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Revista de la Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad de Carabobo. Diciembre 2013 Vol. 17 N 3Salus

ARTCULO

1Laboratorio de Protozoologa. Instituto de Biologa

Molecular de Parsitos (BioMolP). Universidad de

Carabobo. Valencia. Venezuela

2Departamento de Bioqumica. Escuela Ciencias

Biomdicas y Tecnolgicas. Universidad de Carabobo.

Valencia. Venezuela

3Departamento de Morfosiopatologa. Escuela de

Bioanlisis. Facultad Ciencias de la Salud. Universidad de

Carabobo. Valencia. Venezuela.

Correspondencia:Ana Rita De Lima.E mail:[email protected]:Abril 2013 Aprobado: Septiembre 2013

SalusCambios metablicos durante la epimastigognesisin vitro de Trypanosoma cruziRESUMEN

La epimastigognesis de Trypanosoma cruzies la transformacin

del tripomastigota sangucola en epimastigota que ocurre en

la porcin anterior del tracto intestinal del insecto vector. Se

ha reportado la activacin de cisten proteasas durante la

epimastigognesis in vitro en condiciones axnicas, sugiriendo

la utilizacin de aminocidos como fuente de carbono para la

obtencin de energa. El objetivo del presente trabajo fue estudiar a

travs de indicadores los cambios metablicos producidos durante

la diferenciacin tripomastigota-epimastigota. Se parti de un 100%

de tripomastigotas sobrenadantes de clulas Vero, incubados en

medio LITB a 27C en condiciones de alta (epimastigognesis

horizontal) y baja (epimastigognesis vertical) tensin de oxgeno.

Se realiz contaje de parsitos (Cmara de Neubauer) y recuentodiferencial (Giemsa) a diferentes tiempos de incubacin (0,

1, 2, 4, 6, 8, 11 y 12 das). A cada tiempo se determin en los

sobrenadantes del medio de cultivo las concentraciones de glucosa

y amonaco, as como los valores de pH. Los resultados mostraron

que: 1) Independientemente de la tensin de oxgeno se evidenci

formas en diferenciacin y amastigotas durante el proceso,

siendo la aparicin de epimastigotas ms tarda en alta tensin de

oxgeno; 2) El incremento poblacional fue signicativamente mayor

en condiciones de alta tensin de oxgeno, registrndose alta

mortalidad de amastigotas durante los primeros das de incubacin

en la epimastigognesis vertical; 3) El consumo de glucosa

fue concomitante con la aparicin de epimastigotas en ambas

condiciones, siendo mayor en alta tensin de oxgeno; 4) No se

registr liberacin de amonaco en ninguno de los casos estudiados;

5) Los valores de pH fueron similares hasta el sexto da en ambas

condiciones, evidencindose una acidicacin gradual del medio de

cultivo en alta tensin de oxgeno. Todo parece sugerir que durante

la epimastigognesis de T. cruzi, los parsitos involucrados en los

procesos de diferenciacin no muestran activacin de las diferentes

rutas metablicas.

Palabras claves: Trypanosoma cruzi, metabolismo,epimastigognesis.

ABSTRACT

Metabolic changes during in vitro Trypanosoma cruziepimastigogenesis

The epimastigogenesis of Trypanosoma cruziis the transformation

from bloodstream trypomastigote to epimastigote that occurs in

the anterior portion of the intestinal tract of the insect vector. It

has been reported cysteine proteases activation during axenic

epimastigogenesis in vitro, suggesting the use of amino acids as a

carbon source for the production of energy. The aim of this work was

to study through indicators metabolic changes produced during the

trypomastigote-epimastigote differentiation. We started with a 100%

trypomastigotes derived from Vero cell supernatants, incubated in

LITB medium at 27C under high (horizontal epimastigogenesis)

and low (vertical epimastigogenesis) oxygen tension. We estimated

parasites number (Neubauer chamber) and differential morphology

(Giemsa) at different incubation times (0, 1, 2, 4, 6, 8, 11 and 12

days). Each time was determined in the supernatants of the culture

medium glucose and ammonia concentrations as well as the pH

values. The results showed that: 1) Regardless of the oxygen

tension it was evidenced differentiation forms and amastigote

during the process, with the later occurrence of epimastigotes in

high oxygen tension; 2) Population growth was signicantly greater

in high oxygen tension, registering high mortality of amastigotes

during the rsts incubation days in the vertical epimastigogenesis;

3) Glucose consumption was concomitant with the appearance

of epimastigotes in both conditions, being higher in high oxygen

tension; 4) There was no ammonia release in any of the cases

studied; 5) The pH values were similar to the sixth day in both

conditions, showing gradual acidication of the culture medium at

high oxygen tension. Everything seems to suggest that during the

epimastigogenesis of T. cruzi parasites involved in differentiation

processes show no activation of different metabolic pathways.

Key words: Trypanosoma cruzi, metabolism, epimastigogenesis.

INTRODUCCIN

Un evento de fundamental importancia durante el ciclo

de vida de Trypanosoma cruzi es la transformacin

de tripomastigotas sangucolas en epimastigotas

(epimastigognesis), que ocurre en la porcin anterior

del tracto intestinal del insecto vector, asegurando lapropagacin del parsito en la naturaleza. La mayora de los

estudios que abordan este fenmeno han sido realizados in

vivoen el insecto vector, en los cuales se ha determinado

mltiples factores en el establecimiento de la infeccin

como la especie de parsito involucrada (1), as como otros

dependientes del vector como el factor ltico del estmago

(2,3), lectinas (4,5) fragmentos de hemoglobina (6) inanicin

del insecto y liberacin de hormonas por parte del sistema

Marvin Querales, Jess Torres, Diana Graterol, Rosa Arteaga, Mara Navarro,Vctor Contreras, Willmer Pineda,Ana Rita De Lima.


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Cambios metablicos durante la epimastigognesis

endocrino del insecto (7). En relacin a los eventos

morfolgicos que ocurre durante la epimastigognesis, se

plantea que el insecto ingiere una poblacin pleomrca

constituda de formas nas o gruesas de tripomastigotas,

donde las primeras se transforman en amastigotas y que es

a partir de stos ltimos que ocurre la diferenciacin hacia

epimastigotas (8). Por otro lado, se propone que la mayora

de la poblacin de tripomastigotas sangucolas ingeridos

por el insecto sufre una serie de cambios morfolgicos antes

de llegar a epimastigotas, mientras que el resto se trasforma

directamente en esa forma (9).

Estudios de epimastigognesis realizados in vivo en

nuestro laboratorio utilizando ninfas de Rhodnius prolixus

indican cambios en la cintica de diferenciacin en funcin

del aislado de T. cruzi empleado (1). No obstante, un

hecho comn en todas las cepas utilizadas es la aparicin

de formas redondeadas compatibles con amastigotas.

Ensayos de epimastigognesis in vitroen diferentes medios

de cultivo axnico indican que durante este proceso ocurre

la aparicin de formas redondeadas sin agelo libre con

kinetoplasto en barra (10, 11), las cuales posteriormentefueron identicadas como amastigotas (12).

Mltiples estudios revelan que los eventos de diferenciacin

de Trypanosoma cruzi estn asociados a condiciones de

estrs representadas por las condiciones microambientales

(13). Esto genera cambios en la utilizacin de fuentes

de energa en funcin del estadio del parsito y su

disponibilidad en el medio. Mientras que los epimastigotas

poseen un metabolismo eminentemente glicoltico (14-16),

se admite que los tripomastigotas poseen un metabolismo

fundamentalmente proteico (17,18). En el caso de los

amastigotas, se describe un metabolismo glicoltico y en

ellos no se ha detectado la presencia tanto de enzimas

involucradas en el ciclo de Krebs como en la degradacinoxidativa de aminocidos (19). Ensayos realizados in vitro

muestran que la deplecin de glucosa en el tracto intestinal

posterior del insecto vector conduce a una activacin

del metabolismo proteico del epimastigota durante la

transformacin hacia tripomastigota metacclico, con

liberacin de cantidades importantes de amonaco (20).

Durante la epimastigognesis in vitro se ha demostrado la

activacin diferencial de proteasas durante este proceso (10),

sugiriendo cambios en la utilizacin de nutrientes asociados

al proceso de diferenciacin morfolgica. En el presente

trabajo, se estudi a travs de indicadores, los cambios

metablicos producidos durante la epimastigognesis de

Trypanosoma cruzien medio LITB.

MATERIALES Y METODOS

Parsitos y Estadios. Se utiliz el clon EPm6 de

procedencia humana y clonado por dilucin limitante y

plaqueo en ratones albinos. Estos parsitos han sido

mantenidos mediante pases trimestrales alternos entre

triatomino (Rhodnius prolixus) y ratn (Balb/c) (21).

Los estadios utilizados fueron: tripomastigotas

sobrenadantes de cultivos celulares (equivalentes a

tripomastigotas tipo hemtico) as como epimastigotas

procedentes de cultivos axnicos, en medio lquido LITB

(Liver Infusin Triptose) (22).

Obtencin de Tripomastigotas tipo hemticoprovenientes de cultivos celulares. Para la obtencin de

los tripomastigotas sobrenadantes de clulas se parti de

tripomastigotas metacclicos puricados inducidos in vitro

(23), con los cuales se infectaron monocapas de clulas

Vero en una relacin de infeccin de 10 parsitos/clula en

frascos de cultivo (Falcon). Luego de un contacto durante

8 horas a 37C, los recipientes fueron lavados con Medio

Esencial Mnimo (MEM) suplementado con 10% de suero

fetal bovino. Se mantuvo las clulas infectadas durante 3

das a 37C y posteriormente se realiz cambio del medio

de cultivo, para un tiempo de incubacin adicional de 2 das

bajo las mismas condiciones. Al quinto da de infeccin, se

retir el sobrenadante de los medios de cultivo y se procedi

a la concentracin de los tripomastigotas a 1500xgdurante

15 minutos a 4C (Centrfuga IEC, B22M), los cuales fueronresuspendidos en medio LITB (22).

Epimastigognesis en medio LITB. Se parti de

tripomastigotas sobrenadantes de clulas Vero, los cuales

fueron inoculados en medio LITB. Con la nalidad de

determinar el efecto de la tensin de oxgeno sobre la

cintica de diferenciacin, se realiz la epimastigognesis

en dos tipos de envases, con el propsito de obtener

diferentes alturas del medio de cultivo. Se ensayaron dos

condiciones extremas, empleando una altura del medio

de 3 mm para alta tensin de oxgeno (epimastigognesis

horizontal) y una altura de 87 mm para baja tensin de

oxgeno (epimastigognesis vertical). En ambos casos se

parti de un inculo de 3,35 x 106 tripomastigotas/mL, loscuales fueron incubados a 27C en frascos Falcon de 25

cm3con 3 mL de medio LITB (epimastigognesis horizontal)

y tubos cnicos estriles de 15 mL con un volumen nal

de 10 mL de medio de cultivo (epimastigognesis vertical),

procedindose a la obtencin de alcuotas del cultivo a las

24 horas, 2, 4, 6, 8, 11 y 12 das.

Los ensayos se realizaron por triplicado. Como condiciones

controles se emplearon tripomastigotas sobrenadantes

de clulas Vero (0 horas de incubacin en medio LITB) y

epimastigotas de 6 das de cultivo crecidos en olas de 125

mL conteniendo 20 mL de medio LITB (22). Con las alcuotas

obtenidas a diferentes das de la cintica de transformacin

se realiz contaje diferencial de parsitos en cmara de

Neubauer.

Las alcuotas se sedimentaron, recolectando los

sobrenadantes para la determinacin de las concentraciones

de glucosa y amonaco, as como determinacin de los

valores de pH. Los sedimentos fueron utilizados para

posterior recuento diferencial de lminas coloreadas con

Giemsa.


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Marvin Querales, Jess Torres, Diana Graterol, Rosa Arteaga, Mara Navarro, Vctor Contreras, Willmer Pineda, Ana Rita De Lima.

Para evidenciar el aumento en el nmero de parsitos se

estim el incremento poblacional (Nt/No) el cual es un ndice

que se calcula dividiendo el nmero de parsitos/mL el da

del contaje (Nt) entre el nmero de parsitos/mL al inicio del

ensayo a tiempo 0 (No).

Anlisis de las transformaciones morfolgicasmediante microscopia ptica. Se realizaron lminas

coloreadas de los parsitos obtenidos a diferentes das del

proceso de transformacin (0, 1, 2, 4, 6, 8, 11 y 12), as

como de tripomastigotas sobrenadantes de clulas con 0

horas de incubacin y epimastigotas procedentes de nal

de fase exponencial (6 das) en medio LITB utilizados

como controles. Para ello, los sedimentos de las diferentes

alcuotas fueron lavados en buffer salino fosfato (PBS) 0,15

M, pH 7.2 y jados con formaldehdo al 2% en solucin

salina. La jacin de los parsitos en la lmina se realiz con

metanol al 100%. Las lminas fueron teidas con Giemsa,

visualizadas con un aumento de 1000X en un microscopio

ptico (Nikon, Eclipse 400) y fotograados con una cmara

digital (Nikon, Coolpix 4500). Se contaron al menos 300

parsitos por cada lmina y tiempo de incubacin.

Determinacin de las concentraciones de glucosa,amonaco y valores de pH. A los sobrenadantes de las

alcuotas obtenidas a los diferentes das de la cintica

de transformacin se les determin la concentracin de

glucosa mediante mtodo enzimtico (glucosa oxidasa)y la concentracin de amonaco mediante la reaccin de

Berthelot (24). En ambos casos se calcul la concentracin

de las diferentes muestras calculadas en base a curvas

de calibracin empleando patrones con diferentes

concentraciones de glucosa y amonaco, respectivamente.

Los valores de pH se estimaron mediante medicin del

sobrenadante empleando un pHmetro (Digimed, DM-23).

Curva de crecimiento de epimastigotas de Trypanosomacruzien condiciones de alta y baja tensin de oxgeno.

Para determinar el efecto de la tensin de oxgeno sobre

el incremento poblacional, consumo de glucosa y liberacin

de amonaco de epimastigotas en medio LITB, se decidi

realizar una curva de crecimiento de epimastigotas simulando

las mismas condiciones de tensin de oxgeno empleadas

durante la cintica de diferenciacin de tripomastigotas

hacia epimastigotas. Para ello, se parti de un inculo de

2 x 106parsitos/mL en medio LITB a 27C, inicindose los

cultivos de cada condicin por triplicado. Se realiz contaje

diferencial de parsitos en cmara de Neubauer los das 0,

2, 4, 6, 8, 10, 13, 16, 19, 22 y 26.

Con el propsito de evidenciar los cambios metablicos

durante ambas curvas de crecimiento (alto y bajo tenor

de oxgeno) se determin la concentracin de glucosa

y amonaco en los sobrenadantes del medio de cultivo a

cada tiempo de incubacin, utilizando la misma metodologa

anteriormente descrita.

Anlisis de los datos.En vista de que todos los ensayosse realizaron por triplicado en cada tiempo de incubacin,

se representaron los datos en funcin del promedio

la desviacin estndar de los resultados obtenidos.

Con el propsito de establecer si existan diferencias

estadsticamente signicativas, se emple la prueba de t de

Student, con un intervalo de conanza del 95%, estimndose

como signicativo un valor de P 0,05.

RESULTADOS

Anlisis de los cambios morfolgicos durante laepimastigognesis invitro de Trypanosoma cruzi enmedio LITB:

Tabla 1.Distribucin porcentual de formas estructurales de Trypanosoma cruzi durante la incubacin a diferentes tiempos de tripomastigotassobrenadantes de clulas en alta y baja tensin de oxgeno en medio LITB a 27 C.

Da Nt/No (1) Recuento Diferencial (%) (2)

Tripomastigota Diferenciacin Amastigota Epimastigota Metacclico

Alta Baja Alta Baja Alta Baja Alta Baja Alta Baja Alta Baja

0 - - 100 100 0 0 0 0 0 0 0 0

1 0,87 0,78 5 1,7 7 2,6 92 1,0 92 3,1 0 0 3 1,2 1 1,2 0 0

2 1,19 0,41* 1 1,0 2 2,9 97 1,0 96 3,2 0 0 2 1,7 2 4,1 0 0

4 3,43 0,41* 0 0 0 0 88 4,6 73 11,1 12 4,6 27 11,1 0 0

6 7,46 0,64* 0 0 0 0 87 2.9 9 2,4 13 2,9 91 2,4* 0 0

8 12,39 3,54* 0 0 0 29 3,5 58 3,1 10 6,7 42 3,1 61 6,1 0 0

11 26,92 8,66* 0 0 26 4,7 21 7,6 30 1,6 14 1,7 38 4,4 65 6,7 6 1,2 0*

12 35,27 8,41* 0 0 25 1,6 15 5,9 14 1,6 8 3,5 39 3,5 77 8,7 20 2,2 0*

(1)Incremento poblacional. Nt indica contaje de parsitos a tiempo t y No indica el nmero de parsitos al inicio del ensayo (da 0). (2)Serealiz mediante lminas coloreadas con Giemsa. Los valores representan la media la desviacin estndar de ensayos realizados portriplicado. El asterisco indica una diferencia estadsticamente signicativa (p


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Habindose establecido previamente que la tensin de

oxgeno afecta las principales rutas metablicas en la

clulas eucariotas, se procedi a evaluar la transformacin

de tripomastigotas sobrenadantes de clulas hacia

epimastigotas (epimastigognesis) de Trypanosoma cruzi

en medio LITB en dos condiciones: a) con alta tensin de

oxgeno (epimastigognesis horizontal) y b) en presencia de

baja tensin de oxgeno (epimastigognesis vertical).

La Tabla 1 muestra una comparacin de los resultados

obtenidos durante la epimastigognesis horizontal y vertical

en medio LITB a 27C. Se parti de un inculo inicial de

3,35 x 106 parsitos/mL constituidos por un 100% de

tripomastigotas sobrenadantes de clulas Vero (da 0),

caracterizados por poseer forma alargada, kinetoplasto

redondo y muy prximo a la extremidad posterior (Figura

1, panel A). A las 24 horas de incubacin se observ una

disminucin en el nmero total de parsitos. El recuento

diferencial efectuado a partir de lminas coloreadas con

Giemsa evidenci que el porcentaje de tripomastigotas

disminuy drsticamente a un 5 y 7% en condiciones de alta

y baja condicin de oxgeno, respectivamente. Esta cadaes a expensas de un aumento de formas en diferenciacin,

los cuales se caracterizaron por presentar un acortamiento

del agelo, cuerpo redondeado y kinetoplasto redondo

Figura 1. Cambios morfolgicos durante la epimastigognesisin vitro de Trypanosoma cruzi en medio LITB. Tripomastigotassobrenadantes de clulas fueron incubados durante 0 horas(panel A), 24 horas (panel B), 4 das (panel C), 8 das (paneles Dy E) y 11 das (panel F). El panel G corresponde a epimastigotascontroles crecidos durante 6 das en medio LITB. Dif=formas endiferenciacin; Epi: Epimastigotas; Ama: Amastigotas; Meta:tripomastigotas metacclicos (Aumento 1000X).

(Figura 1, panel B, sealado con punta de echa). Se puede

observar que a partir del segundo da de incubacin, existe

diferencias estadsticamente signicativas (P 0,05) en el

incremento poblacional (Nt/No), siendo claramente mayor

en la epimastigognesis horizontal y llegando a alcanzar

hasta cuatro veces ms la poblacin de parsitos totales

que en la epimastigognesis vertical. En el recuento

diferencial de morfologas del parsito, no se registraron

cambios entre ambas cinticas hasta el da 4 de incubacin,

con un predominio de formas en diferenciacin los das 1

y 2, con un porcentaje muy bajo de epimastigotas. En el

cuarto da desaparecen las formas en diferenciacin y hay

un porcentaje signicativo de formas ovoides con ausencia

de agelo libre y kinetoplasto en barra compatibles con

el estadio amastigota (Figura 1, panel C), as como un

incremento signicativo en la poblacin de epimastigotas.

A partir del sexto da se pueden apreciar diferencias ms

notorias, observndose que los amastigotas se diferencian

ms rpidamente hacia epimastigotas en condiciones

de baja tensin de oxgeno (91% vs13%), as como una

cada signicativa en el porcentaje de amastigotas. A

partir del octavo da se registr un aumento signicativodel ndice poblacional en condiciones de alta tensin de

oxgeno, coincidiendo con un incremento importante en el

porcentaje de epimastigotas (42%), que se caracterizaron

por presentar forma alargada, kinetoplasto en barra y

de ubicacin anterior prximo al ncleo (Figura 1, panel

D, sealado con punta de echa). No obstante, a pesar

de registrarse un 61% de epimastigotas en condiciones

de baja tensin de oxgeno, slo se registr un ligero

incremento poblacional y la aparicin de un 29% de formas

en diferenciacin (Figura 1, panel E). Cabe destacar

que a partir del da 8 de incubacin se evidenci un 7%

de formas inmtiles en la epimastigognesis vertical,

llegando a alcanzar un 19% para el da 12 (resultados nomostrados). Llama la atencin la aparicin de una nueva

poblacin de formas en diferenciacin a partir del da 11

en ambas cinticas, as como presencia de tripomastigotas

metacclicos en condiciones de alta tensin de oxgeno.

Estos ltimos comparten caractersticas morfolgicas con

los tripomastigotas sobrenadantes de clulas Vero, con la

diferencia de presentar una estructura ms na y delgada

(Figura 1, panel F, sealado con punta de echa).

Es de hacer notar que los epimastigotas obtenidos durante

ambas cinticas de transformacin mostraron morfologa

comparable a sus homlogos crecidos durante seis das

en medio LITB, utilizados como control en los diferentes

ensayos (Figura 1, panel G).

Asociacin de los parmetros estudiados (glucosa,amonaco y pH) durante la epimastigognesis invitrode Trypanosoma cruzi. Con el n de poder obteneruna aproximacin del estatus metablico durante la

epimastigognesis de Trypanosoma cruzi, se procedi

a hacer una asociacin de los indicadores estudiados:

glucosa, amonaco y valores de pH en cada condicin.



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El anlisis comparativo del consumo de glucosa y

liberacin de amonaco durante la epimastigognesis

horizontal (Figura 2A) y vertical (Figura 2B) en medio LITB

no mostraron cambios en sus concentraciones en ambas

condiciones experimentales hasta el da 11, detectndose

diferencias estadsticamente signicativas al da 12, donde

el consumo de glucosa fue ms acentuado en la condicin de

alto tenor de oxgeno (comparar Figuras 2A y 2B) y en donde

los niveles de amonaco fueron prcticamente indetectables

en ambos casos, llegando a alcanzar un valor mximo de

0,44 mM en el da 12 durante la epimastigognesis vertical

(Figura 2B).

La variacin de pH durante los dos tipos de epimastigognesis

mostr que los valores fueron muy similares en ambas

condiciones hasta el cuarto da de incubacin, registrndose

diferencias estadsticamente signicativas a partir del da 6

en donde se observ una disminucin ms acentuada en la

epimastigognesis horizontal (Figura 2A).

Figura 2.Cambios en la concentracin de glucosa (), amonaco() y valores de pH () durante la epimastigognesis encondiciones de alta (Panel A) y baja tensin de oxgeno (PanelB) de Trypanosoma cruzien medio LITB a 27C. La escala de laderecha corresponde a los valores de pH. Los puntos representanel promedio ms o menos la desviacin estndar de los ensayosrealizados por triplicado.

Asociacin entre el nmero absoluto de epimastigotas,consumo de glucosa y liberacin de amonaco durante

la epimastigognesis invitro de Trypanosoma cruzi.Se ha establecido que el consumo de glucosa depende

de varios factores, entre ellos la tensin de oxgeno y el

nmero de parsitos totales. Esto nos hace pensar que an

empleando un mismo inculo de partida y medio de cultivo,

existen diferencias en el comportamiento metablico de los

parsitos en condiciones de alto y bajo tenor de oxgeno.

Al hacer la comparacin entre el incremento poblacional

(Nt/No) de la epimastigognesis horizontal y vertical

(Tabla 1), se evidencia que el nmero total de parsitos

es estadsticamente diferente, razn por la cual con el n

de facilitar la interpretacin de los resultados, se procedi

a hacer grcos que contemplaran el nmero absoluto de

epimastigotas, as como las concentraciones de glucosa y

amonaco durante los diferentes tiempos de la cintica de

transformacin en ambas condiciones.

En la Figura 3A se muestran los parmetros correspondientes

a la epimastigognesis horizontal en donde se evidencia que

en el da 8 de la cintica se alcanz un pico mximo en el

porcentaje de epimastigotas (Tabla 1). No obstante, a pesar

de que este porcentaje fue similar hasta el da 12, existe un

incremento progresivo en el contaje de epimastigotas que

se explica en base al incremento poblacional.

Este aumento signicativo de epimastigotas a partir

del da 8 coincide con la disminucin progresiva de las

concentraciones de glucosa en el medio de cultivo (Figura

2A), sin detectarse liberacin signicativa de amonaco.

Cuando se gracaron estos mismos parmetros utilizando

los resultados obtenidos durante la epimastigognesis

vertical (Figura 3B), se observ un mayor porcentaje

de epimastigotas en el da 6 de la cintica (Tabla 1),

pero no obstante, dado el poco incremento poblacional

registrado, el nmero absoluto de este estadio es menor,

alcanzndose prcticamente la mitad de la reportada para

la epimastigognesis horizontal en el da 12 de incubacin.

Nuevamente, este incremento progresivo en el nmero

absoluto de epimastigotas coincidi con el agotamiento de

la glucosa del medio de cultivo, pero a un ritmo mucho ms

lento.



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Figura 3.Correlacin entre el nmero absoluto de epimastigotas ()

y las concentraciones de glucosa () durante la epimastigognesis

de Trypanosoma cruzien medio LITB en condiciones de alta (Panel

A) y baja (Panel B) tensin de oxgeno. La escala de la derecha

corresponde al nmero de epimastigotas/mL.

Determinacin del consumo de glucosa y liberacin

de amonaco durante la curva de crecimiento de

epimastigotas en medio LITB en condiciones de altay baja tensin de oxgeno. Habindose demostrado

y publicado que durante la curva de crecimiento de

epimastigotas se incrementa signicativamente la

produccin de amonaco una vez agotados los niveles de

glucosa del medio LITB (20), se quiso evaluar su produccin

durante la curva de crecimiento de epimastigotas simulando

las mismas condiciones de alta y baja tensin de oxgeno

empleadas en este estudio. En alta tensin de oxgeno se

evidenci una fase exponencial que se extendi hasta el da

10, seguida de una fase estacionaria tpica hasta el da 26,

inicindose la fase de mortalidad (resultados no mostrados).

Cuando se analiz la concentracin de glucosa durante la

curva de crecimiento (Figura 4A), se evidenci que sta se

agot completamente al octavo da, concomitantemente con

un incremento signicativo en la liberacin de amonaco al

medio de cultivo, el cual se increment progresivamente

hasta el da 26.

Figura 4. Cambios en la concentracin de glucosa () y

amonaco () durante la curva de crecimiento de epimastigotas

de Trypanosoma cruzi en medio LITB a 27C en presencia de

alta (Panel A) y baja (Panel B) tensin de oxgeno. Los puntos

representan el promedio de los ensayos realizados por triplicado.

El anlisis de la curva de crecimiento en condiciones

de baja tensin de oxgeno revel la existencia de una

fase exponencial en dos etapas: una hasta el da cuatro,

y luego un nuevo incremento hasta el da 8. No obstante,

no se evidenci una fase estacionaria tpica y se registr

una cada progresiva en el nmero de parsitos totales a

partir del da 10 que culmin con un 100% de mortalidad

al nal de la curva (resultados no mostrados). El anlisis

de la concentracin de glucosa en esta condicin evidenci

una disminucin en la velocidad del consumo de la misma,

agotndose completamente el da 19 (Figura 4B). Sin

embargo, no se evidenci la liberacin de amonaco al medio

de cultivo, an cuando para dicho momento se contaba con

una poblacin de 1,77 x 106parsitos/mL.

DISCUSIN

Previamente fue demostrado que durante la

epimastigognesis de Trypanosoma cruzi en medio

LITB cursa con un incremento en la actividad de cisten

proteasas, las cuales se intensican en forma progresiva

a partir del cuarto da de incubacin, alcanzando valoresmximos al da 12 (10). Con el propsito de determinar si

este incremento de la actividad proteoltica pudiera estar

asociado al agotamiento de nutrientes del medio de cultivo,

en el presente trabajo se estudiaron a travs de indicadores

los cambios metablicos durante la epimastigognesis del

parsito en medio LITB. En vista que el oxgeno inuye de

manera signicativa en las rutas metablicas de las clulas

eucariotas, se decidi realizar los ensayos en presencia de

alta y baja tensin de oxgeno.

En ambos casos a las 24 horas de incubacin se registr

una disminucin en el nmero de parsitos totales (Tabla 1).

Esto pudiera obedecer a la lisis de los mismos, por cuanto

no se registr la aparicin de formas inmtiles durante elrecuento diferencial en fresco. Esto pudiera obedecer a dos

razones: a) cambio en la composicin del medio de cultivo

de medio MEM a LITB; y b) disminucin de la temperatura de

37 a 28C. Esta situacin coincide con resultados nuestros

durante la epimastigognesis in vivoen la porcin anterior

del tracto intestinal de ninfas de Rhodnius prolixus(1).

El anlisis del recuento diferencial a travs de lminas

coloreadas con Giemsa mostr un comportamiento similar

entre la epimastigognesis horizontal y vertical hasta el

segundo da de la cintica (Tabla 1), caracterizado por una

cada signicativa en el porcentaje de tripomastigotas. De

stos, un 92% se convirtieron en formas en diferenciacin

caracterizadas por poseer forma redondeada con agelo

muy corto y kinetoplasto redondo, previamente identicados

como formas regresivas (25), y en donde slo un muy

pequeo porcentaje se transformaron directamente en

epimastigotas. Esto concuerda con resultados obtenidos

durante la epimastigognesis in vivo en el vector,

donde se reporta que slo un porcentaje muy pequeo

de tripomastigotas evolucionan directamente hacia

epimastigotas (9). Por otra parte, estudios realizados in vivo



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14


en nuestro laboratorio mostraron similar comportamiento

con un porcentaje que vara segn la cepa de T. cruzi

empleada (1). A partir del cuarto da se evidenci que de

estas formas en diferenciacin, algunas se convirtieron

directamente a epimastigotas, mientras que la mayora se

transformaron en parsitos con morfologa redondeada

sin agelo libre, coincidiendo con resultados previos en

nuestro laboratorio empleando otros tipos de medios de

cultivo (10, 11). En ensayos de epimastigognesis in vitroen

medio ML15HA realizados por nuestro grupo de trabajo, se

pudo comprobar que estas formas redondeadas sin agelo

libre presentan resistencia a la lisis por el complemento y

expresan antgenos especcos de amastigotas, sugiriendo

que efectivamente corresponden a este estadio del parsito

(12).

Todo parece indicar que el cambio de temperatura es un

factor disparador para la transformacin del tripomastigota

sobrenadante de clula en las denominadas formas en

diferenciacin. No habindose registrado consumo de

glucosa, liberacin de amonaco ni cambios de pH del

medio en ambas condiciones de trabajo, todo parece indicarque las formas en diferenciacin representan morfologas

de adaptacin al medio de cultivo. An cuando la Tabla 1

indica porcentajes similares de formas en diferenciacin

en ambas condiciones, la cada en el nmero de parsitos

totales (Nt/No) en condiciones de baja tensin de

oxgeno nos indica que estos parsitos parecen ser ms

sensibles a los bajos niveles de oxgeno presentes en la

epimastigognesis vertical. Estas formas de transicin del

parsito se transforman mayoritariamente en amastigotas,

y slo un porcentaje pequeo se transforma directamente

hacia epimastigotas. Esto indica que estas formas en

diferenciacin regresivas representan una poblacin

pleomrca, la cual en su mayora requieren hacerse

competentes hacia la diferenciacin transformndose enamastigotas. El clculo del nmero absoluto de amastigotas

en ambas condiciones parece indicar que stos son

sensibles a los niveles de oxgeno, registrndose una cada

signicativa de su poblacin en condiciones de baja tensin

de oxgeno.

En efecto, se ha reportado que los amastigotas poseen un

metabolismo dependiente de oxgeno (19). Esta condicin

de estrs pudiera inducir una nueva diferenciacin del

parsito, explicando el alto porcentaje de epimastigotas

(91%) registrado al sexto da en condiciones de baja tensin

de oxgeno.

Tanto en condiciones de alta como baja tensin de

oxgeno se registra duplicacin del nmero absoluto

de amastigotas (resultados no mostrados), siendo este

proceso ms acelerado durante la epimastigognesis

horizontal, incrementndose posteriormente la poblacin

de epimastigotas. Estos resultados concuerdan con

otros previamente descritos (26), quienes reportan

que en ausencia de recambio de medio de cultivo los

amastigotas son capaces de duplicarse solamente por dos

generaciones, luego de lo cual inician su diferenciacin hacia

epimastigotas. Sin embargo, el presente estudio no indica

consumo de glucosa en esta etapa en ambas condiciones,

registrndose solamente una cada de los valores de pH

a partir del da 6 durante la epimastigognesis horizontal

(Figura 2A). Estos resultados dieren de los reportados por

Engel y colaboradores (27), quienes cultivaron amastigotas

en medio axnico y determinaron que ya a las 24 horas

de incubacin con un 99% de amastigotas, se registra la

cada de ms de un 50% de la glucosa inicial en el medio

de cultivo. Por lo tanto, es posible que la cada de pH sea

consecuencia de productos liberados por este estadio. La

ausencia de liberacin de amonaco al medio de cultivo

indica ausencia de activacin del metabolismo proteico.

En efecto, se ha reportado que los amastigotas no poseen

enzimas del metabolismo de protenas (19, 27).

La gura 3 muestra que en ambas condiciones de tensin

de oxgeno, se registra un incremento importante del

nmero absoluto de epimastigotas a partir del octavo da,

coincidiendo con el inicio del agotamiento de glucosa

del medio de cultivo. Esto puede explicarse en base almetabolismo eminentemente glicoltico de los epimastigotas

(15, 16, 28). No obstante, slo se lleg a consumir casi en

su totalidad en condiciones de alta tensin de oxgeno.

Esto puede explicarse en base al mayor nmero absoluto

de epimastigotas en esta condicin, as como al hecho de

que la tensin de oxgeno afecte la velocidad del consumo

de glucosa. Para corroborar esta hiptesis, se analiz el

consumo de glucosa durante la curva de crecimiento de

epimastigotas simulando ambas tensiones de oxgeno

utilizadas durante la epimastigognesis (Figura 4),

obtenindose resultados similares. En efecto, en T. cruzi

se ha reportado que la va catalizada por fosfoenolpiruvato

carboxiquinasa (PEPCK) y la malato deshidrogenasa (MDH)

representan los nicos mecanismos para la reoxidacin deNADH bajo condiciones anaerbicas (14). Esto conlleva a

la descarboxilacin del fosfoenolpiruvato a oxaloacetato

y su posterior reduccin a malato, el cual es transportado

a la matriz mitocondrial (15). Al no estar operativo el ciclo

de Krebs, ocurre acumulacin del malato, el cual debe ser

convertido va succinato y su liberacin al medio de cultivo.

Esto, an cuando permite la sobrevida del parsito, permite

un ujo ms lento de los intermediarios de la va glicoltica

afectando la velocidad del consumo de glucosa.

Al nal de ambas cinticas se registra la aparicin

de una nueva poblacin de formas en diferenciacin.

Es posible que estas ltimas correspondan a formas

progresivas previamente descritas (25), postulndose

que posteriormente los epimastigotas, an luego de

sufrir varios perodos de replicacin se diferencian hacia

tripomastigotas. No obstante, slo se evidenci la aparicin

de tripomastigotas metacclicos en condiciones de alta

tensin de oxgeno. Habindose demostrado previamente

que la metaciclognesis est asociada a la capacidad de

utilizacin de aminocidos como fuente de energa una

vez agotado los niveles de glucosa del medio (20), el



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15


menor consumo de glucosa y la ausencia de liberacin de

amonaco (guras 2 y 3) podra explicar la ausencia de este

proceso durante la epimastigognesis vertical.

En resumen, los resultados obtenidos en el presente trabajo

permite proponer que la epimastigognesis de Trypanosoma

cruzien medio LITB se puede producir tanto en condiciones

de baja y alta tensin de oxgeno, observndose en

ambos casos la aparicin de formas en transicin con

caractersticas morfolgicas compatibles con amastigotas.

Independientemente de los niveles de tensin de oxgeno,

todo parece indicar que durante este proceso, los parsitos

involucrados en los procesos de diferenciacin (formas en

diferenciacin y amastigotas) no muestran activacin de

las diferentes rutas metablicas. Por otro lado, la aparicin

de epimastigotas posterior a la duplicacin de amastigotas

parece indicar que la capacidad de diferenciacin est

precedida de un proceso de multiplicacin, ocurriendo

efectivamente activacin de las rutas metablicas una vez

alcanzado el estadio epimastigota. Todo esto sugiere que

en Trypanosoma cruzi los procesos de multiplicacin y

diferenciacin son excluyentes entre s.

Agradecimiento.Al Sr. Johny Albanese por su apoyo en la

infraestructura del laboratorio.

Financiamiento.Este trabajo se realiz con el fnanciamiento

del Consejo de Desarrollo Cientfco y Humanstico de la

Universidad de Carabobo a travs del proyecto de Grupo

FCS-2010-001 y Proyectos de Inversin Menor CDCH-011-

2011, CDCH-012-2013, CDCH-009-2013.

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