y 8).

Los valores de concentración donde se alcanza el 50% de la inhibición en relación al

peso están entre los 0,63 y los 1,06 mg/l de Cr(VI). La inhibición alcanzada en este

último valor sobrepasa con creces el 50% de inhibición de la población ensayada. A

bajas concentraciones se aprecia una estimulación del crecimiento que se había

28

manifestado ya en los puntos finales anteriores, presentando en muchos casos un PH

superior al obtenido en el grupo control. En promedio la estimulación se manifiesta en

menor cantidad de tratamiento presentando en promedio una estimulación en el

crecimiento en torno a los 0,13 mg/l de Cr(VI).

En los valores presentados para clorofila y tal cual se muestra en las tablas 3, 4, 5, 6 y 7,

todos los tratamientos presentaron inhibición de crecimiento con respecto al grupo

control. La toxicidad fue observada en este punto final desde las primeras

concentraciones ensayadas y en ningún caso presentó exaltación o estimulación en su

CTC. La inhibición del 50% de las plantas utilizadas se presentó en ciertos casos desde

la concentración ensayada más baja (0,08 mg/l de Cr(VI)).

5.1.3. Efecto Fitotóxico del Cr (VI) en número de frondas (NF)

La figura 11 (A, B, C, D & E) muestra las curvas promedio del crecimiento diario

de 5 experimentos de calibración frente al tóxico de referencia dicromato de

potasio. El punto final NF considera como se mencionó en la metodología el conteo

de frondas totales (frondas hijas y progenitoras sin considerar las yemas) durante

los 7 días de experimentación.

31

Figura 11: Curva de crecimiento promedio diario medido según el número de frondas

(NF) para los bioensayos A, B, C, D y E durante los 7 días de duración del experimento

ante la exposición de K2Cr2O7

La duplicación del número inicial de las frondas se produce, en el mayor de los

casos, entre el tercer y cuarto día. Además, se presenta un pequeño lapso de

relajación en el crecimiento en dicho periodo para luego seguir con el crecimiento

exponencial. A excepción del grafico C, desde los 0,08 mg/l de Cr(VI) hasta los

0,35 mg/l de Cr(VI) no se presentan mayores diferencias entre los tratamientos y el

control. Al contrario, a pequeñas concentraciones ensayadas en la lenteja de agua se

aprecia una estimulación en el crecimiento de las frondas promedio para cada

tratamiento llegando a superar en los 5 ensayos realizados al número total de

frondas en el control. A los 0,64 mg/l de Cr(VI) se observa una disminución

significativa en el número de frondas en el séptimo día con respecto al tratamiento

control (Fig 11 A, B, C, D & E). El crecimiento diario de éste y los consecutivos

tratamientos con mayor concentración del metal, muestra un aumento en el NF que

se registra entre los primero 3 días de experimentación para luego comenzar a

externalizar la inhibición de su crecimiento hasta el final del séptimo día, e incluso

32

en ciertas oportunidades sufrir daños de sus tejidos lo que provocó necrosis

resultando una disminución numérica de frondas como se muestra en la Figura 3-

C1 la cual se preparó a la concentración de 2,82 mg/l de Cr(VI).

Los valores finales de frondas al terminar cada experimento al séptimo día para el

control, variaron entre las 56 y 87 frondas, mientras que en el caso de los

tratamientos más concentrados de Cr(VI) (1,76 mg/l Cr(VI)) el número de frondas

fluctuó entre las 20 y 30 frondas. (Fig. 2).

5.1.4. Efecto Fitotóxico del Cr (VI) en el área foliar (AF)

La figura 12 (A, B, C, D, E) muestra las curvas de crecimiento diario para 5

experimentos con dicromato de potasio. Las respuestas al tóxico difieren notoriamente

en comparación al parámetro de número de frondas. En el caso de este punto final de

toxicidad, no existe una tendencia que indique determinantemente en cuál es el día de

exposición en el que comienzan a notarse las variaciones en el crecimiento, pues desde

las primeras 24 hrs pueden verse las distintas curvas que toman los tratamientos

ensayados.

En términos generales, con alrededor de 0,35 mg/l de Cr(VI) la planta logra crecer hasta

unos 2 cm² promedio durante los 7 días de exposición sin diferenciarse

significativamente de las curvas de crecimiento del grupo control donde se promedia un

aumento de 2,5 cm² de área foliar. Desde esta concentración hasta las concentraciones

más altas, se logra ver una inhibición en el aumento de superficie que se comienza a

notar desde las 48 hrs de exposición, llegando al final de la experimentación a un

crecimiento, en las dos últimas concentraciones (1,06 y 1,76 mg/l de Cr(VI)), que no

supera los 0,5 cm² de área foliar.

35

Figura 12: Curva de crecimiento promedio diario medido según el área

foliar (AF) para los bioensayos A, B, C, D y E durante los 7 días de

duración del experimento ante la exposición de K2Cr2O7

En los casos de mayor daño al tejido vegetal causado por acción del tóxico, se produce

una perdida mayor del pigmento fotosintético que se traduce en una menor área de

reconocimiento por el programa utilizado para estimar el área de las frondas lográndose

un crecimiento negativo o decrecimiento en el área, como ocurrió al ocuparse una

concentración muy alta de 2,82 mg/l Cr(VI) (fig. 12A).

Al igual que en la estimación del crecimiento de la lenteja de agua mediante el número

de frondas, se puede verificar a través del crecimiento según el área foliar una

estimulación en el crecimiento a bajas concentraciones, presentándose entre la

concentración más baja ensayada 0,04 mg de Cr(VI) y los 0,1 mg/l de Cr(VI) en

promedio.

36

5.1.5. Efecto Fitotóxico del Cr (VI) en peso húmedo (PH)

Los resultados para el punto final de peso húmedo se muestran en la figura 13. Existe

amplia variabilidad en los resultados de este parámetro tanto en los controles como en

las primeras 3 concentraciones ensayadas, no presentándose un patrón uniforme para

todos los experimentos realizados. El fenómeno de estimulación en el crecimiento

también logra manifestarse en este punto final. Si bien no existe un patrón general

totalmente definido comparativamente entre los distintos experimentos realizados, es

posible estimar sin problemas la concentración a la cual se presentan las diferencias

significativas con respecto el control. Este valor se ubica en los 0,63 mg de Cr(VI). El

mayor peak en el PH de las plantas final del experimento se encuentra entre los 0,04 y

0,13 mg de Cr(VI). Los tratamientos ensayados con concentraciones mayores a las

nombradas anteriormente comienzan a mostrar una disminución en su peso sin una

estricta tendencia que los distinga tajantemente del control. Las 3 últimas

concentraciones ensayadas para los 5 experimentos de calibración realizados muestran

diferencias visibles significativas con el control (fig.13 A, B, C, D y E)

39

Figura 13: Curva de crecimiento promedio diario medido según el peso

húmedo para los bioensayos A, B, C, D y E durante los 7 días de duración del

experimento ante la exposición de K2Cr2O7

5.1.6 Efecto Fitotóxico del Cr (VI) en el contenido total de Clorofila (CTC)

Los resultados del efecto fitotóxico en la clorofila total de la lenteja de agua se muestran

a continuación en la figura 14. Al contrario de lo mostrado en los anteriores 3

parámetros evaluados, el contenido total de clorofila solo presenta un tipo de respuesta

la cual es de inhibición. De manera general los valores de clorofila en los controles se

mantuvieron sobre los 600 µg·gr-1

de clorofila en promedio. Las curvas de CTC de cada

grafico en la figura 14 A, B, C, D, E, muestran una clara tendencia de inhibición a

medida que la concentración del toxico utilizado es más concentrado.

Las primeras respuestas de inhibición se presentan incluso en las concentraciones más

bajas de 0,04 mg/L de Cr(VI) -aunque sin una diferencia significativa- las que

mantienen la tendencia hasta alrededor de los 0,63 mg/l de Cr(VI).

42

Figura 14: Curva de crecimiento promedio diario medido según el contenido

total de clorofila (CTC) durante los 7 días de duración del experimento ante la

exposición de K2Cr2O7

. En las concentraciones más altas ensayadas (1,06 y 1,76 mg/l de Cr(VI)) para 4 de los

5 experimentos realizados se muestra un aumento en el contenido de clorofila total que

no se condice en lo absoluto con la curva de tendencia que muestran las primeras

concentraciones ensayadas. Ésta anomalía no se presenta en ningún parámetro anterior,

los cuales muestran una correcta y lógica tendencia de correlación entre la cantidad de

tóxico empleado en el tratamiento con su nivel de inhibición de clorofila..

5.2 EC50, NOEC y LOEC en el número de frondas de Lemna valdiviana

Las tablas siguientes muestran los valores de salida para los análisis estadísticos

realizados en la estimación del EC50 para los puntos finales estudiados en este trabajo.

La estimación de la concentración efectiva que inhibe al 50% de la población ensayada

(EC50) se calculó mediante la medida de bondad de ajuste Chi² a 5 grados de libertad.

43

Los valores de pendiente e intercepto muestran la ecuación de la recta para la

estimación de la dosis/efecto (y= mx+b).

Si la probabilidad (p Chi2), es menor o igual a 0,1 los datos presentan una alta

dispersión para la respuesta de dosis/función calculada.

El coeficiente de r2

(0 <= r ² <= 1) da la proporción de la varianza explicada por la

función dosis/respuesta graficada. El test-F muestra el nivel de significancia entre los

tratamientos, por lo que si p (F) <= alfa seleccionado (en este caso, alfa = 0,05) la

regresión muestra resultados significativamente diferentes.

Los valores de NOEC y LOEC fueron calculados mediante un análisis de normalidad a

través de Shapiro Wilks para posteriormente aplicar el estadístico discriminante de T.-

student

44


en el experimento de calibración A:

Figura 15: Curva de concentración-efecto representando la influencia del cromo (VI) sobre la tasa de

crecimiento (inhibición) media (número de frondas) de Lemna valdiviana en calibración A al séptimo

día.

Tabla 9: Datos de salida del programa Toxrat para la estimación de con los estadísticos principales en la

estimación de las respuestas de inhibición. Valores de EC10, EC20 y EC50 al 95% de confianza. Valores

de NOEC y LOEC en mg/L de Cr(VI)


en el experimento de calibración B:




Data

Function

95%-CL

Concentration [mg/L Cr(VI)]

0,1 1

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Fro

nd N

umbe

r)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Parámetro Valor

Pendiente b: 4,7334

Intercepto a: 0,0444

Chi²: 0,0282

p(Chi²): 1,0000

r²: 0,9620

p(F) (df: 1;5): 0,0000

Parámetro EC10 EC20 EC50

Estimación[mg/L Cr(VI)] 0,525 0,650 0,979 Inferior 95% 0,426 0,557 0,897

Superior 95% 0,603 0,725 1,068

NOEC 0,176

LOEC 0,353

Parámetro Valor

Pendiente b: 4,8467


Chi²: 0,0682

p(Chi²): 0,9999

r²: 0,9230

p(F) (df: 1;5): 0,0010


Estimación[mg/L Cr(VI)] 0,406 0,500 0,746 Inferior 95% 0,292 0,394 0,663

Superior 95% 0,486 0,576 0,839

NOEC 0,220

LOEC 0,381

45


crecimiento (inhibición) media (número de frondas) de Lemna valdiviana en calibración B al séptimo

día.

5.2.3 Parámetros del análisis de regresión PROBIT para el punto final NF en el

experimento de calibración C:




Data

Function

95%-CL

Concentration [mg/L Cr (VI)]

0,1 1

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Fro

nd N

umbe

r)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0


Estimación[mg/L Cr(VI)] 0,343 0,496 1,078

Inferior 95% 0,181 0,320 0,738

Superior 95% 0,470 0,629 1,847

NOEC ≥1,760

LOEC >1,760

Parámetro Valor

Pendiente b: 2,99073


Chi²: 0,32650

p(Chi²): 0,99711

r²: 0,735

p(F) (df: 1;5): 0,014

46


crecimiento (inhibición) media (número de frondas) de Lemna valdiviana en calibración C al séptimo

día.


en el experimento de calibración D:




Data

Function

95%-CL


0,1 1 10

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Fro

nd N

umbe

r)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Parámetro Valor

Pendiente b: 2,7468

Intercepto a: -0,00564

Chi²: 0,1037

p(Chi²): 0,9998

r²: 0,9040

p(F) (df: 1;5): 0,0010



Inferior 95% 0,181 0,320 0,828

Superior 95% 0,470 0,629 1,256

NOEC 0,381

LOEC 0,636

47


crecimiento (inhibición) media (número de frondas) de Lemna valdiviana en calibración D al séptimo

día.


en el experimento de calibración E:





crecimiento (inhibición) media (número de frondas) de Lemna valdiviana en calibración E al séptimo

día.

Data

Function

95%-CL


0,1 1 10

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Fro

nd N

umbe

r)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Data

Function

95%-CL


0,1 1

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Fro

nd N

umbe

r)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Parámetro Valor

Pendiente b: 6,2685


Chi²: 0,0085

p(Chi²): 1,0000

r²: 0,9170

p(F) (df: 1;5): 0,0010



Inferior 95% 0,326 0,417 0,665

Superior 95% 0,600 0,677 0,858

NOEC 0,353

LOEC 1,06

48

Figura 20: Promedio del EC50 de 5 calibraciones para el punto final de NF ante

el toxico de referencia dicromato de potasio. Los valores 1, 2, 3, 4 y 5 del eje x

corresponden a los bioensayos A, B, C, D y E respectivamente

Las figuras desde la 15 a la 19 muestran una gráfica de tipo sigmoidea característica en

este tipo de experimentos. A bajas concentraciones ocurre poca inhibición en las

plantas, mientras que a medida que la concentración del tóxico aumenta la inhibición en

el crecimiento también lo hace de manera exponencial, hasta llegar a un punto de

saturación donde vuelve a cambiar la pendiente estando casi en el punto de saturación

del organismo.

Las líneas punteadas que acompañan esta curva corresponden al error estándar,

calculado para cada tratamiento y pueden presentar un porcentaje de variación alto

dependiendo de la fase reproductiva que este atravesando la planta y la concentración a

la que es expuesta.

Los valores de NOEC y LOEC presentaron gran variabilidad, lo que impide hacer una

correcta estimación sobre a qué concentración ocurren ambos puntos.

La figura 20 por otra parte, muestra un resumen de los valores de la EC50 según NF

frente al toxico dicromato de potasio. El valor promedio de las 5 calibraciones resulto

ser de 0,919 mg/L de Cr(VI) con coeficiente de variación de 15,7% (C.V.=15.7%)

49

5.3 EC50, NOEC y LOEC en el área de las frondas de Lemna valdiviana


en el experimento de calibración A:





crecimiento (inhibición) media en AF (área foliar) de Lemna valdiviana en calibración A, al séptimo día.

Data

Function

95%-CL


0,1 1

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Fro

nd A

rea)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0



Inferior 95% 0,324 0,435 0,748

Superior 95% 0,396 0,505 0,824

NOEC 0,353

LOEC 0,7

Parámetro Valor

Pendiente b: 3,8116


Chi²: 0,0073

p(Chi²): 1,0000

r²: 0,9910

p(F) (df: 1;5): 0,0000

50


en el experimento de calibración B:





crecimiento (inhibición) media en AF (área foliar) de Lemna valdiviana en calibración B, al séptimo día.

Data

Function

95%-CL


0,1 1

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Fro

nd A

rea)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Parámetro Valor

Pendiente b: 2,6884


Chi²: 0,1038

p(Chi²): 0,9998

r²: 0,9280

p(F) (df: 1;5): 0,0000



Inferior 95% 0,115 0,196 0,496

Superior 95% 0,275 0,373 0,736

NOEC 0,081

LOEC 0,134

51


en el experimento de calibración en C:





crecimiento (inhibición) media en AF (área foliar) de Lemna valdiviana en calibración C, al séptimo día.

Data

Function

95%-CL


0,1 1 10

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Fro

nd A

rea)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Parámetro Valor

Pendiente b: 2,4512


Chi²: 0,1765

p(Chi²): 0,9994

r²: 0,8780

p(F) (df: 1;5): 0,0020



Inferior 95% 0,087 0,175 0,559

Superior 95% 0,332 0,457 0,991

NOEC n.d

LOEC n.d

52


en el experimento de calibración D:




Figura 24: Curva de concentración-efecto representando la influencia del cromo

(VI) sobre la tasa de crecimiento (inhibición) media en AF (área foliar) de

Lemna valdiviana en calibración D, al séptimo día.

Data

Function

95%-CL


0,1 1 10

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Fro

nd A

rea)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Parámetro Valor

Pendiente b: 1,8932


Chi²: 0,1151

p(Chi²): 0,9998

r²: 0,9100

p(F) (df: 1;5): 0,0010



Inferior 95% 0,081 0,182 0,686

Superior 95% 0,282 0,431 1,201

NOEC 0,381

LOEC 0,220

53


en el experimento de calibración E




: Figura 25: Curva de concentración-efecto representando la influencia del cromo

(VI) sobre la tasa de crecimiento (inhibición) media en AF (área foliar) de

Lemna valdiviana en calibración E, al séptimo día.

Data

Function

95%-CL


0,1 1 10

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Fro

nd A

rea)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0



Inferior 95% 0,124 0,206 0,500

Superior 95% 0,217 0,315 0,694

NOEC 0,088

LOEC 0,176

Parámetro Valor

Pendiente b: 2,4062


Chi²: 0,0469

p(Chi²): 1,0000

r²: 0,9710

p(F) (df: 1;5): 0,0000

54

Figura 26: Promedio del EC50 de 5 calibraciones para el punto final de AF ante



Las figuras desde la número 21 a la número 25 muestran la curva de respuesta al

dicromato de potasio calculado según el área foliar. Las correlaciones de las curvas

sigmoideas mostradas para cada ensayo de calibración muestran una buena correlación

de datos(r2) y el error estándar es menor que el observado en las curvas del NF. En la

figura 26 se observa un resumen de los valores de EC50 obtenidos para este punto final,

observándose que el ensayo D (número 4 en la figura 26) se escapa visualmente a la

media de los demás valores sin ser significativamente distinto. El valor promedio de la

EC50 calculado para el AF es de 0,718 mg/l de Cr(VI) con un coeficiente de variación

de 17,3% (C.V=17,3%)

55

5.4 EC50, NOEC y LOEC en el peso húmedo de Lemna valdiviana

5.4.1 Parámetros del análisis de regresión PROBIT para el punto final PH

en el experimento de calibración A





crecimiento (inhibición) media en PH (peso húmedo) de Lemna valdiviana en calibración A, al séptimo

día.

Data

Function

95%-CL


0,1 1

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Bio

mas

s)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0



Inferior 95% 0,202 0,313 0,685

Superior 95% 0,358 0,480 0,898

NOEC 0,176

LOEC 0,353

Parámetro Valor

Pendiente b: 2,9181


Chi²: 0,0423

p(Chi²): 1,0000

r²: 0,9590

p(F) (df: 1;5): 0,0000

56

5.4.2 Parámetros del análisis de regresión PROBIT de Biomasa en el ensayo B




Figura 25: Curva de concentración-efecto representando la influencia del cromo (VI) sobre la tasa

de crecimiento (inhibición) media en PH (peso húmedo) de Lemna valdiviana en calibración B, al

séptimo día.

5.4.3 Parámetros del análisis de regresión PROBIT de Biomasa en el ensayo C




Data

Function

95%-CL


0,1 1

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Bio

mas

s)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Parámetro Valor

Pendiente b: 2,6333


Chi²: 0,0913

p(Chi²): 0,9999

r²: 0,9380

p(F) (df: 1;5): 0,0000



Inferior 95% 0,110 0,187 0,468

Superior 95% 0,247 0,339 0,678

NOEC 0,081

LOEC 0,134



Inferior 95% 0,115 0,186 0,416

Superior 95% 0,357 0,425 0,665

NOEC 0,220

LOEC 0,381

Parámetro Valor

Pendiente b: 4,3408


Chi²: 0,1927

p(Chi²): 0,9992

r²: 0,8220

p(F) (df: 1;5): 0,0050

57

Figura 26 : Curva de concentración-efecto representando la influencia del cromo (VI) sobre la tasa de

crecimiento (inhibición) media en PH (peso húmedo) de Lemna valdiviana en calibración C, al séptimo

día.

5.4.4 Parámetros del análisis de regresión PROBIT de Biomasa en el ensayo D




Data

Function

95%-CL


0,1 1

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Bio

mas

s)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0



Inferior 95% 0,081 0,182 0,686

Superior 95% 0,282 0,431 1,201

NOEC 0,063

LOEC 1,06

Parámetro Valor

Pendiente b: 1,8932


Chi²: 0,1151

p(Chi²): 0,9998

r²: 0,9100

p(F) (df: 1;5): 0,0010

58

Figura 27: Curva de concentración-efecto representando la influencia del cromo (VI)

sobre la tasa de crecimiento (inhibición) media en PH (peso húmedo) de Lemna

valdiviana en calibración D, al séptimo día.

5.4.5 Parámetros del análisis de regresión PROBIT de Biomasa en el ensayo E





crecimiento media en PH (peso húmedo) de Lemna valdiviana en calibración E, al séptimo día.

Data

Function

95%-CL


0,1 1 10

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Fro

nd A

rea)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Data

Function

95%-CL


0,1 1 10

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Bio

mas

s)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0



Inferior 95% 0,144 0,246 0,624

Superior 95% 0,319 0,449 0,946

NOEC 0,220

LOEC 0,353

Parámetro Valor

Pendiente b: 2,4947


Chi²: 0,0735

p(Chi²): 0,9999

r²: 0,9480

p(F) (df: 1;5): 0,0000

59

Figura 29: Promedio del EC50 de 5 calibraciones para el punto final de PH ante



Los gráficos mostrados desde las figuras 24 a la 28, muestran la respuesta inhibitoria

que presentó el punto final PH al séptimo día. Al igual que los anteriores 2 parámetros

vistos, en el ensayo de calibración C existe la mayo variabilidad de los datos

traduciéndose en un alto error estándar (r2=0,82). En la figura 29 se observa el resumen

para los EC50 calculados mediante el programa ToxRat y se observa claramente como

el valor del bioensayo C (número 4 en el gráfico) se dispara de la tendencia mostrada

por los anteriores datos. Al considerar todos los datos obtenidos en estas calibraciones,

el promedio calculado de EC50 para el punto final PH corresponde a 0,794 mg/L Cr(VI)

con un coeficiente de variación de 40,2% (C.V=40,2%) para los 5 bioensayos y de

20,2% si consideramos como puntos fuera de serie al bioensayo “D”.

60

5.4.6 Respuestas de inhibición en CTC y EC50 para los ensayos

A, B, C, D y E

Los datos de clorofila fueron obtenidos a través del programa ICPIN elaborado por la

EPA para este tipo de análisis, el cual a través de datos cuantitativos realiza un análisis

de regresión en la estimación del EC50.

Las figuras desde la 30 a la 34 muestran los puntos de inhibición promedio alcanzados

para las concentraciones ensayadas con dicromato de potasio. Se observa en los puntos

graficados la parte exponencial de inhibición para luego alcanzar el nivel de saturación

del organismo formándose una curva parecida a la sigmoidea característica de este tipo

de experimentos.

Figura 30: Curva de concentración-efecto representando la influencia del

cromo (VI) sobre la tasa de crecimiento media en CTC (contenido clorofila

total) de Lemna valdiviana en calibración A, al séptimo día.

61



total) de Lemna valdiviana en calibración B, al séptimo día.



total) de Lemna valdiviana en calibración C, al séptimo día.



total) de Lemna valdiviana en calibración D al séptimo día.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

% In

hib

ició

n

mg/L Cr(VI)

62

Figura 34: Curva de concentración-efecto representando la influencia del cromo

(VI) sobre la tasa de crecimiento media en CTC (contenido clorofila total) de

Lemna valdiviana en calibración E, al séptimo día.

Calibración IC50 (mg/L Cr VI)

Intervalo de confianza inferior superior

A 0,155 0,140 0,170

B 0,196 0,144 0,230

C 0,070 0,059 0,081

D 0,087 0,067 0,103

E 0,063 0,055 0,068 Tabla 24: Valores de EC50 finales en el punto final CTC para los 5

ensayos de calibración frente a la exposición de dicromato de

potasio.

La figura 35 muestra los valores promedios del EC50 calculados mediante el programa

ICPIN. La dispersión de estos 5 valores finales de inhibición es alta, siendo el valor

mínimo y máximo de los datos de EC50 los 0,06 a los 0,2 mg/L de Cr(VI)

respectivamente. Sin embargo esta dispersión se ve agrupada en dos bloques (1-2 y 3-4-

5 de la figura 35) El valor final promedio para este punto final - considerando los 5

ensayos- fue de 0,114 mg/L de Cr(VI) con un coeficiente de variación de 51,2

(C.V.=51,2%) mientras que, obviando los dos primeros datos (A y B), el EC50 es de un

16,8%.

63

Es importante aclarar que los dos primeros experimentos de calibración se realizaron 5

meses antes que los segundos experimentos.

Coincidentemente este tiempo de separación entre un grupo de bioensayos y el resto se

ve reflejada en la figura 35. La sensibilidad de la planta fue menor en comparación a los

3 últimos experimentos realizados.

Figura 35: Promedio del EC50 de 5 calibraciones para el punto final de PH ante



64

5.5. Evaluación toxicológica del Cu (II)

Los efectos fitotóxicos del sulfato de cobre heptahidratado sobre Lemna valdiviana

durante los 7 días del experimento pueden verse en las figura 36, donde se compara el

estado final de las plantas expuestas para las dos más altas concentraciones de cada

ensayo de calibración (P, Q & R) con respecto al grupo control.

Figura 36 Efectos del Cu

2+ en la estructura foliar y pigmentos de Lemna valdiviana para 3 ensayados de

calibración (P, Q y R). P1, Q1 y R1 corresponden a los controles de dichos ensayos; P2 y Q2

corresponden a una concentración de 0,65 mg/l de Cu2+

; P3 y Q3 corresponden a 2 mg/l de Cu2+

; R2 y R3

corresponden a 0,46 y 1 mg/l de Cu2+

respectivamente.

65

Las concentraciones entre 0,01 a 0,28 mg/l de Cu2+ no presentaron una diferencia visual

que muestre un efecto al toxico empleado. Sin embargo las dos últimas concentraciones

probadas en los primeros experimentos (P y Q) presentaron daños en sus frondes que

son claramente visibles (figura Q2 y Q3). La característica más evidente de este daño es

el color amarillento de las hojas en Q2, la posterior destrucción de sus tejidos y

consecuente clorosis producida en la concentración siguiente. Sin embargo y a

diferencia de los efectos fitotóxicos provocados por el cromo, las plantas a

concentraciones ya subletales seguían adelante con el proceso de división vegetativa

(estimado según el número de frondas) sin provocar una inhibición acorde a dichos

daños.

La abscisión de las frondas se presentó solo en una de las concentraciones ensayadas

correspondiente a 2 mg/ Cu2+ donde sus frondes ya al tercer día se separaron de sus

colonias. A concentraciones de 1 mg/L de Cu2+

(figura 36-R3) se presentó gran daño

foliar y pérdida de pigmento pero con muy poca separación de las colonias de la lenteja

de agua.

66

5.5.1 Tasa de crecimiento e inhibición de crecimiento

La taza de multiplicación promedio de Lemna valdiviana durante los 7 días de

exposición al sulfato de cobre y su respuesta de inhibición al tóxico se muestra a

continuación en las tablas 25,26 y 27. En promedio para el tratamiento control, la tasa

de multiplicación o factor de incremento fue de 0,15 lo que indica que al cuarto día se

dobla la cantidad de frondas/ área/ biomasa. Se aprecia una cierta proporcionalidad en la

disminución de la tasa de multiplicación a medida que la concentración del toxico

aumenta. A los 0,65 mg/l de Cu2+

esta disminución se hace puntualmente notoria en el

peso húmedo y el área foliar donde el factor de multiplicación bordea los 0,05. Sin

embargo, ésta disminución contrasta con la tasa de multiplicación en el NF donde el

valor de este punto final alcanza un promedio de 0,10 a los mismos 0,65 mg/l de Cu2+.

A partir de esta concentración y hasta 1 mg/l de Cu2+

, el crecimiento es casi nulo para

luego en la concentración más alta ensayada (2 mg/l de Cu2+

) presentar evidente

clorosis y necrosis producto de la acción toxica del cobre.

Por otro lado y a diferencia de los resultados obtenidos con Cr(VI), no se observa – a

excepción de la concentración de 0,02 mg/l Cu2+

en el ensayo “R” - que a bajas

concentraciones exista estimulación en el crecimiento en el NF, PH y AF sino más bien

hubo inhibición. Por otro lado el CTC a bajas concentraciones presentó, en varias

réplicas ensayadas, valores mayores de clorofila con respecto al control pero no siendo

estos significativamente diferentes (figura 40). Esta respuesta no se evidenció en ningún

tratamiento de calibración con cromo.

67

P Tasa crec

PH

%

Inhibición

PH

Tasa crec.

NF

%

Inhibición

NF

Tasa crec

AF

%

Inhibición

AF

%

Inhibición

Chl mg/l Cu(II)

Control 0,15 0 0,16 0,0 0,14 0,0 0

0,01 0,14 5,0 0,16 3,9 0,14 3,2 12,8

0,02 0,09 35,0 0,13 21,5 0,10 33,0 -3,9

0,05 0,12 34,1 0,13 20,5 0,11 24,2 1,8

0,12 0,10 39,0 0,14 15,0 0,10 31,8 4,8

0,28 0,09 45,5 0,13 18,7 0,11 22,3 25,4

0,65 0,04 76,3 0,11 33,4 0,04 68,6 70,3

2,00 -0,13 100,0 -0,07 142,1 -0,27 294,0 51,3

Tabla 25: tasa de crecimiento promedio y porcentaje de inhibición para todos los tratamientos ensayados

con sulfato de cobre en experimento de calibración “P” al final del periodo de exposición.

Q Tasa crec

peso

%

Inhibición

PH

Tasa crec.

NF

%

Inhibición

NF

Tasa crec

AF

%

Inhibición

AF

%

Inhibición

Chl mg/l Cu(II)

Control 0,15 0,0 0,16 0,0 0,14 0,0 0

0,01 0,10 28,3 0,13 19,2 0,10 28,0 -9,8

0,02 0,10 29,8 0,13 19,8 0,10 30,4 -7,9

0,05 0,13 25,1 0,13 20,6 0,11 21,2 7,7

0,12 0,11 29,5 0,13 21,4 0,11 21,3 4,9

0,28 0,10 38,4 0,14 16,9 0,11 22,3 19,0

0,65 0,07 59,0 0,10 38,3 0,04 71,1 66,3

2,00 -0,17 188,6 -0,07 142,3 -0,38 367,5 60,1


con sulfato de cobre en experimento de calibración “Q” al final del periodo de exposición.

R Tasa crec

peso

%

Inhibición

PH

Tasa crec.

NF

%

Inhibición

NF

Tasa crec

AF

%

Inhibición

AF

%

Inhibición

Chl mg/l Cu(II)

Control 0,18 0,0 0,15 0,0 0,15 0,0 0

0,01 0,17 0,2 0,16 -5,7 0,14 7,1 6,9

0,02 0,16 -2,1 0,16 -6,1 0,14 8,1 4,9

0,04 0,16 10,4 0,14 2,5 0,14 7,3 14,4

0,10 0,15 10,2 0,14 2,2 0,14 6,5 20,5

0,21 0,16 1,4 0,16 -7,2 0,14 9,0 21,4

0,46 0,15 14,1 0,14 4,9 0,12 20,6 40,2

1,00 0,04 73,6 0,09 38,0 0,01 95,5 55,3


con sulfato de cobre en experimento de calibración “R” al final del periodo de exposición.

68

5.5.2 Efecto fitotóxico de Cobre (Cu2+) en número de frondas (NF)

Los resultados de los efectos fitotóxicos en el número de frondas y su crecimiento diario

se muestran en la figura 37. Teniendo en el bioensayo “P” y “Q” las mismas

concentraciones se observa cierta similitud en el crecimiento a lo largo del periodo de

exposición. Entre el día 3 y 4 existe un periodo de relajación en el crecimiento que por

lo general se manifiesta en el periodo en el que se está doblando la cantidad de frondas

con respecto a la inicial. El tratamiento control fue quien mayor cantidad de frondas

logró producir terminando con entre 60 y 65 frondas al fin del séptimo día. Las

concentraciones de exposición entre los 0,01 y 0,35 mg/l de Cu2+

presentan una

evolución similar durante el experimento finalizando el test con alrededor de 50 a 55

frondas totales, mostrando efectos parecidos como respuesta al cobre. Las plantas

expuestas a 0,65 mg/l de Cu2+

muestran en la figura una menor pendiente con respecto

al control al igual como sucede en concentraciones de 1 mg/l de Cu2+

. Estas pendientes

(0,65 y 1 mg/l de Cu2+

) son visiblemente distintas a la del tratamiento control,

evidenciando el efecto inhibitorio así como el daño en sus tejidos causado por el tóxico

(figura 36 y 37)

70

Figura 37: Curva de crecimiento promedio diario medido según el

número de frondas (NF) para los bioensayos P, Q y R durante los 7 días

de duración del experimento ante la exposición de CuSO4 5H2O

5.5.3 Efecto fitotóxico de Cobre (Cu2+) en área foliar (AF)

La figura 38 muestra el crecimiento promedio en Lemna valdiviana ante la exposición a

sulfato de cobre para las 3 calibraciones ensayadas. El tratamiento control fue quien

aumento más su superficie bordeando los 2,5 cm2. No se observan estimulaciones en el

crecimiento según este punto final. En “P” y “Q” las concentraciones desde 0,01 mg/l

de Cu2+

a 0,28 mg/l de Cu2+

bordean los 1,5 cm2

de ganancia neta obtenida durante el

periodo de experimentación no existiendo entre estos tratamientos grandes diferencias

en su crecimiento. A los 0.65 mg/l de Cu2+

se observa en P y Q que las plantas

expuestas ganaron una superficie que bordea los 0,4 cm2

durante los 7 días de

experimentación, mostrando una fuerte inhibición en el crecimiento pero sin evitar que

día a día sus frondas continúen con el crecimiento. A la concentración de 1 mg/l de Cu2+

71

se observa que el crecimiento se detiene ya a las primeras 24 hrs de exposición. Desde

ese periodo hasta el séptimo día se observa que la superficie se mantiene prácticamente

en cero compensando el crecimiento de nuevas frondas con la perdida de estas mismas

que estuvieron por más tiempo expuestas al toxico. Las plantas expuestas a 2 mg/l de

Cu2+

perdieron superficie de sus frondas antes de las primeras 24 horas, causado esto

por la alta toxicidad del cobre que provocó clorosis y necrosis en las frondas (Figura 36)

72

Figura 38: Curva de crecimiento promedio diario medido según el área de las

frondas (AF) para los bioensayos P, Q y R durante los 7 días de duración del

experimento ante la exposición de CuSO4 5H2O

73

5.5.4 Efecto fitotóxico de Cobre (Cu2+) en peso húmedo (PH)

La estimación de la fitotoxidad según la biomasa promedio neta mostrada en la figura,

muestra una amplia variabilidad en sus valores, esto debido principalmente al contenido

de agua que puedan o no tener al momento de ser pesadas en la microbalanza

electrónica. Pese a esto, se observa una tendencia principalmente en P y R que relaciona

el aumento de la concentración de cobre con el menor peso obtenido al final del

experimento. No se presentan estimulaciones en el crecimiento. A excepción de la

concentración de 2 mg/l de Cu2+

todos los tratamientos ganaron peso con relación a lo

inoculado al día 1. El peso promedio inoculado al día cero fue de 23 mg, por lo que el

daño provocado en la concentración más alta ensayada provocó casi la total

desintegración y pérdida del peso inoculado.

74

Figura 39: Curva de crecimiento promedio diario medido según el peso húmedo

(PH) para los bioensayos P, Q y R durante los 7 días de duración del experimento

ante la exposición de CuSO4 5H2O

75

5.5.5 Efecto fitotóxico de Cobre (Cu2+) en contenido de clorofila total (CTC)

Al evaluar la respuesta en el CTC frente a la exposición subcrónica del cobre entre las

concentraciones de 0,01 mg/l Cu2+

y los 0,122 mg/l Cu2+

(figura P Q R) observamos una

similitud en sus promedio totales de clorofila, sin diferencias que denoten efectos de

daño o inhibición evidente. En los 3 ensayos de calibración se encontró mayor CTC

(0,01 y 0,02 mg/l Cu2+

) con respecto al grupo control pero sin ser esta diferencia de

carácter significativo. Se observa que a los 0,46 mg/l Cu2+

la planta presenta un bajo

CTC y distinto que el control, siguiendo la tendencia a medida que la concentración

aumenta. Sin embargo, no es precisamente lo que se dibuja en el gráfico. En él se

aprecia que a los 2 mg/l Cu2+

el CTC es mayor que su antecesor. Sin embargo esto se

debe al bajo peso húmedo (biomasa) por la que es normalizado el CTC. Además, la

extracción con acetona al 90% se efectúa más eficientemente en tejidos que estén

deteriorados en contraste con aquellos que estén en mejores condiciones.

76

Figura 40: Curva de crecimiento promedio diario medido según el contenido

total de clorofila (CTC) para los bioensayos P, Q y R durante los 7 días de

duración del experimento ante la exposición de CuSO4 5H2O

77

5.6. EC50, NOEC y LOEC en el número de frondas de Lemna valdiviana

Las tablas siguientes muestran los valores de salida para los análisis estadísticos

realizados en la estimación del EC50 para los puntos finales estudiados en este trabajo.

La estimación de la concentración efectiva que inhibe al 50% de la población ensayada

(EC50) se calculó mediante la medida de bondad de ajuste Chi² con 5 grados de

libertad. Los valores de pendiente e intercepto muestran la ecuación de la recta para la

estimación de la dosis/efecto (y= mx+b).

Si la probabilidad (p Chi2), es menor o igual a 0,1 los datos presentan una alta

dispersión para la respuesta de dosis/función calculada.

El coeficiente de r2

(0 <= r ² <= 1) da la proporción de la varianza explicada por la

función dosis/respuesta graficada. El test-F muestra el nivel de significancia entre los

tratamientos, por lo que si p (F) <= alfa seleccionado (en este caso, alfa = 0,05) la

regresión muestra resultados significativamente diferentes.

Los valores de NOEC y LOEC fueron calculados a través de un análisis de normalidad

a través de Shapiro Wilks para posteriormente aplicar el estadístico discriminante de

T.-student.

78


en el experimento de calibración P




Figura 41: Curva de concentración-efecto representando la influencia

del cobre(II) sobre la tasa de crecimiento (inhibición) media en NF

(número de frondas) de Lemna valdiviana en calibración P, al

séptimo día.

Data

Function

Concentration [mg/L Cu (II)]

0,01 0,1 1

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Fro

nd N

umbe

r)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Parámetro Valor Pendiente b: 3,0401


Chi²: 0,8530

p(Chi²): 0,9735

r²: 0,4330

p(F) (df: 1;5): 0,1080

Parámetro EC10 EC20 EC50 Estimación[mg/L Cr(VI)] 0,284 0,396 0,749

Inferior 95% n.d. n.d. n.d.

Superior 95% n.d. n.d. n.d.

NOEC 0,010

LOEC 0.023

79


en el experimento de calibración Q





del cobre(II) sobre la tasa de crecimiento(inhibición) media en NF

(número de frondas) de Lemna valdiviana en calibración Q, al séptimo

día.

Data

Function


0,01 0,1 1 10

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Fro

nd N

umbe

r)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0




NOEC <0,010

LOEC <0,010



Chi²: 1,0979

p(Chi²): 0,9543

r²: 0,4170

p(F) (df: 1;5): 0,1170

80

5.6.3 Parámetros del análisis de regresión PROBIT para el punto

final NF en el experimento de calibración R




Figura 43: Curva de concentración-efecto representando la

influencia del cobre(II) sobre la tasa de crecimiento (inhibición)

media en NF (número de frondas) de Lemna valdiviana en

calibración R, al séptimo día.

Las figuras 41, 42 y 43 muestran la curva de inhibición del punto final NF al término

de la exposición a dicromato de potasio. En el caso de los experimentos P y Q la

estimación de los límites de confianza no pudo ser computada. Ambos gráficos

muestran una linealidad en los primeros 5 puntos, es decir, prácticamente la misma

inhibición hasta la concentración de 0,63 mg/L Cr(VI). El punto siguiente (en ambos

gráficos) aumenta hasta casi el 40% de inhibición y ya el séptimo punto sobrepasa el

100% de inhibición a los 2 mg/L Cu(II) . Esta rápida saturación en la inhibición impide

Data

Function

95%-CL


0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Fro

nd N

umbe

r)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0


Intercepto a: -0,71089

Chi²: 0,3016

p(Chi²): 0,9976

r²: 0,6480

p(F) (df: 1;5): 0,0290

Parámetro EC10 EC20 EC50 Estimación[mg/L Cr(VI)] 0,189 0,683 n.d.

Inferior 95% 0,019 0,200 n.d.

Superior 95% 1,928 1666,883 n.d.

NOEC 0,460

LOEC 1

81

estimar rangos de confiabilidad en la estimación del EC50 En el caso del bioensayo R el

rango de concentraciones utilizado (0.01 a 1 mg/L Cu(II)) no alcanzó a inhibir el 50%

de crecimiento de la población de Lemna estimado como NF. Por esta razón no existe

un valor de EC50 para este parámetro en este experimento de calibración.

Los valores estadísticos de salida entregados por el programa muestran una baja

correlación de los datos frente al aumento de toxico, estando el parámetro de r2 cercano

a 0,4 para P y Q y r2

=0,6 en el caso del experimento R.

El valor promedio del EC50 para este parámetro fue de 0,716 mg/L Cu(II) con un

coeficiente de variación de 6,51 (C.V= 6,51%)

Figura 44: grafica de dos valores EC50 calculados para la calibración

con sulfato de cobre. El error estándar no fue posible estimarlo mediante

el programa Toxrat. Los valores 1, 2 y 3 del eje x corresponden a P, Q y

R respectivamente

82

5.7. EC50, NOEC y LOEC en el área de las frondas de Lemna valdiviana

5.7.1 Parámetros del análisis de regresión PROBIT para el punto

final AF en el experimento de calibración P





del cobre(II) sobre la tasa de crecimiento (inhibición) media en AF

(área foliar) de Lemna valdiviana en calibración P, al séptimo día.

Data

Function

95%-CL


0,001 0,01 0,1 1 10 100

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Fro

nd A

rea)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0


Inferior 95% n.d. n.d. 0,034

Superior 95% 0,090 0,173 162,404

NOEC 0,10

LOEC 0,23



Chi²: 0,9767

p(Chi²): 0,9644

r²: 0,5970

p(F) (df: 1;5): 0,0420

83

5.7.2 Parámetros del análisis de regresión PROBIT para el punto final AF en el

experimento de calibración Q

Parámetro Valor

Pendiente b: 1,6706


Chi²: 1,4490

p(Chi²): 0,9189

r²: 0,4950

p(F) (df: 1;5): 0,0780




Figura 46: Curva de concentración-efecto representando la

influencia del cobre(II) sobre la tasa de crecimiento (inhibición)

media en AF (área foliar) de Lemna valdiviana en calibración Q,

al séptimo día.

Data

Function


0,01 0,1 1 10

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Fro

nd A

rea)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0





NOEC n.d

LOEC n.d

84

5.7.3 Parámetros del análisis de regresión PROBIT para el punto final AF en el

experimento de calibración R





del cobre(II) sobre la tasa de crecimiento media en AF (área foliar) de

Lemna valdiviana en calibración R, al séptimo día.

Como ha sido la tendencia en los resultados visto para cobre, la variabilidad en los datos

es alta también en la evaluación de la toxicidad en AF. La figura 45 muestra en sus

líneas de error estándar una altísima dispersión, mientras que en la figura 46 no se

pueden estimar los valores del error estándar. La figura 48 muestra los 3 valores de

EC50 calculados para el punto final AF. Se muestra más notoriamente el error estándar

Data

Function

95%-CL


0,01 0,1 1

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Fro

nd A

rea)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Parámetro Valor

Pendiente b: 7,4033


Chi²: 0,1110

p(Chi²): 0,9998

r²: 0,7490

p(F) (df: 1;5): 0,0120



Inferior 95% 0,237 0,336 0,506

Superior 95% 0,468 0,538 0,914

NOEC 0,210

LOEC 0,460

85

en el bioensayo de calibración P y sus límites de confianza mientras que Q (número 2 en

el gráfico) no presenta estos límites. El valor promedio en de los EC50 para el área

foliar es de 0,591 mg/L Cu(II) con un coeficiente de variación de 36,2% (C.V=36,2%)

Figura 48: Gráfica de valores de EC50 calculados para la calibración con

sulfato de cobre. El error estándar en el experimento Q no fue posible

estimarlo mediante el programa Toxrat.

86

5.8 EC50, NOEC y LOEC en peso húmedo de Lemna valdiviana

5.8.1 Parámetros del análisis de regresión PROBIT para el punto final PH

en el experimento de calibración P





cromo (VI) sobre la tasa de crecimiento media en PH (peso húmedo) de Lemna

valdiviana en calibración P, al séptimo día.

Data

Function

95%-CL


0,001 0,01 0,1 1 10 100

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Bio

mas

s)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0



Inferior 95% 0,000 0,001 0,060

Superior 95% 0,031 0,063 0,497

NOEC 0,010

LOEC 0,023

Parámetro Valor

Pendiente b: 1,0151


Chi²: 0,4461

p(Chi²): 0,9940

r²: 0,7770

p(F) (df: 1;5): 0,0090

87


PH en el experimento de calibración Q





cromo (VI) sobre la tasa de crecimiento media en PH (peso húmedo) de

Lemna valdiviana en calibración Q, al séptimo día.

Data

Function

95%-CL


0,01 0,1 1 10 100

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Bio

mas

s)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0



Inferior 95% n.d. 0,000 0,145

Superior 95% 0,196 0,321 5,008

NOEC <0,081

LOEC <0,081

Parámetro Valor

Pendiente b: 1,3500


Chi²: 0,8533

p(Chi²): 0,9735

r²: 0,6100

p(F) (df: 1;5): 0,0380

88


PH en el experimento de calibración R




Figura 50:Curva de concentración-efecto representando la

influencia del cromo (VI) sobre la tasa de crecimiento media en PH

(peso húmedo) de Lemna valdiviana en calibración R, al

séptimo día.

Data

Function

95%-CL


0,01 0,1 1

% I

nhib

ition

of

Mea

n G

row

th R

ate

(Bio

mas

s)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Parámetro Valor

Pendiente b: 5,0478


Chi²: 0,1333

p(Chi²): 0,9997

r²: 0,8250

p(F) (df: 1;5): 0,0050



Inferior 95% 0,196 0,295 0,588

Superior 95% 0,547 0,637 0,929

NOEC 0,210

LOEC 0,460

89

Las estimaciones del EC50 variaron entre los 0,160 y los 0,750 mg/L de Cu(II)

revelando una alta variabilidad en la estimación, Llama la atención además el altísimo

valor del error estándar en el experimento Q,, el cual teniendo un valor de estimación

del efecto sobre el 50% de la población de 0,55 mg/L Cu(II), el error estándar llego

sobre los 5 mg/L.

Los valores de NOEC en este parámetro se encuentran todos bajo los 0,210 mg/L Cu(II)

Los resultados de EC50 para PH muestran un promedio de EC50 de 0,489 mg/L Cu(II)

con un coeficiente de variación de 20,7 (C.V= 20,75%)

Figura 51: valores de EC50 calculados para la calibración con sulfato de

cobre en el punto final de peso húmedo. Los valores 1, 2 y 3 del eje x

corresponden a P, Q y R respectivamente

90

5.8.4 Respuestas de inhibición en CTC y EC50 para los ensayos P, Q y R

A continuación se muestran la curva de regresión para las respuestas promedio de L.

valdiviana frente al sulfato de cobre. Los datos de EC50 en clorofila fueron obtenidos a

través del programa ICPIN (EPA) para este tipo de análisis, el cual a través de datos

cuantitativos mediante un análisis de regresión.

Figura 52: Respuestas de inhibición y exaltación en la lenteja de agua según se contenido

total de clorofila expuestos a distintas concentraciones de toxico. Valores correspondientes

al experimento de calibración P.

Figura 53: Respuestas de inhibición y exaltación en la lenteja de agua según se contenido

total de clorofila expuestos a distintas concentraciones de toxico. Valores correspondientes

al experimento de calibración Q.

91

Figura 54: Respuestas de inhibición y exaltación en la lenteja de agua según se contenido total

de clorofila expuestos a distintas concentraciones de toxico. Valores correspondientes al

experimento de calibración R.

Las figuras 52 a la número 54 muestran el nivel de inhibición o estimulación que en

promedio se obtuvo como resultado a la exposición de Lemna valdiviana en cobre. En

los experimentos P y Q se observa estimulación en el contenido total de clorofila en por

los menos 1 concentración, mientras que en el bioensayo R no se presentó solo

inhibición de CTC con respecto al control.

La tendencia de inhibición en clorofila presenta una curva más lineal en comparación a

los demás parámetros. Las respuestas son menos sensibles en comparación a la

exposición del cromo en este mismo parámetro.

La tabla 37 muestra los valores de EC50 obtenidos según el contenido de clorofila total.

Los valores obtenidos para los experimentos P, Q y R fueron de 0,537, 0521 y 0,811

mg/L Cu2+

respectivamente.

92

Calibración IC50 (mg/L CU (II)

Intervalo de confianza

inferior superior P 0,537 0,488 0,576

Q 0,521 0,463 0,555

R 0,811 n.d n.d

Tabla 37: Valores de EC50 finales en el punto final CTC para los 5

ensayos de calibración frente a la exposición de dicromato de

potasio.

El error estándar no pudo ser estimado para el experimento R. El promedio de los EC50

para este punto final fue de 0,623 mg/L Cu2+

. Si bien los dos primero ensayos poseen

valores similares (0,537 y 0,521 mg/L Cu2+

) en el tercer experimento la sensibilidad de

lemna disminuye considerablemente tolerando en promedio 0,811 mg/L de Cu(II).

El coeficiente de variación (C.V) para este parámetro fue de 26,1 (C.V=26,1%)

Figura 55: valores de EC50 calculados para la calibración con sulfato de

cobre en el punto final de CTC. Los valores 1, 2 y 3 del eje x corresponden a P,

Q y R respectivamente

93

6. Discusión

Al analizar los puntos finales de número de frondas, área foliar, peso húmedo y

contenido total de clorofila de manera comparativa se observa que, si bien en todos los

casos existe una respuesta al tóxico utilizado, la sensibilidad de cada parámetro fue

distinta.

En el caso de la fitotoxicidad subcrónica en cromo, el punto final más sensible ensayado

fue el de CTC presentando inhibición en las primeras concentraciones ensayadas (0,04 y

0,08 mg de Cr (VI)) llegando a ser hasta 14 veces más sensible que el punto final menos

sensible, en este caso, el número de frondas. La sensibilidad de la lenteja de agua para

los parámetros de PH y AF es, en general, bastante parecida y oscilan en los rangos de

sensibilidad y estimación del EC50. Si bien es cierto que en 3 de los 5 experimentos

ensayados el PH fue el segundo punto final más sensible por sobre el área de las

frondas, la estimación de este parámetro (PH) al final de los ensayos de toxicidad puede

conllevar ciertos problemas de sobre o sub-estimación. Esto debido principalmente al

criterio de secado de la persona encargada de realizar el pesaje y el tiempo ocupado para

tal acción. Se hace importante tomar en cuenta este punto pues los valores de PH no

solo sirven como un indicador de inhibición del crecimiento sino también como

normalización o ajuste a la clorofila total. Por lo mismo, se hace necesaria la

implementación de un protocolo que permita ajustar y estandarizar la metodología en

relación al pesaje de las frondas de lemna, con el fin de disminuir la variabilidad

generada durante la obtención de la data en cuestión.

La sensibilidad en el NF fue el parámetro de menor sensibilidad para Cr (VI) en los 5

ensayos realizados en este trabajo, estando sus valores de EC50 entre 0,7 y 0,8 mg de

Cr(VI).

94

Por otra parte, al evaluar la toxicidad del cromo a altas concentraciones, el parámetro

más afectado en los 5 experimentos de calibración fue el CTC, registrándose en este

punto final la máxima tendencia de inhibición y, consecuentemente los valores de EC50

menores (figura 14).

Si se comparan las EC50 del cromo en los 4 puntos finales de los 5 experimentos de

calibración, el orden de sensibilidad de Lemna valdiviana desde la más a la menos

sensible es el siguiente: CTC (0,114 mg Cr) > AF (0,718 mg Cr) > PH (0,794 mg Cr)>

NF (0,919 mg Cr)

Agencias internacionales (OCDE, APHA, EPA) utilizan en sus protocolos comúnmente

el número de frondas como indicador principal en la evaluación toxicológica de

muestras. Sin embargo nuestros experimentos dan a éste punto final como uno de los

menos sensibles en dicha evaluación, ya sea utilizando sulfato de cobre o dicromato de

potasio como tóxicos de referencia fundamentando la hipótesis número 2 del comienzo.

Sin embargo la contabilización del número de frondas tiene la indesmentible ventaja de

que es fácilmente visible y cuantificable por un lado y es el número de frondas la más

fehaciente muestra de que la planta se está dividiendo, caso que no puede ser dicho tan

axiomáticamente en el caso de PH y AF. Este último parámetro resulta de gran ayuda

para estimar el crecimiento diario y sus distintas “pulsaciones” a lo largo de su ciclo

vegetativo pues muestra con certeza su crecimiento exponencial, no así en el NF donde

luego de la creación de nuevas frondas se ha de esperar un tiempo para que las frondas

hijas puedan producir nuevas frondes (figura 11 y 12)

En el caso de la fitotoxicidad subcrónica utilizando sulfato de cobre, las respuestas

resultaron ser menos claras en comparación al cromo presentando una alta variabilidad

en los datos y alto porcentaje de variación entre las estimaciones del EC50.

95

El orden de sensibilidad de los parámetros medidos desde el más sensible al menos

sensible fue PH (0,489 mg Cu) > AF (0,591 mg Cu) > CTC (0,623 mg Cu) > NF (0,716

mg Cu).

Comparativamente hablando, los efectos producidos por el cromo y el cobre difieren en

varios aspectos. En el caso del NF y su aspecto externo ante la exposición de cromo, la

planta produce 3 síntomas visibles; la inhibición o tardanza en la creación de nuevas

frondes, presencia de clorosis en sus frondes partiendo por las zonas más perimetrales y

en casos de alta concentración de metal se produce la abscisión de sus frondes. En el

caso del cobre y en este mismo parámetro, no se evidencia una inhibición en el

crecimiento y aparición de sus frondes, al contrario, siguen aumentando el número de

frondas a medida que éstas comienzan a presentar clorosis y necrosis en la zona opuesta

al nodo (zona perimetral de la fronde). Solo en casos de alta concentración de cobre (>1

mg/L de Cu(II)) se produce abscisión en las frondes. Fue por esta razón que a pesar de

presentar gran daño, no existieron diferencias significativas que pudiesen estimar un

EC50 en NF para el bioensayo R. Por lo mismo se hace necesario evaluar 2 o más

parámetros simultáneos para estimar la respuesta a bajas y a altas concentraciones.

La sensibilidad tanto en AF como en PH se manifiesta tempranamente según el cálculo

de la EC50, sin embargo la variabilidad de los datos es alta y en ocasiones confusas por

no poder estimarse sus límites de confianza o que estos sean exageradamente altos.

En el caso de los resultados en la estimación de CTC tanto a través de cromo, se observa

una correlación entre la cantidad de toxico utilizado y la respuesta inhibitoria de la

clorofila. Esta tendencia fue interrumpida en los tratamientos con más concentración de

toxico obteniéndose mayor cantidad de clorofila por gramo de planta que el tratamiento

que le antecede (figura 14 C, D y E). Sin embargo esta anomalía se puede responder por

96

dos factores; la primera es debido al mal estado de los tejidos de la lenteja de agua, que

permite que el solvente orgánico utilizado (acetona 90%) actuase removiendo más

eficientemente el contenido de clorofila en aquellas frondes con mayor daño en relación

a aquellas donde los tejidos se presentan más firmes al final del test, y por otro lado éste

mismo factor provoca que el CTC obtenido en estos tratamientos de alta toxicidad se

vean magnificados por la poca biomasa (peso húmedo) con la que terminan el

experimento provocando que la normalización de CTC por gramo de planta (peso final)

aumente en dichas concentraciones. Una de las maneras para corroborar que la

normalización mediante biomasa en L. valdiviana se hizo de manera correcta es utilizar

la superficie foliar de la planta al séptimo día como medio de normalización. La planta

endémica presente en nuestra región posee la característica de ser muy delgada,

traduciéndose esto en que su superficie es prácticamente pigmento fotosintético en su

totalidad. Este ejercicio de normalizar el CTC por la superficie en desmedro del PH fue

realizado en este trabajo obteniendo prácticamente los mismos resultados, corroborando

que es una manera factible ante la variabilidad presente en el pesaje de las frondas

húmedas. Sin embargo y ante el mismo escenario de encontrar mayor cantidad de

clorofila en concentraciones altas (que no se condice con la tendencia ni es lógico en la

realidad, una buena solución sería que en presencia de compuestos con alta toxicidad

que provoquen en los tejidos vegetales un daño severo, ocupar un solvente orgánico más

potente (i. e. N,N-dimetilformamida o DMSO) asegurando una eficiente extracción

tanto en las frondas controles con bajo nivel de daño epitelial así como en las plantas

expuestas a fuertes tóxicos con daño vegetal.

La impresionante sensibilidad que tiene la clorofila frente a estos metales utilizados

(especialmente en el cromo), hace este punto de vital importancia pues tiene directa

relación en el funcionamiento de la planta en sí y no a un efecto visible producido por

97

un toxico a nivel metabólico y caracterizado en una inhibición en el crecimiento como

es el objetivo de los demás parámetros. La alta sensibilidad a estos compuestos (y muy

posiblemente a la mayoría de los metales pesados) se debe a la interacción positiva que

las plantas poseen con el cobre y en menor grado con el cromo. En el caso de este

último, su presencia en la planta tiene comprobadas alteraciones a nivel de fotosíntesis

tal y como lo observaron Vajpayee et al. (2000) y Sobrero & Moschione (2001) quienes

encontraron entre otros efectos disminución en el contenido de clorofila en hojas

jóvenes e inhibición en la actividad de las enzimas del ciclo de Calvin. Sin embargo, y

aunque el cromo no constituya un elemento esencial en los vegetales, su presencia en

bajas concentraciones provoca ciertas estimulaciones en el crecimiento de AF y NF

(tabla 5,6,7 y 8).

En cuanto al cobre, su presencia como micronutriente es beneficiosa para los vegetales

pero constituye un elemento altamente tóxico en concentraciones más altas. Eso explica

en parte la estimulación en el CTC que se observó en nuestro experimento a bajas

concentraciones de este metal (tabla 25) En concentraciones altas genera clorosis e

inhibición en el trasporte de electrones en el FSI y FSII quizás por competencia con el

Fe. (Frankart et al., 2002; Liu et al., 2004). Provocando perdida de pigmento de manera

más rápida que el cromo.

En cuanto a la alta variabilidad en algunos puntos finales analizados, es necesario seguir

reproduciendo los test con el mismo rango de concentraciones. En este trabajo se

ensayaron distintas concentraciones de ambos tóxicos con el fin de encontrar el rango

más o menos certero de sensibilidad en Lemna valdiviana, y al no ocupar siempre las

mismas concentraciones los EC50 pueden estar algo sesgados. Otro factor a considerar

es el largo tiempo de experimentos entre uno y otro y las condiciones en las que se

produjeron, ya que variables mínimas como el estado nutricional de la planta,

98

temperatura y fotoperiodo alterarán nuestros resultados finales en busca del EC50. Para

cuantificar que distintos han variado las sensibilidades en la planta se ocupa el

coeficiente de variación. El servicio de protección ambiental de Canadá (EPS 1990) y la

agencia de protección ambiental de los Estados Unidos (USEPA, 1990) fijan un

coeficiente de variación menor o igual a 30% (C.V≤30%). En este trabajo se obtuvieron

valores aceptables para el NF y PH para ambos tóxicos. En el caso de CTC el C.V de

Cu(II) está bajo el 30% mientras que en Cr(VI) supera el 50%. Como ya se había

mencionado anteriormente, el largo lapso de tiempo que se sucedió entre los 5

bioensayos pudo haber incidido en las condiciones de exposición o en la sensibilidad

innata de la planta producida por factores que se alejan de nuestro alcance.

Los valores de NOEC (por sus siglas en ingles No Observed Effect Concentration) y

LOEC (Lowest Observated Effect Concentration) fueron calculados para todos los

puntos finales en ambas exposiciones de metal. Sin embargo, estos valores dependen

directamente de las concentraciones ensayadas. Su estimación se realiza a través de un

ANOVA que discrimina la última concentración que no presenta efectos significativos

de inhibición con respecto al control (NOEC) y la primera concentración que sí presenta

efectos significativos con respecto al control (LOEC). Es por esto que al ensayar

experimentos con distintos rangos de concentraciones los valores de NOEC y LOEC

serán distintos y no comparables en esta situación. Lo recomendable es calcular estos

valores teniendo un rango de concentraciones calibrado y establecido pudiendo así

comparar todos los NOEC y LOEC de manera más certera.

Según la literatura relacionada a los efectos del Cr(VI) en el contenido total de

clorofila, otros autores también observaron inhibición en este parámetro. Estudios

realizados por Vajpayee et al. (2000) indican, para Nymphaea alba, reducción en el

99

CTC por inhibición en la biosíntesis de clorofila, observando que los efectos son

mayores en una de las clorofilas (Chla) respecto de la Chlb. La exposición de la

conocida flor de lotto (Nymphaea alba) a valores entre 0,5 y 10 mgCr(VI)/L produce

reducción de la actividad de una de las enzimas precursora de la síntesis de clorofila, y

la consecuente inhibición en el CTC a esas concentraciones de exposición (Vajpayee et

al.,2000).

La sensibilidad y respuesta de otras especies de lemnáceas al cromo, vemos que las hay

más y menos sensibles en comparación a los resultados obtenidos en este trabajo para

Lemna valdivina.. Para el caso de Spirodela polyrrhiza y Lemna aequinoctialis, Landolt

& Kandeler (1987) encontraron inhibición del crecimiento a partir de exposiciones a 1

mgCr(VI)/L, mientras que para L. minor la sensibilidad es muy alta, reduciéndose el

crecimiento a 0,001mgCr(VI)/L y observándose a niveles de 0,052 mg Cr(VI)/L,

inhibición en el área foliar, contenido de clorofila a y b. Mohan & Hosetti (1999)

informan para L.minnor valores de EC50 bastante más altos que los encontrados en este

trabajo en el número de frondes producidas, estando entre 6 y 35 mgCr(VI)/L, para 7

y14 días de exposición respectivamente.

Por otro lado si comparamos dentro de la literatura disponible nuestros resultados de

cobre con otros experimentos, observamos que existen respuestas más y menos

sensibles que la calculada para Lemna valdiviana; Landolt & Kandeler (1987) en L.

minor y L. aequinoctialis indican inhibición en el crecimiento a 0,051 y 0,095

mgCu(II)/L. Mohan & Hosetti (1999) informan valores en EC50 en el número de

frondes producidas entre 0,1 y 1,1 mgCu(II)/L para L. minor y 0,1 mgCu(II)/L para L.

valdiviana y entre 0,9 y 1,3 para L. gibba. Para la especie L. trisulca el valor de CE50

100

para la tasa de multiplicación, corresponde a 0,23 mgCu(II)/L, luego de 14 días de

exposición (Huebert et al., 1993).

Con relación a los efectos en el CTC Wahaab et al. (1995) observan en L. minor que a

0,25 mgCu(II)/L hay clorosis significativa luego de 10 días de exposición, mientras que

a 1 mgCu(II)/L se produce la muerte de los individuos. Con relación a la exaltación en

el CTC, Prasad et al. (2001) observó un aumento en el contenido de Cl-a y Cl-b en L.

trisulca por exposición al cobre a valores de 0,064 mgCu(II)/L,. En nuestro caso a esa

concentración encontramos inhibición del CTC, sin embargo a valores menores (0,02 y

0,02 mg/L Cu(II)) encontramos un aumento en el contenido de clorofila llegando hasta

un 9,8% de estimulación en ésta.

La siguiente es una tabla comparativa de los valores de EC50 obtenidos en este trabajo

(tabla 36) para ser comparada con valores encontrados en la literatura disponible para el

punto final NF.(tabla 1)

Cr (VI) NF AF PH CTC

A 0,98 0,79 0,78 0,16

B 0,75 0,60 0,56 0,20

C 1,08 0,74 0,53 0,07

D 1,01 0,88 0,88 0,09

E 0,79 0,06 0,77 0,06

Promedio 0,92 0,61 0,70 0,11

C.V(%) 15,7 53,4 21,7 55,5

Cu(II) NF AF PH CTC

P 0,75 0,30 0,16 0,54

Q 0,68 0,23 0,56 0,52

R s.d. 0,59 0,75 0,81

Promedio 0,72 0,37 0,49 0,62

C.V(%) 6,9 51,6 27,4 26,1

Tabla 36: Valores finales de todos los puntos analizados en este trabajo para la

estimación de la sensibilidad en Lemna valdiviana. Se muestra en la tabla los puntos

finales para cada experimento por separado y el valor promedio tanto para cromo y

para cobre.

101

7. Conclusiones

Según los resultados encontrados en este trabajo, se puede concluir lo siguiente:

1. Lemna valdiviana responde positivamente a la exposición de Cromo y Cobre,

pudiendo ser implementada en la evaluación fitotóxica de contaminación por

metales pesados en condiciones de laboratorio

2. Tal y como se logró corroborar, existen parámetros más sensibles en la estimación

ecotoxicológica de la contaminación, que el usado regularmente número de

frondas, tales como clorofila o área foliar.

3. Es posible lograr una buena y exitosa calibración en L. valdiviana a través de

tóxicos de referencia mediante la repetitividad de los mismos rangos de

concentraciones y bajo las mismas condiciones físico-químicas, ya que si bien los

valores encontrados en este trabajo poseen -en ciertos casos- un alto coeficiente de

variación, estos pueden deberse a cambios en las condiciones de mantención o

estados de salud de la planta en incluso a la influencia del ritmo circadiano propio

de la especie.

102

8. Referencias bibliográficas

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Anexos:

Datos crudos de crecimiento NF, AF, PH

Tabla 1a: datos crudos de estimación diaria en el crecimiento de Lemna valdiviana en el bioensayo de calibración A para dicromato de potasio. Tiempo 0 se realiza

estimación de peso inicial (mg), número de frondas inicial y área inicial (cm2). Día 7, al desmontar el experimento se vuelve a estimar el peso húmedo final y los parámetros

NF y AF. Los días intermedios muestran NF, área total y área corregida según el día 0.

.

Fecha 02.10.2012

Organismo Lemna valdiviana

Tiempo de exposición7 dias

Medio de CultivoSteinberg

Condiciones de cámara de cultivo 20±2°C 5000 lum 14/10 fotoperiodo

Tipo de sustancia o efluenteK2Cr2O7

Tiempo 0 hrs

peso (mg) frondas Área frondas Área area corr. frondas Área area corr.frondas Área area corr. frondas Área area corr. frondas Área area corr. frondas Área area corr. frondas Área peso final (mg)

Control1 18 20 0,776 21 0,91 0,134 24 1,146 0,370 36 1,207 0,431 45 1,593 0,817 45 2,254 1,478 56 2,922 2,146 65 3,132 2,356 82,8

Control2 18,3 20 0,885 22 0,97 0,085 34 1,159 0,274 40 1,438 0,553 44 1,823 0,938 53 2,399 1,514 66 3,041 2,156 72 3,072 2,187 69,2

Control3 17,1 20 0,849 22 0,91 0,061 26 1,007 0,158 40 1,262 0,413 40 1,613 0,764 49 2,026 1,177 61 2,514 1,665 67 2,581 1,732 61,1

Control4 16,9 20 0,863 23 0,91 0,047 27 0,938 0,075 39 1,251 0,388 43 1,518 0,655 47 2,09 1,227 60 2,499 1,636 67 2,67 1,807 63,9

Control5 17,5 20 0,799 23 0,87 0,074 31 0,966 0,167 36 1,381 0,582 44 1,663 0,864 59 2,309 1,510 67 3,085 2,286 78 3,407 2,608 83,1

Control6 18,7 20 0,816 23 0,92 0,108 28 1,001 0,185 38 1,39 0,574 42 1,659 0,843 55 2,119 1,303 60 2,927 2,111 70 3,122 2,306 68,2

0,04 mg/l 17 20 0,767 20 0,85 0,078 26 0,92 0,153 40 1,204 0,437 40 1,68 0,913 47 2,199 1,432 64 3,163 2,396 75 4,013 3,246 91,2

0,04 mg/l 17,4 20 0,747 20 0,84 0,092 23 0,927 0,180 36 1,15 0,403 38 1,691 0,944 46 2,221 1,474 69 3,14 2,393 71 3,85 3,103 80

0,04 mg/l 17,4 20 0,756 23 0,87 0,112 27 0,936 0,180 38 1,237 0,481 43 1,708 0,952 54 2,2 1,444 64 2,572 1,816 77 3,3 2,544 63,1

0,08 mg/l 18,6 20 0,792 22 0,91 0,115 31 0,997 0,205 40 1,298 0,506 40 1,732 0,940 51 2,223 1,431 68 2,565 1,773 80 3,236 2,444 79,1

0,08 mg/l 19,6 20 0,942 22 0,98 0,034 34 1,136 0,194 37 1,44 0,498 44 1,878 0,936 59 2,335 1,393 71 2,818 1,876 81 3,348 2,406 75,4

0,08 mg/l 19,8 20 0,996 23 1,01 0,012 35 1,209 0,213 39 1,451 0,455 43 1,842 0,846 60 2,316 1,320 72 2,773 1,777 76 3,484 2,488 80,6

0,17 mg/l 19,6 20 0,896 23 0,97 0,077 31 1,144 0,248 39 1,412 0,516 45 1,969 1,073 55 2,358 1,462 70 2,834 1,938 77 3,272 2,376 65,2

0,17 mg/l 20,1 20 0,905 22 0,98 0,073 28 0,993 0,088 37 1,32 0,415 42 1,715 0,810 52 2,231 1,326 65 2,924 2,019 72 3,465 2,56 82,7

0,17 mg/l 19,5 20 0,906 24 0,99 0,079 27 1,096 0,190 38 1,349 0,443 47 1,831 0,925 53 2,39 1,484 60 3,055 2,149 67 3,299 2,393 78,5

0,35 mg/l 19,1 20 0,872 23 1 0,125 26 1,052 0,180 38 1,396 0,524 40 1,778 0,906 46 2,143 1,271 57 2,553 1,681 65 2,631 1,759 55,7

0,35 mg/l 19,2 20 0,951 27 1,08 0,128 33 1,127 0,176 38 1,435 0,484 42 1,721 0,770 50 2,253 1,302 60 2,695 1,744 62 2,897 1,946 61,8

0,35 mg/l 19,1 20 0,946 24 1,04 0,095 31 1,1 0,154 38 1,481 0,535 39 1,738 0,792 50 2,284 1,338 57 2,786 1,840 62 3,101 2,155 63,4

0,70 mg/l 19,3 20 0,911 23 0,97 0,058 29 1,081 0,170 39 1,358 0,447 39 1,471 0,560 38 1,622 0,711 42 1,951 1,040 52 1,884 0,973 38

0,70 mg/l 18,1 20 0,896 21 0,94 0,041 31 0,985 0,089 35 1,179 0,283 39 1,425 0,529 39 1,789 0,893 45 1,988 1,092 52 1,882 0,986 36,8

0,70 mg/l 17,8 20 0,879 22 0,92 0,041 28 0,998 0,119 36 1,206 0,327 38 1,384 0,505 40 1,695 0,816 44 2,016 1,137 53 1,952 1,073 33,8

1,41 mg/l 16,3 20 0,873 23 0,92 0,046 22 0,926 0,053 27 0,954 0,081 28 0,972 0,099 26 1,137 0,264 25 1,182 0,309 22 1,015 0,142 24,1

1,41 mg/l 17,7 20 0,885 22 0,94 0,052 25 0,942 0,057 27 1,019 0,134 28 1,015 0,130 26 1,179 0,294 26 1,18 0,295 26 1,015 0,13 27,9

1,41 mg/l 18,3 20 0,971 24 0,93 -0,041 28 1,019 0,048 31 1,217 0,246 33 1,221 0,250 33 1,482 0,511 36 1,559 0,588 32 1,347 0,376 27,3

2,82 mg/l 18,2 20 0,973 24 0,9 -0,077 26 1,001 0,028 25 0,84 -0,133 26 0,951 -0,022 24 1,075 0,102 23 1,095 0,122 21 0,892 -0,081 21,5

2,82 mg/l 19,2 20 0,914 22 0,88 -0,033 22 0,865 -0,049 22 0,894 -0,020 23 0,872 -0,042 19 0,86 -0,054 17 0,895 -0,019 17 0,705 -0,209 18,5

2,82 mg/l 18,4 20 0,824 22 0,83 0,009 23 0,877 0,053 23 0,864 0,040 23 0,977 0,153 20 1 0,176 18 0,974 0,150 22 0,853 0,029 19,5

Dia 724 hrs dia 2 dia 3 Dia 5 Dia 6Dia 4

110

Tabla 2a:Datos crudos de absorbancia obtenida para la cuantificación de clorofila a, b y

total a 3 longitudes de onda en el bioensayo de calibración A con dicromato de potasio.

Volumen de extracción y peso al final del test para la normalización de clorofila total.

Valores de clorofila a, b y total en µg de chl·g¯¹de planta

647 664 665

R1 0,396 0,984 0,971 3 0,0728 467,633 143,511 617,580

R2 0,461 1,127 1,11 3 0,0692 562,064 179,747 749,540

R3 0,417 1,023 1,01 3 0,0611 578,767 183,041 769,769

R4 0,426 1,054 1,038 3 0,0639 569,834 177,119 754,792

R5 0,412 1,031 1,019 3 0,0831 429,874 129,436 565,227

R6 0,517 1,265 1,246 3 0,0682 640,211 204,302 853,317

R1 0,373 0,912 0,9 3 0,0912 345,488 110,195 460,434

R2 0,365 0,896 0,886 3 0,08 387,507 122,142 514,979

R3 0,385 0,94 0,927 3 0,0631 514,417 164,762 686,253

R1 0,365 0,865 0,855 3 0,0791 377,067 129,093 511,339

R2 0,381 0,921 0,907 3 0,0754 421,102 138,296 565,186

R3 0,450 1,085 1,068 3 0,0806 463,853 153,337 623,565

R1 0,180 0,428 0,422 3 0,0652 226,111 77,041 306,258

R2 0,235 0,550 0,542 3 0,0827 228,674 80,818 312,630

R3 0,193 0,427 0,422 3 0,0785 186,309 74,248 263,108

R1 0,085 0,186 0,184 3 0,0557 114,310 46,583 162,458

R2 0,097 0,217 0,213 3 0,0618 119,952 47,021 168,617

R3 0,095 0,214 0,212 3 0,0634 115,968 44,345 161,903

R1 0,070 0,144 0,143 3 0,038 129,158 59,538 190,459

R2 0,053 0,109 0,107 3 0,0368 100,311 46,799 148,479

R3 0,066 0,147 0,146 3 0,0338 149,465 58,409 209,922

R1 0,044 0,078 0,076 3 0,0241 107,257 66,780 175,489

R2 0,045 0,078 0,078 3 0,0279 93,735 59,377 154,381

R3 0,049 0,095 0,093 3 0,0273 116,895 61,364 179,848

R1 0,033 0,057 0,057 3 0,0215 88,849 56,637 146,687

R2 0,038 0,076 0,074 3 0,0185 138,079 68,612 208,573

R3 0,033 0,067 0,065 3 0,0195 115,449 55,897 172,920

CONTROL

0,04mg/L

Cr(VI)volum

en mlpeso gr Chl a Chl b

0,70 mg/L

1,41 mg/L

2,82 mg/L

Chl Total

µg·g¯¹]

0,08 mg/L

0,17 mg/L

0,35 mg/L

111

Tabla 3a: Valores crudos de estimación diaria en el crecimiento de Lemna valdiviana en el bioensayo de calibración B para dicromato de potasio. Tiempo 0 se realiza

estimación de peso inicial (gr), número de frondas inicial y área inicial (cm2). Día 7, al desmontar el experimento se vuelve a estimar el peso húmedo final y los parámetros

NF y AF.Los días intermedios muestran NF, área total y área corregida según el día 0.

Fecha 22.11.2012

OrganismoLemna valdiviana



Condiciones de cámara de cultivo 20°C±2, 5000 lux, FP 14/10

toxico K2Cr2O7

Tiempo 0 hrs

peso (gr) frondas area frondas Área Área corr. frondas Área Área corr. frondas Área Área corr. frondas Área Área corr. frondas Área Área corr. frondas Área Área corr. frondas Área Área corr. peso final (gr)

Control1 0,027 20 1,212 22 1,22 0,008 30 1,602 0,39 40 2,139 0,927 44 3,003 1,791 61 3,821 2,609 80 5,247 4,035 100 7,257 6,045 0,163

Control2 0,023 20 1,22 20 1,298 0,078 28 1,586 0,366 40 2,032 0,812 43 2,701 1,481 57 3,209 1,989 70 4,155 2,935 82 5,107 3,887 0,1153

Control3 0,0223 20 1,223 20 1,299 0,076 23 1,673 0,45 40 2,049 0,826 43 2,55 1,327 53 3,196 1,973 67 4,198 2,975 84 5,498 4,275 0,1143

Control4 0,0218 20 1,298 22 1,313 0,015 33 1,675 0,377 40 2,203 0,905 46 3,034 1,736 56 3,251 1,953 75 4,157 2,859 83 5,608 4,31 0,1027

Control5 0,0223 20 1,21 1,354 0,144 33 1,536 0,326 40 2,224 1,014 45 2,92 1,71 61 3,409 2,199 78 4,891 3,681 90 6,265 5,055 0,1228

Control6 0,0221 20 1,197 23 1,382 0,185 32 1,652 0,455 40 2,073 0,876 46 2,917 1,72 60 3,831 2,634 75 4,449 3,252 85 5,44 4,243 0,113

0,081 mg/l 0,023 20 1,187 22 1,383 0,196 30 1,632 0,445 40 1,998 0,811 48 2,836 1,649 62 3,6 2,413 74 4,231 3,044 88 5,564 4,377 0,1156

0,081 mg/l 0,0227 20 1,221 20 1,318 0,097 33 1,54 0,319 40 2,105 0,884 47 2,811 1,59 62 3,582 2,361 81 5,076 3,855 93 6,333 5,112 0,1432

0,081 mg/l 0,0225 20 1,18 20 1,219 0,039 33 1,606 0,426 40 2,148 0,968 43 2,767 1,587 59 3,421 2,241 80 4,367 3,187 93 5,906 4,726 0,1328

0,134 mg/l 0,0217 20 1,158 21 1,241 0,083 30 1,6 0,442 40 1,975 0,817 43 2,443 1,285 49 2,903 1,745 65 3,358 2,2 80 4,485 3,327 0,0922

0,134 mg/l 0,0225 20 1,261 20 1,32 0,059 35 1,642 0,381 40 2,046 0,785 42 2,595 1,334 55 3,112 1,851 73 3,876 2,615 80 4,618 3,357 0,0935

0,134 mg/l 0,022 20 1,202 21 1,307 0,105 38 1,658 0,456 40 2,204 1,002 44 2,691 1,489 57 2,984 1,782 76 3,964 2,762 80 5,017 3,815 0,1049

0,23 mg/l 0,0228 20 1,241 22 1,412 0,171 34 1,677 0,436 40 2,117 0,876 42 2,676 1,435 47 3,148 1,907 60 3,504 2,263 80 4,382 3,141 0,0877

0,23 mg/l 0,0226 20 1,235 21 1,416 0,181 34 1,705 0,47 40 2,165 0,93 41 2,679 1,444 46 2,941 1,706 68 3,564 2,329 76 4,234 2,999 0,0948

0,23 mg/l 0,0222 20 1,21 23 1,42 0,21 34 1,754 0,544 40 2,282 1,072 43 2,995 1,785 64 3,671 2,461 79 4,85 3,64 98 6,05 4,84 0,1231

0,38 mg/l 0,0213 20 1,176 21 1,345 0,169 33 1,582 0,406 37 1,834 0,658 40 2,357 1,181 48 2,801 1,625 54 3,208 2,032 78 4,112 2,936 0,0838

0,38 mg/l 0,023 20 1,264 21 1,281 0,017 29 1,561 0,297 39 1,976 0,712 41 2,231 0,967 41 2,5 1,236 52 2,925 1,661 63 3,162 1,898 0,0588

0,38 mg/l 0,0215 20 1,148 22 1,367 0,219 31 1,698 0,55 44 1,997 0,849 44 2,477 1,329 44 2,757 1,609 56 2,991 1,843 72 3,37 2,222 0,0611

0,63 mg/l 0,021 20 1,074 21 1,124 0,05 26 1,646 0,572 34 1,699 0,625 35 1,912 0,838 39 2,155 1,081 48 2,33 1,256 52 2,638 1,564 0,0541

0,63 mg/l 0,0228 20 1,223 21 1,275 0,052 26 1,471 0,248 39 1,63 0,407 41 2,014 0,791 42 2,285 1,062 49 2,495 1,272 53 2,799 1,576 0,0524

0,63 mg/l 0,023 20 1,216 20 1,335 0,119 29 1,441 0,225 39 1,882 0,666 40 1,966 0,75 43 2,451 1,235 46 2,629 1,413 58 2,837 1,621 0,0527

1,06 mg/l 0,0232 20 1,245 20 1,269 0,024 33 1,455 0,21 29 1,668 0,423 28 1,638 0,393 28 1,729 0,484 29 1,775 0,53 29 1,852 0,607 0,0345

1,06 mg/l 0,0234 20 1,25 20 1,305 0,055 26 1,445 0,195 27 1,68 0,43 26 1,693 0,443 28 1,677 0,427 28 1,66 0,41 29 1,702 0,452 0,0321

1,06 mg/l 0,0222 20 1,182 20 1,322 0,14 25 1,483 0,301 29 1,544 0,362 28 1,462 0,28 25 1,598 0,416 25 1,624 0,442 24 1,567 0,385 0,0283

1,76 mg/l 0,0218 20 1,127 20 1,166 0,039 20 1,352 0,225 20 1,442 0,315 20 1,432 0,305 22 1,435 0,308 20 1,471 0,344 20 1,412 0,285 0,0276

1,76 mg/l 0,0223 20 1,096 20 1,219 0,123 20 1,299 0,203 20 1,231 0,135 20 1,344 0,248 21 1,428 0,332 20 1,375 0,279 21 1,372 0,276 0,0261

1,76 mg/l 0,0229 20 1,203 20 1,231 0,028 21 1,245 0,042 21 1,18 -0,023 20 1,232 0,029 19 1,237 0,034 19 1,25 0,047 20 1,206 0,003 0,0248

Dia 724 hrs dia 2 dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6

112

Tabla 4a :Datos crudos de absorbancia obtenida para la cuantificación de clorofila a, b y

total a 3 longitudes de onda en el bioensayo de calibración B con dicromato de potasio.



647 664 665

R1 0,995 2,515 2,451 3 0,163 531,035 158,707 689,741

R2 0,699 1,689 1,654 3 0,1153 503,458 166,583 670,041

R3 0,449 1,074 1,056 3 0,1143 323,346 109,018 432,364

R4 0,577 1,382 1,361 3 0,1027 463,525 155,521 619,046

R5 0,796 1,956 1,923 3 0,1228 549,429 173,948 723,377

R6 0,763 1,839 1,822 3 0,113 562,738 184,788 747,526

R1 0,471 1,117 1,106 3 0,1156 333,512 113,771 447,283

R2 0,658 1,571 1,549 3 0,1432 378,030 127,593 505,624

R3 0,63 1,51 1,481 3 0,1328 390,826 131,530 522,356

R1 0,364 0,835 0,821 3 0,0922 310,424 115,010 425,434

R2 0,500 1,164 1,143 3 0,0935 427,017 153,335 580,352

R3 0,481 1,127 1,109 3 0,1049 369,158 130,351 499,509

R1 0,288 0,645 0,638 3 0,0877 252,328 97,870 350,198

R2 0,339 0,764 0,753 3 0,0848 308,688 118,572 427,259

R3 0,272 0,616 0,608 3 0,1431 147,675 56,039 203,715

R1 0,142 0,301 0,298 3 0,0838 122,608 53,345 175,953

R2 0,176 0,376 0,370 3 0,0588 217,728 93,797 311,526

R3 0,230 0,509 0,501 3 0,0611 284,708 113,885 398,592

R1 0,119 0,237 0,234 3 0,0541 148,308 73,310 221,617

R2 0,089 0,174 0,172 3 0,0524 112,254 57,455 169,709

R3 0,151 0,318 0,314 3 0,0527 205,535 90,870 296,405

R1 0,076 0,145 0,143 3 0,0345 141,496 76,052 217,548

R2 0,054 0,095 0,095 3 0,0321 99,418 61,311 160,729

R3 0,056 0,097 0,097 3 0,0283 114,911 72,881 187,792

R1 0,053 0,096 0,095 3 0,0276 116,588 68,826 185,413

R2 0,048 0,089 0,087 3 0,0261 113,848 65,094 178,943

R3 0,051 0,094 0,093 3 0,0248 127,305 72,788 200,093

C5 1,8 mg/L

C6 3 mg/L

C7 5 mg/L

Chl Total

µg·g¯¹]

C2 0,38 mg/L

C3 0,65 mg/L

C4 1,08 mg/L

CONTROL

C1 0,23 mg/L

Cr(VI)volu

men peso gr Chl a µg·g¯¹ Chl b µg·g¯¹]

113

Tabla 5a: Valores crudos de estimación diaria en el crecimiento de Lemna valdiviana en el bioensayo de calibración C para dicromato de potasio. Tiempo 0 se realiza

estimación de peso inicial, número de frondas inicial y área inicial. Día 7, al desmontar el experimento se vuelve a estimar el peso húmedo final y los parámetros NF y AF.Los

días intermedios muestran NF, área total y área corregida según el día 0.

Fecha 13.03.13





toxico K2Cr2O7

A Tiempo 0 hrs

peso (gr) frondas Área frondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área frondas area Área corregidapeso final (gr)

Control1 0,021 20 1,034 25 1,293 0,26 30 1,646 0,61 33 1,903 0,869 39 2,416 1,382 46 2,9 1,865 47,5 2,242 49 3,652 2,618 0,063

Control2 0,0251 20 1,222 23 1,391 0,17 28 1,797 0,58 36 1,879 0,657 42 2,541 1,319 44 3,07 1,844 47,5 2,141 51 3,659 2,437 0,0572

Control3 0,023 20 1,115 23 1,337 0,22 27 1,661 0,55 34 1,87 0,755 39 2,607 1,492 45 3,37 2,259 51,5 2,512 58 3,879 2,764 0,0763

Control4 0,0291 20 1,395 22 1,482 0,09 29 1,825 0,43 37 1,99 0,595 41 2,753 1,358 45 3,78 2,386 54,5 2,701 64 4,41 3,015 0,0913

Control5 0,0242 20 1,05 23 1,378 0,33 29 1,689 0,64 35 1,863 0,813 40 2,475 1,425 44 3,14 2,086 55 2,616 66 4,196 3,146 0,0911

Control6 0,0224 20 1,046 21 1,355 0,31 29 1,643 0,6 33 1,92 0,874 39 2,295 1,249 42 2,97 1,927 45,5 1,883 49 2,884 1,838 0,0623

0,08 mg/l 0,0245 20 1,347 23 1,477 0,13 31 1,697 0,35 39 1,914 0,567 41 2,441 1,094 42 2,84 1,49 49,5 1,803 57 3,463 2,116 0,0702

0,08 mg/l 0,0294 20 1,179 24 1,533 0,35 36 1,769 0,59 40 1,979 0,8 42 2,65 1,471 44 3,18 1,999 53,5 2,241 63 3,661 2,482 0,0737

0,08 mg/l 0,0307 20 1,598 28 1,778 0,18 39 2,102 0,5 42 2,365 0,767 46 2,993 1,395 49 3,34 1,74 56,5 2,083 64 4,023 2,425 0,082

0,13 mg/l 0,0333 20 1,539 33 2,12 0,58 41 2,471 0,93 48 2,614 1,075 49 3,53 1,991 62 3,84 2,305 67 2,852 72 4,938 3,399 0,0991

0,13 mg/l 0,0268 20 1,193 23 1,507 0,31 30 1,743 0,55 35 2,023 0,83 41 2,413 1,22 46 2,92 1,722 54,5 2,192 63 3,854 2,661 0,0884

0,13 mg/l 0,0299 20 1,591 32 1,803 0,21 36 2,3 0,71 45 2,614 1,023 50 3,199 1,608 58 3,62 2,029 62 2,311 66 4,183 2,592 0,0853

0,23 mg/l 0,0257 20 1,105 21 1,417 0,31 30 1,568 0,46 37 1,702 0,597 40 2,245 1,14 41 2,41 1,305 47,5 1,702 54 3,203 2,098 0,0688

0,23 mg/l 0,0359 20 1,616 33 2,053 0,44 43 2,485 0,87 45 2,767 1,151 58 3,482 1,866 63 3,82 2,201 70 2,864 77 5,142 3,526 0,1028

0,23 mg/l 0,0239 20 1,123 21 1,34 0,22 28 1,486 0,36 34 1,669 0,546 40 2,069 0,946 41 2,38 1,255 46,5 1,652 52 3,171 2,048 0,0672

0,38 mg/l 0,0297 20 1,384 29 1,763 0,38 38 2,07 0,69 43 2,411 1,027 46 2,618 1,234 51 2,83 1,444 57,5 1,789 64 3,517 2,133 0,0755

0,38 mg/l 0,0376 20 1,521 31 1,894 0,37 37 2,352 0,83 49 2,765 1,244 51 3,021 1,5 57 3,22 1,697 61 2,008 65 3,84 2,319 0,0838

0,38 mg/l 0,0355 20 1,543 34 1,842 0,3 41 2,296 0,75 43 2,577 1,034 47 2,989 1,446 55 3,16 1,614 62,5 1,92 70 3,768 2,225 0,0832

0,63 mg/l 0,0282 20 1,285 24 1,47 0,19 27 1,707 0,42 34 1,876 0,591 43 2,168 0,883 43 2,23 0,949 43,5 1,073 44 2,481 1,196 0,0449

0,63 mg/l 0,021 20 1,061 20 1,355 0,29 26 1,374 0,31 33 1,58 0,519 37 1,673 0,612 38 1,95 0,888 40 1,036 42 2,245 1,184 0,024

0,63 mg/l 0,0276 20 1,254 24 1,629 0,38 32 1,711 0,46 40 1,902 0,648 40 2,191 0,937 40 2,28 1,028 44 1,216 48 2,658 1,404 0,0397

1,06 mg/l 0,0281 20 1,234 24 1,623 0,39 26 1,56 0,33 30 1,722 0,488 30 1,854 0,62 30 1,79 0,559 30,5 0,574 31 1,822 0,588 0,0307

1,06 mg/l 0,0276 20 1,276 20 1,531 0,26 22 1,628 0,35 27 1,659 0,383 27 1,874 0,598 24 1,79 0,51 24 0,517 24 1,8 0,524 0,0356

1,06 mg/l 0,0284 20 1,365 21 1,648 0,28 28 1,63 0,27 34 1,883 0,518 34 1,999 0,634 33 1,89 0,528 32 0,593 31 2,023 0,658 0,032

1,76 mg/l 0,0325 20 1,581 31 1,716 0,14 33 1,94 0,36 34 2,014 0,433 35 2,175 0,594 33 2,07 0,493 36,5 0,561 40 2,209 0,628 0,0383

1,76 mg/l 0,0316 20 1,562 26 1,662 0,1 29 1,762 0,2 29 1,92 0,358 29 2,002 0,44 29 1,83 0,266 29,5 0,348 30 1,992 0,43 0,0348

1,76 mg/l 0,0263 20 1,37 1,37 0 22 1,372 0 23 1,375 0,005 21 1,376 0,006 21 1,37 0,004 21,5 0,015 22 1,395 0,025 0,029

24 hrs dia 2 dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7

114


total a 3 longitudes de onda en el bioensayo de calibración C con dicromato de potasio.



647 664 665

R1 0,536 1,252 1,245 3 0,063 686,564 241,263 927,826

R2 0,542 1,293 1,286 3 0,0572 782,546 261,997 1044,543

R3 0,604 1,433 1,437 3 0,0763 652,764 219,253 872,017

R4 0,686 1,595 1,601 3 0,0913 606,375 213,052 819,427

R5 0,753 1,817 1,812 3 0,0911 692,192 224,961 917,154

R6 0,403 0,934 0,932 3 0,0423 763,704 272,079 1035,784

R1 0,288 0,664 0,662 3 0,0702 326,835 117,922 444,756

R2 0,194 0,440 0,440 3 0,0737 206,309 76,933 283,242

R3 0,335 0,778 0,775 3 0,082 327,914 116,510 444,424

R1 0,301 0,684 0,683 3 0,0991 238,368 88,653 327,021

R2 0,172 0,388 0,389 3 0,0884 151,809 57,123 208,933

R3 0,250 0,557 0,557 3 0,0853 225,261 87,323 312,584

R1 0,107 0,225 0,226 3 0,0688 112,431 48,997 161,429

R2 0,114 0,244 0,244 3 0,1128 74,320 31,369 105,689

R3 0,108 0,227 0,229 3 0,0672 116,405 50,550 166,955

R1 0,084 0,163 0,165 3 0,0755 73,893 37,500 111,393

R2 0,091 0,177 0,179 3 0,0838 72,273 36,545 108,818

R3 0,095 0,183 0,183 3 0,0832 74,708 38,908 113,616

R1 0,092 0,179 0,180 3 0,0449 135,985 69,101 205,086

R2 0,101 0,196 0,196 3 0,0247 269,752 138,509 408,261

R3 0,082 0,155 0,156 3 0,0397 132,795 71,261 204,057

R1 0,118 0,224 0,224 3 0,0277 274,198 146,853 421,051

R2 0,092 0,164 0,166 3 0,0256 217,044 129,233 346,277

R3 0,119 0,226 0,226 3 0,0261 293,621 157,121 450,741

R1 0,080 0,132 0,134 3 0,0383 115,785 78,996 194,781

R2 0,099 0,171 0,171 3 0,0348 164,677 104,974 269,651

R3 0,086 0,144 0,144 3 0,0209 229,952 154,923 384,876

0,63 mg/L

1,06 mg/L

1,76 mg/L

0,134 mg/L

0,22 mg/L

0,38 mg/L

Chl Total

µg·g¯¹

CONTROL

0,08 mg/L

Cr(VI)

volu

men

ml

peso mg Chl a µg·g¯¹ Chl b µg·g¯¹]

115

Tabla 7a: Valores crudos de estimación diaria en el crecimiento de Lemna valdiviana en el bioensayo de calibración D para dicromato de potasio. Tiempo 0 se realiza

estimación de peso inicial (gr), número de frondas inicial y área inicial (cm2). Día 7, al desmontar el experimento se vuelve a estimar el peso húmedo final y los parámetros

NF y AF. Los días intermedios muestran NF, área total y área corregida según el día 0.

Fecha 13.03.13





toxico K2Cr2O7

B Tiempo 0 hrs

peso (gr) frondas Área frondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área frondas areaÁrea corregidapeso final (gr)

Control1 0,021 20 1,034 25 1,293 0,26 30 1,646 0,61 33 1,903 0,869 39 2,416 1,382 46 2,9 1,865 47,5 3 2,242 49 3,652 2,618 0,063

Control2 0,0251 20 1,222 23 1,391 0,17 28 1,797 0,58 36 1,879 0,657 42 2,541 1,319 44 3,07 1,844 47,5 3 2,141 51 3,659 2,437 0,0572

Control3 0,0238 20 1,115 23 1,337 0,22 27 1,661 0,55 34 1,87 0,755 39 2,607 1,492 45 3,37 2,259 51,5 4 2,512 58 3,879 2,764 0,0763

Control4 0,0291 20 1,395 22 1,482 0,09 29 1,825 0,43 37 1,99 0,595 41 2,753 1,358 45 3,78 2,386 54,5 4 2,701 64 4,41 3,015 0,0913

Control5 0,0242 20 1,05 23 1,378 0,33 29 1,689 0,64 35 1,863 0,813 40 2,475 1,425 44 3,14 2,086 55 4 2,616 66 4,196 3,146 0,0911

Control6 0,0224 20 1,046 21 1,355 0,31 29 1,643 0,6 33 1,92 0,874 39 2,295 1,249 42 2,97 1,927 45,5 3 1,883 49 2,884 1,838 0,0623

0,08 mg/l 0,0253 20 1,13 21 1,258 0,13 29 1,674 0,54 36 2,034 0,904 42 2,504 1,374 48 2,83 1,701 58,5 3 2,306 69 4,04 2,91 0,0621

0,08 mg/l 0,029 20 1,369 23 1,473 0,1 34 1,973 0,6 41 2,23 0,861 44 2,896 1,527 50 3,31 1,941 56 4 2,348 62 4,123 2,754 0,1064

0,08 mg/l 0,0278 20 1,472 27 1,521 0,05 38 2,45 0,98 43 2,989 1,517 51 3,715 2,243 66 4,14 2,663 68,5 4 2,944 71 4,697 3,225 0,1066

0,13 mg/l 0,0324 20 1,575 31 1,914 0,34 36 2,407 0,83 43 2,746 1,171 47 3,52 1,945 58 4,02 2,442 69 5 3,222 80 5,577 4,002 0,1312

0,13 mg/l 0,0356 20 1,558 30 1,79 0,23 36 2,509 0,95 43 2,963 1,405 48 3,434 1,876 60 4,2 2,639 72,5 5 3,408 85 5,734 4,176 0,1312

0,13 mg/l 0,0365 20 1,525 30 2,074 0,55 36 2,601 1,08 42 3,131 1,606 46 3,541 2,016 62 4,01 2,481 69,5 5 3,172 77 5,387 3,862 0,1359

0,23 mg/l 0,0311 20 1,338 27 1,793 0,46 31 2,109 0,77 37 2,374 1,036 49 2,879 1,541 55 3,46 2,118 61,5 4 2,503 68 4,226 2,888 0,1021

0,23 mg/l 0,0253 20 1,05 20 1,309 0,26 30 1,549 0,5 38 1,707 0,657 39 2,094 1,044 40 2,49 1,443 47 3 1,674 54 2,954 1,904 0,0675

0,23 mg/l 0,0258 20 1,202 24 1,446 0,24 33 1,809 0,61 37 2,075 0,873 40 2,557 1,355 43 2,77 1,565 51,5 3 1,902 60 3,441 2,239 0,092

0,38 mg/l 0,026 20 1,325 22 1,536 0,21 31 1,679 0,35 34 1,765 0,44 37 2,207 0,882 44 2,72 1,396 49,5 3 1,576 55 3,081 1,756 0,0772

0,38 mg/l 0,023 20 1,172 21 1,317 0,15 21 1,554 0,38 26 1,715 0,543 39 1,927 0,755 41 2,5 1,324 44 3 1,496 47 2,84 1,668 0,0662

0,38 mg/l 0,0295 20 1,375 25 1,53 0,16 35 1,808 0,43 39 2,121 0,746 41 2,473 1,098 44 2,81 1,439 51 3 1,664 58 3,263 1,888 0,079

0,63 mg/l 0,0273 20 1,195 23 1,321 0,13 27 1,44 0,25 25 1,755 0,56 31 1,864 0,669 31 2,03 0,831 33 2 0,939 35 2,242 1,047 0,0482

0,63 mg/l 0,0286 20 1,279 26 1,478 0,2 29 1,699 0,42 37 2,028 0,749 38 2,329 1,05 40 2,39 1,11 40,5 2 1,216 41 2,601 1,322 0,0615

0,63 mg/l 0,0246 20 1,214 21 1,337 0,12 26 1,482 0,27 30 1,737 0,523 35 1,937 0,723 35 2,11 0,898 36 2 1,047 37 2,41 1,196 0,0512

1,06 mg/l 0,0296 20 1,391 24 1,516 0,13 30 1,733 0,34 35 1,905 0,514 36 2,072 0,681 36 2,15 0,757 36 2 0,799 36 2,231 0,84 0,0421

1,06 mg/l 0,0259 20 1,107 22 1,266 0,16 28 1,495 0,39 29 1,649 0,542 29 1,761 0,654 29 1,85 0,745 29 2 0,729 29 1,82 0,713 0,0387

1,06 mg/l 0,0295 20 1,536 26 1,569 0,03 29 1,667 0,13 33 1,867 0,331 34 1,962 0,426 34 1,96 0,423 34 2 0,558 34 2,229 0,693 0,0436

1,76 mg/l 0,0288 20 1,435 24 1,444 0,01 30 1,692 0,26 28 1,822 0,387 26 1,976 0,541 26 1,68 0,244 26 2 0,453 26 2,097 0,662 0,0396

1,76 mg/l 0,0266 20 1,212 21 1,422 0,21 24 1,538 0,33 26 1,578 0,366 27 1,563 0,351 26 1,63 0,413 26 2 0,511 26 1,82 0,608 0,0346

1,76 mg/l 0,0207 20 1,063 25 1,459 0,4 24 1,497 0,43 23 1,611 0,548 24 1,644 0,581 26 1,82 0,753 27 2 0,754 28 1,818 0,755 0,0393

Dia 6 Dia 724 hrs dia 2 dia 3 Dia 4 Dia 5

116


total a 3 longitudes de onda en el bioensayo de calibración D con dicromato de potasio.



647 664 665

R1 0,536 1,252 1,245 3 0,063 686,564 241,263 927,826

R2 0,542 1,293 1,286 3 0,0572 782,546 261,997 1044,543

R3 0,604 1,433 1,437 3 0,0763 652,764 219,253 872,017

R4 0,686 1,595 1,601 3 0,0913 606,375 213,052 819,427

R5 0,753 1,817 1,812 3 0,0911 692,192 224,961 917,154

R6 0,403 0,934 0,932 3 0,0423 763,704 272,079 1035,784

R1 0,283 0,628 0,628 3 0,0621 348,719 136,356 485,075

R2 0,362 0,831 0,830 3 0,1064 270,027 98,173 368,201

R3 0,617 1,403 1,4 3 0,1066 454,393 168,881 623,274

R1 0,344 0,782 0,783 3 0,1312 206,161 76,382 282,543

R2 0,309 0,698 0,700 3 0,1412 171,027 64,142 235,170

R3 0,319 0,718 0,719 3 0,1359 182,578 69,126 251,704

R1 0,16 0,326 0,327 3 0,1021 109,319 50,858 160,177

R2 0,127 0,245 0,246 3 0,0675 123,583 63,932 187,516

R3 0,162 0,328 0,328 3 0,092 121,774 57,545 179,318

R1 0,151 0,301 0,303 3 0,0772 133,435 64,605 198,041

R2 0,154 0,300 0,301 3 0,0662 154,406 78,445 232,851

R3 0,138 0,262 0,264 3 0,079 112,934 60,033 172,967

R1 0,130 0,239 0,240 3 0,0482 167,881 95,120 263,001

R2 0,123 0,222 0,223 3 0,0615 121,962 71,482 193,444

R3 0,111 0,190 0,191 3 0,0512 124,588 80,338 204,926

R1 0,109 0,181 0,182 3 0,0421 143,777 97,820 241,596

R2 0,123 0,211 0,212 3 0,0387 183,045 117,629 300,674

R3 0,137 0,242 0,242 3 0,0436 186,552 114,202 300,753

R1 0,108 0,175 0,176 3 0,0396 147,303 104,594 251,898

R2 0,116 0,191 0,190 3 0,0346 183,268 127,756 311,025

R3 0,109 0,171 0,171 3 0,0393 143,897 108,580 252,477

CONTROL

0,08 mg/L

Cr(VI)

1,76 mg/L

Chl Total

µg·g¯¹

0,134 mg/L

0,22 mg/L

0,38 mg/L

0,63 mg/L

1,06 mg/L

peso mg Chl a µg·g¯¹ Chl b µg·g¯¹volu

men

ml

117

Tabla 9a: Valores crudos de estimación diaria en el crecimiento de Lemna valdiviana en el bioensayo de calibración E para dicromato de potasio. Tiempo 0 se realiza

estimación de peso inicial, número de frondas inicial y área inicial. Día 7, al desmontar el experimento se vuelve a estimar el peso húmedo final y los parámetros NF y AF.Los

días intermedios muestran NF, área total y área corregida según el día 0.

Fecha 20.03.13





toxico K2Cr2O7

5 Tiempo 0 hrs

peso (gr) frondas Área frondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área frondas area Área corregidapeso final (gr)

Control1 0,0245 20 1,338 23 1,742 0,4 32 1,95 0,612 40 2,367 1,03 42 3,093 1,76 49 3,4185 2,08 56 3,744 2,41 61 3,63 2,29 0,0874

Control2 0,0252 20 1,376 21 1,687 0,31 24 1,968 0,592 39 2,346 0,97 42 2,749 1,37 47 3,3675 1,99 52 3,986 2,61 65 4,694 3,32 0,1056

Control3 0,0243 20 1,411 22 1,443 0,03 34 1,929 0,518 39 2,344 0,93 40 2,756 1,35 43 3,0835 1,67 46 3,411 2 51 3,6 2,19 0,0733

Control4 0,0253 20 1,299 22 1,59 0,29 27 1,839 0,54 39 2,426 1,13 40 2,717 1,42 43 2,9435 1,64 46 3,17 1,87 51 3,953 2,65 0,0834

Control5 0,0241 20 1,255 22 1,396 0,14 27 1,834 0,579 38 2,137 0,88 40 2,687 1,43 43 3,265 2,01 46 3,843 2,59 56 3,707 2,45 0,0865

Control6 0,0254 20 1,316 21 1,56 0,24 27 1,838 0,522 40 2,176 0,86 40 2,786 1,47 46 3,0385 1,72 52 3,291 1,98 55 3,98 2,66 0,0872

0,04 mg/l 0,0233 20 1,297 22 1,378 0,08 30 1,761 0,464 36 2,084 0,79 42 2,396 1,1 47,5 2,86 1,56 53 3,324 2,03 65 4,176 2,88 0,0887

0,04 mg/l 0,0256 20 1,371 21 1,464 0,09 31 1,919 0,548 40 1,99 0,62 42 2,588 1,22 47,5 3,172 1,8 53 3,756 2,39 63 4,187 2,82 0,087

0,04 mg/l 0,0279 20 1,552 22 1,569 0,02 32 1,799 0,247 37 2,265 0,71 42 2,696 1,14 49,5 3,5235 1,97 57 4,351 2,8 68 4,618 3,07 0,1011

0,08 mg/l 0,0254 20 1,436 21 1,525 0,09 32 1,999 0,563 38 2,245 0,81 41 2,793 1,36 47,5 3,425 1,99 54 4,057 2,62 63 4,332 2,9 0,1032

0,08 mg/l 0,0246 20 1,434 22 1,445 0,01 33 1,703 0,269 40 1,995 0,56 40 2,574 1,14 46,5 3,027 1,59 53 3,48 2,05 59 3,864 2,43 0,0887

0,08 mg/l 0,0268 20 1,498 21 1,489 -0,01 34 1,8 0,302 39 2,204 0,71 42 2,868 1,37 47,5 3,1955 1,7 53 3,523 2,03 64 3,944 2,45 0,0955

0,17 mg/l 0,0254 20 1,363 20 1,409 0,05 33 1,643 0,28 40 2,01 0,65 40 2,411 1,05 45,5 2,6675 1,3 51 2,924 1,56 58 3,195 1,83 0,0673

0,17 mg/l 0,0252 20 1,384 25 1,519 0,14 34 1,825 0,441 40 2,172 0,79 40 2,697 1,31 46 3,0925 1,71 52 3,488 2,1 59 3,496 2,11 0,078

0,17 mg/l 0,0252 20 1,331 31 1,448 0,12 38 1,795 0,464 40 2,112 0,78 45 2,827 1,5 50,5 3,059 1,73 56 3,291 1,96 67 3,517 2,19 0,0824

0,22 mg/l 0,0279 20 1,507 33 1,572 0,07 40 2,032 0,525 40 2,46 0,95 45 2,944 1,44 51 3,0775 1,57 57 3,211 1,7 58 3,683 2,18 0,0822

0,22 mg/l 0,0264 20 1,33 29 1,509 0,18 37 1,809 0,479 41 2,29 0,96 45 2,683 1,35 50 3,0025 1,67 55 3,322 1,99 57 3,488 2,16 0,0782

0,22 mg/l 0,0286 20 1,474 34 1,679 0,21 40 1,961 0,487 40 2,404 0,93 48 2,788 1,31 53 3,08 1,61 58 3,372 1,9 58 3,409 1,94 0,0815

0,35 mg/l 0,0253 20 1,396 28 1,66 0,26 40 1,781 0,385 40 2,226 0,83 43 2,448 1,05 50 2,8295 1,43 57 3,211 1,82 55 3,236 1,84 0,0744

0,35 mg/l 0,0246 20 1,376 28 1,387 0,01 37 1,853 0,477 40 2,051 0,68 45 2,571 1,2 49,5 2,8065 1,43 54 3,042 1,67 59 3,165 1,79 0,0654

0,35 mg/l 0,0268 20 1,506 27 1,621 0,12 36 1,901 0,395 37 2,101 0,6 41 2,561 1,06 44,5 2,74 1,23 48 2,919 1,41 56 3,328 1,82 0,0663

1,06 mg/l 0,0275 20 1,479 21 1,568 0,09 22 1,583 0,104 24 1,714 0,24 26 1,885 0,41 26 1,934 0,46 26 1,983 0,5 26 2,007 0,53 0,0362

1,06 mg/l 0,0289 20 1,472 20 1,5 0,03 22 1,626 0,154 24 1,603 0,13 25 1,827 0,36 25 1,874 0,4 25 1,921 0,45 25 1,91 0,44 0,0359

1,06 mg/l 0,0226 20 1,338 20 1,343 0,005 20 1,408 0,07 22 1,43 0,09 23 1,646 0,31 23 1,639 0,3 23 1,632 0,29 23 1,737 0,4 0,0294

1,76 mg/l 0,0275 20 1,525 20 1,641 0,12 20 1,69 0,165 20 1,656 0,13 21 1,72 0,2 21 1,664 0,14 21 1,608 0,08 21 1,749 0,22 0,0304

1,76 mg/l 0,0294 20 1,509 20 1,517 0,01 20 1,604 0,095 20 1,687 0,18 20 1,727 0,22 20,5 1,69 0,18 21 1,653 0,14 21 1,638 0,13 0,0317

1,76 mg/l 0,0282 20 1,513 20 1,527 0,01 20 1,728 0,215 22 1,685 0,17 21 1,752 0,24 21 1,8175 0,3 21 1,883 0,37 21 1,727 0,21 0,0317


118


total a 3 longitudes de onda en el bioensayo de calibración E con dicromato de potasio.



647 664 665

R1 0,687 1,647 1,636 3 0,0874 652,205 216,199 868,404

R2 0,702 1,696 1,686 3 0,1056 556,486 181,009 737,494

R3 0,572 1,365 1,357 3 0,0733 644,529 215,743 860,271

R4 0,554 1,397 1,389 3 0,0834 582,644 170,917 753,561

R5 0,628 1,51 1,5 3 0,0865 604,356 198,954 803,310

R6 0,6 1,458 1,45 3 0,0872 579,771 185,937 765,709

R1 0,367 0,876 0,872 3 0,0887 342,067 114,266 456,333

R2 0,435 1,031 1,027 3 0,087 410,347 139,217 549,564

R3 0,546 1,088 1,085 3 0,1011 366,367 179,154 545,521

R1 0,233 0,541 0,539 3 0,1032 181,193 64,399 245,592

R2 0,175 0,396 0,394 3 0,0887 153,817 57,967 211,784

R3 0,233 0,530 0,529 3 0,0955 191,636 71,151 262,787

R1 0,126 0,267 0,265 3 0,0673 135,604 58,887 194,492

R2 0,133 0,286 0,285 3 0,078 125,796 52,773 178,569

R3 0,105 0,217 0,216 3 0,0824 89,920 40,970 130,890

R1 0,120 0,244 0,244 3 0,0822 101,435 47,528 148,964

R2 0,107 0,220 0,220 3 0,0782 96,252 44,106 140,357

R3 0,134 0,281 0,281 3 0,0815 118,209 52,044 170,253

R1 0,130 0,268 0,268 3 0,0744 123,276 56,188 179,464

R2 0,102 0,199 0,199 3 0,0654 103,501 52,600 156,101

R3 0,107 0,206 0,206 3 0,0663 105,527 55,019 160,545

R1 0,093 0,167 0,168 3 0,0362 155,898 92,108 248,006

R2 0,090 0,161 0,160 3 0,0359 150,444 90,513 240,957

R3 0,082 0,143 0,142 3 0,0294 162,565 102,502 265,066

R1 0,095 0,170 0,168 3 0,0304 187,013 113,021 300,035

R2 0,089 0,153 0,152 3 0,0317 161,053 104,149 265,202

R3 0,086 0,146 0,146 3 0,0317 153,999 101,247 255,246

0,04 mg/L

Chl Total

µg·g¯¹Cr(VI)

volu

men

ml

peso mg Chl a µg·g¯¹ Chl b µg·g¯¹

1,7 mg/L

CONTROL

0,08 mg/L

0,17 mg/L

0,22 mg/L

0,35 mg/L

1,06 mg/L

119

Datos crudos de exposición de L. valdiviana en sulfato de cobre

Tabla 11a: Valores crudos de estimación diaria en el crecimiento de Lemna valdiviana en el bioensayo de calibración P para Sulfato de cobre. Tiempo 0 se

realiza estimación de peso inicial (gr), número de frondas inicial y área inicial (cm2). Día 7, al desmontar el experimento se vuelve a estimar el peso húmedo final

y los parámetros NF y AF. Los días intermedios muestran NF, área total y área corregida

Fecha 20.04.13




Condiciones de cámara de cultivo20°C±2, 5000 lux, FP 14/10

toxico CuSO4 5H2O

peso (gr)frondasÁrea frondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área frondas area Área corregidapeso final (gr)

Control1 0,0248 20 1,302 29,5 1,489 0,19 39 1,676 0,37 40 1,944 0,64 45 2,224 0,92 50 2,411 1,11 60 2,8365 1,53 70 3,262 1,96 0,0752

Control2 0,026 20 1,326 28 1,5225 0,2 36 1,719 0,39 39 1,95 0,62 42 2,444 1,12 45 2,6405 1,31 58 3,3333 2,01 71 4,026 2,7 0,0867

Control3 0,0257 20 1,152 25,5 1,3265 0,17 31 1,501 0,35 36 1,621 0,47 41 2,213 1,06 46 2,3875 1,24 48 2,5728 1,42 50 2,758 1,61 0,0555

Control4 0,0238 20 1,241 26,5 1,394 0,15 33 1,547 0,31 39 1,834 0,59 41 2,284 1,04 43 2,437 1,2 48 2,56 1,32 53 2,683 1,44 0,0522

Control5 0,0232 20 1,118 27,5 1,3035 0,19 35 1,489 0,37 40 1,963 0,85 44 2,358 1,24 48 2,5435 1,43 61 3,3023 2,18 73 4,061 2,94 0,0936

Control6 0,0264 20 1,237 28,5 1,4605 0,22 37 1,684 0,45 42 2,008 0,77 42 2,473 1,24 42 2,6965 1,46 54 2,9778 1,74 66 3,259 2,02 0,0751

0,01 mg Cu 0,0276 20 1,249 26,5 1,3865 0,14 33 1,524 0,28 37 1,836 0,59 41 2,268 1,02 45 2,4055 1,16 49 2,5888 1,34 53 2,772 1,52 0,0557

0,01 mg Cu 0,0222 20 1,275 27 1,3475 0,07 34 1,42 0,15 39 1,647 0,37 45 1,994 0,72 51 2,0665 0,79 59 2,7218 1,45 66 3,377 2,1 0,079

0,01 mg Cu 0,0273 20 1,123 29 1,3835 0,26 38 1,644 0,52 41 1,9 0,78 44 2,561 1,44 47 2,8215 1,7 55 3,0963 1,97 63 3,371 2,25 0,0703

0,023 mg Cu 0,0261 20 1,328 27 1,4105 0,08 34 1,493 0,17 37 1,778 0,45 44 2,22 0,89 47 2,3025 0,97 49 2,3643 1,04 51 2,426 1,1 0,0485

0,023 mg Cu 0,0292 20 1,248 26,5 1,395 0,15 33 1,542 0,29 37 1,799 0,55 42 2,089 0,84 44 2,236 0,99 47 2,382 1,13 50 2,528 1,28 0,0503

0,023 mg Cu 0,0212 20 1,205 26 1,343 0,14 32 1,481 0,28 37 1,703 0,5 42 2,083 0,88 44 2,221 1,02 46 2,298 1,09 47 2,375 1,17 0,0475

0,053 mg Cu 0,0235 20 1,218 26,5 1,307 0,09 33 1,396 0,18 37 1,655 0,44 42 2,123 0,91 43 2,212 0,99 45 2,3585 1,14 47 2,505 1,29 0,0448

0,053 mg Cu 0,0203 20 1,269 26 1,3815 0,11 32 1,494 0,23 35 1,696 0,43 39 2,14 0,87 43 2,2525 0,98 46 2,3613 1,09 49 2,47 1,2 0,0441

0,053 mg Cu 0,0224 20 1,291 26 1,3355 0,04 32 1,38 0,09 37 1,704 0,41 41 1,986 0,7 45 2,0305 0,74 50 2,5408 1,25 54 3,051 1,76 0,0605

0,122 mg Cu 0,0239 20 1,216 29 1,3875 0,17 38 1,559 0,34 37 1,901 0,69 41 2,295 1,08 45 2,4665 1,25 48 2,4953 1,28 50 2,524 1,31 0,051

0,122 mg Cu 0,0227 20 1,28 27 1,3165 0,04 34 1,353 0,07 35 1,746 0,47 40 2,088 0,81 42 2,1245 0,84 51 2,4478 1,17 60 2,771 1,49 0,0526

0,122 mg Cu 0,0244 20 1,24 25,5 1,2745 0,03 31 1,309 0,07 35 1,577 0,34 44 1,824 0,58 48 1,8585 0,62 49 1,9733 0,73 50 2,088 0,85 0,0379

0,28 mg Cu 0,0234 20 1,086 24,5 1,0975 0,01 29 1,109 0,02 32 1,264 0,18 35 1,494 0,41 38 1,5055 0,42 44 1,7863 0,7 49 2,067 0,98 0,04

0,28 mg Cu 0,0232 20 0,973 25 1,115 0,14 30 1,257 0,28 30 1,56 0,59 39 1,833 0,86 43 1,975 1 46 2,1245 1,15 49 2,274 1,3 0,0435

0,28 mg Cu 0,0223 20 1,122 27 1,3105 0,19 34 1,499 0,38 36 1,718 0,6 39 2,065 0,94 42 2,2535 1,13 49 2,3918 1,27 55 2,53 1,41 0,0473

0,65 mg Cu 0,0212 20 1,297 21 1,215 -0,1 22 1,133 -0,2 26 1,266 -0,03 33 1,324 0,03 37 1,242 -0,05 40 1,4175 0,12 42 1,593 0,3 0,0325

0,65 mg Cu 0,0234 20 1,127 21,5 1,1965 0,07 23 1,266 0,14 28 1,393 0,27 35 1,438 0,31 38 1,5075 0,38 41 1,6853 0,56 43 1,863 0,74 0,0332

0,65 mg Cu 0,0238 20 1,188 23 1,147 -0 26 1,106 -0,1 30 1,165 -0,02 36 1,211 0,02 39 1,17 -0,02 42 1,327 0,14 44 1,484 0,3 0,0278

2 mg Cu 0,0262 20 1,085 21,5 0,9745 -0,1 23 0,864 -0,2 15 0,848 -0,24 13 0,537 -0,55 11 0,4265 -0,66 12 0,3058 -0,8 12 0,185 -0,9 0,0107

2 mg Cu 0,0271 20 1,19 22,5 1,133 -0,1 25 1,076 -0,1 16 0,792 -0,4 15 0,559 -0,63 14 0,502 -0,69 14 0,332 -0,9 13 0,162 -1,03 0,0116

2 mg Cu 0,0247 20 1,312 21,5 1,1105 -0,2 23 0,909 -0,4 18 0,806 -0,51 15 0,474 -0,84 12 0,2725 -1,04 12 0,2258 -1,1 12 0,179 -1,13 0,0097

Dia 7Tiempo 0 hrs Dia 624 hrs dia 2 dia 3 Dia 4 Dia 5

120


total a 3 longitudes de onda en el bioensayo de calibración P con sulfato de cobre. Volumen

de extracción y peso al final del test para la normalización de clorofila total. Valores de

clorofila a, b y total en µg de chl·g¯¹de planta

647 664 665

R1 0,476 1,160 1,154 3 0,0752 533,213 179,835 712,857

R2 0,422 1,056 1,053 3 0,0867 422,656 133,689 550,362

R3 0,291 0,678 0,674 3 0,0555 420,179 156,788 571,019

R4 0,320 0,745 0,740 3 0,0522 490,629 183,543 667,227

R5 0,451 1,066 1,061 3 0,0936 392,569 141,741 528,753

R6 0,448 1,084 1,079 3 0,0751 498,740 170,855 662,535

R1 0,301 0,698 0,696 3 0,0557 431,532 162,149 587,572

R2 0,221 0,552 0,550 3 0,07 273,476 86,961 356,565

R3 0,425 0,992 0,989 3 0,0703 486,213 180,145 659,475

R1 0,321 0,740 0,736 3 0,0485 524,351 200,112 717,040

R2 0,277 0,641 0,639 3 0,0503 438,678 165,632 598,100

R3 0,265 0,609 0,607 3 0,0475 440,984 169,045 603,786

R1 0,228 0,513 0,511 3 0,0448 392,831 157,645 544,915

R2 0,267 0,602 0,599 3 0,0441 468,124 187,251 648,748

R3 0,341 0,810 0,807 3 0,0605 461,978 164,798 620,236

R1 0,237 0,527 0,528 3 0,051 355,178 145,226 495,376

R2 0,293 0,649 0,646 3 0,0526 422,383 175,303 591,707

R3 0,237 0,535 0,533 3 0,0379 484,478 193,046 670,666

R1 0,176 0,380 0,378 3 0,04 324,170 141,917 461,498

R2 0,192 0,454 0,423 3 0,0435 347,122 134,381 476,590

R3 0,198 0,429 0,428 3 0,0473 310,118 134,393 440,122

R1 0,058 0,099 0,100 3 0,0325 101,707 68,392 168,660

R2 0,063 0,115 0,115 3 0,0332 116,090 69,831 184,279

R3 0,058 0,097 0,098 3 0,0278 116,162 80,951 195,469

R1 0,041 0,035 0,036 3 0,0107 94,335 191,969 284,972

R2 0,045 0,038 0,039 3 0,0116 93,983 194,904 287,560

R3 0,042 0,037 0,038 3 0,0097 111,053 215,304 326,227

2 mg/L

CONTROL

0,023 mg/L

0,0536 mg/L

0,122 mg/L

0,28 mg/L

0,65mg/L

0,01 mg/L

Chl Total

µg·g¯¹Cu(II)

volu

men

ml


121

Tabla 13a: Valores crudos de estimación diaria en el crecimiento de Lemna valdiviana en el bioensayo de calibración Q para Sulfato de cobre. Tiempo 0 se



Fecha 20.04.13




Condiciones de cámara de cultivo20°C±2, 5000 lux, FP 14/10

toxico CuSO4 5H2O

6 Tiempo 0 hrs

peso (gr)frondasÁrea frondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área frondas area Área corregidapeso final (gr)

Control1 0,0248 20 1,302 29,5 1,489 0,19 39 1,676 0,37 40 1,944 0,64 45 2,181 0,879 50 2,368 1,07 60 2,8 1,51 70 3,262 1,96 0,0752

Control2 0,026 20 1,326 28 1,5225 0,2 36 1,719 0,39 39 1,95 0,62 42 2,444 1,118 45 2,6405 1,31 58 3,3 2,01 71 4,026 2,7 0,0867

Control3 0,0257 20 1,152 25,5 1,3265 0,17 31 1,501 0,35 36 1,621 0,47 41 2,213 1,061 46 2,3875 1,24 48 2,6 1,42 50 2,758 1,61 0,0555

Control4 0,0238 20 1,241 26,5 1,394 0,15 33 1,547 0,31 39 1,834 0,59 41 2,284 1,043 43 2,437 1,2 48 2,6 1,32 53 2,683 1,44 0,0522

Control5 0,0232 20 1,118 27,5 1,3035 0,19 35 1,489 0,37 40 1,963 0,85 44 2,358 1,24 48 2,5435 1,43 61 3,3 2,18 73 4,061 2,94 0,0936

Control6 0,0264 20 1,237 28,5 1,4605 0,22 37 1,684 0,45 42 2,008 0,77 42 2,473 1,236 42 2,6965 1,46 54 3 1,74 66 3,259 2,02 0,0751

0,01 mg Cu 0,0276 20 1,3 28 1,4515 0,15 36 1,603 0,3 37 1,788 0,49 43 2,279 0,979 45 2,4305 1,13 48 2,6 1,28 50 2,729 1,43 0,0519

0,01 mg Cu 0,0222 20 1,152 28,5 1,255 0,1 37 1,358 0,21 39 1,632 0,48 43 1,979 0,827 47 2,082 0,93 50 2,3 1,11 53 2,443 1,29 0,0522

0,01 mg Cu 0,0273 20 1,28 28,5 1,377 0,1 37 1,474 0,19 38 1,785 0,51 39 1,976 0,696 40 2,073 0,79 45 2,3 0,97 49 2,43 1,15 0,0505

0,023 mg Cu 0,0261 20 1,297 27 1,3595 0,06 34 1,422 0,13 39 1,718 0,42 41 2,098 0,801 43 2,1605 0,86 47 2,4 1,07 51 2,575 1,28 0,0568

0,023 mg Cu 0,0292 20 1,153 27,5 1,214 0,06 35 1,275 0,12 38 1,577 0,42 42 1,796 0,643 46 1,857 0,7 49 2,1 0,9 51 2,251 1,1 0,0442

0,023 mg Cu 0,0212 20 1,282 26,5 1,4175 0,14 33 1,553 0,27 39 1,724 0,44 39 2,222 0,94 39 2,3575 1,08 44 2,5 1,2 49 2,603 1,32 0,0517

0,053 mg Cu 0,0235 20 1,206 24 1,301 0,1 28 1,396 0,19 36 1,548 0,34 37 1,813 0,607 39 1,908 0,7 42 2,1 0,9 45 2,298 1,09 0,0453

0,053 mg Cu 0,0203 20 1,29 26,5 1,3515 0,06 33 1,413 0,12 38 1,859 0,57 38 1,91 0,62 44 1,9715 0,68 50 2,5 1,22 55 3,05 1,76 0,0658

0,053 mg Cu 0,0224 20 1,175 26,5 1,312 0,14 33 1,449 0,27 38 1,805 0,63 39 2,079 0,904 40 2,216 1,04 45 2,5 1,28 50 2,702 1,53 0,0513

0,122 mg Cu 0,0239 20 1,23 24,5 1,3375 0,11 29 1,445 0,22 36 1,605 0,38 39 1,873 0,643 42 1,9805 0,75 43 2,2 0,99 44 2,46 1,23 0,0455

0,122 mg Cu 0,0227 20 1,245 27,5 1,325 0,08 35 1,405 0,16 39 1,668 0,42 40 2,002 0,757 41 2,082 0,84 45 2,4 1,15 48 2,707 1,46 0,0481

0,122 mg Cu 0,0244 20 1,149 25,5 1,213 0,06 31 1,277 0,13 35 1,515 0,37 38 1,756 0,607 41 1,82 0,67 49 2,3 1,13 57 2,728 1,58 0,06

0,28 mg Cu 0,0234 20 1,178 22,5 1,2575 0,08 25 1,337 0,16 34 1,561 0,38 39 1,807 0,629 44 1,8865 0,71 48 2,3 1,11 52 2,681 1,5 0,0533

0,28 mg Cu 0,0232 20 1,166 22,5 1,2645 0,1 25 1,363 0,2 35 1,493 0,33 37 1,868 0,702 39 1,9665 0,8 46 2,2 1,08 52 2,524 1,36 0,0518

0,28 mg Cu 0,0223 20 1,055 25,5 1,126 0,07 31 1,197 0,14 37 1,477 0,42 41 1,772 0,717 45 1,843 0,79 49 2 0,94 52 2,148 1,09 0,0349

0,65 mg Cu 0,0212 20 1,188 22 1,2085 0,02 24 1,229 0,04 29 1,294 0,11 34 1,346 0,158 39 1,3665 0,18 40 1,4 0,22 41 1,453 0,27 0,0326

0,65 mg Cu 0,0234 20 1,203 23 1,2155 0,01 26 1,228 0,02 30 1,382 0,18 36 1,48 0,277 37 1,4925 0,29 39 1,6 0,36 41 1,625 0,42 0,0361

0,65 mg Cu 0,0238 20 1,126 22,5 1,1855 0,06 25 1,245 0,12 30 1,385 0,26 33 1,342 0,216 36 1,4015 0,28 38 1,5 0,38 40 1,604 0,48 0,0401

2 mg Cu 0,0262 20 1,312 18,5 1,0585 -0,3 17 0,805 -0,5 15 0,748 -0,56 14 0,455 -0,86 13 0,2015 -1,11 12 0,1 -1,2 11 0,088 -1,22 0,0069

2 mg Cu 0,0271 20 1,083 19 0,968 -0,1 18 0,853 -0,2 16 0,655 -0,43 16 0,41 -0,67 16 0,295 -0,79 15 0,2 -0,9 13 0,057 -1,03 0,0086

2 mg Cu 0,0247 20 1,212 20 1,1175 -0,1 18 1,023 -0,2 18 0,76 -0,45 17 0,428 -0,78 16 0,3335 -0,88 15 0,2 -1 13 0,123 -1,09 0,0089


122


total a 3 longitudes de onda en el bioensayo de calibración Q con sulfato de cobre.



647 664 665

R1 0,476 1,160 1,154 3 0,0752 533,213 179,835 712,857

R2 0,422 1,056 1,053 3 0,0867 422,656 133,689 556,199

R3 0,291 0,678 0,674 3 0,0555 420,179 156,788 576,810

R4 0,320 0,745 0,740 3 0,0522 490,629 183,543 673,989

R5 0,451 1,066 1,061 3 0,0936 392,569 141,741 534,166

R6 0,448 1,084 1,079 3 0,0751 498,740 170,855 669,416

R1 0,311 0,690 0,686 3 0,0519 454,908 188,390 643,118

R2 0,348 0,784 0,779 3 0,0522 514,605 206,498 720,903

R3 0,319 0,711 0,707 3 0,0505 482,037 197,686 679,534

R1 0,372 0,842 0,838 3 0,0568 508,633 201,739 710,176

R2 0,280 0,619 0,617 3 0,0442 479,688 199,605 679,102

R3 0,298 0,662 0,657 3 0,0517 437,770 181,144 618,740

R1 0,270 0,588 0,586 3 0,0453 443,815 190,534 634,170

R2 0,330 0,765 0,764 3 0,0658 400,689 150,411 550,950

R3 0,246 0,529 0,638 3 0,0513 393,223 140,142 533,221

R1 0,263 0,569 0,565 3 0,0455 426,404 186,235 612,465

R2 0,248 0,528 0,525 3 0,0481 373,885 168,472 542,203

R3 0,334 0,784 0,781 3 0,06 450,295 164,933 615,060

R1 0,212 0,448 0,448 3 0,0533 286,949 130,505 417,334

R2 0,243 0,529 0,528 3 0,0518 349,458 149,909 499,227

R3 0,197 0,415 0,415 3 0,0349 405,805 185,725 591,361

R1 0,073 0,102 0,104 3 0,0326 101,635 95,267 196,835

R2 0,079 0,116 0,117 3 0,0361 104,638 91,169 195,741

R3 0,098 0,169 0,171 3 0,0401 141,066 93,007 234,000

R1 0,056 0,049 0,050 3 0,0169 83,860 165,179 248,940

R2 0,056 0,047 0,047 3 0,016 82,624 176,636 259,155

R3 0,059 0,052 0,053 3 0,0189 79,705 155,357 234,968

0,01 mg/L

Chl Total

µg·g¯¹Cu(II)

volu

men

ml


2 mg/L

CONTROL

0,023 mg/L

0,0536 mg/L

0,122 mg/L

0,28 mg/L

0,65mg/L

123

Tabla 15a: Valores crudos de estimación diaria en el crecimiento de Lemna valdiviana en el bioensayo de calibración R para Sulfato de cobre. Tiempo 0 se



Fecha 13.08.13





toxico CuSO4 5H2O

peso (gr) frondas Área frondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área Área corregidafrondas Área frondas areaÁrea corregidapeso final (gr)

Control1 0,0245 20 1,338 23 1,742 0,4 32 1,95 0,61 40 2,367 1,03 42 3,093 1,755 46,5 3,419 2,0805 51 3,744 2,41 61 3,63 2,29 0,0874

Control2 0,0252 20 1,376 21 1,687 0,31 24 1,968 0,59 39 2,346 0,97 43 2,749 1,373 48,5 3,368 1,9915 54 3,986 2,61 65 4,694 3,32 0,1056

Control3 0,0243 20 1,411 22 1,443 0,03 34 1,929 0,52 39 2,344 0,93 40 2,756 1,345 43,5 3,084 1,6725 47 3,411 2 51 3,6 2,19 0,0733

Control4 0,0253 20 1,299 22 1,59 0,29 27 1,839 0,54 39 2,426 1,13 40 2,717 1,418 44 2,944 1,6445 48 3,17 1,87 51 3,953 2,65 0,0834

Control5 0,0241 20 1,255 22 1,396 0,14 27 1,834 0,58 38 2,137 0,88 38 2,687 1,432 42,5 3,265 2,01 47 3,843 2,59 56 3,707 2,45 0,0865

Control6 0,0254 20 1,316 21 1,56 0,24 27 1,838 0,52 40 2,176 0,86 40 2,786 1,47 46,5 3,039 1,7225 53 3,291 1,98 55 3,98 2,66 0,0872

C1R1 0,0254 20 1,4 28 1,765 0,37 36 2,014 0,61 41 2,729 1,33 46 3,703 2,303 56 3,975 2,5745 66 4,246 2,85 73 4,842 3,44 0,1073

C1R2 0,0274 20 1,548 21 1,712 0,16 30 1,889 0,34 34 2,588 1,04 40 2,966 1,418 44,5 3,155 1,607 49 3,344 1,8 55 3,705 2,16 0,0819

C1R3 0,0255 20 1,442 21 1,553 0,11 26 1,706 0,26 37 2,362 0,92 40 2,469 1,027 43 2,624 1,182 46 2,779 1,34 53 3,511 2,07 0,0765

C2R1 0,0297 20 1,558 20 1,738 0,18 31 1,958 0,4 40 2,657 1,1 40 3,005 1,447 46,5 3,497 1,939 53 3,989 2,43 62 4,373 2,82 0,0976

C2R2 0,0275 20 1,614 21 1,648 0,03 32 2,007 0,39 39 2,464 0,85 40 3,095 1,481 46,5 3,376 1,762 53 3,657 2,04 61 4,64 3,03 0,0806

C2R3 0,0291 20 1,602 20 1,481 -0,1 33 1,945 0,34 38 2,65 1,05 40 2,873 1,271 45,5 3,019 1,4165 51 3,164 1,56 57 3,872 2,27 0,0934

C3R1 0,0278 20 1,496 24 1,661 0,17 31 1,931 0,44 38 2,292 0,8 41 2,836 1,34 48,5 3,27 1,7735 56 3,703 2,21 61 4,321 2,83 0,0874

C3R2 0,0244 20 1,448 22 1,684 0,24 22 1,828 0,38 36 2,113 0,67 38 2,616 1,168 44 3,065 1,6165 50 3,513 2,07 53 3,852 2,4 0,0691

C3R3 0,0229 20 1,454 20 1,469 0,02 21 1,781 0,33 33 2,025 0,57 40 2,439 0,985 42,5 2,915 1,4605 45 3,39 1,94 51 3,781 2,33 0,076

C4R1 0,0268 20 1,382 20 1,445 0,06 25 1,882 0,5 37 2,257 0,88 38 2,607 1,225 43,5 2,91 1,5275 49 3,212 1,83 55 3,735 2,35 0,0765

C4R2 0,0274 20 1,411 21 1,501 0,09 23 1,73 0,32 33 2,083 0,67 38 2,566 1,155 44,5 2,968 1,5565 51 3,369 1,96 55 3,69 2,28 0,0752

C4R3 0,0251 20 1,393 20 1,496 0,1 25 1,823 0,43 33 2,194 0,8 40 2,797 1,404 45,5 3,157 1,764 51 3,517 2,12 55 4,046 2,65 0,0804

C5R1 0,0292 20 1,509 22 1,571 0,06 27 1,807 0,3 33 2,147 0,64 40 2,517 1,008 44 2,967 1,458 48 3,417 1,91 59 4,066 2,56 0,0837

C5R2 0,0284 20 1,702 21 1,674 -0 28 1,939 0,24 34 2,301 0,6 39 2,683 0,981 46,5 3,274 1,572 54 3,865 2,16 63 4,435 2,73 0,0928

C5R3 0,0276 20 1,592 21 1,626 0,03 26 1,731 0,14 35 2,168 0,58 39 2,78 1,188 44,5 3,138 1,5455 50 3,495 1,9 60 4,295 2,7 0,0828

C6R1 0,0253 20 1,412 20 1,594 0,18 21 1,78 0,37 29 1,948 0,54 39 2,292 0,88 41 2,628 1,216 43 2,964 1,55 50 3,211 1,8 0,0668

C6R2 0,0293 20 1,669 20 1,758 0,09 30 1,819 0,15 33 2,103 0,43 38 2,595 0,926 44 3,001 1,3315 50 3,406 1,74 60 3,839 2,17 0,0792

C6R3 0,0247 20 1,516 22 1,512 -0 23 1,621 0,11 28 1,767 0,25 36 2,355 0,839 42 2,721 1,205 48 3,087 1,57 51 3,768 2,25 0,0754

C7R1 0,0271 20 1,563 21 1,57 0,01 23 1,564 0 27 1,57 0,01 33 1,66 0,097 33,5 1,705 0,142 34 1,75 0,19 40 1,693 0,13 0,0357

C7R2 0,0264 20 1,545 20 1,586 0,04 22 1,575 0,03 24 1,434 -0,11 29 1,399 -0,146 32,5 1,359 -0,1865 36 1,318 -0,2 37 1,561 0,02 0,0331

C7R3 0,026 20 1,413 20 1,47 0,06 22 1,584 0,17 28 1,575 0,16 28 1,476 0,063 30,5 1,55 0,1365 33 1,623 0,21 37 1,493 0,08 0,0358

Tiempo 0 hrs 24 hrs dia 2 dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7

124


total a 3 longitudes de onda en el bioensayo de calibración R sulfato de cobre. Volumen de

extracción y peso al final del test para la normalización de clorofila total. Valores de

clorofila a, b y total en µg de chl·g¯¹de planta

647 664 665

R1 0,687 1,647 1,636 3 0,0874 652,205 216,199 868,404

R2 0,702 1,696 1,686 3 0,1056 556,486 181,009 737,494

R3 0,572 1,365 1,357 3 0,0733 644,529 215,743 860,271

R4 0,554 1,397 1,389 3 0,0834 582,644 170,917 753,561

R5 0,628 1,51 1,5 3 0,0865 604,356 198,954 803,310

R6 0,6 1,458 1,45 3 0,0872 579,771 185,937 765,709

R1 0,622 1,453 1,495 3 0,1073 476,678 161,053 637,731

R2 0,7 1,614 1,606 3 0,0819 680,231 245,923 926,154

R3 0,456 1,112 1,107 3 0,0765 504,465 160,250 664,716

R1 0,662 1,561 1,553 3 0,0976 553,176 190,160 743,336

R2 0,607 1,447 1,440 3 0,0806 621,654 208,345 829,999

R3 0,598 1,414 1,41 3 0,0934 524,206 178,737 703,196

R1 0,606 1,418 1,411 3 0,0874 560,801 196,141 735,791

R2 0,546 1,262 1,255 3 0,0691 630,345 226,798 802,437

R3 0,404 0,940 0,936 3 0,076 427,455 151,308 511,897

R1 0,351 0,815 0,812 3 0,0765 368,235 130,867 555,773

R2 0,378 0,876 0,873 3 0,0752 402,621 143,668 611,212

R3 0,559 1,291 1,285 3 0,0804 554,431 199,645 736,832

R1 0,504 1,175 1,168 3 0,0837 484,802 171,172 659,229

R2 0,519 1,195 1,191 3 0,0928 444,818 161,025 601,374

R3 0,496 1,162 1,156 3 0,0828 485,082 169,241 620,547

R1 0,405 0,924 0,920 3 0,0668 477,137 176,465 621,139

R2 0,328 0,739 0,737 3 0,0792 321,757 122,099 438,769

R3 0,310 0,705 0,703 3 0,0754 322,692 119,991 371,332

R1 0,131 0,249 0,249 3 0,0357 236,534 126,370 369,874

R2 0,143 0,270 0,270 3 0,0331 276,411 149,557 418,450

R3 0,133 0,249 0,249 3 0,0358 235,451 129,447 282,478

0,01 mg/L

Chl Total

µg·g¯¹Cu (II)

volu

men

ml


1 mg/L

CONTROL

0,02 mg/L

0,04 mg/L

0,1mg/L

0,21 mg/L

0,46 mg/L

CALIBRACION Y ESTIMACION DE LA SENSIBILIDAD …

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