DISEÑODISEÑOCAPTURACAPTURA

SECUENCIACIÓNSECUENCIACIÓNANÁLISISANÁLISIS

GENYCELL BIOTECH CLINICAL NGS SERVICE

UNA SOLUCIÓN COMPLETA DE SECUENCIACIÓN MASIVA APLICADA A LA CLÍNICA Y AL DIAGNÓSTICO HUMANO.

PANELES DE GENES CUSTOM MADE PARA APLICACIONES CLÍNICAS EN COLABORACIÓN EXCLUSIVA CON HALOPLEX-AGILENT.

DIAGNÓSTICO GENÉTICO HUMANO CON MARCADO CE IVD DE LA MANO DE MULTIPLICOM.

ANÁLISISANÁLISIS

DIAGNÓSTICO GENÉTICO HUMANO CON MARCADO CE IVD DE LA MANO DE MULTIPLICOM.

PLATAFORMAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA PROPIAS.

ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO AJUSTADO A LAS NECESIDADES DE CADA USUARIO.

DISEÑO con SureDesignCAPTURA DE LAS ROIs en un día y medio

PCR de AMPLIFICACIÓN del target

A. Paneles custom

B. Kits ready-to-use

SECUENCIACIÓN

ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO

PCR de AMPLIFICACIÓN del target PCR de INDEXACIÓN

B. Kits ready-to-use

ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO

SOLUCIÓN GLOBALSIN NECESIDAD DE ADQUIRIR EQUIPAMIENTO ADICIONAL.

PRECIO POR REACCIÓN TODO INCLUIDO.

SERVICIO DE ASESORAMIENTO CIENTÍFICO Y FORMACIÓN EN LAS HERRAMIENTAS DE DISEÑO Y ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO.DISEÑO Y ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO.

IMPLEMENTACIÓN DEL PROTOCOLO DE CAPTURA EN EL LABORATORIO DEL USUARIO.

REACTIVOS DE SECUENCIACIÓN , ENVÍO Y MANEJO PREVIO DE LAS MUESTRAS INCLUIDOEN EL PRECIO.

COMPATIBLE CON TODAS LAS PLATAFORMAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA.

•Más de 25 proyectos al año desde 2011•Más de 10 provincias distintas•Más de 15 aplicaciones clínicas diferentes•Más de 50 clientes de NGS en España y Portugal•4 equipos MiSeq propios (y los que vendrán…)

SERVICIO NGS CLÍNICA: OVERVIEW

1. Introducir los genes por: ID/nombre/coordenada

2. Definir la región de interés o ROI: Solo exones, exones + UTR’s o el gen completo.

3. Click “Begin Probe Design”

www.agilent.com/genomics/suredesign

3. Click “Begin Probe Design”

4. Resumen del diseño en 10 minutos

4. Amplificación

región

nriquecida

•Herramienta de análisis informático on-line.•Herramienta de análisis informático on-line.•Cloud computing.•Accesible desde cualquier ordenador conectado a Internet.

•Intuitivo y fácil de utilizar.•Pipelines exclusivos optimizados para cada tipo de tecnología de captura y para cada diseño custom.•Almacenamiento de datos y resultados durante 1 año.•Formación y asesoramiento clínico en la •Formación y asesoramiento clínico en la interpretación de los resultados.

GBio recomienda:Referencia 57624

GBio recomienda:

REQUERIMIENTOS PREVIOS EN CUANTO AL DNA �Estar disuelto en agua.

� Ratio 260/280 entre 1.8 y 2.0.

� Ratio 260/230 a partir de 1.8.

� Comprobación de la integridad de la muestra mediante gel de agarosa.agarosa.

� Cuantificación por fluorometría (Qubit o PicoGreen).

� Evitar cualquier presencia de inhibidores como EDTA.

PUNTOS CRÍTICOS DEL PROTOCOLO �DIGESTIÓN: Mezclar bien las enzimas entre sí y en el orden indicado y con los DNAs.

� HIBRIDACIÓN: No mezclar todas las reacciones de digestión a la vez sino ir añadiéndolas de una en una al tubo recolector que contiene la solución de inactivación. Se desaconseja profundamente dejar que la hibridación dure más del tiempo establecido en el protocolo.

� CAPTURA con NaOH: Antes de añadir la sosa hay que eliminar completamente la presencia de SSC Buffer ya que puede afectar a la posterior PCR. Dejar las muestras en contacto con el NaOH más tiempo del indicado en el protocolo puede tener consecuencias desastrosas.

� PCR: El número de ciclos de la PCR viene indicado en el CoA el cual está en el BOX 1 de reactivos del kit.

� PURIFICACIÓN de productos de PCR: Se ha comprobado empíricamente que hacer dos rondas de purificación con las beads magnéticas AMPure Beads mejora rondas de purificación con las beads magnéticas AMPure Beads mejora significativamente los resultados. Tres o cuatro lavados con EtOH en vez de dos también son aconsejables, cambiando los tubos de posición en el imán para favorecer la interacción de los reactivos.

CONSEJOS ÚTILES �Nombrar cada PCR/incubación y pre-programar el termociclador con cada una de ellas para no tener que volver hacerlo cada vez.

� Pre-calentar la tapa del termociclador a 105ºC.

� Intentar evitar las rampas de temperatura y favorecer el choque térmico.

� Para los cálculos de volúmenes de NaOH y Ácido Acético, tener en cuenta que en ambos � Para los cálculos de volúmenes de NaOH y Ácido Acético, tener en cuenta que en ambos casos MOLARIDAD = NORMALIDAD ya que en ambos el Nº de Equivalentes = 1.

�Hacer todas las diluciones siguiendo técnicas analíticas de laboratorio.

� A la hora de trabajar con 12 muestras, es más cómodo hacerlo con 2 strips de 8 tubos y cortarle a cada uno dos pocillos. Marcarlos bien con rotuladores indelebles para saber cuál es el pocillo 1 y cuál el 12. OJO! Porque al añadir EtOH puede que dichas marcas se borren.

� En el paso 6 (Elución del DNA capturado) es CRÍTICO usar 50mM NaOH preparada a partir de, al menos, 10M NaOH.

� Dejar atemperar siempre las beads magnéticas antes de utilizarlas.

� Todos los reactivos deben ser de grado de Biología Molecular.

WWW.DNANEXUS.COM

Analysis software for NGS

DNAnexus es una plataforma de análisis en nube donde se puede

realizar todo tipo de análisis de NGS (Genoma, Exoma, re-secuenciación, RNA…)

Sólo requiere de ordenador con conexión a internet.

Es una plataforma abierta donde además de tener una serie de appsmodelo uno puede crear su propio análisis para adecuarlo a sus muestras.

Genycell junto con DNAnexus, ha desarrollado dos pipelines

bioinformáticos específicos de análisis para su kits Haloplex de Agilent , MASTR de Multiplicom y los paneles clínicos de illumina TruSight teniendo en cuenta para cada uno las características técnicas de su protocolo.cuenta para cada uno las características técnicas de su protocolo.

Estos protocolos de análisis tienen en cuenta, por ejemplo, si la técnica de captura depende de una multiplex o de una hibridación ya que el tratamiento no es el mismo.

EL PROTOCOLO:

ALINEAMIENTO: El protocolo alinea las lecturas salidas del secuenciador con las regiones que se determinaron de interés a la hora de diseñar la captura utilizando para ello el archivo BED que proporciona Agilent o illumina o con las regiones correspondientes a los amplicones del kit illumina o con las regiones correspondientes a los amplicones del kit MASTR de Multiplicom que estemos estudiando.

VARIANT CALLING Y ANNOTATION: Utiliza FREEBAYES para realizar un análisis de variantes y luego anotarlas a sus respectivas posiciones, genes, exones…

CÁLCULOS DE EFECTOS: Las variantes son después analizadas por el Ensemble Variant Effect Predictor y SNPeff para dar una indicación acerca Ensemble Variant Effect Predictor y SNPeff para dar una indicación acerca del potencial daño que puede provocar en la función proteica dicha variación.

Visualización del gen

VISUALIZACIÓN DE LAS LECTURAS Y LA COBERTURA

Lecturas alineadas

Región definida por el diseño del kit

Visualización del gen

Histograma de cobertura

Zoom a una región con variante

INFORMACIÓN QUE SE OBTIENE DE LAS VARIANTES Y RELACIONES A BASES DE DATOS-Cromosoma-Coordenada-Alelo de referencia-Alelo encontrado-Zigosidad-Recuento de lecturas de ambos alelos-Recuento de lecturas de ambos alelos-Recuento total de lecturas en la posición dada-Parámetro de calidad del variant call-Nombre del Gen-Número de transcrito, proteína y gen ENSEMBL (opción de canónico o todos)-Nomenclatura HGVS de la mutación-Efecto de la variante (sinónima, ganancia de stop, variación en splicing…)-Efecto de la variante (sinónima, ganancia de stop, variación en splicing…)-Número de Exon/Intron-Número dbSNP si lo tiene-Código HGMD-Predicción del efecto sobre la función proteica (SIFT, Polyphen, ClinVar…)-MAF (1K genomes)

VISUALIZACIÓN DE RESULTADOS

Las variantes encontradas se presentan en diferentes formatos (VCF, txt, html). El formato .txt será el más formato .txt será el más utilizado por el usuario por ser donde encontrará la información más completa y accesible. Se puede descargar y abrir como Excel.

Esta tabla es fácilmente filtrable por nombre de Esta tabla es fácilmente filtrable por nombre de gen, por efecto de la variante, coberturas, calidad, zigosidad…

EJEMPLOS DE FILTRADOS (se pueden poner tantos filtros como se quiera).

INFORMACIÓN DE LA CARRERA

-Calidad de las lecturas (Q30, Q20…)-%GC-Número de lecturas aptas para el alineamiento y análisis-Número de lecturas que han quedado dentro de la zona definida por el archivo delos targets-% de lecturas que han mapeado bienarchivo delos targets-% de lecturas que han mapeado bien-% de lecturas que han quedado fuera-Cobertura media y mínima de cada target definido en el diseño.

RELACIÓN DE PROYECTOS LLEVADOS A CABO HASTA AHORA

- Enfermedades Neurosensoriales- Autismo- Epilepsia- Enfermedades Metabólicas- Retinosis Pigmentaria- Enfermedades Metabólicas- Retinosis Pigmentaria- Enfermedades Cardiovasculares- Cáncer Hereditario- Hipoacusia- Glaucoma- Charcot-Marie-Tooth- Síndrome de Usher- Fenilcetonuria- Fenilcetonuria- Diabetes- Migrañas

GENYCELL BIOTECH ESPAÑA, S.L.Garrido Atienza 2, par2

P.I. 2 de Octubre 18320 SANTA FE – GRANADA – SPAIN

Tel. (+34)902 194 353 Fax. (+34)958 513 149Fax. (+34)958 513 149

E-mail: sales@genycell.comhttp:// www.genycell.com

Application Clinical NGS Service SpecialistsMara Conejero

mara@genycell.com

Álvaro JiménezÁlvaro Jiménezalvaro@genycell.com

(+34) 913 516 733