Cap 10 – Análisis de

Genes y Genomas

JA Cardé, PhD

Universidad Adventista

Alberts et al.

Objetivos• Al finalizar la presentación el estudiante

podrá:– Definir biotecnología– Conocer los mecanismos de corte y unión del

DNA por enzimas– Conocer métodos de visualización de las

moléculas orgánicas.– Establecer diferencias, parecidos la

importancia y los diferentes tipos de vectores y bibliotecas

– Conocer distintas aplicaciones de la biotecnología

Biotechnology3 greeks roots

- Bios - life- Teuchos - tools- Logos - study

- Study of tools from living things

Biotechnology

“The application of science and technology to living organisms, as well as parts, products and models thereof, to alter living or non-living materials for the production of knowledge, goods and services.”

Biotechnology

Biotechnology means any technological application that uses biological systems, living organisms, or derivatives thereof, to make or modify products or processes for specific use.” - Wikipedia.org

Biotechnology

- Using living organisms, their products or derivatives as tools to solve human issues to improve our life quality.

- Organisms: Model systems

- Products: Proteins, Antibiotics, Genetically Modified Products (GMPs)

- Issues: health, environmental, economical

¿Qué es biotecnología?

• Es el uso de organismos vivos, o sus productos para mejorar nuestra calidad de vida y/o nuestro ambiente.

• Dependiente grandemente de avances en:– Biología molecular– Métodos y/o Tecnología de DNA

recombinante

10_04_Restrict.nuclease.jpgEnzimas de Restricción

Palíndromes

5’ GTAATC 3’

3’ CTAATG 5’

Cohesivos

Romos

Nomenclatura

Aplicaciones

M a n I p u l a c I ó ndelDNA

10_05_gel.electrophor.jpgAnalisis y Visualización de DNA

Azul MetEtBR-UVRadioactividad

Como se verá la gel?

EcoRI 5GA / ATTC5 3CTTA / AG3Alu I 5AG / CT 3

3TC / GA5Not I 5GC / GGCCGC3

3CGCCGG / CG5

LAS 3 A LA VEZ?!!!

5’AAGAATTCGCGGAATTCGAGCTTAAGGGCCGCGCGCCGAAGCTTTAAA3’3’ TTCTTAACGCCTTAAGCTCGAATTCCCGGCGCGCGGCTTCGAAATTT 5’

10_11_BAC.clones.jpgMapas de Restricción Clonos de BAC

Varias enzimas - individuales y en conjunto

Solapamientos

10_12_de_renaturation.jpgDenaturación y Renaturación

DNA - DS - Complementaridad - GC / AT

3 enlaces vs 2 enlaces; TM

Complejidad del Genoma – Experimentos Cot

Secuencias altamente repetitivas

Moderadamente Repetitivas

Unicas

10_14_1_Southrn.blotting.jpg

Southern/Northern Blotting

10_14_2_Southrn.blotting.jpg

Visualización

10_18_ DNA.in.vitro.jpg

Moléculas QuiméricasLigación = ClonaciónCortesLigación y/oComplementaridad

10_19_DNA.uptake.jpgTraTransformación Bacteriana –

Griffith

Competencia

Transformacion 2

10_20_Bacteria.plasmid.jpgPlasmidos Bacterianos

Vectores

Ori

Antibiótico

MCS/Polylinker

ORF

Ejemplos:pAMPpKANpBLUE

10_21_DNA ligase.jpg

Digestión/Digestión

Cloning

Ligación

Quimera

Transformación

Cultivo/Resistencia

10_22_cloned.DNA.frag.jpgTransformación – Selección - Replicación –

DNA Miniprep

Transformacion 1

10_23_genomic.library.jpg

Bibliotecas: Genómica

-Restricción

-Ligación

-Clonación

-Replicación

-Selección

10_24_hybridization.jpgScreening - Replica plating - Probing radioactivo - Autoradiografía

10_25_cDNA.jpg

Bibliotecas: de cDNA

mRNA Total

Oligo dT

RT

RNAsa H

DDDP - replicación

DS DNA copia mRNA

ClonarSelecciónScreen.

10_26_Genomic_cDNA.jpg

vs

10_27_1_PCR_amplify.jpgReacción de la Polimerasa en Cadena: PCR

-Objetivo

-aplicaciones

10_27_2_PCR_amplify.jpg

PCR 1, PCR 2

10_28_PCR_clones.jpgAplicación-cloning

10_29_PCR_viral.jpgAplicación – detección/diagnóstico

10_30_1_PCR_forensic.jpgAplicación - Forense - VNTR

10_30_2_PCR_forensic.jpg

10_07_1_enzym.dideoxy.jpg

Secuenciacion

Di-deoxi

Aplicación - Secuenciación

10_07_2_enzym.dideoxy.jpg

4 reacciones

ddNTPs

PCR

PAGE

Autoradiografia

10_08_DNA.sequencing .jpgSecuencia Digitalizada/Color Code PCR / Fluorescencia

http:www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html

10_31_SerialDNA.clone.jpgClonación en secuencia

Para unir un grupo de fragmentos derivados de distintos origenes

10_32_expressionvector.jpgVectores de Expresión-Ori, Antibiotico, Polylink

-Promotor eficiente

-Senales de poliA etc

-Transformado en celulas

10_33_gene_protein.jpgDogma Central Repensado - huevo o gallina/gen o

proteína?

10_34_Reporter.genes.jpg

cual será el efecto de seq 1 sobre seq 3)

Genes Reporteros-Determinar el patron de expresion de un gen-Quiero saber cual celua expresa a X, proteina indetectable

10_35_GFP.jpgGFP: Gen Reportero

Promotor de neurona con GFP

Neuronas expresando GFP

Hibridización In situ

- Detección de la presencia de papiloma humano

- Sonda pink complementaria al genoma viral

10_16_In.situ.hybrdztn.jpgIn situ

En cromosomas

Localizar genes

Cromosoma 5

2 pts/por cada gen, WHY?

10_13_hybridization.jpgDiagnósticos

DiagnósticoScreening poblacional para Sckl cell anemia

10_15_DNA.microarrays .jpg

cDDNs de dos celulas para comparar expresion

Marcarlos fluorescente(rojo/verde)

Mezclar e hibridizar con el array

Lavados, Rastreos, Lectura 110 genes

Rojo A > B o Verde B>A o Amarillos

Análisis: spot Rojo, este gen es del pool R, donde se expresa mas que en el otro pool, lo mismo para verde

DNA Microarray- Para monitorear la expresión de miles de genes a la vezER Rx

ER No Rx

10_36_mutagenesis.jpgSite Directed Mutagenesis

10_37_engineered.org.jpgSustituciones: mutantes, KO, doble copia

10_38_ES.cells.jpgTransgénicos

10_39_Transgenic.mice.jpg

10_40_Transgenic.plant.jpg

Transgénicos

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