Campy Lob Acter

1

CAMPYLOBACTERACEAE

Bacteriología

Curso de Bacteriología

2

HISTORIA


3

THEODOR ESCHERICH 1886

Bacilos Gram negativos curvos en

DESCRIBE

OBSERVA

deposiciones de 16/17 niñosfallecidos por diarrea

Bacilos semejantes en gatosjóvenes con diarrea Vibrio felinus


4

Sir McFadyean John (1853-1941)Royal Veterinary College LondonVeterinary pathology

Sir Stockman Stewart (1869-1926)Royal Veterinary College London

Los primeros aislamientos de especies del género Campylobacter fueronrealizados en el área de la microbiología veterinaria, en 1909 y 1913.

1918 Mac Fadyean y Stockmann y posteriormente Smith establecieron laparticipación de una bacteria microaerófila en el aborto del ganado bovino yovino, de morfología similar al género Vibrio, por lo que se lo llamó Vibrio fetus.


5

En 1931, Jones y Little aislaron a partir de bovinos condisturbios intestinales “un vibrión” microaerófilo, al quedenominaron Vibrio jejuni.En 1944 Doyle describió “un vibrión” aislado del intestino decerdos con diarrea y lo denominó Vibrio coli.


6

†

Elizabeth King 1966

“related Vibrio”

En 1957 E. King

Estudia las características deVibrios aislados de diferentesfuentes.

Estableció que no todoscorrespondían a Vibrio fetus .

Determinó dos grupos concaracterísticas serológicas ybioquímicas diferentes

Algunos eran capaces de crecer a25 y 37°C

Otros lo hacían a 42°C, a estoslos consideró como “Vibriosrelacionados” y se comprobó queeran agentes causantes de diarreaaguda.


7

Prof. J.-P. ButzlerSt. Pierre Hospital - VUB

En 1972 Dekeyser y Butzler aislaronlos microorganismos de las heces depacientes con enteritis aguda usandouna técnica de filtración que permitíael pasaje de pequeños bastonescurvos a través de una membrana,pero retenía microorganismos fecalesmás grandes.

Butzler y Skirrow, Bolton y Robertson,Blaser y col, desarrollaron mediosselectivos que permitieron aislar estosmicroorganismos con relativa facilidady establecer su participación endiferentes cuadros infecciosos en elhombre.


8

La primera asociación entre “vibriones” microaerófilosy diarrea en el hombre fue sugerida por Levy en 1946,el que realizó un estudio en un brote de gastroenteritissobre 357 pacientes en un penal en Illinois,observando en exámenes directos la presencia devibrios en el 20% de las muestras.

del géneroEn 1963, Sébald y Veron proponen la creaciónCampylobacter.


9

Taxonomía

REINODIVISIONCLASEFAMILIAGENEROS

ESPECIE

ProcaryotaeGracillicutesProteobacteriaCampylobacteraceaeCampylobacterArcobacterSulfospirillumBacteroides ureolyticus


10

PFEIFFER 1987

Describe:

- hallazgos clínicos post-mortem enintestino grueso compatibles conenteritis por Campylobacter

- bacterias espiraladas, de 2 a 3 vueltasregulares, móviles, no cultivables


11

1909 -1919193119441957195819631971 –197219771992

fetos bovinos yovinosbovinos con diarrreacerdos con diarreagastroenteritis?vibriosis hepáticaDNAdiarrea en humanosmedio selectivotaxonomía

Vibrio fetusVibrio jejuniVibrio colirelated vibriosVibrio hepaticusGén. CampylobacterC. fetus subsp. jejuni

Fam. Campylobacteraceae

Los primeros aislamientos de especies del género Campylobacter fueronrealizados en el área de la microbiología veterinaria, en 1909 y 1913.


12

CAMPYLOBACTER : taxonomía y nomenclatura

V. jejuni

V. coli

V. hepaticus

C. fetussubsp. jejuni

C. jejuni

C. coli

V. fetus

C. fetus subsp.intestinalis

C. fetus subsp.fetus

RelatedVibrios


13

Metabolismo

No Fermentativo

Fermentativo

Género

Campylobacter

Vibrio

% G-C

29-35

44-50


14

Vandamme y col. 1992

TAXONOMÍA DE BACILOS GRAM NEGATIVOS CURVOS

Helicobacter, Campylobacter, Arcobacter yWolinella

pertenecen a un grupo distinto de bacterias

Superfamilia VI del rARN


15


Superfamilia VI del rARN

Campylobacter

Bacteroides ureolyticusCampylobacteraceae

Arcobacter

Flexispira

WolinellarRNA superfamilias I a V

Helicobacter

Organismos “Campylobacter-like” de vida libre


16


Cambios de Nomenclatura

Campylobacter cinaedi

C. fenneliae

C. nitrofrigilis

C. cryaerophila

Wolinella recta

W. curva

Helicobacter cinaedi

H. feneliae

Arcobacter nitrofrigilis

A. cryaerophilus

Campylobacter rectus

C. curvus


17

GÉNEROCAMPYLOBACTER

19especiesy

GÉNEROARCOBACTER

4especies

GÉNEROSULFUROSPIRILLUM

4especies

BACTEROIDESUREOLYTICUS

Vandamme y col.

FAMILIA CAMPYLOBACTERACEAE

1992

subespecies


18

• A. nitrofrigilis*

• A. cryaerophilus

• A. butzleri

• A. skirrowii

ESPECIES DEL GÉNERO ARCOBACTER

CARACTERÍSTICAS

• bacilos gram negativos curvos

• cultivos viejos: formas cocoides yfilamentos largos

• monotricos: bipolar o monopolar

• oxidasa positivos

• crecen entre 15 y 37ºC (24ºC)

• aerobiosis y anaerobiosis

• G + C 27 a 31 mol%

• menaquinona - 6


19

ESPECIES DEL GÉNEROSULFUROSPIRILLUM

• S. deleyianum*

• S. archaconense

• S. arsenophilum

• S. barnesii

CARACTERÍSTICAS

• bacilos gram negativos curvos

• oxidasa positivos

• crecen entre 8 y 36ºC

• de difícil cultivo ¿fastidiosos?

• G + C 32 a 42 mol%

• de vida libre

• asociados a presencia de metales


20

ESPECIE

BACTEROIDES UREOLYTICUS

• bacilo gram negativo curvo

• inmóvil

• crece a 36ºC

• microaerófilo + hidrógeno

• metabolismo proteolítico

• asociados a infecciones de:

- tejidos blandos,uretritis,- enfermedad periodontal

• > número de cepas para clasificación definitiva


21

Especies de Campylobacter

con patogenicidad conocida

• C. jejuni ssp. jejuni

• C. coli

• C. fetus subsp. fetus

• C. upsaliensis

• C. lari


22

ESPECIES DE CAMPYLOBACTER

Campylobacter lari

• ssp. lari (cepas clásicas NARTC)

• ssp. ureasum (variedades atípicas -urea neg, AN S)

• ssp. subantaricum (animales subantárticos)

11th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and related organisms,Freiburg, 2001


23

Especies de Campylobacter emergentes o

con patogenicidad no bien establecida

• C. jejuni ssp. doylei

•C. hyointestinalis (hyointestinalis, lawsonii)

• C. sputorum (sputorum, fecalis, ureolyticus)

• C. concisus

• C. mucosalis

• C. gracilis

• C. rectus

• C. curvus

• C. lenienae


24

Especies de Campylobacter no patógenospara el hombre

• C. fetus subsp. venerealis

• C. showae

• C. helveticus


25Curso de Bacteriología

27

CEPA CONTROL POSITIVO: C. jejuni

CEPA CONTROL NEGATIVO (DÉBIL): C. upsaliensis ATCC 43954


28

CEPA CONTROL POSITIVO: Campylobacter jejuni ssp jejuni

CEPA CONTROL NEGATIVO: Escherichia coli


29

OXIDASA (+)

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA

CARACTERÍSTICAS DE CRECIMIENTO• 42ºC – 48 h de incubación• Microaerofilia

MORFOLOGÍA DE LA COLONIA(Colonia invasora)

MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA• Gram (bacilo Gram – curvo)

• Contraste de fase (bacilo curvo, móvil)

CATALASA (+)

Nuestro aislamiento corresponde aCampylobacter sp.


30

Nuestro aislamiento corresponde a alguna delas especies del género Campylobacter

PRUEBAS BIOQUÍMICAS• hidrólisis del hipurato

• hidrólisis del indoxil acetato

• producción de H2S

• reducción de NO3y otras

TEMPERATURAS DE CRECIMIENTO• crecimiento a 26 – 37 y 42ºC

IDENTIFICACIÓN DEFINITIVA (determina especie)

SUSCEPTIBILIDAD A CEFALOTINA YÁCIDO NALIDÍXICO


31

ESPECIE

C. jejuni ssp. jejuni

C. jejuni ssp. doylei

C. coli

C. lari

C. upsaliensis

C. fetus ssp. fetus

C. fetus ssp. venerealis

C. hyointestinalis

37 C

+

+

+

+

+

+

+

+

42 C

+

-

+

+

+

v

-

v

V = variable

CAMPYLOBACTER: TEMPERATURAS DE CRECIMIENTO

26 C

-

-

-

-

-

+

+

-


32

fetus jejuni doylei liensis

Catalasa

Red. NO3

H2S

Hipurato

Indoxilacet.

Crecim. 25ºC

Crecim. 37ºC

Crecim. 42ºC

Sens. Ác. Nal.

Sens. Cefalot.

+

+

-

-

-

+

+

-

R

S

+

+

+/-

+

+

-

+

+

S

R

+

-

-

-

+

-

+

-

S

S

+

+

-

-

+

-

+

+

S

R

+

+

+

-

-

-

+

+

R

R

d/-

+

-

-

+

-

+

V

R

V

ALGUNAS PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DE CAMPYLOBACTERC. fetus C. jejuni C. jejuni C. coli C. lari C. upsa-


33

Patogenicidad de Campylobacter

Más frecuente en pacientescon diarrea

Hemocultivos positivos

Altos títulos de Ac.homólogos

Eritromicina

Monos- perros- pollos-

Países desarrollados:

Diarrea c/septicemia:

Pacientes c/diarrea:

Tratamiento antibiótico:

Inoculación Experimental:

cerdos- becerros

Diarrea experimental en humanos


34

Infección Intestinal

• Trasmisión: oral-fecal

• Dosis infectante 5x102 a 106

• Mecanismos defensivos del huésped

• Factores de virulencia


35

Mecanismos de virulencia

• ADHERENCIA

• INVASIÓN

• ENTEROTOXINA

• CITOTOXINAS


36

Adhesinas

• Proteínas de membrana externa

• Lipopolisacárido

• Flagelo


38

Campylobacter: producción deenterotoxina

Demostrada utilizando:

• Perfusión intestinal en ratas

transporte de electrolitos al intestino

• Asa ligada en intestino de rata

aumento de fluido intestinal

• Cultivos celulares (CHO)

efecto citotónico (aumento de AMPc)


39

PERFUSIÓN EN ASA INTESTINAL DE RATA

Dr. Heriberto FernándezUniversidadAustral de Chile / Facultad de Medicina / Instituto De Microbiologia Clinica


40

ASA LIGADA DE RATA

Dr. Heriberto FernándezUniversidadAustral de Chile / Facultad de Medicina / Instituto De Microbiologia Clinica


41

Célula CHO normales

Célula CHO elongadas porefecto de la enterotoxina


42

Célula VERO normales

CDT +C. jejuni

C. coli

74.2%

64.7%


43

BIOTIPIA Y SEROTIPIA DE

Campylobacter


44

BIOTIPIA DE Campylobacter


45

Esquemas propuestos parabiotipia de Campylobacter

Hidrólisis del Hipurato y la Prueba Rápida para H2S.M.B. Skirrow and J. Benjamin. 1980. Differenciation of enteropathogenic campylobacter. J. Clin. Path.33:1122

Hidrólisis del Hipurato, Hidrólisis del DNA y Crecimiento en AgarExtracto de Levadura y Carbón. G.A. Hebert,

D.H. Hollis, R.E. Weaver, M.A. Lambert, M.J. Blaser and C.W.Moss 1982. 30 years of campylobacters:biochemical characteristics and a biotyping proposal for Campylobacter jejuni. J. Clin. Microbiol, 15: 1065– 1073.

Prueba Rápida de Hidrólisis del Hipurato, Prueba Rápida de H2Sy la Prueba de Hidrólisis del DNA.Lior, H. 1984. New extended Biotyping Scheme for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, and“Campylobacter laridis”. J. Clin. Microbiol. 20:636-640


46

Esquema de Biotipia del Dr. Hermy Lior

Lior, H. 1984. New extended Biotyping Scheme for Campylobacter jejuni,Campylobacter coli, and “Campylobacter laridis”. J. Clin. Microbiol. 20:636-640


47

BIOTIPIA DE Campylobacter

Para todas las pruebas de debe tener encuenta: Utilizar cultivos que hayan crecido en Agar

Mueller Hinton Sangre.

Incubadas a 37°C o a 43°C y Bajo condicionesde microaerofilia o con mezcla de gasesrecomendado para Campylobacters.


48

BIOTIPIA DE CampylobacterEsquema del Dr. H. Lior

PRUEBA RAPIDA DE HIDROLISIS DEL HIPURATO

PRUEBA RAPIDA DE H2S

PRUEBA DE HIDROLISIS DEL DNA


49

PRUEBA RAPIDA DEHIDRÓLISIS DEL HURATO


50

Hidrólisis del Hipurato

H2OÁcido hipúrico Benzoato de sodio + Glicina

Hipuricasa(hidrolasa)

Hidrólisis del ácido Hipúrico: Detección del benzoato

Detección de glicina

cloruro férrico al 7%

ninhidrina (oxidante)

Color púrpura CO2ninhidrina residual + NH3


51

PRUEBA RAPIDA DEHIDROLISIS DEL HIPURATO

MATERIAL NECESARIO

Hipurato de sodio al 1% en H2ONinhydrina al 3.5% en butanol acetona (1:1)preparación fresca, cada semana.

Hipurato de sodio (0.1%)

Dispensar 0.4 mL de la solución de hippuratode sodio en tubos de 10 x 75 mm

Mantener los tubos tapados y congelados(-20°C) hasta su uso.

Los tubos Antes de ser usados, deben serdescongelados y puestos a temperaturaambiente.


52

PRUEBA RAPIDA DEHIDROLISIS DEL HIPURATO

PROCEDIMIENTO

Colocar una pequeña asada de cultivo de 24 a 48 Hrs. en el tubo conla solución de hipurato de sodio.

Mezclar bien e incubar por 2 horas a 37°C en baño maría.

Luego, lentamente se agrega 0.2 mL del reactivo nynhidrina.NO SE DEBE MEZCLAR, reincubar por otros 10 minutos y leer.

Un color púrpura intenso (similar al cristal violeta) representa unareacción positiva y la ausencia de color o un color púrpura tenue indicauna prueba de hidrólisis del hipurato negativa.

Controles : + C. jejuni LIO 6;- C. coli LIO 8

•Lior, H. 1984. New extended Biotyping Scheme for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, and “Campylobacter laridis” J. Clin. Microbiol. 20:636-640•H. wang, M.N. 1975. Rapid hippurate hydrolysis method for presumptive identification of Group B Streptococci. J. Clin. Microbiol. 1:114-115


53

PRUEBARAPIDA DEHIDROLISISDELHIPURATO

Hidrólisis del Hipurato positivo Hidrólisis del Hipurato negativo


55

PRUEBA RÁPIDA DE H2S


56

Prueba Rápida de H2S

MATERIAL NECESARIOEl medio FBP Agar ha sido modificado como sigue

A : Caldo Brucella (GIBCO) 2.9 gNa2HPO4 (anhidro) 0.118 gK H2PO4 (Anhidro) 0.023 gAgar (L28-Oxoid) 0.2 g

H2O 97 mLEsterilizar en autoclave por 15 minutos a 15 lb y dejar enfriar a 45°C.

Prepare separadamente las siguientes soluciones en agua destilada yesterilice con filtro:

B Sulfato ferroso 7H2O 10%C Metabisulfito de sodio 10%D Piruvato de sodio 10%


57

1 mLsol B

+

1 mLsol C

MedioBase

A

1 mLsol B

+

1 mLsol C

+

1 mLsol D

1 mLsol C

1 mLsol B

Mezclarbien

1 mLsol B

Preparación del Medio FBP Agarmodificado

Mezcla B+C+D1 mL sol B

+1 mL sol C

1 mL sol B

A Medio baseCaldo Brucella (GIBCO) 2.9 g

Na2HPO4 (anhidro) 0.118 gK H2PO4 (Anhidro) 0.023 gAgar (L28-Oxoid) 0.2 gH2O 97 mL

B Sulfato ferroso 7H2OC Metabisulfito de sodio

10%10%

D Piruvato de sodio 10%

1 mLsol D

Ajustar el pH a 7.3, dispensar asepticamente 3 mL en tubos estériles 13x100 con taparosca. Preparar medios frescos cada dos semanas.


58

Prueba Rápida de H2S

PROCEDIMIENTO

Coloque un inóculo grande semejante a una bolilla (con un asa de 5mm de diámetro) de un cultivo de 24 horas en el tercio superior delmedio de cultivo. NO MEZCLE.

Incube en bañomaría a 37°C por 2 horas.

El ennegrecimiento alrededor de la masa bacteriana representa unareacción positiva, usualmente comienza aparecer entre los 30-45minutos.

USE SOLO CULTIVOS DE 24 HORAS. La reproducividad con cultivosde 48 horas es muy pobre.

Controles : + C. jejuni LIO 6;- C. jejuni LIO 1

Lior, H. 1984. New extended Biotyping Scheme for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, and “Campylobacter laridis”. J. Clin. Microbiol. 20:636-640


59

H2S negativo H2S positivo


60

HIDRÓLISIS DEL DNA


61

DNasaÁcido Desoxyrribonucleico DNA depolimerizado

zonas claras alrededor

de la siembra


62

Prueba de Hidrólisis del DNA

MATERIAL NECESARIO Agar DNA Azul de toluidina Modificado

Ácido Desoxyrribonucleico (DIFCO DNA Cat#3321-12-1) 0.3 g0.01 M Cloruro de CalcioCloruro de sodioAgar Oxoid L 28

1 mL10.0 g

6.5 mL0.05M Buffer TRIS pH 9.0 * 1000 Ml

Coloque todos los ingredientes en un matraz y caliente hasta que elDNA y el agar estén completamente disueltosEnfríe a 50°C y agregue

Azul de toluidina "O" al 3% 2.5 mL(Fisher Scientific Certified Stain CAT# T-161)

Mezcle bien y distribuya en placas Petri 25 mL en cada unaNO REQUIERE ESTERILIZACION.


63

Prueba de Hidrólisis del DNA

PROCEDIMIENTO En la placa de Agar DNA- Azul de Toluidina modificado* Se inocula con un asa de 3 mm de diámetro y en un área circular

pequeña, a partir de cultivos de 24 - 48 horas. Incubar 43°C bajo condiciones de atmósfera de mezcla de gases

recomendado para Campylobacters por 24 a 48 horas. Una zona clara incolora o algo rosada alrededor del inoculo es

considerado una reacción positiva. En una placa se pueden probar varios cultivos y se debe incluir

controles, positivo y negativo. Control Positivo = C. jejuni LIO 36


66

SEROTIPIA DECampylobacter


67

Esquemas de Serotipia deCampylobacter Sistema Penner y Hennessy: detecta antígenos somáticos

termoestables; puede identificar 60 serotipos de C. jejuni y C.coli.

Penner, J.L., Hennessy, J.N. 1980. Passive hemagglutination technique for serotyping Campylobacter fetus subsp.jejuni on the basis of soluble heat-stable antigens. J. Clin. Microbiol. 12: 732-737

Sistema Lauwers S., Vlaes L. and Butzler J.P.: detecta antígenossomáticos termoestables; puede identificar 42 serotipos de C.jejuni y C. coli.

Lauwers S., Vlaes L. and Butzler J.P. 1981 Campylobacter serotyping and epidemiology, Lancet, 1,158

Sistema Lyor: detecta antígenos flagelares termolábiles; puedeidentificar más de 100 serotipos de C. jejuni, C. coli y C. lari.

factors.

Lior, H.D. et al. 1982. Serotyping of Campylobacter jejuni by slide agglutination based on a heat-labile antigenic

J. Clin. Microbiol. 15: 761-768.


69

SEROTIPIA DE Campylobacter jejuni yCampylobacter coli

MATERIAL NECESARIO DNasa (10 mg /vial DNasa Bovina pancreática Grade II N° de Catalogo 104 159

(EC3.1.21.1)

Boehringer Mannheim, Alemania)

Solución Stock DNasa – PBS 0.1% Agregar asépticamente 10 mL de PBS al vial, mezclar bien y

dispensar en tubos de tapa rosca alícuotas de 1 mL,mantener congelado a -20°C.

Solución de trabajo DNasa -PBS Diluir 1 mL de la solución stock con 4 mL de PBS Dispensar alícuotas de 0.5 mL en tubos con tapa rosca Los tubos que no están en uso se deben mantener

congelados a -20°C


70

MATERIAL NECESARIOBuffer Fosfato Saline 0.01M , pH 7.2 (PBS).PBS-Merthiolate 1:10,000NaCl al 2%Láminas de vidrio (300 mm x 150 mm x 3 mm)Placas de Petri 90 x 15 mmAsas de siembra de 2 mm de diámetroMezcla de gases 5% O2, 10% CO2, 85 % N2

(Skirrow) Medio de cultivo: Mueller Hinton con 5% de sangre

de carnero en placas de Petri


71

PROCEDIMIENTO Previamente antes de realizar la serotipia:

Los cultivos deberán ser sembrados en placas deMueller Hinton sangre (frescas y húmedas) e incubadasa 37°C por 48 horas en atmósfera de mezcla de gasesrecomendado para Campylobacters.


72

Campylobacter en Mueller Hinton sangre 5%


73

Campylobacter en Mueller Hinton sangre 5%


74

SEROTIPIA DE Campylobacter jejuni y C. coliPOR AGLUTINACIÓN EN LÁMINA

1. Verificar que el cultivo no este rugosoEn una lámina colocar una gota pequeña (10-20 mL) de DNasa y hacer unasuspensión bacteriana con el cultivo. Agregar 1 gota (50 ml) de ClNa al 2% ychequear si autoaglutina o no.

Si el cultivo esta rugoso, resembrar y volver a probar.

2. Si el cultivo esta liso se procede de la siguiente manera: Colocar una gota pequeña (10-20 ml) de DNasa-PBS en cada uno de 5

rectángulos en la lámina.

Emulsificar una pequeña asada del cultivo con DNasa-PBS.Agregar (50 ml) de cada pool (1-4) de antisueros y con un mondadiente ocon el asa mezclar bien en sentido longitudinal.Mover lámina con movimientos de vaivén por 45 segundos.LEER LA PRUEBA DE INMEDIATOLos resultados obtenidos después de 1 minuto o las reacciones débiles,podrían representar reacciones cruzadas.Si no se observa aglutinación con los pools 1 a 4, repetir el procedimientocon los pools remanentes (5 a 16)


75

3. Lectura de ResultadosUtilizando iluminación indirecta sobre un fondo negro, registre el grado de aglutinación comosigue:

± = ligera aglutinación y el fluido turbio1+ = cerca del 25% de células aglutinadas y el fluido turbio.2+ = cerca del 50% de células aglutinadas y el fluido es moderadamente turbio.3+ = aproximadamente el 75% de las células aglutinadas y el fluido es ligeramente turbio.4+ = todas las células están aglutinadas y el fluido es claro.

El título del antisuero en los pools es usualmente definido como una dilución menor que ladilución más alta que muestre 3+ o una aglutinación más fuerte en 1 minuto.

4. INTERPRETACION DE RESULTADOS

Los antisueros no absorbidos en los pools, contienen aglutininas para antígenos heterólogos deCampylobacter jejuni y C. coli.Podrían producir reacciones de aglutinación en más de un pool.Los pools estan diseñados solo para screening.Los serogrupos son identificados con antisueros monovalentes y confirmados por antisuerosabsorbidos.Los antisueros han sido agrupados en lo posible para reducir la ocurrencia de reacciones en variospools.A veces las reacciones en más de un pool podría deberse a la presencia de más de un serotipo enel mismo cultivo. Esto se puede resolver haciendo la serotipia a partir de una clona de coloniasindividuales.


76

DNasa- PBS

DNasa- PBS

DNasa- PBS - PBS

DNasa DNasa- PBS

Esquema de la Serotipia deCampylobacter

Serotipo LIO 36


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